Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá basa

Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bá

MSSV : 107111115 LỚP : 07DSH3

MỞ ĐẦU

Trong sản xuất và đời sống, các loại enzyme nói chung và protease nói riêng

được sử dụng ngày càng phổ biến Chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu nhờ vi

sinh vật, một số ít có nguồn gốc từ thực vật, mô động vật Gần đây, do yêu cầu về

vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng

ngày càng cao Trong khi đó chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực

vật được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các

phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương

mại Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng

khan hiếm và không kinh tế do nội tạng động vật thường được dùng làm thực phẩm

và dùng để ghép tạng cho những bệnh nhân đặc biệt Protease trong cơ thể cá, đặc

biệt là ở cơ quan tiêu hóa đã được biết đến từ lâu nhưng lại chưa được nghiên cứu

đầy đủ và cũng chưa có công nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá Vì

vậy, những công trình nghiên cứu về protease nội tạng và phương pháp chiết rút

chúng đang được ráo riết tiến hành ở nhiều nước có nghề cá phát triển

Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển, với trên 200

loài cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm Tuy sản lượng lớn nhưng phần được sử

dụng hữu ích từ cá chỉ chiếm khoảng gần 50% Nghĩa là hàng năm có trên 700.000

tấn phế liệu, trong đó có trên 30.000 tấn nội tạng cá Theo thói quen, nội tạng cá chỉ

được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị

thải bỏ vào môi trường vừa lãng phí vừa là nguồn gây ô nhiễm môi trường

Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là sử dụng hợp

lý và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng

ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao

Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên, em thực hiện đề tài

“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch

enzyme protease từ nội tạng cá Basa”

Mục đích chung là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết

và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá, cũng như tính chất của enzyme này

1 Xác định quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá :

- Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu

- Xác định dung môi chiết enzyme protease

- Xác định thời gian chiết enzyme protease

- Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô

- Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô

- Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel

- Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS – PAGE

2 Khảo sát một số tính chất của enzyme protease nội tạng cá :

- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ

- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease

- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH

- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn

- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease khi có mặt một số ion kim

loại, chất đặc hiệu nhóm

D PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :

1 Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease :

- Chiết rút thu dịch chiết

- Thu nhận chế phẩm enzyme protease

- Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel

- Phân tách enzyme protease bằng điện di trên gel polyacrylamide

2 Các phương pháp phân tích :

- Xây dựng đường chuẩn albumin

- Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

- Xây dựng đường chuẩn tyrosine

- Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano

Đồ án tốt nghiệp gồm :

- Chương 1 : Tổng quan tài liệu

- Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3 : Kết quả và thảo luận

- Chương 4 : Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME :

1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme :

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme tham gia xúc

tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá

trình chuyển hóa các chất trong cơ thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều

hướng xác định Do đó đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống

Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme

thu được ở dạng tinh thể Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả

trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt

là công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm…

1.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme :

1.1.2.1 Bản chất của enzyme :

Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên nó có đủ tính chất của protein

Giống với các protein hình hạt khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, dung dịch

đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý…

Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước Enzyme trong

dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hòa như sulphatamon

hoặc các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất

hoạt tính xúc tác Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm enzyme

Ngược lại dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid

hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị mất khả năng

xúc tác Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính của phân tử protein

– enzyme

1.1.2.2 Cấu trúc enzyme :

Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa phần

protein Enzyme một cấu tử trong thành phần phân tử chỉ có protein Enzyme hai

cấu tử trong thành phần cấu tạo gồm : protein (“feron” hoặc “apoenzyme”) và phi

protein (“agon” hoặc “coenzyme”) Trung tâm hoạt tính của enzyme chiếm phần rất

nhỏ với phân tử enzyme nhưng có vai trò quan trọng trong việc tham gia kết hợp

đặc hiệu với cơ chất trong quá trình xúc tác

Ở các enzyme một cấu tử, trung tâm thường bao gồm một tổ hợp các nhóm

chức acid amin liên kết lại với nhau Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 các nhóm này tuy nằm

cách xa nhau trong mạch polypeptide, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau

hơn Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm

ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme

1.1.3 Danh pháp và phân loại enzyme :

Theo quy ước quốc tế, tên enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu

của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo đó tên enzyme

thường có hai phần : phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân của

phản ứng

Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất phân loại enzyme ra làm

6 lớp sau :

- Oxydoreductase : enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử

- Transpherase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

- Hydrolase : enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân

thuận nghịch phân tử nước

- Isomerase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp

giữa galactose và glucose

- Ligase : enzyme này xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic tạo thành

oxaloacetic acid

1.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme :

Bản chất của phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme,

các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ

chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng Do tác dụng của

enzyme cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn

thay đổi tính chất hóa học Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra 3 giai đoạn :

- Giai đoạn thứ nhất : enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu,

nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất Phức hệ này thường không bền

Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra nhanh và đòi hỏi

một ít năng lượng

- Giai đoạn thứ hai : khi cơ chất tạo phức với enzyme thì sẽ bị thay đổi cả cấu

hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả các liên

E : enzyme ; S : cơ chất ; ES : Phức hệ enzyme – cơ chất ; P : Sản phẩm

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme :

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như : bản chất và

nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, các ion kim

loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác ( có tác dụng kìm hãm hay hoạt hóa enzyme)

1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất :

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ enzyme sẽ

phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả

nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme – cơ chất, phản

ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại Nhưng đôi khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên

thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

1.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme :

Nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến

tính vào nồng độ enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản

ứng tăng chậm hoặc không tăng

1.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa :

Hoạt tính enzyme có thể thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu

cơ khác nhau Các chất này có thể làm tăng, hoặc làm giảm hoạt tính enzyme Tác

dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất,

từng enzyme khác nhau

Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ

làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme Các

chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein, kìm hãm

thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh Khi biết

được tác dụng ức chế của các chất này đối với từng loại enzyme trong từng phản

ứng cụ thể ta có thể điều chỉnh được phản ứng

Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme Các chất

này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại

hoặc các chất hữu cơ Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của

enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp Cơ chế của sự kích hoạt này có các chất

tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính của enzyme, làm thay đổi cấu hình không

gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc cho gián tiếp thông qua

việc loại trừ các chất ức chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng, nhưng không tác dụng trực

tiếp với phân tử enzyme

1.1.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường :

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme vì nó ảnh

hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của protein –

enzyme pH thích hợp của phần lớn enzyme là 7

pH thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như đặc

tính và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng…

1.1.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ :

Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa

học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một

giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme

hoạt tính thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme Các enzyme

có nguồn gốc thực vật và một số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao hơn

Nhiệt độ thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như : thời

gian xác định hoạt tính, pH…

phục khi đưa về nhiệt độ bình thường

tới hạn Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hiếm khi được hồi phục hoạt tính

trở lại

1.1.5.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại :

Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa enzyme Các ion kim loại

nặng ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch

enzyme

Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ

hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới

hạn xác định, khi vượt quá nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme Giới hạn

nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy

ở cùng một nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể

có tác dụng trái ngược nhau Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hóa

trị

1.2.1 Giới thiệu chung :

Protease là một nhóm các enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình thủy

phân các liên kết peptide trong phân tử protein Trong cơ thể cá còn sống các

protease là tác nhân xúc tác quá trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống của cá

Sau khi cá chết, khả năng xúc tác quá trình thủy phân của các enzyme này vẫn còn

và là nguyên nhân gây ra sự biến đổi thịt cá sau khi chết, khi tách ra khỏi cơ thể cá

thì protease vẫn giữ được khả năng xúc tác quá trình thủy phân Do đó, cần nghiên

cứu các đặc tính của protease nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme này từ phế liệu

cá trong công nghiệp chế biến thủy sản, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá

1.2.2 Phân loại enzyme protease :

Theo Baret và Donald (1986) thì protease được chia thành hai nhóm lớn là

endopeptiase (proteinase) và exopeptidase

Nhóm endopeptiase

Là các enzyme phân giải các liên kết ở giữa chuỗi mạch polypeptide Theo

phân loại của Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa Sinh quốc tế, các enzyme nhóm này

Là các enzyme thủy phân liên kết peptide ở đầu mút của chuỗi mạch peptide

Các enzyme thuộc nhóm này gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase,

dipeptidase Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptide ở trung

tâm mà chỉ tác dụng thủy phân liên kết ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu

amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide

1.2.3 Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản :

Hệ tiêu hóa của cá gồm nhiều bộ phận khác nhau Mỗi bộ phận có chức năng

và các đặc điểm riêng của quá trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn Do đó, hệ enzyme

protease trong các bộ phận này cũng khác nhau Tuy nhiên hoạt tính của enzyme

chủ yếu diễn ra ở dạ dày và ruột cá

Enzyme dạ dày

Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có pepsin xúc tác cho quá trình thủy phân

protein trong môi trường acid mạnh Trong dạ dày có cả hai loại enzyme chính là

pepsin và parapepsin

Pepsin là enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein trong dạ dày, được sinh

tổng hợp trong các tế bào màng nhày của dạ dày và tiết ra dưới dạng không hoạt

tính gọi là pepsinogen Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền

trong môi trường trung tính và acid yếu, nhưng dưới tác dụng của acid clohydric và

sự có mặt của một lượng nhỏ pepsin tự do trong dạ dày, sẽ chuyển hóa thành pepsin

dạng hoạt tính là một chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da Pepsin có tác

dụng của một proteinase, transpeptidase và esterase nhưng chủ yếu có tác dụng của

endopeptidase và thủy phân chủ yếu các liên kết peptide sát gốc Lα – acid amin

thơm và dicacboxyl

Enzyme đường ruột

Trong màng nhày ruột và trong dịch ruột, người ta xác định được có 22

enzyme tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn Trong đó các enzyme protease gồm

: enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase,

cacboxylpeptidase

 Enterokinase

Là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen và chymotripsinogen Enterokinase

được tổng hợp từ tế bào màng ruột, nhờ tác dụng của các muối mật mà xâm nhập

vào khe ruột và hoạt hóa tripsinogen trên bề mặt màng nhày của ruột cũng như ở

trong khoang ruột Dưới tác dụng của enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt một

đoạn 6 acid amin tại vùng giữa lysin và isoleusin và do đó chuyển thành dạng hoạt

tính Ngoài ra, tuyến tụy còn tiết ra một lượng enterokinase cân bằng với tripsin để

hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin

 Chymotripsin

Là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử khoảng

25.000 Da gồm 3 chuỗi polypeptide gắn với nhau bằng hai cầu nối sulfua

Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong đó có

nhóm – CO - của các acid amin thơm hoặc methionin Nó cũng xúc tác cho phản

ứng thủy phân este của các acid amin này

Tripsin và chymotripsin có khả năng cắt đứt các liên kết ở giữa mạch

polypeptide của phân tử protein, kết quả hoạt tính thủy phân protein của chúng tạo

thành các đoạn polypeptide Các đoạn này khi vào khoang ruột sẽ được các protease

khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối cùng là các acid amin

1.2.4 Lược sử nghiên cứu về protease :

Loài người sử dụng enzyme protease trong sản xuất và đời sống từ lâu đời

trước khi biết đến chúng 5000 năm trước công nguyên, con người đã sử dụng renin

có trong dạ dày bê như chất đông tụ để sản xuất phomat Các thổ dân Nam Mỹ cổ

đại đã sử dụng lá đu đủ để làm mềm thịt và phương pháp này đã được kế thừa, phát

triển thành kỹ thuật làm mềm thịt nhân tạo bằng papain và các enzyme protease

khác Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông cha ta đã chế biến nước mắm trên cơ sở quá trình

tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có sẵn trong nội tạng và cơ thịt cá, trong điều

kiện nồng độ muối cao

Đến thế kỷ 18, Reomur mới phát hiện dịch dạ dày của loài chim ăn thịt có

khả năng tiêu hóa thịt Năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease

của dịch vị trong dạ dày chó Năm 1857, Corvisart tách được chế phẩm thô tripsin

từ dịch tụy Năm 1862, Danilevxki tách được tripsin và amylaza từ tụy tạng Từ

những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận và ứng

dụng enzyme protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển và hoàn thiện công nghệ

thu nhận protease từ các mô động vật và thực vật Từ đó đến nay, hàng loạt các

protease từ vi sinh vật, từ động vật và thực vật đã được sản xuất và ứng dụng vào

mọi lĩnh vực sản xuất và đời sống Đặc biệt, những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ

21, công nghệ enzyme phát triển vô cùng nhanh chóng, các loại protease được sử

dụng trong hầu hết các lĩnh vực sản xuất, đời sống, y học và nghiên cứu khoa học

Nếu như năm 1980, cả thế giới sản xuất và tiêu thụ khoảng 1300 tấn enzyme các

loại trong đó có protease chiếm 40,7% thì đến năm 1985, thị trường enzyme thế

giới đã có sản lượng được mua bán là 45000 tấn, trị giá gần 650 triệu USD và đến

năm 1990, doanh thu từ các enzyme công nghệ của thế giới đạt 1,5 tỷ USD, trong

đó thị phần enzyme protease là 48% Như vậy có khoảng 5 năm, lượng enzyme

được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới tăng gấp đôi, trong đó lượng enzyme

protease chiếm khoảng 50% Các cường quốc về sản xuất và tiêu thụ enzyme

protease công nghiệp là Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch,

Trung Quốc… hầu hết thuộc các nước công nghiệp phát triển Dự báo, trong thế kỷ

21, sản xuất và tiêu thụ enzyme của thế giới sẽ tăng với tốc độ hàng năm khoàng

20%

Tuy protease được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau nhưng cho đến những

năm gần đây, các protease sử dụng trong công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi

sinh vật, các protease có nguồn gốc từ thực vật và động vật có vị trí thứ yếu

1.3 ỨNG DỤNG PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA CÁ TRONG CHẾ BIẾN

THỦY SẢN :

1.3.1 Giới thiệu chung :

So với các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật trên

cạn, protease của động vật thủy sinh nói chung, cá nói riêng ít được ở trong quy mô

công nghiệp Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:

 Nguồn nguyên liệu thủy sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định

nên việc cung cấp nguồn thu enzyme không ổn định, khó tổ chức sản xuất

chế phẩm enzyme ở quy mô công nghiệp

 Trong cơ thể động vật thủy sản, cơ quan tập trung enzyme lớn và có hoạt

tính cao là nội tạng nên thường được sử dụng làm nguồn thu enzyme Tuy

nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh hôi, không hấp dẫn đối với công nhân

sản xuất, lại rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên

 Protease của động vật thủy sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác

nhau Để tách riêng và làm tinh sạch từng enzyme cần trải qua hàng chục

bước khác nhau với kỹ thuật phức tạp Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị

trường chưa có protease thương mại từ nguyên liệu thủy sản Để phát triển

sản xuất chế phẩm enzyme từ thủy sản phải nghiên cứu, hoàn thiện công

nghệ và giảm giá thánh sản phẩm

Từ những năm 50 của thế kỷ trước, ở nhiều nước đã phát triển công nghệ sản

xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Hàng trăm loại chế phẩm protease từ các

chủng vi sinh vật khác nhau đã được sản xuất và mua bán trên thị trường sản lượng

các chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục và tỷ trọng các protease từ

vi sinh vật trong tổng doanh số enzyme trên thị trường thế giới luôn ở mức cao nhất

với các protease từ các nguồn khác Việc sản xuất các chế phẩm protease thương

mại từ vi sinh vật có những ưu điểm như :

- Có nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease, chu kỳ sinh

trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể thu nhận enzyme hàng chục lần trong

năm, có thể chủ động về nguyên liệu

- Có thể dễ dàng điều hòa, định hướng quá trình sinh tổng hợp enzyme cần

thiết trên cơ sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc hoặc

gây đột biến ở các chủng vi sinh vật

- Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi cấy tổng hợp cao hơn

việc thu nhận enzyme thuận lợi

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme

hạ

Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme

công nghiệp gặp phải một số trở ngại Các chủng vi sinh vật protease phải được

đánh giá, kiểm tra nghiêm ngặt về độc tính để bảo đảm an toàn, vệ sinh cho sản

phẩm Việc phân tích, kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ chính

xác cao nên cần phải có các phòng thí nghiệm, phân tích chuyên dùng, trang bị

dụng cụ hiện đại, chi phí đầu tư lớn

Trong khi đó, các enzyme protease có nguồn gốc từ động vật và thực vật

luôn được đánh giá an toàn, sau khi thu nhận có thể sử dụng ngay vào quá trình chế

biến mà không cần kiểm tra độc tính Với sản lượng 100 triệu tấn cá biển và 30

triệu tấn cá nước ngọt hằng năm, cả thế giới có tới 6,5 – 9 triệu tấn nội tạng và nếu

đưa vào để thu nhận enzyme protease, nguồn lợi thu được là không nhỏ

1.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thủy sản ở Việt Nam :

Đến nay trong phạm vi quốc gia, ngành thủy sản chưa có một cơ quan, đơn

vị chuyên nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong chế biến thủy sản Các Viện

nghiên cứu, các trường đào tạo cán bộ khoa học công nghệ chuyên ngành thủy sản

chưa có chương trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thủy sản

nói riêng Chính vì vậy, có thể nói ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu về enzyme của

cá và động vật thủy sinh cũng như các hướng ứng dụng chúng vào sản xuất và đời

sống, vào chế biến thủy sản hầu như chưa có gì Những năm gần đây, một số nhà

khoa học và công nghệ đã bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nhưng mới chỉ là

những nỗ lực cá nhân, chưa được sự quan tâm của nhiều người, chưa được sự đầu

tư về tài, lực cho nghiên cứu nên kết quả mới là bước đầu và còn rất khiêm tốn Các

tài liệu, số liệu về enzyme thủy sản và ứng dụng enzyme trong ngành thủy sản còn

nghèo nàn, thiếu hệ thống

Tuy nhiên có một ngành chế biến có truyền thống lâu đời là chế biến nước

mắm Các công trình nghiên cứu về nước mắm đều đi đến kết luận là nước mắm là

sản phẩm của quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme

protease của bản thân nguyên liệu Quá trình thủy phân thịt cá bằng enzyme thực

hiện trong điều kiện có muối ăn ở nồng độ cao, để ngăn hoạt tính của các vi khuẩn

gây thối rữa, tạo thành các chất đạm hòa tan, chủ yếu là acid amin và peptide ngắt

mạch Do thủy phân thịt cá bằng hệ enzyme của bản thân nguyên liệu trong điều

kiện muối mặn nên quá trình chế biến nước mắm trong điều kiện tự nhiên có thời

gian dài, từ trên 10 tháng tới 1 - 2 năm Trong quá trình lâu dài ấy, đồng thời với

quá trình thủy phân thịt cá còn có các quá trình lên men khác với sự tham gia của hệ

vi sinh vật yếm khí hình thành các hợp chất bay hơi, các acid hữu cơ… Làm cho

nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc trưng, có giá trị dinh dưỡng và cảm quan đặc

biệt

Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học

công nghệ nước ta cũng đã quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng

protease trong chế biến thủy sản Các lĩnh vực sử dụng protease trong chế biến thủy

sản chủ yếu tập trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu thủy sản

cũng như nguồn cá tạp, cá kém giá trị kinh tế

So với kết quả nghiên cứu về enzyme protease của thực vật, động vật máu

nóng và vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm thì việc nghiên cứu, ứng

dụng enzyme protease cá trong chế biến thủy sản mới chỉ tập trung vào việc tận

dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng dụng

protease trong chế biến thủy sản còn hạn chế, chỉ mới dừng ở trong phòng thí

nghiệm, chưa chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp

Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản để sử dụng trong chế biến

cũng như cung cấp cho ngành khác đang đặt ra trực tiếp và cấp bách Các công trình

nghiên cứu về protease của cá và các lĩnh vực ứng dụng đang tăng lên nhanh chóng

ở nhiều nước có nghề cá phát triển Tiềm năng phát triển sản xuất chế phẩm

protease từ thủy sản và ứng dụng để chế biến ra những sản phẩm mới rất là to lớn

Trong thời đại bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn

trương và thuận lợi, các nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu

các thành tựu mới trong lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển

nhanh chóng công nghệ chế biến thủy sản ở đất nước

1.3.3 Nguồn thu enzyme protease :

Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng được thu nhận chủ yếu từ

ba nguồn cơ bản : mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh

vật

Enzyme được tách từ các mô như : tụy tạng, dạ dày, ruột … của một số động

vật thủy sản (mực , cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin… Từ

thực vật có thể thu nhận được một số enzyme thủy phân như : papain từ nhựa đu đủ,

bromelin từ thân, lá và vỏ dứa Ngoài ra còn có thể thu nhận được một số enzyme

khác như : amylase, urease, peroxydase…

1.3.4 Ứng dụng enzyme protease :

Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng có thể sử dụng theo hai

hướng sau :

 Hướng 1 : Sử dụng trong quá trình thủy phân trong cơ thể Các enzyme này

là các enzyme nội bào Chúng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào

sống, nhưng khi sinh vật chết quá trình thủy phân protein vẫn diễn ra Như vậy,

protease tham gia vào quá trình thủy phân protein của chính nguyên liệu chứa

nó Việc sử dụng enzyme theo hướng này rất đơn giản, có thể làm tăng hương

vị, màu sắc của sản phẩm Tuy vậy, chỉ có thể sử dụng enzyme loại này đối với

quy trình chế biến nguyên liệu chứa nó

 Hướng 2 : Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng

chúng vào trong các quá trình sản xuất Việc tách chiết enzyme dựa vào tính

chất của chúng : enzyme tan được trong nước, trong dung dịch muối sinh lý, các

dung dịch đệm Dịch chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ

và vô cơ nên phải tiến hành tinh sạch để thu chế phẩm Các chế phẩm enzyme

được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

a Trong công nghiệp thực phẩm :

- Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm

quan, làm tăng giá trị sản phẩm Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội

tạng động vật để thủy phân làm mềm nguyên liệu, hoặc thủy phân nguyên

liệu tạo thành dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hóa

- Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease

được sử dụng làm trong dịch quả, dịch bia

- Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm pho mát

- Protease được dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của sản

phẩm có giá trị thấp Ví dụ như dùng protease để thủy phân protein trong phế

liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen…) thành các dạng hòa tan, thu

dịch đạm thủy phân làm thức ăn cho người hoặc thức ăn chăn nuôi

- Dùng protease để thủy phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá

b Trong công nghiệp dệt :

Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng,

không ảnh hưởng đến độ bền của tơ

c Trong công nghệ phim ảnh :

Protease được sử dụng để sản xuất gellatin trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái

sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X – quang

d Trong công nghiệp da :

Sử dụng protease để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông

thu hồi (tỷ lệ thu hồi tăng 25 – 30 % so với khi dùng phương pháp hóa học),

và da có chất lượng cao

e Trong công nghệ sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm :

Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, kem đánh răng… có tác dụng

tẩy sạch các vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt để loại các lớp

biểu bì chết, làm mịn da

f Trong công nghiệp dược phẩm :

Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa, thuốc

tiêu mủ ở các vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm sạch vết

thương và giảm đau cho người bệnh

g Trong chế biến thủy sản :

Nước mắm được hình thành từ quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới

tác dụng của hệ enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu trong điều kiện

muối mặn và thời gian dài Người ta đã sử dụng chế phẩm protease để bổ

sung trong quá trình sản xuất nước mắm với lượng nhất định nhằm rút ngắn

thời gian chế biến Nhờ vậy mà làm tăng hiệu quả kinh tế, tăng sự luân

chuyển vốn

Ngoài ra, người ta còn sử dụng enzyme protease vào việc sản xuất bột đạm

cá, bột đạm hòa tan, … từ các loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá

tạp…) Sở dĩ làm như vậy vì hướng sản xuất này có thể tận dụng được các

phế liệu trong quá trình chế biến, tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản

phẩm, … đem lại hiệu quả kinh tế cao

1.4 SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ LỌC GEL :

1.4.1 Bản chất của phương pháp :

Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân

tử và phân tích định lượng tương tác phân tử

Hình 1.1 Tách các phân tử bằng lọc gel

Một số thông số vật lý của phương pháp:

+ Giới hạn tách (exclution limit) : Là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử

nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel Thí dụ giới hạn tách của G - 50 có FR từ

1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel

+ Phạm vi tách (Fructionation range) : Thí dụ, sephadex G 50 có FR từ 1.500

-30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được

phân tách dễ dàng bởi G - 50

+ Độ ngậm nước (water regain) : Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút

quanh hạt Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột

+ Thể tích nền (bed volume) : Là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu

khi trương nở trong nước G - 50 có thể tích nền 9 - 11 ml/g gel khô

+ Hạt gel (Gel particle) : Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ Kích thước hạt xác định

chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt Thường người ta chọn hạt gel có kích thước

+ Thể tích trống (void volume) : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel

trong cột Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons

+ Thể tích thổi (elution volume) : Là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách

ra khỏi cột

1.4.2 Đặc tính của gel :

Có 4 loại gel thường được sử dụng

Dextran – có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB

(Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex (bảng trang 84) Giới hạn

tách của gel dextran - 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang

nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn Tuy nhiên nếu dextran được

bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’-methylene bisacrylamide thì dextran có

giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia –LKB cung cấp)

Gel polyacrylamide : Tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và

N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thương mại)

Gel agarose : Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ

galactose và anhydrogalactose Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều

hơn là do các liên kết ngang Hãng Bio - Rad cung cấp agarose với tên thương mại

là Bio - gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thương mại là sepharose và seperose

Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho

phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp

suất để tách

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH :

- Thời gian thực hiện bắt đầu từ tháng 10/2010 đến tháng 12/2011

- Quá trình nghiên cứu tại phòng “ Các chất có hoạt tính sinh học” thuộc Viện

Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU :

Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là nội tạng cá basa

Giới thiệu chung về cá Basa :

Hình 2.1 Cá Basa

- Cá Basa còn có tên gọi là cá giáo, cá sát bụng là loài cá da trơn cá giá trị kinh

tế cao, được nuôi tập trung nhiều nước trên thế giới

- Theo hệ thống phân loại Tyson Roberts phân loại cá basa như sau :

Pangasius, loài cá basa Pangasius bocuorti (sau vage 1880)

giống Helicophagus có 2 loài Có một số loài sống trong nước lợ, và 2 loài

sống ở biển

 Trong họ Pangasiidae hai loài cá tra và basa là cá nuôi kinh tế của đồng bằng

sông Cửu Long

- Đặc điểm hình thái, sinh lý cá Basa :

Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều

dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao bên thân

dài chuẩn Dải răng trên to rộng có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có

hai đôi râu, râu hàm trên bằng ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài

đầu Có 40 - 60 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31 - 36

tia vây, chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn, lưng dầy màu xám

xanh và trắng

- Phân bố :

Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan Ở nước ta những năm trước đây khi chưa

có sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu

Do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê Công để sinh sống và tìm nơi

sinh sản tự nhiên Bãi đẻ của cá nằm khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mê

Công và Tonlesap, nơi giáp Campuchia và Lào Nhưng tập trung nhất từ

Kampi đến hết Rongiev thuộc địa giới 2 tỉnh Kratie và Stung Treng

- Tỷ trọng :

Nuôi trong bè sau 2 năm đạt 2,5kg/ con Trong tự nhiên gặp cỡ cá dài 0,5m

2.3 THU THẬP VÀ BẢO QUẢN MẪU :

Mẫu nghiên cứu là nội tạng cá Basa được thu gom tại chợ Thủ Đức vào sáng

sớm ngay khi cá mới về

Mẫu sau khi thu thập được sẽ được xác định khối lượng ban đầu, đem bảo

Khi cần sử dụng, mẫu được đem ra, cân chính xác lượng cần dùng trong thời

gian nhanh chóng và vẫn trong điều kiện lạnh, và chuyển phần mẫu còn lại vào tủ

lạnh để bảo quản ở nhiệt độ âm, tránh làm mất hoạt tính mẫu

2.4 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT :

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị :

- Ống nghiệm thủy tinh, pippet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống đong …

- Máy đo quang phổ UV – Vis

- Cơ chất để xác định hoạt tính enzyme là casein

- Hóa chất dùng trong quá trình tủa : acetone, ethanol, sulphatamol

- Các thuốc thử hàm lượng, hoạt tính của protease

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :

2.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford :

 Nguyên tắc :

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc

nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch

mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước

sóng hấp thu cực đại là 465nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển

sang dạng màu xanh dương và được hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với

dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường là

bovine serum albumin Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm,

màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy

mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị

OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành

b Hóa chất :

 Dung dịch Albumine 0,1 mg/ml : Cân chính xác 10 mg albumine pha trong

dung dịch albumine có nồng độ 0,01 mg/ml

 Nước cất

 Dung dịch thuốc thử Bradford : dung dịch thuốc thử có thành phần trong

100 ml như sau :

 Coomassie Brilliant Blue : 0,001g

 Ethanol tuyệt đối : 4,7g

 Phosphoric acid 85% : 8,5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hòa tan trong ethanol trong một

chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid 85% và chỉnh tới 100ml bằng

nước cất

 Dựng đường chuẩn Albumine:

Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30,

40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/ml

Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn Albumine

Định lượng protein trong mẫu ống nghiệm

Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml thuốc thử

Bradford

Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595nm

Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm

Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường

chuẩn

 Kết quả tính toán:

Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát ta suy ra

hàm lượng protein của mẫu là X (µg/ml) có trong m (g) nguyên liệu

Vậy lượng protein có trong 1g nguyên liệu là:

Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme

protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng màu với thuốc thử

Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm

thủy phân dưới tác dụng của enzyme Hoạt tính của enzyme được biểu hiện bằng

đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme

- Tyrosine tinh khiết

- Thuốc thử Folin (pha loãng 5 lần khi sử dụng )

 Các bước tiến hành :

Pha dung dịch Tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70;

Dung dịch HCl (μl)

(ml)

Thuốc thử Folin (ml)

khác nhau và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp Sau khi lắc đều, để

ổn định dung dịch ở 37 ± 0,50C trong 20 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở

Đối với ống đối chứng dùng 1 ml HCl 0,1 M thay cho tyrosine Đo độ hấp thụ

Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối

chứng sẽ được giá trị từ OD1 đến OD9 Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo

nồng độ protein Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine

phút

(ghi nhận kết quả này là Am)

Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml enzyme và tiến hành các

bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện Ghi nhận kết quả độ hấp thụ

này là Ao

Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng

cách lấy Am – Ao rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tính

protease theo tính toán sau :

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng

enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 μg tyrosine trong 1 ml dịch

lọc dưới điều kiện thí nghiệm

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – Ao).F.1/100.n

Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – Ao) F 1/100 n.V.1/m

Trong đó :

bước sóng 660 nm trên đường chuẩn

Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease : từ kết quả hàm lượng

protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (U/ml) tính hoạt tính riêng của

enzyme

HTR (U/mg) = Số đơn vị hoạt tính / mg protein enzyme

2.5.3 Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease :

Tiến hành tách chiết và thu nhận enzyme protease từ các phần riêng khác

nhau : nội tạng cá Toàn bộ quá trình tách chiết thu enzyme được tiến hành trong

tác động của môi trường Nội tạng cá được nghiền mịn với cát thạch anh trong cối

inox đặt trong một thau đá

2.5.3.1 Chiết rút thu dịch chiết :

Dùng một số dung môi có khả năng hòa tan enzyme (nước cất, dung dịch

muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate) với tỷ lệ và thời gian thích hợp để chiết rút

dịch chiết Xác định hoạt tính enzyme dịch chiết theo phương pháp Amano, chọn tỷ

lệ dung môi và thời gian thích hợp

2.5.3.2 Thu nhận chế phẩm protease :

Kết tủa protein – enzyme trong dịch chiết thu được từ nội tạng bằng các tác

dịch chiết với tỷ lệ và nồng độ thích hợp, để gây kết tủa protease Quá trình kết tủa

trong 10 phút thu chế phẩm thô Chế phẩm thô được bảo quản trong dung dịch đệm

phosphate 0,1 M ở pH = 7 Xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô theo phương

pháp Amano, chọn tỷ lệ, tác nhân, thời gian tủa thích hợp

2.5.3.3 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng sắc lý lọc gel :

Hình 2.2 Bộ máy chạy sắc ký lọc gel

 Nguyên tắc :

Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng

lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử có

kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua

cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di

chuyển nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel

 Hóa chất

Gel Sephadex G - 50 có các đặc tính : Dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 -

 Chuẩn bị gel và chạy mẫu :

Cân 5g gel “Sephadex G - 50” khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm

phosphate pH 7.0 đựng trong cốc Dùng dung dịch đệm phosphate pH 7.0 nhiều gấp

2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 =

106ml dung dịch đệm Để gel ổn định cho đến khi 90 - 95% số hạt ổn định Gạn

hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn Lặp lại công việc

trên 4 lần để loại > 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm

đầy 20% thể tích cột

Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bắn

gel ra ngoài, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí

Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 - 5cm, mở khóa đầu ra của cột cho

đến khi cột được nạp đầy gel (packed) Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra

(outlet) của cột

Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể

tích lớp nền (106ml) chảy qua cột khi điều khiển tốc độ chảy

 Nạp mẫu :

Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không lẩn các vật rắn),

hoàn toàn hòa tan trong dung dịch đệm

Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm tốc độ phân tách, ít quá làm mẫu bị

loãng Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột tới 10 – 20% tổng thể tích

cột Để phân tích chỉ được phép đưa 1 lượng mẫu nhỏ vào 1/55 tổng thể tích cột (là

thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi)

Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng

chảy tự do Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8 –

ml/h) Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén

Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và

cho kết quả tốt đối với gel bằng lỗ nhỏ Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng

chảy ổn định nên phải dùng bơm nén

Khởi động cho máy chạy mẫu, mẫu tinh sạch sẽ hòa vào trong đệm

phosphate pH 7.0 và đi ra các ống nghiệm đựng mẫu Dựa vào sắc ký đồ hiển thị

trên máy tính ta biết được những ống nghiệm nào chứa enzyme có cùng trọng lượng

phân tử

 Thu và xác định mẫu tách được :

Dịch ra khỏi cột được đo ở bước sóng 280 nm bằng bộ tách sóng trong hệ sắc

ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP data view

trên máy tính Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector ), mỗi phân đoạn

2 ml

Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak sau đó

phân tích hàm lượng protein và xác định hoạt tính

2.5.4 Phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide

(Polyacrylamide Gel Electrophoresis) :

2.5.4.1 Nguyên tắc :

Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử

acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide Quá trình polymer hóa được xúc tác

bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine

(TEMED) Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích

thước của lỗ gel Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của

các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và

bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân

tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là

một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein Trong kĩ thuật này

protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là

mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT) Với các tác nhân này protein từ cấu trúc

bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều

được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ

thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn

những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định

Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực

dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường

Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một

thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác

nhau đã biết

Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự

phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên

tục (discontinuous gel) Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp :

và tạo một lớp băng mỏng

trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban

đầu

Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide

và vị trí

Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng

lượng phân tử từ 10.000 - 200.000 Daltons Những phân tử protein có trọng lượng

lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít

hơn 2,5%

Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến

tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên

gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính

(Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một

số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo liên kết

(cross-linked) giữa các protein với nhau Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện

tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập

trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis)

2.5.4.2 Các bước tiến hành :

 Đổ gel :

 Gel phân tách : Cho các thành phần theo thứ tự vào becher 50ml sạch

Sau khi cho Ammonium pesulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần

(tránh tạo bọt khí) Dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho

mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel) Sau đó đặt một

lớp nước cất trên lớp gel để mặt gel được phẳng Chờ gel đông 20- 30 phút

 Gel gom : Tương tự cho các thành phần vào becher 50ml sau

Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn đổ hết lớp nước bên trên

Tiến hành dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn Đồng thời đưa lược

vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí) Sau khi đã trùng ngưng, tháo lược,

lắp đĩa gel vào bộ phận diện di Cho dung dịch điện di vào buồng điện di

 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di :

 Xử lý mẫu : Hút 30l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer ) và 30l

dung dịch mẫu protein vào eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi

cách thủy 5 - 10 phút Ly tâm 10.000 v/p trong 1 – 5 giây

 Tiến hành chạy điện di :

Tiến hành chạy điện di ổn định dòng 100V

Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước Sau đó

tiến hành nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền

gel trong suốt không màu Sau khi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các

vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt

2.4.5.3 Xác định trọng lượng phân tử của protein :

i Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band

protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng

ii Tính giá trị Rf :

Khoảng cách di chuyển của protein

Rf =

Khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol Blue

iii Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và

các giá trị Rf của chúng

2.5.5 Bố trí thí nghiệm :

2.5.5.1 Khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease :