Nghiên cứu biến đổi sinh học ghẹ (portunus) bằng công nghệ vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải

Đặt vấn đề Động vật giáp xác ở nước ta là khá phong phú, một số trở nên quen thuộc và gắn liền với cuộc sống của chúng ta như Tôm, Ghẹ, Ghẹ, Ba khía…đây là nguồn thực phẩm nhiều chất di

tên đề tài.txt Nghiên cứu biến đổi sinh học Ghẹ (Portunus) bằng công nghệ vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải

(GIảng viên hướng dẫn:Lê Chiến Phương)

SV:Nguyễn Hồng Sơn

MSSV: 107111139

Lớp: 07DSH02

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân tôi Những kết quả và các số liệu trong báo cáo thực tập được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới Tp HCM, không sao chép bất kỳ nguồn nào khác Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 7 năm 2011

LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian làm đồ án tại viện sinh học nhiệt đới TP HCM, được sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô và anh chị trong viện đã giúp em hiểu sâu hơn về chuyên nghành của mình, có them kinh nghiệm cũng như kiến thức quí báu Em xin chân thành gủi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo, thầy cô và anh chị ở viện đã tạo điều kiện thuận lợi cho em tiếp cận thực tế và giúp đỡ em thu thập thông tin để hoàn thành bài báo cáo này

Em cảm ơn thầy Lê Chiến Phương và anh Hải, anh Dân, chị Liên là những người trực tiếp hướng dẫn và cung cấp tài liệu tham khảo cho em trong suốt thời gian làm việc Em xin cám ơn Quí Thầy Cô giảng dạy tại khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt kiến thức cho em trong sốt thời gian em học tại trường và tạo điều kiện cho em thực tập nâng cao kinh nghiệm

Trong thời gian làm đồ án, do kiến thức còn hạn chế nên dù có sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô và anh chị hướng dẫn nhưng cũng không tránh khỏi những hạn chế thiếu sót Mong các thầy cô anh chị ban lãnh đạo bỏ qua Em rất mong được góp ý chân thành của Quý Thầy Cô

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô và các anh chị

Trân trọng cảm ơn

SV Nguyễn Hồng Sơn

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích đề tài 1

3 Nội dung đề tài 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Ghẹ 2

2.1.1 Phân loại 4

2.1.1.1.Ghẹ xanh 4

2.1.1.2 Ghẹ đốm (Ghẹ chấm) 7

2.1.1.3 Ghẹ 3 chấm 8

2.2 Khái quát về Trichoderma harzianum sp 9

2.2.1.Đặc điểm sinh học của nấm T harzianum sp 9

2.2.2 Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma 11

2.3 Tổng quan về Chitin 14

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Chitin 14

2.3.2 Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên 14

2.3.3 Cấu trúc phân tử và tính chất của Chitin 16

2.3.4 Sự tách chiết Chitin 18

2.3.5 Thành phần của Chitin trong một số loài 18

2.4 Đại cương về hệ enzyme Chitinase 19

2.4.1 Định nghĩa 19

2.4.2 Phân loại 19

2.4.3 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme Chitinase 22

2.4.4 Cơ chế tác động của hệ enzyme Chitinase 23

2.5 Glucosamin 25

2.6 Calci 25

2.6.1 Đặc tính vật lý 25

2.6.2 Calci trong cơ thể người 25

2.6.3 Sự chuyển hóa Calci trong cơ thể 26

2.6.4 Vai trò Calci trong cơ thể 26

2.7 Vi khuẩn lactic [3] 27

2.7.1 Phân loại 27

2.7.2 Đặc điểm 27

2.7.3 Các con đường lên men lactic 28

2.7.4 Vài đại diện của vi khuẩn lactic 29

2.7.5 Ứng dụng 31

2.8 Acid acetic 31

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

3.1 Vật liệu 34

3.1.1 Ghẹ 34

3.1.2 Nấm mốc T.harzianum 34

3.1.3 Vi khuẩn lactic 35

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 36

3.1.5 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 38

3.2 Phương pháp nghiên cứu 39

3.2.1 Phương pháp tách chiết Chitin 39

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Chitinase 40

3.2.3 Định tính xác định hoạt độ của enzyme Chitinase bằng đo đường kính vòng phân giải 41

3.2.4 Phương pháp định lượng Glucosamin ( phương pháp Elson-Morgan ) 42 3.2.5 Phương pháp định lượng Calci 44

3.2.6 Phương pháp định lượng acid lactic 45

3.2.7 Phương pháp định lượng Protein (Phương pháp Bradford ) 45

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48

4.1 Thu nhận Chitin từ mai Ghẹ 48

4.2 Xác định tỷ lệ Chitin tối ưu để nuôi cấy T.harzianum 49

4.3 Nuôi lắc T.harzianum trong môi trường dịch thể 51

4.4 Định lượng Calci bằng phương pháp hóa học 52

4.4.1 Ngâm Ghẹ trong acid acêtic 15% 52

4.4.2 Ngâm Ghẹ trong acid lactic với các nồng độ khác nhau 56

4.5 Xử lý Ghẹ bằng phương pháp vi sinh 59

4.5.1 Kết quả định lượng Calcium (Ca) 61

4.5.2 Kết quả định lượng acid lactic 62

4.5.3 Kết quả định lượng Protein 63

4.5.3 Kết quả định lượng Glucosamin 65

4.5.4 Chế biến một số món từ Ghẹ đã biến đổi sinh học 67

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Ghẹ 2

Hình 2.2 Ghẹ xanh 4

Hình 2.3 Ghẹ đốm 7

Hình 2.4 Ghẹ ba chấm 8

Hình 2.5 Hình thái vi thể của T harzianum 10

Hình 2.6 Cấu trúc Chitin 16

Hình 2.7 Cấu trúc không gian của Chitin 17

Hình 2.8 Quy trình tách chiết Chitin 18

Hình 2.9 Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 19

Hình 2.10 Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 20

Hình 2.11 Vị trí phân cắt enzyme Chitinase 22

Hình 2.12 Cơ chế hoạt động của enzyme Chitinase ở Trichoderma 23

Hình 3.1 Ghẹ được mua ở Vũng Tàu 34

Hình 3.2 Trichoderma harzianum sp 35

Hình 3.3 Lactobacillus sp 35

Hình 3.4 Quy trình thu nhận Chitin từ mai Ghẹ 39

Hình 4.1 Chitin từ mai Ghẹ 48

Hình 4.2 Hiệu suất thu nhận Chitin 49

Hình 4.3 Đường tròn phân giải Chitin 1% 50

Hình 4.4 Hàm lượng Calcium có trong dịch ngâm acid acetic 15% 53

Hình 4.5 Ghẹ ngâm trong acid acetic 15% 54

Hình 4.6 Ghẹ ngâm trong các nồng độ acid lactic khác nhau 56

Hình 4.7 Xử lý Ghẹ bằng phương pháp vi sinh 60

Hình 4.8 Sự biến đổi hàm lượng acid lactic 63

Hình 4.9 Đường chuẩn Protein 64

Hình 4.10 Đường chuẩn Glucosamin 65

Hình 4.11 Ghẹ xào giấm 68

DANH MỤC BẢN

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của Ghẹ 3

Bảng 2.2 Thành phần Chitin ở một số loài 18

Bảng 4.1 Khối lượng Chitin thu được từ mai Ghẹ 48

Bảng 4.2 Đường kính vòng tròn phân giải 50

Bảng 4.3 Hoạt tính của enzyme Chitinase theo thời gian nuôi cấy 51

Bảng 4.4 Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm acid acetic 15% 53

Bảng 4.5 Sự biến thiên pH khi ngâm Ghẹ trong acid acetic 15% 55

Bảng 4.6 Đánh giá cảm quan khi ngâm Ghẹ trong acid acetic 15% 55

Bảng 4.7 Thể tích EDTA 0.1M theo các nồng độ acid lactic 57

Bảng 4.8 Hàm lượng Calci ở các nồng độ acid lactic khác nhau 58

Bảng 4.9 Hàm lượng Calci có trong dịch ngâm 61

Bảng 4.10 Hàm lượng acid lactic có trong dịch ngâm 62

Bảng 4.11 Hàm lượng Protein có trong dịch ngâm 63

Bảng 4.12 Hàm lượng Glucosamin có trong dịch ngâm 65

Bảng 4.13 Đánh giá cảm quan khi ngâm Ghẹ trong dịch sinh khối T.harzianum 66

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

1 Đặt vấn đề

Động vật giáp xác ở nước ta là khá phong phú, một số trở nên quen thuộc và gắn liền với cuộc sống của chúng ta như Tôm, Ghẹ, Ghẹ, Ba khía…đây là nguồn thực phẩm nhiều chất dinh dưỡng, cung cấp nhiều năng lượng và khoáng chất cần thiết cho cơ thể Tuy nhiên, do hàm lượng vỏ của nguồn nguyên liệu này là khá lớn nên khi thải ra ngoài môi trường sẽ gây ô nhiễm môi trường do nó rất khó phân huỷ Bên cạnh đó, qua quá trình nghiên cứu, người ta thấy rằng trong thành phần vỏ của các loài giáp xác này

có chứa nhiều chất khoáng, protein, Chitin….mà đặc biệt là Chitin - một vật liệu rất quý, đang được cả thế giới quan tâm và nghiên cứu

Bởi vậy chúng ta phải góp phần giải quyết ô nhiễm môi trường mà lại tận dụng được lớp vỏ của các loài giáp xác này làm thực phẩm chức năng Vì lí do này mà tôi được giao nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu biến đổi sinh học Ghẹ (Portunus) bằng công nghệ

vi sinh để chế biến thực phẩm không phế thải ”

2 Mục đích đề tài

 Nâng cao giá trị kinh tế của Ghẹ

 Có thể ăn Ghẹ nguyên con vì lợi ích về dinh dưỡng, kinh tế và môi trường

3 Nội dung đề tài

- Nuôi sinh khối các vi sinh vật thí nghiệm và thu nhận Chitin từ vỏ Ghẹ

- Làm mềm vỏ Ghẹ bằng các phương pháp hóa và vi sinh vật học

- Phân tích sinh hóa các nguyên liệu tham gia và được tạo thành trong thí nghiệm

- Chế biến thực phẩm từ Ghẹ đã được làm mềm vỏ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Ghẹ

Ghẹ là đối tượng hải sản quý, có giá trị thương mại cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của Việt Nam Ghẹ được phân bố ở khắp các vùng biển đến độ sâu 50 – 100m và cửa sông, đáy cát bùn từ Bắc vào Nam, nguồn lợi khá phong phú Ban đêm Ghẹ sống sát đáy, ngày bơi lên Ghẹ là loài rất nhạy cảm với những thay đổi thời tiết Qua khai thác thử nghiệm đánh giá nguồn lợi Ghẹ theo Dự án đánh giá của nguồn lợi sinh vật biển Việt Nam (ALMRV) từ tháng 8/1996 đến tháng 2/1997, năng suất khai thác Ghẹ bằng lưới giã cào ở độ sâu 20-50m đạt khoảng 0,3-1,3 kg/giờ, ở độ sâu 50-100m đạt khoảng 1,3-2,9 kg/giờ Ở vùng biển phía Nam năng suất có thể tới 6,9 kg/giờ kéo lưới.Những năm gần đây do nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu tăng, nên cùng với nghề khai thác Ghẹ tự nhiên, nghề nuôi Ghẹ đã phát triển ở nhiều địa phương

Hình 2.1 Ghẹ

trong cả nước, tuy nhiên nguồn con giống chủ yếu vẫn còn phụ thuộc vào khai thác tự nhiên Từ năm 1998, để giải quyết vấn đề con giống cho nghề nuôi Ghẹ, Ghẹ của Việt

Nam, đã có đề tài “Sản xuất giống và nuôi thương phẩm Ghẹ xanh (Portunus

Pelagicus)” do Trung Tâm Nghiên cứu Thuỷ sản III (nay là Viện Nghiên cứu nuôi

trồng thủy sản III) thực hiện, đã đạt được một số kết quả quan trọng, tạo cơ sở để mở rộng nghề nuôi Ghẹ ở Việt Nam

Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thực phẩm ăn được

2.1.1 Phân loại

2.1.1.1 Ghẹ xanh [30]

Hình 2.2 Ghẹ xanh

Đặc điểm :

Ghẹ xanh (danh pháp khoa học: Portunus pelagicus, đồng nghĩa Neptunus

pelagicus) là một loài Ghẹ lớn tìm thấy ở các cửa sông của Ấn Độ Dương và Thái Bình

Dương (phần duyên hải châu Á) cũng như vùng duyên hải trung-đông của Địa Trung Hải Loài Ghẹ này phân bố rộng ở miền đông châu Phi, Đông Nam Á, Nhật Bản, Australia và New Zealand

Ghẹ đực có vỏ màu lam sáng với các đốm trắng và các càng dài đặc trưng, trong khi Ghẹ cái có màu nâu/lục xỉn màu hơn và mai thuôn tròn hơn Mai của chúng có thể rộng tới 20 cm

Phần lớn thời gian chúng ẩn nấp dưới cát hay bùn, cụ thể là trong thời gian ban ngày và mùa đông, điều này có thể giải thích nhờ sự chịu đựng tốt của chúng đối với

NH4+ và NH3[1] Chúng đi kiếm ăn khi thủy triều lên Thức ăn của chúng khá đa dạng,

từ các động vật hai mảnh vỏ, cá và ít hơn là các loại tảo lớn Chúng bơi lội rất tốt, chủ yếu là do các cặp chân dẹp tựa như các mái chèo Tuy nhiên, ngược lại với loài Ghẹ bể

xanh (Scylla serrata) trong cùng họ Portunidae, chúng không thể sống một thời gian

dài mà không có nước

Ghẹ xanh là loài hải sản có tầm quan trọng thương mại trong khu vực Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương và nó được buôn bán dưới dạng Ghẹ mai cứng hoặc "mai mềm", cả hai dạng này đều được coi là những đặc sản trong khu vực châu Á Loài này

được đánh giá cao do thịt của nó ngọt như thịt Ghẹ xanh Đại Tây Dương (Callinectes

sapidus), nhưng P pelagicus lại to hơn

Các đặc trưng này, cùng với tộc độ lớn nhanh, nuôi dễ dàng, mắn đẻ và khả năng kháng chịu cả nitrat [2] [3] lẫn amoniac [1], (cụ thể là NH3, là dạng có độc tính cao hơn dạng ion NH4+, do nó dễ dàng khuyếch tán qua màng mang), đã làm cho loài này là

tương đối lý tưởng trong nuôi trồng thủy sản P pelagicus không phải là loài sinh vật

biển thật sự do nói chung nó hay tiến vào các cửa sông để kiếm thức ăn và trú ẩn Ngoài ra, chu trình vòng đời của nó phụ thuộc vào các cửa sông do ấu trùng và Ghẹ non sử dụng các môi trường nước lợ cửa sông để sinh sống và phát triển Trước khi trứng nở, Ghẹ cái di chuyển tới các môi trường sống nông cạn ven cửa sông, đẻ trứng

và ấu trùng mới nở (ấu trùng giai đoạn I) sẽ tiến về các cửa sông Trong khoảng thời gian này chúng ăn các loại phiêu sinh vật nhỏ và phát triển từ giai đoạn ấu trùng I (zoea I) tới ấu trùng giai đoạn IV (khoảng 8 ngày) và sau đó thành giai đoạn ấu trùng cuối cùng (megalopa), kéo dài khoảng 4-6 ngày Giai đoạn ấu trùng này có đặc trưng là có các càng to để bắt mồi Giai đoạn từ dạng megalopa biến hóa thành dạng Ghẹ/Ghẹ thì chúng vẫn tiếp tục sống tại cửa sông, do môi trường vẫn phù hợp để kiếm ăn và trú ẩn Tuy nhiên, các chứng cứ cho thấy Ghẹ non không thể chịu được độ mặn thấp trong một thời gian dài, có lẽ là do khả năng điều chỉnh siêu thẩm thấu quá yếu của nó[4] Điều

này có thể giúp giải thích sự di cư hàng loạt của chúng từ cửa sông ra biển trong mùa mưa

 Đặc trưng phân bố

Ghẹ xanh xuất hiện khá phổ biển ở khắp các vùng biển của Việt Nam Ghẹ xanh

ưa thích sống ở vùng nước có độ mặn 25-31‰ và thường sống ở độ sâu từ 4 đến 10m nước ở những vùng biển có đáy là cát, cát bùn và cát bùn có san hô chết Mùa sinh sản của Ghẹ kéo dài quanh năm, nhưng thời gian Ghẹ xanh ôm trứng nhiều nhất là tháng 2-

4 ở vùng biển miền Trung Cũng như các loài Ghẹ biển, sau khi nở ấu trùng Ghẹ xanh phải qua nhiều lần lột vỏ và biến thái mới trở thành Ghẹ giống Đến màu sinh sản Ghẹ xanh kết thành đàn ra biển, nơi có độ mặn 30 - 34‰ để đẻ trứng

- Đặc điểm hình thái : Ghẹ thường có vỏ màu xanh, có các chấm trắng Cỡ khai thác ở trong

vịnh/đầm, trung bình là 80-120 g/con; Cỡ khai thác ngoài biển khoảng 150 -250g/con

- Phân bố: Khắp vùng biển Việt Nam

- Mùa vụ khai thác: tháng 5 – 2 năm sau

- Ngư cụ khai thác: Lưới Ghẹ, lưới kéo, câu, lồng bẫy

thúc đẩy nghề nuôi Ghẹ phục vụ xuất khẩu

- Hình thức nuôi: chủ yếu nuôi quảng canh cải tiến trong các đầm nước lợ và nuôi ghép với các đối tượng khác trên lồng bè ở vịnh Hạ Long và vịnh Cát Bà

2.1.1.2 Ghẹ đốm (Ghẹ chấm)

Hình 2.3 Ghẹ đốm

Ghẹ chấm, Ghẹ đốm hay Ghẹ cát (danh pháp khoa học: Portunus

trituberculatus) là loài Ghẹ được đánh bắt nhiều nhất trên toàn thế giới, với trên

300.000 tấn đánh bắt mỗi năm, 98% trong số này đánh bắt ngoài khơi của Trung Quốc[1]

P trituberculatus được tìm thấy trong vùng biển từ Hokkaidō tới miền nam Ấn Độ,

xuyên qua khu vực quần đảo Mã Lai và xa về phía nam tới Australia Nó sống trên nền đáy nông nhiều cát hay bùn, với độ sâu nhỏ hơn 50 mét, thức ăn chủ yếu của nó là các loại rong biển và cả các loài cá nhỏ, giun và động vật hai mảnh vỏ

Mai của nó có thể rộng tới 15 cm (6 inch) và 7 cm (2,75 inch) tính từ phần trước ra

phần sau của lưng P trituberculatus có thể phân biệt với loài Ghẹ xanh có họ hàng gần (và cũng được đánh bắt nhiều) P pelagicus bằng một loạt các khía răng cưa rộng trên phần trước của mai (3 ở P trituberculatus, 4 ở P pelagicus) và trên mép trong của

còng (4 ở P trituberculatus, 3 ở P pelagicus)[1] Các loài Ghẹ khác có họ hàng gần còn

có P sanguinolentus và các loài nhỏ hơn như P haani và P nipponensis

 Phân bố:

- Phân bố: Vịnh Bắc Bộ, ven biển miền Trung

- Mùa vụ khai thác: Tháng 5 – 3 năm sau

- Ngư cụ khai thác: Lưới kéo

- Kích thước khai thác: 7,5 – 14 cm

- Khả năng nuôi: Có thể nuôi

2.1.1.3 Ghẹ ba chấm [31]

Hình 2.4 Ghẹ ba chấm

Tên tiếng Anh: Three spots swimming crab

Tên khoa học: Portunus sanguinolentus (Herbst, 1796)

- Phân bố: Vịnh Bắc Bộ và ven biển miền Trung

- Mùa vụ khai thác: Tháng 7 – 3 năm sau

- Ngư cụ khai thác: Lưới Ghẹ hoặc lưói kéo, lồng bẫy, câu

- Kích thước khai thác: 7 – 14,5 cm

- Khả năng nuôi: Có thể nuôi

2.2 Khái quát về Trichoderma harzianum sp

2.2.1.Đặc điểm sinh học của nấm T harzianum sp

2.2.1.1 Vị trí phân loại [12,15]

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong việc phân loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ Theo hai nhà khoa học Elisa Espossito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc loại

họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, được phân làm năm nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Satutnisporum, Pachybarium và Hypocreanum

Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma được phân loại như sau: Giới: Nấm

T harzianum được phân thành hai nhóm nhỏ qua việc phân tích chuỗi DNA và hình

thái ngoài: T harzianum1 và T harzianum 2

Hai nhóm nhỏ này khác nhau ở khả năng tạo ra chất kháng nấm bệnh

2.2.1.2 Đặc điểm hình thái [1, 11]

Khuẩn lạc T.harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau lục tươi, lục sẫm Mặt dưới

khuẩn lạc không màu Bào tử áo ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các nhánh, hình cầu, nhẵn, không màu, đường kính 6-12 m

Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 m, dài tới 250 m Thể bình có kích thước 3-4 x 5-7m, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở dọc các nhánh thường đơn độc Thể bình ở giữa thường dài tới 17 m và có đường kính nhỏ hơn, phần rộng nhất khoảng 2-3 m Bào tử trần hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, không vách ngăn, kích thước 2 - 3 x 3 - 3,5 m, nhày ở thể bình

Bào tử T.harzianum Hệ sợi T.harzianum

Hình 2.5 Hình thái vi thể của T Harzianum

2.2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của T.harzianum [15]

T.harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp Theo nghiên cứu của Domsch và

cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của T.harzianum vào

khoảng 30 C, tối đa khoảng 36 C

T.harzianum cũng có thể phát triển ở nhiệt độ khoảng 5 C, những sinh trưởng rất chậm và yếu

Giá trị awnhỏ nhất là 0,91 ở 25 C

T.harzianum tổng hợp enzyme Chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin,

glyotosin…)

Vấn đề độc tố của T.harzianum chưa được biết đến

2.2.2 Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

2.2.2.1 Bảo vệ thực vật [12]

Một trong những nghiên cứu ứng dụng T.harzianum được quan tâm nhiều nhất đó là

khả năng kiểm soát sinh học và khả năng kháng một số nấm gây bệnh quan trọng ở thực vật Giống Trichoderma này tấn công các nấm bệnh bằng cách tiết ra các enzyme phân giải Chitin Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những kết quả thuyết phục về hoạt động kháng nấm Sclerotium rolfsii (nấm bệnh ký sinh trên cây thuốc lá)

của T.harzianum qua việc tổng hợp các enzyme Chitinase

Bên cạnh tác dụng kháng nấm, T.harzianum còn có khả năng ức chế các tác nhân gây

bệnh trên cây trồng Trichoderma là một thành phần đặc hiệu trong Trochodex – một chế phẩm dùng để chống lại sự mục rữa của táo sau thu hoạch Mặt khác,

T.harzianum còn được kết hợp với polysporum trong việc sản xuất Binabt - chế phẩm

được dùng trong chữa trị các vết thương bị nhiễm trùng và thối rữa ở rễ

Backman, Redriguer - Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm T.harzianum ngăn chặn

bệnh do nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia, Pythium sp ,bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh được bệnh chết ẻo Theo Emxep V.T (1989) nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc

và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển của các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây trồng Một số

chủng nấm T.harzianum còn có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống

chịu bệnh của cây trồng

2.2.2.2 Cải thiện năng suất cây trồng [7, 26]

Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn, làm các loài giun đất không thể phát triển được, hạn chế sự phát triển của đất, độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt Vì vậy các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có khuynh hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới, thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng sau:

Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, héo rũ… và hạn chế các tác hại nguy hiểm

do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân

Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và kích thích cây sinh trưởng của cây

Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa Đã có nhiều

công trình khoa học chứng minh rằng T harzianum và T koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trưởng của cây Đối với các loài được trồng trong nhà kính, T.harzianum

đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa

Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ

cứng cáp hơn Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu bắp có T harzianum T-22 hỗ

sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22

Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất, bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng

Như vậy, các chủng nấm Trichoderma sp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên

2.2.2.3.Trong lĩnh vực xử lý môi trường [12]

T.harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng

T.harzianum có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các hợp chất tự do 2,4,6 –

Trichlorophenol ; 4,5 – dichloroguaiacol và cả AOX trong môi trường có chứa muối khoáng Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn

T.harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin,

glycophosphate, và amino methylphosphonic ( 3-methoxyphenyl)

T.harzianum 2023 (khoa sinh lý thực vật trường Đại học California) có thể phân giải

DDT , endosulfan, pentachloronitrophenol và pentachlorophenol

T.harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ,

đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong đất và trong đầm lầy

2.2.2.4 Trong các lĩnh vực khác [14, 28 ]

Trichoderma sp là nguồn sản xuất hiệu quả các hệ enzyme cellulase ngoại bào Các

enzyme này được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp dệt, do chúng có thể làm cho vải bông mềm và trắng hơn

L.Grange và cộng sự đã biểu hiện gen - xylanase ( XYN 2) của T.reesei ở Saccharomyces cerevisiae để bổ sung vào thức ăn của gia cầm, tăng khả năng tiêu hóa hemicellululose trong lúa mạch và các cây lương thực khác

2.3 Tổng quan về Chitin

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Chitin [11]

Năm 1811 Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot Trong quá trình nghiên cứu trên một loài nấm Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác với dung dịch kiềm , ông thu được sản phẩm và đặt tên là Chitin (Chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là

“tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc)

Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của Chitin Năm 1843 Lassaige chứng minh rằng trong Chitin có mặt của Nitrogen

2.3.2 Sự tồn tại của Chitin trong tự nhiên [8, 27]

Chitin là một Polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một Polyme sinh học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật Lượng Chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm /1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên Chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật

Trong giới động vật, Chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ của một

số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong giới thực vật, Chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi Trong tự nhiên, Chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp Chitin- protein Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hóa chất và các men thủy phân gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của Chitin

Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, Ghẹ Ghẹ, mai mực, hàm lượng Chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, Ghẹ, Ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Chitin – Chitosan và các sản phẩm từ chúng

Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau :

2.3.3 Cấu trúc phân tử và tính chất của Chitin

 Cấu trúc phân tử: [25, 29]

Qua nghiên cứu về sự thủy phân Chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng Chitin là một Polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-(-D-Glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside)

Hình 2.6 Cấu trúc Chitin

Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ , sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp các chuỗi Ở chuỗi α – Chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau Tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng chiều Ở chuỗi β – Chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – Chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc

Hình 2.7 Cấu trúc không gian của Chitin

 Tính chất của Chitin [8 ]

Chitin ở thể rắn có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung môi thông thường Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc ( HCl,

H2SO4, H3PO4…)

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đặc, Chitin bị khử gốc acetyl tạo thành Chitosan Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại ở bước sóng 884- 890 nm

2.3.4 Sự tách chiết Chitin [8]

Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của Chitin là từ vỏ Ghẹ và tôm Trong công nghệ chế biến, do Chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như : CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc: đó là loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất của Chitin

Hình 2.8 Quy trình tách chiết Chitin

2.3.5 Thành phần của Chitin trong một số loài

Xử lý bằng

CH3COOH

Chitin Tẩy, khử màu

CaCO3

protein

Nấm, tảo

2.4 Đại cương về hệ enzyme Chitinase

2.4.1 Định nghĩa

Chitinase [ Poly Beta 1-4 – (2-acetalmido-2-deoxy )-D glucoside glucanohydrolase ] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân Chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1

và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamin liên tiếp nhau trong Chitin Mã số của enzyme Chitinase là EC 3.2.1.14

2.4.2 Phân loại

2.4.2.1 Căn cứ vào khối lượng phân tử [16]

Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, Chitinase thuộc hai họ Glycohydrose 18 và Glycohydrolase 19

 Họ Glycohydrolase18

Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokariot và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme Chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetylGlucosaminidase

Các Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, T.harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens…

Hình 2.8 Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18

 Họ Glycohydrolase 19

Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae…

Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những Chitinase thuộc nhóm I, II,IV

Hình 2.9 Cấu trúc không gian của Chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19

2.4.2.2 Dựa vào trình tự aminoacid [17]

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme Chitinase thành 5 nhóm:

Nhóm I : là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl ( C )

( peptide nhận biết ) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất Chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

Nhóm II : là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự

Chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn, chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài

Nhóm III : trình tự amino acid hoàn toàn khác với Chitinase nhóm I và II

Nhóm IV : là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình

tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như Chitinase nhóm I, phân tử cũng

có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với Chitinase nhóm I

Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn Chitin ( vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

2.4.2.3 Dựa vào phản ứng phân cắt [16]

Enzyme phân giải Chitin bao gồm : endoChitinase, Chitin 1-4 –  – chitobiosidase, acetyl – – D-Glucosaminidase (exoChitinase) và chitobiase

N-EndoChitinase: là enzyme phân cắt nội mạch Chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuối cấy nấm mốc T.harzianum ( 2 loại endoChitinase : M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa,

pI2 = 3,9) , Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8)

Chitin 1,4- - chitobiosidase: là enzyme phân cắt Chitin tạo thành các sản phẩm chính

là các dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ T.harzianum sp (M = 36kDa,

N-acetyl-D-Hình 2.10 Vị trí phân cắt enzyme Chitinase

2.4.3 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme Chitinase [16]

2.4.3.1 Trọng lượng phân tử

Enzyme Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa ( kilodalton) Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số Chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử của enzyme Chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa

2.4.3.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme Chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng: 3- 10 ở thực vật bậc cao

và tảo; pI: 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá ; pI: 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 ( g/100ml)

2.4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme Chitinase ở vi sinh vật hoạt động tại 40 C Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme Chitinase có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau Các enzyme Chitinase thực vật thuộc nhóm III và Chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 80 C

2.4.4 Cơ chế tác động của hệ enzyme Chitinase [13, 18]

EndoChitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của Chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các Polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endoChitinase không thể phân cắt thêm được nữa

Hình 2.11 Cơ chế hoạt động của enzyme Chitinase ở Trichoderma

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt Chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2

β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay Chitin một cách liên tục

từ đầu khộng khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetylGlucosamin (GlcNAc) Ngoài ra để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất Các oligsaccharide thường được thuỷ phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên Một số enyme Chitinase có khả năng thuỷ phân trisaccharid, một số khác thì không Cũng có hai dạng Chitinase thuỷ phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid ; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid Tóm lại Chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên

Cơ chất đặc hiệu của hệ enzyme Chitinase từ Trichoderma rất phức tạp EndoChitinase , chitobiosidase và β –N- acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù Chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên Chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa Chitin là những cơ chất thích hợp cho endoChitinase hơn là chitobiosidase và -N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi Chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng

-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù Chitin (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của -N-acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endoChitinase hay chitobiosidase Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endoChitinase, chitobiosidase và -N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là GluNAc

Glucosamin là nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp các chất nhờn và sụn ở các khớp cơ thể Khi các khớp bị tổn thương, nó là nguyên liệu để cơ thể sản xuất các chất cần thiết như: collagen, proteoglycan, Glucosaminglycan để phục hồi sụn khớp và tái cung cấp chất nhờn giúp các khớp linh động trở lại

Ngoài ra, Glucosamin còn có tác dụng chống ung thư, chữa tổn thương dường ruột, dạ dày

2.6 Calci

Calci (tên La Tinh : Calcium) là nguyên tố hóa học ký hiệu Ca, số thứ tự 20 trong bảng tuần hoàn Nó là một kim loại kiềm thổ

2.6.1 Đặc tính vật lý [20]

Calci là một kim loại màu xám bạc, mềm được điều chế bằng phương pháp điện phân

từ fluorua Calci Nó cháy với ngọn lửa màu vàng - đỏ và tạo thành một lớp nitrua che phủ có màu trắng khi để ngoài không khí Nó có phản ứng với nước tạo hydro và hydroxyd Calci

2.6.2 Calci trong cơ thể người [21]

Calci là chất khoáng thiết yếu cho hoạt động bình thường của rất nhiều quá trình nội và ngoại bào khác nhau bao gồm co cơ, dẫn truyền thần kinh, phóng thích hormon và

đông máu Ngoài ra, ion Calci còn đóng vai trò then chốt trong hệ thống truyền tin nội bào và liên quan đến quá trình điều hòa hoạt động của nhiều enzyme khác nhau

Mặc dù có vai trò nội bào rất quan trọng nhưng khoảng 99% lượng Calci của cơ thể được dự trữ ở xương ( khoảng 1kg Calci) Tại đây Calci liên kết với các ion khác để tạo nên các dạng tinh thể hydroxyapatite Khoảng 1% Calci của xương có thể trao đổi

tự do với dịch ngoại bào và như vậy lượng Calci này có vai trò đệm, hạn chế những dao động trong cân bằng Calci

2.6.3 Sự chuyển hóa Calci trong cơ thể [22]

Calci sau khi được hấp thụ từ thực phẩm sẽ theo máu đến xương, răng nhưng không nằm ỳ thụ động Sau một thời gian, Calci lại được huy động trở lại dòng máu tuần hoàn, để nhờ đó xương có cấu trúc luôn luôn đổi mới Nhưng ngược lại, cấu trúc của xương vì thế mà không có độ bền vững cố định Khuynh hướng huy động Calci thay đổi tùy theo loại xương, nên có loại xương cứng cáp như xương đùi, có xương bọng hơn như xương bả vai, xương dễ thất thoát Calci là xương hàm

2.6.4 Vai trò Calci trong cơ thể [23, 24]

Calci cần thiết cho cấu trúc của xương, răng, cho đến tiến trình vận động của bắp thịt

và quy trình đông máu

Calci giúp làm lành vết thương, điều hòa chức năng của tim, điều hòa trung khu giấc ngủ, đồng thời đảm bảo tình trạng êm dịu thần kinh

Calci góp phần ổn định quân bình kích tố, yểm trợ hoạt động của men và giữ vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hóa chất sắt

Calci là thành phần cần thiết để trấn an não bộ và xoa dịu hệ thần kinh ngoại biên Cùng với hai khoáng tố natri và kali, Calci chi phối hoạt động dẫn truyền tín hiệu thần kinh

Calci cũng có khả năng khống chế một số chất béo và cholesterol trong đường ruột –

2.7.2 Đặc điểm

Hình thái : vi khuẩn thường có 2 dạng :

Hình cầu : Diplococcus (2 hình cầu), Tetracoccus (4 hình cầu), Streptococcus ( hình cầu chuỗi)

Hình que : hình que đơn và hình que chuỗi

Sinh lý : tất cả Gram dương, không sinh bào tử, hầu hết không di động, không tạo

màng nhầy, kỵ khí bắt buộc, thu nhận năng lượng nhờ thải ra acid lactic và phân giải hydratcacbon Khác với vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn lactic là loại lên men bắt buộc, không chứa Cytochrome và Catalase

Chúng có nhu cầu về mặt dinh dưỡng khá phức tạp Ngoài glucose, NH, chúng còn đòi hỏi hàng loạt vitamin: lactoflavin, thiamin, acid pantothenic, acid nicotinic, acid folic, biotin… và các acid amin Vì thế thường nuôi cấy chúng trên môi trường có bổ sung cao nấm men, cao thịt, nước chiết cà chua

Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm :

+ Vi khuẩn lactic đồng hình : sản phẩm chính của lên men lactic đồng hình là acid

lactic

+ Vi khuẩn lactic dị hình : sản phẩm cuối đa dạng như acid lactic, ethanol, acid acetic,

CO…

Tùy thuộc vào nhiệt độ lên men và tăng trưởng tối ưu, vi khuẩn lactic được chia thành :

vi khuẩn ưa nhiệt và vi khuẩn ưa nhiệt vừa

pH cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn lactic là từ 5,5- 6,4 Sự lên men bị ức chế mạnh ở pH =5 và dưới 4,5 Trong quá trình trao đổi chất, vi khuẩn lactic luôn tiết ra acid lactic làm pH môi trường giảm, đến một lúc nào đó chính acid lactic nó tiết ra gây ức chế sự sinh trưởng của chính nó

Acid béo cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic Phosphate là muối quan trọng nhất cần cho vi khuẩn lactic Ion ammnium không thể dùng như nguồn đạm duy nhất nhưng có vài ảnh hưởng trên biến dưỡng của vài amino acid Sự hiện diện của những chất khoáng không quá thiết yếu và hàm lượng tự nhiên trong những môi trường phức tạp hầu hết là đủ

2.7.3 Các con đường lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí với sự tích lũy acid lactic trong môi trường Tùy theo tính chất các sản phẩm sinh ra mà người ta chia làm 2 loại :

+ Lên men lactic đồng hình

Qúa trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic Lượng acid lactic chiếm 90-98% tổng sản phẩm lên men Có thể có một ít sản phẩm phụ khác như : ethanol, acid acetic,

CO, acetoin

Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường phân giải EMP Vi khuẩn thực hiện kiểu kên men này chủ yếu là 2 giống Lactobacterium và Streptococcus

Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic

và công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xút sữa chua, phomai Chúng đóng vai trò quan trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việc tạo hương cho các sản phomai rắn

+ Lên men lactic dị hình

Sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như sau : acid lactic 40% , acid acetic 10% , các chất khí 20%

Cơ chế chuyển hóa trong lên men dị hình chưa được giải thích đầy đủ Theo giả thiết hiện nay thì các vi khuẩn lactic dị hình thiếu enzym chủ yếu của con đường EMP, đó là aldolase và triosephosphate isomerase

Giống vi khuẩn chủ yếu lên men lactic dị hình là Leuconostoc và giống phụ là Betabacterium

Lên men lactic dị hình ít có ý nghĩa trong công nghiệp Qúa trình lên men tạo thành nhiều sản phẩm cuối nên việc tách và cô lập các sản phẩm giống nhau rất tốn kém Tuy nhiên, quá trình lên men này cũng có vai trò rất quan trọng trong việc chế biến một số loại thực phẩm Vi khuẩn lactic lên men dị hình có thể làm cho các sản phẩm có mùi vị thơm ngon và đặc trưng hơn

2.7.4 Vài đại diện của vi khuẩn lactic

Giống Streptococcus

Hình cầu hay oval, kích thước từ 0,5-2 m ( biến đổi theo loài) Hiện diện ở dạng cầu đôi hoặc chuỗi khi phát triển trên môi trường lỏng, Gram dương, không di động hoặc hiếm khi di động Không tạo bào tử, không có benzidine, không có catalase, kị khí tùy

ý

Yêu cầu dinh dưỡng phức tạp, bao gồm : amino acid, purines, pyrimidines, peptides, vitamin và đôi khi các acid béo

Nhiệt độ tối thích khoảng 370C, giới hạn tối đa và tối thiểu thay đổi tùy loài từ

25-450C, tỷ lệ G + C biến đổi từ 33-420C

- Đại diện :

+ Streptococcus lactis : ưa nhiệt vừa, tế bào hình cầu Khi còn non tạo chuỗi ngắn, khi

về già thường xếp đôi Chúng lên men được glucose, lactose, galactose, maltose, dextrin, không lên men được saccharose Phát triển tốt trong môi trường sữa hoặc casein thủy phân, hiện diện hầu hết trong các sản phẩm sữa Độ acid dao động từ

1100T- 1200T, tạo mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm sữa Chúng có khả năng phát triển tốt ở nhiệt độ 30-350C, làm đông tụ sữa từ 10-12 giờ

+ Streptococcus cremosis : Tế bào hình cầu nhỏ hơn Streptococcus lactics, nhưng hình

thành chuỗi dài hơn Có khả năng lên men được glucose, không lên men được saccharose, maltose và dextrin Tạo acid trong môi trường sữa dao động từ 100-1100T Nhiệt độ thích hợp 25-300C, chúng hiện diện trong kem, bơ, phomai

Giống Lactobacillus

Hình que, thường đơn độc hoặc chuỗi, không di động, không tạo bào tử, Gram dương trở thành Gram âm khi già hay môi trường bị acid hóa, kị khí tùy ý Không có catalase, không có cytochrome ( do không có porphyrines ) và benzidine Sắc tố hiếm khi tạo thành nếu có thì là màu vàng, cam hay màu rỉ

Yêu cầu dinh dưỡng phức tạp, tiêu thụ đường cao, một nửa sản phẩm cuối của sự trao đổi chất từ carbohydrate là lactate Môi trường dinh dưỡng phức tạp, cần phải có acid amin, peptid, dẫn xuất của acid nucleic, vitamin, acid béo hay ester của acid béo

Biên độ nhiệt độ rộng 5-350C, nhiệt độ thích hợp là 30-420C

pH thích hợp là 5,5-5,8

2.7.5 Ứng dụng

Ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa để sản xuất sữa chua, kefir, phomai, koumis…

Ứng dụng trong muối chua rau quả : bắp cải muối, dưa chuột muối…

Ứng dụng trong ủ chua thức ăn gia súc dùng trong chăn nuôi

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và các loại muối lactate : acid lactic được ứng dụng trong ngành thuộc da, dệt, công nghiệp tổng hợp chất dẻo, công nghiệp thực phẩm

2.8 Acid acetic

Công thức phân tử: CH3COOH

Khối lượng phân tử: M = 60.05

Nhiệt độ nóng chảy: Tnc = 16,6C

Nhiệt độ sôi : Ts = 118.1 C

Acid acetic hay còn được gọi là giấm là sản phẩm của quá trình lên men từ ngũ cốc, đường hoặc oxi hóa rượu Trong giấm có nhiều amino acid : 18 loại amino acid tự do đều có trong giấm, trong đó có 8 loại aminoacid mà cơ thể con người không thể tổng hợp được, cần phải do thức ăn cung cấp Aminoacid trong giấm có từ sự phân giải của protein và sự hòa tan của bản thân vi sinh vật trong nguyên liệu Do mùi vị của các aminoacid khác nhau nên hương vị của giấm có mùi khác nhau

Trong giấm có các loại đường như đường trái cây, đường mạch nha … là một trong những nguồn năng lượng cho hoạt động của cơ thể

Trong giấm có các vitamin B1, B2, vitaminC, có từ trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình lên men của thức ăn và nguyên liệu Những chất này là thành phần cấu thành chất xúc tác của một số men nào đó trong quá trình trao đổi chất của cơ thể con người

Công dụng của giấm :

Trung Quốc là nước sử dụng sớm nhất liệu pháp trị bệnh bằng giấm Có rất nhiều phương thuốc kinh nghiệm dân gian dùng giấm để điều trị các chứng bệnh như quai bị, nấm ngoài da, nấm móng tay (chân) …Sau đây là một số công năng của giấm :

o Làm giảm và loại trừ mệt mỏi: giấm có chứa nhiều acid hữu cơ, có thể thúc tiến quá trình trao đổi đường và loại trừ được sự mệt mỏi nhờ quá trình phân giải các acid lactic và pyruvic

o Điều tiết độ kiềm acid trong dịch cơ thể, duy trì sự ổn định tương đối của môi trường trong cơ thể con người: Theo sự phân tích của các nhà dinh dưỡng học, giấm là một loại thức ăn có tính kiềm sinh lí, qua trao đổi trong cơ thể có thể sinh ra phản ứng kiềm tính Do cơ thể cơ thể con người hằng ngày ăn các loại thức ăn có tính acid ( thịt, cá , trứng , gạo,

…) uống một chút giấm có thể trung hòa phản ứng acid từ đó duy trì cân bằng acid kiềm của môi tường bên trong cơ thể

o Giúp tiêu hóa, có lợi cho hấp thụ: giấm ăn có thể nâng cao độ chua của dịch vị, chất thơm bay hơi, và amino acid trong giấm có thể kích thích trung ương thần kinh, thúc đẩy cơ quan tiêu hóa, bài tiết số lượng lớn dịch tiêu hóa, giúp tăng cường công năng tiêu hóa của dạ dày Đồng thời, còn có thể khiến cho các loại muối vô cơ ( Calci, sắt , phospho trong thức

ăn hòa tan càng nhiều, có thể phòng các loại vitamin C bị phá hủy) Điều

đó không những nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà còn có lợi cho tiêu hóa và hấp thụ