Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng, phát triển của oncidiumkozumit delight in vitro

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của Oncidium Kozumit Delight in vitro“ nhằm xác định được môi trường nuôi cấy và lo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG LÊN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT

TRIỂN CỦA ONCIDIUM KOZUMIT DELIGHT IN VITRO

Chuyên ngành: MÔI TRƯỜNG

Giảng viên hướng dẫn : ThS Trịnh Thị Lan Anh Sinh viên thực hiện : CAO THẾ HIỂN

TP Hồ Chí Minh, năm 2013

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay khi nói tới hoa lan người ta đã liên tưởng đến sự thanh tao, tinh khiết, quý trọng, đam mê và tình yêu vĩnh cửu bất diệt Trong tất cả các loài hoa được biết đến thì hoa lan được mệnh danh là “Nử hoàng của sắc đẹp” cùng với vẽ đẹp quyến rũ, hương thơm dịu dàng từ vô vàn các lòai hoa lan với đủ các màu sắc

khác nhau với tên gọi khác

Hoa lan là một loài hoa biểu tượng cho vẻ đẹp và sự quý phái, nó có rất nhiều chủng loại, mỗi loại mang một vẻ đẹp riêng Có nhiều loại lan khác nhau như

Dendrobium, Phalaenopsis, Oncidium Kozumit Delight, Oncidium, Vanda, Cattleya chúng đều có mùi hương quyến rũ và vẻ đẹp kiêu sa Hoa lan cũng

thường dùng để trang trí, trưng bày trong các bữa tiệc hay các cuộc hội thảo Trong

số đó, có lẽ Oncidium là giống nổi bật nhất từ màu sắc và dạng hoa cho đến giống loài,

Hiện nay, nhu cầu về hoa lan ngày càng nhiều góp phần thúc đẩy nghề trồng lan phát triển mạnh mẽ và thu về lợi nhuận cao cho nhiều nước, trong đó phải kể đến Đài Loan, đây là nước có kỹ thuật trồng lan hàng đầu thế giới với khả năng điều khiển sự ra hoa của lan Hồ Điệp và bộ sưu tập giống cực kì đồ sộ Nước ta cũng có rất nhiều cơ sở kinh doanh hoa lan mọc lên, tuy nhiên còn nhiều hạn chế về quy mô, đội ngũ kỹ thuật nên cây giống có chất lượng thấp, không đồng đều chưa đáp ứng nhu cầu thị trường, kết quả là hàng năm nước ta phải nhập giống từ nước ngoài Chính vì vậy, việc tăng năng suất, chất lượng cho cây giống đang là vấn đề cấp bách hiện nay

Theo nghiên cứu mới nhất thì một hay hai yếu tố sẽ không giúp cây phát triển một cách toàn diện Để cây phát triển một cách tối ưu ta cần phải bổ sung đầy đủ các yếu tố như: dinh dưởng, ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện nuôi cấy,… nhưng trong đó có hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của cây đó là dinh dưỡngvà ánh sáng

Môi trường thường sử dụng trong nuôi cấy lan in vitro là môi trường MS

(Murashige and Skoog, 1962), đây là môi trường dinh dưỡng khá đầy đủ cho cây

Sự kết hợp môi trường MS lỏng và Rắn để tạo ra môi trường MS 2 lớp để góp phần thúc đẩy sự phát triển của cây một cách tốt nhất Bên cạnh đó, ánh sáng cũng là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình quang hợp và phát sinh hình thái cây Do đó, việc ứng dụng các loại ánh sáng trong nuôi cấy mô cũng là một hướng nghiên cứu mới và khả năng ứng dụng cao

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự

sinh trưởng và phát triển của Oncidium Kozumit Delight in vitro“ nhằm xác định được môi trường nuôi cấy và loại ánh sáng thích hợp cho sự nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight trong điều kiện in vitro, từ đó cải tiến phương pháp nhân giống

giúp giảm giá thành sản phẩm

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được môi trường nuôi cấy, loại ánh sáng và điều kiện chiếu sáng thích

hợp cho sự nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight trong điều kiện in vitro, nhằm gia tăng hệ số nhân chồi lan Oncidium Kozumit Delight cũng như tăng chất lượng

cây con trong môi trường nuôi cấy in vitro

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng ánh sáng và môi trường MS (Murashige and

Skoog, 1962) hai lớp (lỏng và rắn) lên giai đoạn tạo chồi lan Oncidium Kozumit Delight trong điều kiện in vitro

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Từ trước đến nay, việc nhân giống lan in vitro đều sử dụng môi trường MS

(Murashige and Skoog 1962), nên việc kết hợp môi trường MS lỏng và Rắn để tạo

ra môi trường MS 2 lớp với khảo sát ánh sáng cũng là một hướng hiệu quả trong

nhân giống lan trong điều kiện in vitro Tuy nhiên, đối với mỗi cây khác nhau thì có

môi trường dinh dưởng và bước sóng ánh sáng cũng khác nhau Vì vậy, việc xác dịnh môi trường dinh dưởng cũng như loại ánh sáng và điều kiện chiếu sáng thích

hợp là cơ sở khoa học cho việc tạo ra cụm chồi khỏe có sức sống tốt, tăng sinh mạnh, đạt hiệu quả chất lượng cao, gia tăng khả năng sống sót khi chuyển cây con ra

vườn ươm là vấn đề rất quan trọng trong nhân giống in vitro Từ đó giảm giá thành

sản phẩm, nâng cao hiệu quả kinh tế

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Hệ thống đèn được thiết kế khá đơn giản không tốn chi phí cao, dễ áp dụng cho

sản xuất cây giống và đạt hiệu quả cao

Trong môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) hai lớp ( lỏng và rắn ), giá thành thấp, đơi giản có thể áp dụng sản xuất lớn, nó sẽ tạo điều kiện để chúng ta

có thể so sánh với các môi trường dinh dưởng khác để tìm ra môi trường tối ưu cho

nhân giống in vitro, từ đó áp dụng vào sản xuất

5 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài thực hiện nhân chồi trên môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) Môi trường nuôi cấy: 2 lớp:

 Lớp trên: MS lỏng + 1 g/l than hoạt tính + 1 g/l NAA + 2 g/l BA + 30 g/l đường +

50 ml/l nước dừa

 Lớp dưới: MS đặc (10g/l agar) + 1 g/l NAA + 2 g/l BA + 30 g/l đường + 50 ml/l nước dừa

 Quan sát và lấy kết quả trong 4 tuần

chiếu sáng với các loại ánh sáng có bước sóng khác nhau: ánh sáng trắng (ánh sáng đa sắc – nghiệm thức đối chứng); ánh sáng xanh dương, ánh sáng vàng; ánh sáng đỏ tối hoàn toàn trong 4 tuần

 Quan sát và lấy kết quả trong 4 tuần

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Xác định được môi trường dinh dưởng thích hợp cho sự nhân chồi lan

Oncidium

Xác định được loại ánh sáng thích hợp cho sự nhân chồi lan Oncidium

Xác định điều kiện chiếu sáng thích hợp cho sự nhân chồi lan Oncidium

Các số liệu, hình ảnh và biểu đồ mô tả

7 Kết cấu đồ án tốt nghiệp

 Đồ án tốt nghiệp bao gồm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Quang hợp ở thực vật

Quang hợp là một quá trình tổng hợp các chất hữu cơ từ các chất vô cơ đơn giản là CO2 và H2O dưới tác dụng của năng lượng ánh sáng mặt trời và sự tham gia của sắc tố diệp lục

Quang hợp đã biến đổi quang năng thành hóa năng ở thực vật, thông qua quang hợp cây tạo ra một lượng lớn sinh khối, nó có ý nghĩa quyết định sự sống của mọi sinh vật và con người trên trái đất

Ánh sáng cần cho quá trình quang hợp được tiếp nhận bởi hai nhóm sắc tố: chlorophyll và carotenoid, ở một số thực vật bậc thấp còn có phycobillin

Trong đó, diệp lục (chlorophyll) là sắc tố chính có vai trò quan trọng nhất trong quang hợp

Trong lá cây, phân tử diệp lục liên kết với các phân tử protein khác nhau nên các phân tử diệp lục có cực đại hấp thu khác nhau và được kí hiệu bằng P700, P680…

Cấu trúc cơ bản của diệp lục là vòng porphyrin, được tạo nên từ 4 vòng pyrrol riêng lẻ, ở trung tâm của vòng có một nguyên tử Mg liên kết với các nguyên tử N bởi 2 liên kết đồng hóa trị và hai liên kết phối trí Nguyên tử Mg có thể được tách

ra khi có tác động của acid loãng Phân tử diệp lục không chứa Mg gọi là pheophytin cũng có một vai trò quan trọng trong phản ứng sáng quang hợp Chuỗi bên của phân tử diệp lục có tính kỵ nước và nhờ vậy phân tử có đặc tính kỵ nước

 Carotenoid:

Quang phổ hấp thu của nhóm carotenoid ở vùng ánh sáng xanh có bước sóng

451 – 481 nm

Carotenoid có vai trò lọc ánh sáng và bảo vệ cho diệp lục không bị oxi hóa bởi cường độ ánh sáng cao Carotenoit có khả năng hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời ở vùng mà diệp lục không hấp thu được rồi chuyển năng lượng này cho diệp lục để biến đổi thành năng lượng hóa học

o Carotenoid là nhóm sắc tố vàng, da cam, tỷ lệ diệp lục: carotenoid thường bằng 3:1, carotenoid thường chia thành 2 nhóm: carotene và xanthophyll

Carotene (C40H56) là tiền vitamin A, chỉ tan trong dung môi hữu cơ

Xanthophyll là sắc tố có màu vàng sẫm, có công thức hóa học C40H56On (n từ 1 – 6)

Màng thylakoid chứa 3 cấu trúc siêu phân tử, đó là hệ thống quang hóa I, hệ thống quang hóa II vá phức hệ cytochrome b/f, chúng chiếm toàn bộ bề rộng màng

và là thành phần quan trọng trong chuỗi vận chuyển điện tử của quang hợp

Hệ thống quang hóa I chứa ít nhất 13 loại protein khác nhau, khoảng 200 phân

tử diệp lục, một số lượng carotenoid và 3 phức hệ Fe – S

Hệ thống quang hóa II chứa ít nhất 11 phân tử polypeptide khác nhau, khoảng 200 phân tử diệp lục a, 100 phân tử diệp lục b, hai phân tử pheophytin, quinone

Hệ thống quang hóa I và II không chỉ chứa sắc tố tiếp nhận ánh sáng mà mỗi hệ thống còn chứa một phân tử diệp lục hoàn toàn đặc biệt ở vị trí của nó, phân tử diệp lục này khi tiếp nhận ánh sáng có khả năng bắn ra 1 điện tử Phân tử diệp lục đặc biệt của hệ thống I hấp thu cực đại ánh sáng có bước sóng 700 nm (còn gọi là P700) và phân tử diệp lục đặc biệt của hệ thống quang hóa II hấp thu cực đại ở 680

nm ( còn gọi là P680) Năng lượng được hấp thu từ năng lượng ánh sáng nhờ các sắc tố quang hợp của mỗi hệ thống quang hóa và được chuyển đến P680 cũng như P700 qua sự cộng hưởng điện từ Bằng cách này hai hệ thống quang hợp tạo ra sự vận chuyển điện tử khi có ánh sáng

Ánh sáng ảnh hưởng trực tiếp ở giai đoạn đầu của quá trình quang hợp, giai đoạn sau không ảnh hưởng trực tiếp Những công trình của Blackman cho thấy khi cường độ ánh sáng và nồng độ CO2 đạt tối ưu cho quang hợp, nếu tăng cường độ ánh sáng và nồng độ CO2 thì cường độ quang hợp không tăng

 Quá trình quang hợp được chia làm hai giai đoạn như sau:

1.1.1 Phản ứng sáng (pha sáng)

Là quá trình hấp thu năng lượng ánh sáng bởi diệp lục, vận chuyển năng lượng

đó vào trung tâm phản ứng và tại đây năng lượng ánh sáng được biến đổi thành năng lượng hóa học của phân tử ATP (Adenosine Triphosphate) và tạo nên hợp chất khử mạnh NADPH2 (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) Pha sáng gồm hai giai đoạn kế tiếp nhau: giai đoạn quang vật lý và giai đoạn hóa học

 Giai đoạn quang vật lý: là giai đoạn đầu tiên của pha sáng quang hợp, trong giai

đoạn này có hai hoạt động chính xảy ra là sự hấp thu năng lượng của sắc tố và sự truyền năng lượng do các sắc tố hấp thu được đến hai tâm quang hợp là P700 và P680 Kết quả của giai đoạn này là hai tâm quang hợp tiếp nhận được năng lượng ánh sáng do các hệ sắc tố chuyển đến và trở thành trạng thái hoạt động Điện tử của hai tâm quang hợp giàu năng lượng tham gia vào các phản ứng quang hóa của giai đoạn quang hóa tiếp sau đó

 Giai đoạn quang hóa: là giai đoạn chuyển hóa năng lượng của các điện tử ở hai

tâm quang hợp thành năng lượng của các hợp chất giàu năng lượng là ATP và

NADPH2 Quang hóa được thực hiện tại hai tâm quang hợp với sự tham gia của hai

hệ thống quang hóa I và II Hoạt động chính của giai đoạn quang hóa là quá trình quang phân ly nước và quá trình phosphoryl hóa

o Quang phân ly nước: là một quá trình rất quan trọng trong quang hợp đã được

nghiên cứu bởi Hill và cộng sự năm 1937 Quá trình này xảy ra qua 3 giai đoạn cơ bản

-Trong các sản phẩm do quang phân ly nước tạo ra, O2 thải ra môi trường, e

-thực hiện chuỗi vận chuyển điện tử quang hợp để vận chuyển ATP – quá trình phosphoryl hóa, H+ kết hợp với NADP- để tạo ra NADPH2

o Phosphoryl hóa quang hóa: trong pha sáng quang hợp, sau khi năng lượng ánh

sáng được chuyển thành năng lượng điện tử của hai tâm quang hợp trong giai đoạn quang vật lý, năng lượng điện tử này được biến thành năng lượng của ATP, quá trình này được thực hiện qua phosphoryl hóa quang hóa

Năm 1954, Arnon phát hiện ra hai hình thức phosphoryl hóa vòng và phosphoryl hóa không vòng Đến năm 1969, ông lại phát hiện ra hình thức phosphoryl hóa đặc biệt ở cây mọng nước là phosphoryl hóa vòng giả

Phosphoryl hóa vòng: xảy ra ở hệ quang hóa I, quá trình này xảy ra trong điều kiện kỵ khí với sự tham gia của các chất oxy hóa như vitamin K, ferredoxin Ánh sáng hệ I tác động vào hệ sắc tố I, điện tử giàu năng lượng do nhận thêm năng lượng ánh sáng được chuyển đến tâm quang hợp I (P700) Qua hệ thống vận chuyển điện tử của hệ quang hóa I, điện tử được di chuyển theo con đường vòng: xuất phát từ P700, khi e- của P700 nhận thêm năng lượng ánh sáng nó trở nên giàu năng lượng hơn Ở trạng thái giàu năng lượng này (trạng thái kích động điện tử của sắc tố) không bền nên điện tử mất dần năng lượng qua chuỗi phản ứng oxy hóa khử

thuận nghịch Đến khi trở lại trạng thái bình thường thì nó quay trở lại P700, hoàn thành một chu kỳ hoạt động Trong quá trình mất dần năng lượng qua chuỗi phản ứng oxy hóa khử, nếu giai đoạn nào đủ điều kiện sẽ thực hiện phản ứng tổng hợp ATP

Phosphoryl hóa không vòng: Trong pha tối quang hợp để khử CO2 thành phân

tử glucose không chỉ đòi hỏi năng lượng do ATP mà còn cần chất khử mạnh NADPH2 Phosphoryl hóa vòng mới cung cấp một phần ATP cho nền, cần có quá trình cung cấp thêm ATP và đặc biệt là NADPH2 cho pha tối Nhu cầu đó đã được quá trình phosphoryl hóa không vòng thỏa mãn Quá trình này thực hiện qua cả hai

hệ quang hóa, đặc biệt có sự tham gia của nước Qua quang phân ly, nước đã được cung cấp e- cho quá trình phosphoryl hóa không vòng Dưới tác động của năng lượng ánh sáng với sự tham gia của các chất oxy hóa và P680, nước bị oxy hóa Sau khi hấp thụ năng lượng ánh sáng, hệ sắc tố II truyền năng lượng đó cho P680, P680 trở nên trạng thái kích động điện tử với thế oxy hóa cao sẽ oxy hóa nước Phân tử nước bị P680 oxy hóa cướp e- nên phân ly thành H+ và O2 Điện tử tách ra

tử P680 được vận chuyển qua hệ quang hóa II để đến P700 Từ P700, nhờ năng lượng ánh sáng cung cấp qua hệ sắc tố I, e- lại giàu năng lượng để chuyển đến cho ferredoxin Ferredoxin khử NADP kết hợp với 2H+ do nước tách ra để tạo NADPH2– sản phẩm quan trọng thứ hai của pha sáng

Trong quá trình di chuyển e- từ hệ quang hóa II sang hệ quang hóa I, năng lượng e

-giảm dần Năng lượng thải ra qua các phản ứng oxy hóa khử đó nếu đủ điều kiện sẽ được tổng hợp ATP Như vậy, sản phẩm của phosphoryl hóa không vòng ngoài ATP còn có NADPH2, đó là nhờ có sự tham gia của quang phân ly nước xảy ra đồng thời với quá trình phosphoryl hóa không vòng này

1.1.2 Pha tối trong quang hợp

Sau khi pha sáng tạo ra ATP và NADPH2, giai đoạn tiếp theo là sử dụng ATP, NADPH2 để khử CO2, tạo nên sản phẩm của quang hợp

Quá trình này xảy ra không cần năng lượng ánh sáng mà dùng sản phẩm của pha sáng và hệ enzyme xúc tác

Sản phẩm đấu tiên của quá trình đồng hóa CO2 là glucose Từ glucose, qua nhiều con đường biến đổi khác nhau sẽ tạo nên các hợp chất hữu cơ trong lá Cho đến nay, người ta đã xác định có 3 con đường đồng hóa CO2 tạo glucose trong quang hợp: chu trình Calvin, chu trình Hatch và Slack, chu trình CAM

ribulosediphosphate

o Chu trình Calvin xảy ra qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn tiếp nhận CO2

6C5 + 6CO2 + 6H2O 12C3(APG)

Giai đoạn khử APG

12APG + 12ATP + 12NADPH2 12C3(AIPG) + 12ADP + 12H3PO4

1.1.2.2 Chu trình Hatch và Slack

Ở một số loài thực vật như ngô, cao lương, mía Chất nhận CO2 là phosphoenolpyruvate (PEP) Quá trình bắt đầu bằng phản ứng kết hợp HCO3- và PEP, nhờ enzyme PEP – carboxylase, một hợp chất 4C – oxaloacetic acid được tạo thành Phản ứng này giải phóng năng lượng do phân giải liên kết cao năng trong PEP, oxaloacetic acid bị khử tạo thành malate hoặc bị amin hóa tạo thành aspartate Trình tự phản ứng của chu trình C4 như sau:

Phản ứng 1: HCO3- kết hợp với PEP tạo thành oxalocetate, phản ứng được xúc tác bởi enzyme PEP – carboxylase

Phản ứng 2: Oxalocetate bị khử thành malate nhờ NADPH

Phản ứng 3: Oxalocetate được biến đổi thành aspartate bằng phản ứng chuyển amin hóa

Phản ứng 4: Malate bị carboxyl hóa và oxy hóa tạo nên pyruvate, CO2 được giải phóng nhờ chu trình Calvin

Phản ứng 5: Pyruvate được chuyển hóa trở lại thành PEP nhờ phản ứng khử carboxyl hóa, phản ứng cần ATP và phosphate vô cơ

Ưu điểm của sự đồng hóa CO2 ở thực vật C4 là enzyme PEP – carboxylase có trong tế bào chất tiếp nhận CO2 có trong mô lá và CO2 từ quá trình hô hấp tốt hơn

sự tiếp nhận CO2 ở thực vật C3, vì ở thực vật C3, CO2 phải chui vào lục lạp Điểm

bù CO2 ở thực vật C4 thấp hơn C3, thực vật C4 có khả năng giảm nồng độ CO2

trong mô lá mạnh hơn thực vật C3, vì vậy chúng có khả năng sử dụng CO2 trong không khí hiệu quả hơn

Tuy nhiên thực vật C4 cần nhiều năng lượng cho sự đồng hóa CO2, phần lớn những thực vật C4 thích nghi với những vùng có cường độ ánh sáng mạnh

1.1.2.3 Quang hợp theo chu trình CAM (Crassulaceae Acid Metabolism)

Các loài thực vật khác nhau của họ Crassulaceae có khả năng tiếp nhận CO2

vào ban đêm nhờ khí khổng mở và ban ngày thì khí khổng đóng để tránh mất nước

Người ta nghiên cứu trước hết trên loài Crassulaceae, những thực vật có hình thức

trao đổi này được gọi là thực vật CAM

Ban đêm khí khổng mở, CO2 được tiếp nhận, nhờ enzyme PEP – carboxylase carboxyl hóa PEP tạo thành oxaloacetate Chất này bị khử thành malate, sau đó malate dự trữ trong không bào Ban ngày, khí khổng đóng malate được chuyển vào lục lạp và nó bị khử CO2 tự do và NADPH tạo ra trong chu trình Calvin, bên cạnh

đó sự đồng hóa CO2 được cung cấp bởi ATP và NADPH được tạo ra từ quang hợp Sản phẩm đồng hóa này một phần được biến đổi thành tinh bột, tích lũy trong lục lạp, ban đêm một phần tinh bột được phân giải thành PEP Ở sự khử carboxyl hóa oxy hóa pyruvate được tạo thành từ malate, sau đó pyruvate được biến đổi thành PEP nhờ enzyme pyruvate – phosphate – kinase

Sự tích lũy malate trong không bào là một quá trình chủ động, được điều khiển bởi sự trương của không bào, thế nước của cây điều khiển sự đóng mở khí khổng Người ta phân biệt thực vật CAM bắt buộc và không bắt buộc, thực vật CAM không bắt buộc chỉ thực hiện chu trình CAM khi thiếu nước

1.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục

o Nồng độ diệp lục a và b trong dung dịch được xác định trị số tắt, đo ở hai bước sóng dài

Công thức tính nồng độ diệp lục được viết ở dạng sau:

Ca = α Dλ1 + β Dλ2

Cb = γ Dλ3 + δ Dλ4

Trong đó:

α, β, γ, δ: những hệ số phụ thuộc vào dung môi

Ca, Cb: nồng độ tương ứng của diệp lục a và b

Dλ: hệ số đo tắt bằng mg/l ở bước sóng cho biết theo mµ

Giá trị của các hệ số phụ thuộc dung môi, do đó với mỗi dung môi có một công thức riêng:

Đối với dung dịch aceton 80% (nước)

Theo Mac – Kini – Aron: Ca = 12,7 D663 – 2,69 D645

Cb = 22,9 D645 – 4,68 D663

Theo Vernon: Ca = 11,63 D665 – 2,69 D649

Đối với dung dịch ether ethylic

Theo Komar – Cigeil: Ca = 9,93 D660 – 0,777 D642,5

Cb = 17,6 D642,5 – 2,81 D660

Theo Smit – Benitei: Ca = 10,1 D662 – 1,01 D644

Cb = 16,4 D644 – 2,57 D662 Đối với dung dịch ethanol 960

Tương quan giữa diệp lục, carotenoid và các sắc tố khác phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh trưởng của cây

1.2 Khái quát về ánh sáng

Ánh sáng là các bức xạ điện từ có bước sóng nằm trong vùng quang phổ nhìn thấy được bằng mắt thường (từ 400nm đến 700nm)

Ánh sáng mặt trời là một dạng năng lượng bức xạ hay năng lượng điện từ, năng lượng điện từ trong không gian ở dạng sóng, dãy sóng điện từ đầy đủ được gọi là phổ điện từ

Ánh sáng mặt trời có độ dài sóng khác nhau mà mắt người có thể nhìn thấy một vùng hẹp

Khi ánh sáng mặt trời chiếu trên lá, cây chỉ hấp thụ một vài bước sóng (như ánh sáng đỏ) dùng cho quang hợp, trong khi ánh sáng có độ dài khác (như ánh sáng lục) cây phản chiếu và truyền qua lá Vì vậy, ta không thể thấy ánh sáng ở các độ dài sóng bị các sắc tố hấp thụ, ví dụ màu lục của lá cây do ánh sáng lục không được hấp thụ, nó được truyền suốt hay phản chiếu

1.2.1 Ánh sáng và tác động của ánh sáng đến thực vật

1.2.1.1 Vai trò của ánh sáng đối với thực vật

o Ánh sáng có thể truyền thông tin qua nhiều dạng khác nhau, trong đó có tối thiểu

4 dạng đặc trưng:

- Chất lượng: dạng năng lượng bức xạ, màu quang phổ, thành phần bước sóng ánh sáng

- Lượng: số lượng năng lượng bức xạ, cường độ, số photon, tốc độ dòng

- Hướng: Có sự đa dạng rất lớn giữa các môi trường sống khác nhau theo hướng chiếu sáng

- Quang kỳ: mô tả sự khác nhau đều đặn theo chu kỳ ngày đêm và sự thay đổi độ dài ngày theo mùa

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, việc chiếu sáng có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng của tế bào, mô thực vật và sự sinh tổng hợp chất biến

dưỡng sơ cấp và thứ cấp (Ouyang et al., 2003) Năng lượng bức xạ có ảnh hưởng

quan trọng lên hình thái và hoạt động của thực vật bao gồm khả năng quang hợp, tham gia vào nhịp độ nội sinh, định hướng về không gian (quang kích thích, tính hướng dương, tính hướng sáng và tính hướng quang động) và thời gian (quang kỳ, nhịp thời gian)

o Sự chiếu sáng với cường độ và chất lượng phổ ánh sáng khác nhau lên sự sinh trưởng và phát triển của cây:

- Ánh sáng trắng: tổng hợp các loại ánh sáng có bước sóng khác nhau (từ 400 –

800 nm) Trong nuôi cấy dịch huyền phù của Perilla frutescens, sự chiếu ánh sáng

trắng với cường độ 27,2 W.m-2 trong suốt thời gian nuôi cấy rất hiệu quả và lượng

anthocyanin được tạo ra gấp 2 lần so với không chiếu sáng (Zhong et al., 1991)

- Ánh sáng đỏ (700 – 780 nm)/đỏ xa (trên 750 nm): kéo dài rễ và kéo dài lóng

thân Trong nuôi cấy lông rễ của Artemisia annua L sinh khối lông rễ và hàm

lượng artemisia dưới ánh sáng đỏ cao hơn 17 đến 67% so với dưới ánh sáng trắng

(Wang et al., 2001)

- Ánh sáng xanh: thúc đẩy sự sinh trưởng của mô sẹo và ức chế sự kéo dài lóng

thân (Khattak et al., 2004)

- Ánh sáng xanh lục và tia UV gần: bước sóng UV gần (200 – 380 nm) và xanh lục

có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật do tác động đến quang hợp và sự phát triển bình thường của cây

1.2.1.2 Vai trò của ánh sáng trong phát sinh hình thái thực vật

Trong điều kiện tối, cây phát triển theo chương trình “skotomorphogensis”, chẳng hạn như kéo dài chồi, có rất ít hay không có lá mầm và lá thật, bị vàng hóa Cường độ ánh sáng: từ 1000 – 2500 lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô, với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng chồi chậm lại nhưng thúc đẩy quá trình tạo rễ Theo Ammirato (1987) ánh sáng tham gia vào sự phát sinh và phát triển của phôi soma

Quang phổ ánh sáng: được nhiều tác giả nghiên cứu như Pierik (1987)…Ảnh hưởng của loại ánh sáng được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của các loại ánh sáng khác nhau lên thực vật

Loại ánh

sáng

Ký hiệu Bước

sóng (nm)

Tác động

Da cam 640

610

Quang hợp cực đại (635 nm) do được chlorophyll hấp thụ cực đại Nảy mầm (660 nm)

Mở lá Hình thành nụ hoa

UV – B 280 Không tốt cho quang hợp (ở cường độ

cao); làm tổn thương các mô thực vật

UV - C 100 Cây chết ngay lập tức

1.2.1.3 Vai trò của ánh sáng trong vi nhân giống

Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật nuôi cấy mô Hiện nay, ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm nuôi cây mô

Ánh sáng góp phần tạo rễ và chồi bất định của đoạn cắt Sự phát sinh hình thái thực vật bị ảnh hưởng bởi các nhân tố môi trường như nhiệt độ, CO2, chất dinh dưỡng, chất lượng ánh sáng, thời gian và cường độ chiếu sáng Debergh và cộng sự (1991) đã chứng minh rằng cường độ ánh sáng ảnh hưởng kích thước lá, thân và sự hình thành sắc tố của cây con

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng đến quang hợp (Kim at el., 2004) và các

quá trình sinh tổng hợp và phát triển của cây như nảy mầm, ra hoa (Taiz and Zeiger, 2002), sự đóng mở khí khổng (Taylor and Assmann, 2001)

1.2.2 Quang phát sinh hình thái ở thực vật

Quang phát sinh hình thái là những thay đổi về hình dạng và chức năng của một cơ quan dưới những thay đổi trong môi trường chiếu sáng Quang phát sinh hình thái bao gồm sự phân hóa lục lạp, tích tụ diệp lục và phát triển lá Quá trình phát sinh hình thái có thể được cảm ứng bởi ánh sáng đỏ, đỏ xa, ánh sáng xanh Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến phát sinh hình thái thực vật thông qua các quang thụ thể, ở thực vật có ít nhất 3 loại quang thụ thể có độ hấp thụ với các ánh

sáng quang phổ khác nhau

1.2.2.1 Phytochrome (650 – 680 nm; ánh sáng đỏ/đỏ xa)

Là một homodimer, trong đó mỗi phân tử protein xác định có trọng lượng khoảng 125 kDa với 1128 amino acid, nối với một phân tử hấp thu ánh sáng khác (rhodopsin) Ở thực vật có 5 phytochrome là PhyA, PhyB, PhyC, PhyD, PhyE với chức năng khác nhau

Các phytochrome hiện diện trong 2 dạng có thể chuyển đổi qua lại:

o PR khi nó hấp thu ánh sáng đỏ (R; 660 nm)

o PFR khi nó hấp thu ánh sáng đỏ xa (FR; 730 nm)

o PR hấp thu ánh sáng đỏ chuyển đổi thành PFR

o PFR hấp thu ánh sáng đỏ xa chuyển thành PR

o Trong tối, PFR chuyển ngay thành PR

Ánh sáng mặt trời giàu tia đỏ hơn tia đỏ xa, do vậy khi mặt trời lặn tất cả các phytochrome đều ở dạng PFR, đây là dạng hoạt động sinh lý học có thể ảnh hưởng

đến hoạt tính của các enzyme và sự biểu hiện gen Trong suốt ban đêm, PFR phần lớn chuyển thành PR và một phần bị phá hủy, không thể tách riêng 2 dạng PR và

PFR

 Chức năng của phytochrome:

Đáp ứng ánh sáng và quang kỳ của thực vật như phân hóa lục lạp từ proplastid, nảy mầm hạt, kéo dài thân và ra hoa Là nhân tố trung gian trong sự đáp ứng ức chế kéo dài trục hạ diệp của ánh sáng xanh, khi đó PhyA có thể hoạt động như một thụ quan của ánh sáng xanh, điều khiển quá trình mở rộng lá mầm dưới sự cảm ứng của ánh sáng xanh

Kiểm soát sự biểu hiện gen: phytochrome kiểm soát sự phiên mã một số gen bao gồm tiểu phần nhỏ rubisco, protein gắn kết với chlorophyll a hay b và enzyme

ly giải phenylalanine ammonia Dưới ánh sáng đỏ, tốc độ phiên mã của tiểu phần nhỏ rubisco có thể tăng lên 20 lần

1.2.2.2 Các thụ quan nhận ánh sáng xanh gồm cryptochrome (340 – 520 nm; ánh sáng xanh UV – A), phototropin

 Cryptochrome: hiện diện hầu hết thực vật bậc cao với sự đa dạng về số lượng và

kiểu loại Ở thực vật nó hiện diện trong cây hai lá mầm, cây một lá mầm, dương xỉ,

rêu và tảo

Hầu hết các cryptochrome thực vật là các protein 70 – 80 kDa, cryptochrome là một flavoprotein của nhân, khác với phytochrome được chuyển từ nhân do áp lực của ánh sáng, được xác định bởi phổ hoạt động của nó, là thụ quan ánh sáng xanh giống như photoplyase, một enzyme có chức năng sửa chữa sai hỏng DNA dưới tác

dụng của ánh sáng (Gressel, 1979)

Chức năng của cryptochrome có hoạt tính sinh hóa, nhưng sự biểu hiện gene cryptochrome lại được điều hòa bởi ánh sáng bằng các cơ chế khác nhau từ sự

phiên mã cho đến sự thoái hóa

 Phototropin: được xác định ở nhiều loại thực vật khác nhau từ tảo xanh

Chlamydomonas reinhardtii cho đến các loài thực vật bậc cao (Briggs et al., 2001)

Phototropin được biết như là một protein liên kết với màng sinh chất có trọng

lượng 1200 kDa

Chức năng: là một họ quang thụ quan flavoprotein mới, điều khiển không chỉ

sự quang hướng động ở thực vật mà còn tích lũy lục lạp, sự mở khí khổng

1.2.2.3 Thụ quan hấp thu tia cực tím ở thực vật

Tia cực tím làm tổn thương các tế bào thực vật, do vậy các tế bào tổng hợp các chất bảo vệ như flavonoid trong biểu bì và lớp siêu dính trong cutin, những đáp ứng này được kích thích bởi tia UV – B

1.2.3 Những thành tựu đạt được khi sử dụng ánh sáng trong nuôi cấy mô thực vật

Các nghiên cứu của Wheeber và cộng sự (1991) cho thấy sự giảm chiều dài

thân của cây đậu nành khi cung cấp ánh sáng xanh

Grimstad (1991) so sánh ảnh hưởng sự ảnh hưởng của 6 loại đèn huỳnh quang khác nhau lên sự tăng trưởng và phát triển của rau diếp trong nuôi cấy mô thấy rằng

có sự khác biệt về trọng lượng khô và tạo lá Trọng lượng khô và hàm lượng

chlorophyll trong lá cao khi sử dụng ánh sáng đỏ, xanh cũng như đỏ xa

1.2.4 Một số nguồn chiếu sáng nhân tạo sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Năm 1870, Edison đã chế tạo ra bóng đèn sợi tóc, tạo tiền đề cho hàng loạt những cải tiến và phát minh sau này, ra đời nhiều loại nguồn sáng nhân tạo với chất lượng và kiểu dáng đa dạng Có thể phân làm 3 loại: đèn sợi đốt, đèn huỳnh quang, đèn phát quang

Trong các nguồn sáng nhân tạo hiện nay có 6 nguồn sáng chủ yếu dùng trong nuôi cấy mô là: đèn nóng sáng, đèn thủy ngân cao áp, đèn thủy ngân không cần ballast, đèn halogen kim loại, đèn natri cao áp và đèn huỳnh quang Ngoài ra, còn

có đèn xenon và đèn natri cao áp

 Một số loại đèn dùng trong nuôi cấy mô:

Đèn phóng điện vô cực/đèn vi sóng (Electrodeless discharge lamp/ Microwave – powered lamp)

Đèn đi – ốt laser (Laser diode divide, LD)

Đèn đi – ốt phát quang (light – emitting diodes): là nguồn sáng bán dẫn, cung cấp lượng ánh sáng đơn sắc khi cho dòng điện một chiều đi qua

Đèn LED có thể phát ra ánh sáng có màu khác nhau gồm trắng, xanh đậm, xanh lơ, xanh lục, vàng, hổ phách, cam, đỏ tươi, đỏ sẫm

Ưu điểm của LED: tuổi thọ cao (từ 6000 – 100000 giờ), năng suất năng lượng cao, năng lượng tiêu thụ nhỏ tiết kiệm chi phí và hiệu quả, đa dạng về màu sắc, không phát ra tia UV và phát rất ít tia hồng ngoại, ít tạo nhiệt, hầu như không làm nóng môi trường xung quanh, do đó giảm thiểu nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh

để tạo điều kiện cho cây sinh trưởng Độ bền cao, kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế Nhược điểm duy nhất là giá thành khá cao

1.3 Môi trường nhân giống in vitro

1.3.1 Nước

Nước chiếm hơn 90% trong mô thực vật, nước là dung môi tan các chất dinh

dưỡng cần thiết cho thực vật ngườn nước trong nhân giống in vitro là nước cất

hoặc nước máy

1.3.2 Nguồn carbohydrate

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô vả tế bào thực vật tổng hợp nên

các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose

Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy nồng độ sucrose có thể ảnh hưởng đến tố độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy

1.3.3 Các nguyên tố khoáng

1.3.3.1 Khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính như: N,P, K

 Đạm (N)

Giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân là rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu cây sinh trưởng kém, cằn cỗi,…Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau:

- CO(NH2)2 : Urea (46% N)

- (NH4)2SO4 : Ammonium sulphate tức SA (22% N)

- KNO3 : Potassium nitrate (14% N)

- NH4NO3 : Ammonium nitrate (34% N)

- NaNO3 : Sodium nitrate (16,4% N)

- Ca(NO3)2 : Calcium nitrate (15,5% N)

 Lân (P)

Giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thụ đạm được dễ dàng Lân giúp cây ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng, … Các chất có thể cung cấp Lân như:

- Super Lân : (20% P2O5)

- (NH4)2HPO4 : Diamonium hydrogen phoshate (46% P2O5)

- (NH4)3HPO4 3H2O :Triamonium hydrogen phosphate (15,21% P)

- KH2PO4 : Potassium phosphate (10,35%P)

 Potassium (K)

Tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, đứng thẳng, giúp cây ra hoa … Các chất cung cấp potassium như:

- KCl : Potassium chlorur (60% K2O)

- K2SO4 : Potaasium sulphate (48% K2O)

- KNO3 : Potassium nitrate (44% K2O)

- KH2PO4 : Potassium phosphate (40% K2O)

cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được Các chất cung cấp Ca như:

- CaCl2 : Calcium chlorur

- Ca(NO3)2 : Calci nitrate

 Magnesium (Mg)

Thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây Nếu dư Mg lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị khô héo Thiếu Mg bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân

lá èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá

 Sulfur (S)

Thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng Thường S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4 Thiếu S thì cây lan cằn cỗi, lá bị vàng như bị thiếu đạm, cây trở nên èo uột, ốm yếu

 Đồng (Cu)

Thiếu Cu dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc

Lá bạc tái mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi khô héo Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây

 Kẽm (Zn)

Giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu Nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây đồng thời giảm tưới lân

Các chất điều hòa sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

1.3.5 Nhóm auxin

Môi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: acetic acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA) IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật: còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) không có tác dụng Những auxin có hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) hoặc p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methy1-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amini-3,5,6- trichloropicolinicacid (picloram), và 3,6-dichloro 2-

1H-indole-3-methoxybenzoic acid (dicamba) Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các phytohormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng Mặc dù, những chi tiết ở mức độ phân tử về hoạt động của auxin vẫn chưa được biết nhiều, nhưng một số nghiên cứu về di truyền và phân tử

đã cung cấp những kết quả mới thú vị Trong những năm qua, một số gene mã hóa cho các protein liên kết auxin (auxin binding proteins) đã được tạo dòng (cloning)

và khảo sát các đặc điểm của chúng, và thông tin mới về gene cảm ứng auxin (auxin-induced gene) cũng đã thu được Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+ trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gene và kích thích quá trình tạo rễ

Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường dùng trong nuôi cấy

mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là

2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,… Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin Sự áp dụng loại nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu

- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy

- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy

- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh

Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào… Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các phytohormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu

thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Nói chung các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng (Razdan, 1994)

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy

mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric acid) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin được khái quát dưới đây:

- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chối nách vẫn bị ức chế sinh trưởng cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác là ethylene Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô

- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

(2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6amine (kinetin), và methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

6-(4-hydroxy-3-Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tình giống cytomkinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea Hiệu quả đặc biệt của các hợp chất gốc urea lên sự sinh trưởng của mô thực vật cần phải được nghiên cứu thêm

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các nuôi cấy đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại

sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi nách Vấn đề quan trong không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 24-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 Cơ chế hoạt động của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù mặc dù

có một số kết quả về sự có mặt của các hợp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyến (transfer RNA) Các cytokinin cũng có hoạt tính tổn hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các mô nhất định

Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi Trong cơ thể sống lhông có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia

tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa

Trong tự nhiên cũng tồn tại một phytohormone phân bào khác, Letham là người đầu tiên đã phân lập, tinh chế và cho kết tính thành công phytohormone phân bào tự nhiên đó từ nộ nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea: ngô)

Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là 6-benzylaminopurine (BAP) Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều

so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất

Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi, … Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như sau:

- Kích thích phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

- Làm tăng diện tích là do kích thích sự lớn lên của tế bào

- Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài

- Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao)

- Ức chế sự hình thành rễ

- Ức chế sự kéo dài chồi

- Ức chế quá trình già (hóa vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục

1.3.7 Gibberellin

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930 Lịch sử phát hiện nhóm phytohormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von Nam 1926,

xác định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra Đến những năm

30, mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin Mãi sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm

gibberellic acid Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật

là GA3 Trong đời sống thực vật gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật tác dụng của gibberellic acid chưa thật rõ ràng Nhiều tác giả có sử dụng

và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào

Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:

- Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạt chưa chín hoặc đang nảy mầm đều có chứa nhiều gibberellic acid

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin

- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tâu sau thu hoạch

- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi Năm đầu thân mầm nằm im, sau mùa dông mầm hoa kéo dài đốt rất nhanh và phân hóa hoa

- Ức chế sự hình thành rễ bất định

- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt ngũ cốc nảy mầm, giúp tiêu hóa các chất dự trữ trong nội nhũ để nuôi mầm cây

- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ)

- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt

- Có thể làm chậm sự hóa già ở lá và quả cây có múi

1.3.8 Abscisic acid (ABA)

ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồu, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định

Trong nuôi cấy mô và tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loại loài thực vật

Các tác dụng cơ bản cùa ABA là:

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ta sự nứt quả

- ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây triồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng

- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và lam chậm sự nảy mầm của hạt

- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành

- Gây ra sự đóng khí khổng

1.3.9 Ethylene

Các chức năng cơ bản của ethylene:

- Gây già hóa lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Làm chín quả

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hóa, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

- Điều khiển sự chín của một số loại quả

- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một

số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene

- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hóa của hoa và lá

1.3.10 Nước dừa và một số dịch chiết thường dùng

 Nước dừa

Nước dừa là nguồn cung cấp đạm dồi dào thành phần chứa nhiều acid amin, acid hữu cơ Ngoài ra, nước dừa còn chứa nhiều carbohydrate như sucrose, glucose

và fructose Môi trường chứa auxin và 10-20% nước dừa giúp sự phân chia của các

tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo) người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của chất có hoạt tính trong nước dừa nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh chứa zeatin (Letham, 1974)

Khi nuôi cấy lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegaty, 1955; Niimoto and Sagawa, 1961) Với Dendrobium, nước dừa không ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của phôi ở các giai đoạn đầu nảy mầm (Kotomori and Murashige, 1965) Một trường hợp khác, phôi Phalaenopsis lại tăng sinh mô sẹo và chầm phát sinh cơ quan khi bổ sung nước dừa vào môi trường (Ernst, 1967)

1.3.11 Than hoạt tính

Trước đây, than hoạt tính (Activated charcoal-AC) thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí và các chất lỏng Hiện nay, AC đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ có tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật vai trò cùa AC trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenol, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỷ lệ thành phần các chất có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường

1.3.12 Chất làm đông (giá thể)

Trong nuôi cấy mô thực vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể

để nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường nguyên liệu phổ biến nhất tron nuôi cấy mô là agar; người ta hòa tan agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên60ᵒ C) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng Ngoài ta tùy thuộc từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy lọc, vải, một số màng nhân tạo

Agar là một polysaccharide có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có những tác

động sinh lý trên mô thực vật Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al, 1991; Debergh 1983; Halquist et

al, 1983) Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường do các chất cặn trong agar gây nên Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel

và tan ra ở nhiệt độ 60-100ᵒC, đặc biệt khi nhiệt độ 35ᵒC vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường độ cứng của agar quyết dịnh bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường

1.4 Giới thiệu về lan Oncidium

1.4.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Phong lan vũ nữ (Oncidium) là một loài hoa lan có khoảng 700 loài phân bố rất

rộng ở Bắc bán cầu từ Mexico đến Tây Ấn Độ và Nam bán cầu tới tận Bolivia,

Paraguay Đa số các loài hoa thuộc chi Oncidium đều có giả hành dẹp hay hình trụ,

hoa thường nhỏ nhưng đặc biệt có cánh môi rất lớn, hoa thường có màu vàng và có

điểm đốm nâu trên cánh hoa, ngoài ra một số loài Oncidium khác hoa có màu nâu,

đỏ… chúng có thể mọc thành chùm và đôi khi có phân nhánh, cành hoa rất dài có thể dài khoảng 80 – 120 cm

dài hoặc ngắn, mỗi dò mang từ 30 đến 100 hoa và có nhiều giống kích thước hoa lớn 4 – 5 cm Có biên độ sinh thái khá rộng, nhiệt độ thích hợp phát triển từ 15 – 350C

 Rễ

Rễ mảnh mai, thân rễ bò dài hay ngắn khi sống ở đất Thông thường rễ mọc dưới các nách lá cuối cùng đâm sâu xuống đất hay giá thể, rễ mọc thành đám rối dầy đặc đan xen nhau lộn xộn

 Thân

Thuộc nhóm đa thân còn gọi là nhóm hợp trục Thân lan có thể ngắn hay kéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân vừa có giả hành, giả hành là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nước để nuôi cây

 Giả hành

Là những đoạn phình, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhầy làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi cây sống bám trên cao Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được Giả hành có nhiều hình dạng như: Hình cầu, thuôn dài, hình trụ xếp trồng lên nhau

 Lá

Hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng, lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng, dạng lá mềm mại, có màu xanh bong, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây Các lá mọc song song nhau và ôm lấy thân

 Hoa

Hoa gồm ba cánh đài và ba cánh tràng Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hay cánh đài lưng dài hơn cánh đài bên Ba cánh tràng có hai cánh bên rất giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng giữa còn được gọi là cánh môi, có màu sắc sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn

Cánh môi có các hình dạng như: Chia thùy, khía răng, có tua viền hay chia thành các sợi mảnh Oncidium thường nở hoa vào mùa xuân hay mùa hạ cũng có những cây nở vào mùa thu

 Quả

Đều có quả thuộc loại quả nang Khi hạt chín, các nang bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra nên hạt chỉ có thể

ra khỏi vỏ khi quả mục nát

Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt, nên hạt có kích thước rất nhỏ Sau 8 – 12 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió Khi gắp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp thì hạt sẽ nảy mầm

1.4.4 Điều kiện sinh thái của lan Ocidium

 Ánh sáng

Những giống lá to và dày cần nhiều ánh sáng hơn là những giống lá nhỏ và mềm Cường độ ánh sáng khoảng 50% ánh sáng, ánh sáng yếu hơn cây vẫn phát triển tốt như thân, lá xanh đẹp, tuy nhiên cho hoa kém Để cây ra hoa tốt cần 70 % ánh sáng

 Nước

Nước rất quan trọng để cho cây tăng trưởng, nếu thiếu nước cây sẽ không phát triển và có thể bị chết khô Nhìn thấy thân hay lá của cây mỏng manh nhăn nheo là cây bị thiếu nước Còn quá nhiều nước cây sẽ bị ngập úng có thể thối rễ hoặc không có dấu hiệu sinh trưởng phát triển

Nước duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng, nếu giữ khô ráo giữa các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cho cây cứng cáp hơn

Chế độ tưới nước cần cung cấp cho cây là khoảng 2 – 3 ngày tưới nước một lần, tùy thuộc vào điều kiện thời tiết từng ngày, từng mùa trong năm Vào mùa đông

trời rét, cần giảm số lần nước tưới Nước tưới cần phải sạch sẽ, tránh nguồn nước ô nhiễm sẽ làm chết cây

 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Sâu bệnh hại chủ yếu trên nhóm lan vũ nữ:

- Ốc: Phòng trừ bằng cách sử dụng Deadline 40 (nồng độ theo khuyến cáo), Dioto

- Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra Vết bệnh có

hình dạng bất định, úng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng lá Gặp thời tiết ẩm ướt mô bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám, sử dụng 1 trong 3 hỗn hợp: Saipan + Mexyl.MZ, Saipan + Alpine, Mexyl.MZ + Alpine

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm thực hiện đề tài

Đồ án tốt nghiệp được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Môi trường và CNSH, Trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Tp HCM

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chồi lan Oncidium Kozumit Delight, hoàn toàn khỏe mạnh cao khoảng 2cm

2.2.2 Hóa chất và môi trường

 Môi trường nuôi cấy

Đề tài thực hiện nhân chồi trên môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) Môi trường nuôi cấy: 2 lớp lỏng và rắn là môi trường cơ bản

 Dụng cụ pha môi trường và khử trùng

Cân phân tích có tải cân từ 0,0001g đến 250g

Khay đựng mẫu cấy

Bình nuôi cấy bằng thủy tinh dung tích 250ml, 500ml

2.2.4 Điều kiện trong phòng thí nghiệm

Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ ngày

Cường độ ánh sáng: 2.500 – 3.000 lux

Nhiệt độ: 25 ± 2oC

Độ ẩm trung bình: 75 – 80%

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Cách pha môi trường

 Môi trường MS rắn:

Hút chính xác các Stock của môi trường MS, dung dịch NAA, BA và nước dừa Cân chính xác đường, một số hợp chất hữu cơ bổ sung, agar Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất rồi định mức chính xác đến thể tích đã định sẵn Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH = 5,7 – 5,8 bằng NaOH (1N), hoặc HCl (1N) Môi trường được chuẩn bị và hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm, trong vòng 20 phút

Môi trường sau khi hấp sẽ được trữ ở phòng lạnh ≥ 48h sẽ đem cấy

 Môi trường MS lỏng:

Hút chính xác các Stock của môi trường MS, dung dịch NAA, BA và nước dừa Cân chính xác đường, than hoạt tính, một số hợp chất hữu cơ bổ sung Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất rồi định mức chính xác đến thể tích đã định sẵn

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH = 5,7 – 5,8 bằng NaOH (1N), hoặc HCl (1N) Môi trường được chuẩn bị và hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm, trong vòng 20 phút

Môi trường sau khi hấp sẽ được trữ ở phòng lạnh ≥ 48h sẽ đem cấy

 Môi trường MS hai lớp:

Là sự kết hợp môi trường MS lỏng Va MS rắn, sau khi pha xong hai môi trường

MS lỏng và rắn đả hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm, trong vòng 20 phút, ta để môi trường nguội lại ta cho 30ml MS lỏng vào 40ml MS rắn ta có được 70ml môi trường MS hai lớp

2.3.2 Thiết kế thí nghiệm chiếu sáng

Trong thiết kế hệ thống chiếu sáng, đầu tiên chúng tôi tạo những buồng tối có kích thước 38 x 40 x 25 cm (tương ứng lần lượt là chiều rộng, chiều cao, chiều dài)

Hệ thống buồng tối phải kín, đảm bảo không có sự ảnh hưởng của ánh sáng ngoài tự nhiên đến kết quả nghiên cứu

2.3.2.1 Thiết kế hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng đèn LED đơn sắc

Chúng tôi sử dụng 2 dây đèn LED trên mỗi buồng nuôi cấy, bố trí 2 dây đèn theo dạng song song, cách đều nhau (hình 2.1)