Khảo sát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật imidacloprid và azoxystrobin trong lá và rễ cây đinh lăng – polyscias fruticosa (l ) harms ở cần thơ, an giang và đồng tháp

Nhưng lại ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng, cần phải có biện pháp thích hợp để hạn chế dư lượng thuốc BVTV còn tồn tại trên cây như là kéo dài thời gian thu hoạch, sử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

MÃ SỐ: 52720401

KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ

THỰC VẬT IMIDACLOPRID VÀ

AZOXYSTROBIN TRONG LÁ VÀ RỄ CÂY

ĐINH LĂNG – Polyscias fruticosa (L.) Harms

Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP

Cần Thơ, năm 2017

Sinh viên thực hiện

VÕ THỊ TUYẾT TRÂM MSSV: 12D720401171 LỚP: ĐẠI HỌC DƯỢC 7B Cán bộ hướng dẫn

Ths NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ và giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác Để hoàn thành khóa luận này, lời đầu tiên em xin chân thành cám ơn và tri ân sâu sắc đối với Ban Giám hiệu nhà trường, lãnh đạo Khoa Dược – Điều dưỡng và Thầy Cô bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm trường Đại học Tây Đô đã giúp đỡ và cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian làm khóa luận Và đặc biệt em xin chân thành cám ơn Thầy Ths Nguyễn Phước Định đã quan tâm giúp đỡ, nhiệt tình hướng dẫn em hoàn thành tốt khóa luận này

Trong quá trình làm khóa luận cũng như quá trình làm báo cáo khó tránh khỏi những sai sót, rất mong các Thầy Cô bỏ qua Do trình độ lý luận, kinh nghiệm thực tiễn và thời gian còn hạn chế nên bài báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm hoàn thành tốt báo cáo và đạt được những kết quả tốt nhất

Ngoài ra, không thể không kể đến những người bạn của em, cám ơn các bạn đã ở bên cạnh em, cùng em vượt qua các khó khăn và làm cho khoảng thời gian làm khóa luận của em trở nên ý nghĩa và khó quên

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn và kính chúc Quý Thầy/Cô được nhiều sức khỏe và đạt nhiều thành công trong sự nghiệp cao quý Kính chúc Quý nhà trường đạt được nhiều thành công trong công tác giáo dục

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Khóa học: 2012 – 2017

KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT IMIDACLOPRID VÀ

AZOXYSTROBIN TRONG LÁ VÀ RỄ CÂY ĐINH LĂNG – Polyscias fruticosa

(L.) Harms Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP

TÓM TẮT Mục tiêu: khảo sát dư lượng thuốc BVTV với hai hoạt chất imidacloprid và

azoxystrobin trong dược liệu lá và rễ của cây Đinh lăng lá nhỏ - Polyscias fruticosa

(L.) Harms, Họ Nhân Sâm Nhằm đảm bảo an toàn về sức khỏe cho người tiêu dùng đồng thời kiểm soát chất lượng nguồn dược liệu trong nước và xuất khẩu

Đối tượng nghiên cứu: dược liệu tươi, khô của lá và rễ Đinh lăng lá nhỏ - Polyscias

fruticosa (L.) Harms, Họ Nhân Sâm ởCần Thơ, An Giang và Đồng Tháp

Phương pháp nghiên cứu: khảo sát dung môi chiết có khả năng chiết tối đa dư lượng

hai thuốc BVTV, đồng thời tối thiểu tạp chất và sử dụng phương pháp loại tạp sơ bộ Sau đó tiến hành phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò UV/Vis để xác định đồng thời hai hoạt chất trong dược liệu tươi, khô của lá và rễ Đinh

lăng lá nhỏ - Polyscias fruticosa (L.) Harms, Họ Nhân Sâm

Kết quả: qua quá trình phân tích sơ bộ có một số mẫu ở ba tỉnh Cần Thơ, An Giang và

Đồng Tháp có phát hiện hai thuốc BVTV với hàm lượng khác nhau nhưng đều nằm dưới mức dư lượng tối đa cho phép của rau ăn hằng ngày

Kết luận: qua kết quả có thể thấy hiện nay dược liệu sạch rất hiếm Đa phần các nơi

trồng đều sử dụng thuốc BVTV để hạn chế sâu bệnh giúp tăng năng suất cho cây trồng Nhưng lại ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng, cần phải có biện pháp thích hợp để hạn chế dư lượng thuốc BVTV còn tồn tại trên cây như là kéo dài thời gian thu hoạch, sử dụng thuốc đúng nồng độ, đúng cách, áp dụng các phương pháp truyền thống để phòng trừ sâu bệnh như các loài thiên địch…Tất cả sản phẩm đến tay người tiêu dùng cần phải được kiểm soát chặt chẽ về dư lượng thuốc BVTV đối với cây trồng nói chung và dược liệu nói riêng

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH……… i

DANH MỤC BẢNG……….ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT.……… …….iii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN NỘI DUNG ĐỀ TÀI 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐINH LĂNG 3

2.1.1 Tổng quan thực vật 3

2.1.2 Thành phần hóa học 7

2.1.3 Tác dụng dược lý 9

2.2 GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 11

2.2.1 Khái niệm thuốc BVTV 11

2.2.2 Phân loại thuốc BVTV 12

2.2.3 Mức dư lượng tối đa trong dược liệu 12

2.2.4 Imidacloprid 13

2.2.5 Azoxystrobin 14

2.2.6 Ưu, nhược điểm và vị trí của ngành thuốc BVTV hiện nay 16

2.3 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG thuốc BVTV 17

2.3.1 Tình hình sử dụng thuốc BVTV trên thế giới 17

2.3.2 Tình hình sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam 17

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THUỐC BVTV 18

2.4.1 Phương pháp truyền thống 18

2.4.2 Phương pháp QuEChERS 19

2.5 KỸ THUẬT SẮC KÝ HPLC/UV-VIS 21

2.5.1 Nguyên tắc 21

2.5.2 Cơ sở lý thuyết 22

2.5.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC 22

2.5.4 Ứng dụng của HPLC trong dược liệu 23

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

3.1.2 Chất chuẩn – Hóa chất – Dung môi 24

3.1.3 Trang thiết bị 24

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.2.1 Lựa chọn phương pháp 25

3.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 25

3.2.3 Khảo sát dung môi chiết: 27

3.2.4 Khảo sát phương pháp làm sạch mẫu thử 28

3.2.4.1 Loại tạp bằng SPE (chiết pha rắn) 29

3.2.4.2 Loại tạp bằng sắc ký cột cổ điển 29

3.2.4.3 Loại tạp bằng than hoạt tính 30

3.2.5 Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch 30

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 30

3.3.1 Tính phù hợp hệ thống 30

3.3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 32

3.3.3 Tính đặc hiệu 31

3.3.4 Tính tuyến tính 31

3.3.5 Độ chính xác 32

3.3.6 Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) 32

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT MẪU HCBVTV TRONG DƯỢC LIỆU RỄ, LÁ ĐINH LĂNG TƯƠI VÀ KHÔ 34

4.1.1 Khảo sát dung môi chiết mẫu 34

4.1.2 Khảo sát phương pháp loại tạp 35

4.1.2.1 Chiết lỏng – lỏng 35

4.1.2.2 Chiết lỏng – lỏng và than hoạt 36

4.1.2.3 Chiết lỏng – lỏng và silicagel 37

4.1.3 Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch 38

4.2 QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI THUỐC BVTV BẰNG HPLC/UV-VIS 39

4.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 40

4.3.1 Tính phù hợp hệ thống 40

4.3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 42

4.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT DƯ LƯỢNG HAI THUỐC BVTV TRÊN CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ ĐỒNG THÁP 42

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV Ở CẦN THƠ, AN GIANG VÀ

ĐỒNG THÁP 44 5.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV 44 5.3 VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV TRONG CÂY ĐINH LĂNG LÁ NHỎ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Đinh lăng lá nhỏ 4

Hình 2.2 Đinh lăng lá tròn 4

Hình 2.3 Đinh lăng đuôi phượng 5

Hình 2.4 Đinh lăng lá xoan xẻ 5

Hình 2.5 Đinh lăng lá trổ 6

Hình 2.6 Đinh lăng lá đĩa 6

Hình 2.7 Sơ đồ chiết thuốc BVTV theo QuEChERS 20

Hình 2.8 Cấu tạo HPLC 22

Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị mẫu dược liệu tươi 26

Hình 3.2 Sơ đồ chuẩn bị mẫu dược liệu khô 27

Hình 4.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết 34

Hình 4.2 Kết quả khảo sát loại tạp bằng chiết lỏng – lỏng 36

Hình 4.3 Kết quả khảo sát loại tạp bằng than hoạt 37

Hình 4.4 Kết quả khảo sát loại tạp bằng silicagel 37

Hình 4.5 Kết quả độ thu hồi của hai thuốc BVTV trên rễ Đinh lăng 39

Hình 4.6 Kết quả độ thu hồi của hai thuốc BVTV trên lá Đinh lăng 39

Hình 4.7 Kết quả sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tóm tắt những tác dụng dược lý quan trọng của Đinh lăng tương tự Sâm

Việt Nam 11

Bảng 2.2 Nghiên cứu về độc tính cấp của imidaclorid 14

Bảng 2.3 Giới hạn tối đa dư lượng imidacloprid trong một số thực phẩm 14

Bảng 2.4 Nghiên cứu về độc tính cấp của azoxystrobin 15

Bảng 2.5 Giới hạn tối đa dư lượng azoxystrobin trong một số thực phẩm 16

Bảng 3.1.Thông tin về chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 4.1 Kết quả độ thu hồi của phương pháp chiết và làm sạch 38

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống với chất chuẩn imidacloprid 41

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống với chất chuẩn azoxystrobin 41

Bảng 4.4 Kết quả giới hạn định lượng 42

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát thuốc BVTV 43

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

của Liên hiệp quốc) FDA Food and drug administration (Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ) BVTV Bảo vệ thực vật

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

LD50 Lethal Dose (Liều chết trung bình)

LC50 Lethal Concentration (Liều chết trung bình khi hít phải)

LLE Liquid liquid extraction (Chiết lỏng – lỏng)

LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ Limit of quantification (Giới hạn định lượng)

MRL Maximum residue limit (Giới hạn dư lượng tối đa)

ppm Part per million (Phần triệu)

Rs Resolution (Độ phân giải)

RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SKLM Sắc ký lớp mỏng

SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn)

tR Retention time (Thời gian lưu)

UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại – khả kiến)

WHO Tổ chức Y tế thế giới

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước mà ngành nông nghiệp chiếm phần lớn Vì thế mà việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) để phòng trừ sâu, bệnh hại, chuột, mối mọt … là điều tất yếu Nó mang lại hiệu quả lớn đến việc tăng năng suất và chất lượng nông sản Hiện nay, ước tính trên thế giới có trên 5000 loại thuốc BVTV khác nhau Trong đó có khoảng 200 loại thuốc BVTV gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và độc hại cho môi trường Tuy cơ quan chức năng đã có hướng dẫn cụ thể cho người dân về vấn

đề sử dụng thuốc BVTV an toàn, hiệu quả trên cây nông nghiệp và cây ăn quả nhưng lại chưa có hướng dẫn cụ thể trên cây thuốc Nhưng việc sử dụng đúng cách còn tùy thuộc vào trình độ hiểu biết của người dân ở từng vùng miền Vì thế mà cần phải kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng thuốc BVTV an toàn và hiệu quả nhằm giảm tối đa các tác động nguy hại đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái Đây là vấn đề đang được quan tâm

Kiểm soát mức dư lượng thuốc BVTV trong thực phẩm nói chung và dược liệu nói riêng là việc làm cần thiết và cấp bách Đối với dược liệu là một sản phẩm nông nghiệp đặc biệt nên cần phải sử dụng thuốc BVTV để bảo vệ chất lượng và giúp tăng năng suất Dư lượng thuốc BVTV trong cây trồng là không cần thiết và nó là nguồn gây ô nhiễm nghiêm trọng Việc sử dụng này cần được kiểm soát về mức dư lượng thuốc BVTV trong sản phẩm, điều này cũng có ý nghĩa sàng lọc loại bỏ đi những sản phẩm không an toàn cho người sử dụng Đồng thời giúp kiểm soát được chất lượng nguồn dược liệu trong nước hoặc xuất khẩu

Từ lâu, dân gian đã biết dùng Đinh lăng để bồi bổ sức khỏe, chữa đau nhức xương khớp, tăng sức đề kháng cho cơ thể nên danh y Hải Thượng Lãn Ông đã gọi cây Đinh lăng lá nhỏ là “cây sâm của người nghèo” Chính vì có nhiều hoạt tính sinh học như vậy nên hiện nay Đinh lăng đang ngày càng được sử dụng phổ biến Nhưng đi kèm là vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đang ở mức báo động nói chung và dược liệu nói riêng Hiện nay trên Thế giới đã có rất nhiều phương pháp nghiên cứu xác định thuốc BVTV trên rau quả và hầu hết tất cả đều hướng đến một phương pháp xác định đồng thời nhiều HCBVTV trong cùng một lần phân tích Ở các nước phát triển như Anh,

Mỹ, Nhật Bản trong các dược điển đã có những qui định về mức dư lượng của thuốc BVTV trong thực phẩm và dược liệu Còn ở Việt Nam vẫn chưa có qui định cụ thể này nhưng cũng đã có một số tác giả nghiên cứu phân tích thuốc BVTV trên dược liệu mà chưa cụ thể trên dược liệu Đinh lăng

Nhằm để nâng cao chất lượng dược liệu và đảm bảo an toàn cho người sử dụng nên

chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Khảo sát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

Azoxystrobin và Imidacloprid trong lá và rễ cây Đinh lăng – Polyscias fruticosa

(L.) Harms ở Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp” với mục tiêu:

1 Xây dựng qui trình chiết xuất đồng thời hai thuốc bảo vệ thực vật azoxystrobin

và imidacloprid trong cây Đinh lăng

2 Định tính, định lượng đồng thời hai thuốc BVTV một cách nhanh chóng, chính xác bằng HPLC với đầu dò UV-Vis

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐINH LĂNG

2.1.1 Tổng quan thực vật

Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Thái Bình Dương, thuộc họ Araliaceae, chi Polyscias Chi này có gần 100 loài trên thế giới được phân bố rải rác nhưng nhiều nhất là ở vùng Thái Bình Dương Đa số cây cảnh thông dụng được trồng đều mang tên Đinh lăng nên rất dễ nhầm lẫn, chỉ có một số loài được dùng làm cây thuốc Loài Đinh lăng được sử dụng phổ biến nhất không chỉ làm cây cảnh, rau ăn mà còn là một vị thuốc nam được

biết đến hiện nay là Polyscias fruticosa (L.) Harms hay còn gọi là Đinh lăng lá nhỏ, cây gỏi cá hoặc nam dương lâm.(Đỗ Huy Bích và cs.,2004)

Đinh lăng đã được đưa vào Dược điển Việt Nam như một vị thuốc bổ, tăng lực, sinh thích nghi… Ngoài ra còn được nhiều nước trên thế giới sử dụng như: Trung Quốc, Liên Xô, Ấn Độ và nhiều nước trên thế giới sử dụng với chức năng giải độc, kháng khuẩn, kháng viêm…

Theo điều tra của Trung tâm Sâm Việt Nam ở các tỉnh phía Nam, Đinh lăng có 6 loài:

(Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007)

Polyscias fruticosa (L.) Harms (Đinh lăng hương, Đinh lăng lá xẻ, cây gỏi cá) Polyscias balfouriana Bailey (Đinh lăng lá tròn, Đinh lăng lá xà cừ)

Polyscias filicifolia (Merr et Fourn) Bailey (Đinh lăng đuôi phượng, Đinh lăng

lá rách)

Polyscias guilfeylei var licinita Bailey (Đinh lăng lá xoan xẻ, Đinh lăng lá xà

cừ nhỏ)

Polyscias guilfeylei (Cogh et March) Baylei (Đinh lăng lá trổ)

Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Đinh lăng đĩa)

Một số hình ảnh về các loài Đinh lăng:

Hình 2.1 Đinh lăng lá nhỏ

Hình 2.2 Đinh lăng lá tròn

Hình 2.3 Đinh lăng đuôi phƣợng

Hình 2.4 Đinh lăng lá xoan xẻ

Hình 2.5 Đinh lăng lá trổ

Hình 2.6 Đinh lăng đĩa

Ngoài ra còn có Aralia chinensis L Araliacea – Đinh lăng Trung Quốc có ở rừng Đà

2.1.2 Thành phần hóa học

Theo Ngô Ứng Long và cộng sự thuộc Viện Y học Quân sự: rễ và lá của Đinh lăng có chứa saponin, alkaloid, glucosid, flavonoid, tanin, vitamin B1, B2, B6, C, phytosterol, acid hữu cơ, tinh dầu, nhiều nguyên tố vi lượng, các acid amin như lysin, cystein, methionin là những acid amin không thể thay thế được và 21,1 % đường (Đỗ Tất Lợi, 2004)

Võ Duy Huấn đã phân lập được một số saponin mới từ rễ và lá Đinh lăng

Ngoài ra, Trần Công Luận và cộng sự còn phân lập được 5 hợp chất polyacetylen

trong lá như: panaxydol, panaxynol, (8Z)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3-ol-10-on, (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-

diol Hai hợp chất sau chỉ thấy trong lá Đinh lăng mà chưa thấy trong cây khác thuộc chi Panax và họ Araliaceae Trong lá, còn có saponin triterpen (1,65 %) là một genin dạng oleanolic

Trong rễ, cũng tìm thấy 5 hợp chất polyacetylen nhưng chỉ có panaxydol, panaxynol,

1

HO 3

HO 3

2.1.3 Tác dụng dược lý (Nguyễn Thị Ánh Tuyết, 2009; Trần Cao Sơn, 2015)

Ở Việt Nam, các loài Đinh lăng được trồng rất nhiều và đa phần đều có thể sử dụng làm thuốc Nhưng có rất ít tài liệu nghiên cứu về tác dụng dược lý của từng loài Chỉ

có cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms là được nghiên cứu nhiều nhất về

thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý

Đinh lăng đã được các nhà nghiên cứu ở Liên Xô thử nghiệm tác dụng tăng lực và chống stress trên các phi công, nhà du hành vũ trụ và công nhân làm việc dưới môi trường có bức xạ siêu tần, tác nhân độc hại

Qua các nghiên cứu và thử nghiệm ở Việt Nam, Viện Y học quân sự cũng đã tìm được

rễ Đinh lăng làm tăng sức dẻo dai và sức đề kháng của cơ thể, chống mệt mỏi

Năm 1985, Ngô Ứng Long và cộng sự đã nghiên cứu độc tính của Đinh lăng cho thấy liều gây chết LD50 theo đường tiêm phúc mạc là 32,9 g/kg chuột Kết quả cho thấy với liều uống hằng ngày 60 g/kg, sau 3 ngày có hiện tượng chuột chết Như vậy, Đinh lăng rất ít độc Nếu so sánh với Nhân sâm về LD50 cùng tiêm phúc mạc là 16,5 g/kg thì Đinh lăng ít độc kém 2 lần Ở liều độc gây xung huyết ở gan, tim, phổi, dạ dày, ruột Saponin trong đinh lăng có thể gây huyết tán (vỡ hồng cầu) Ở người, uống quá nhiều Đinh lăng sẽ bị say, mệt mỏi, tiêu chảy Đồng thời Đinh lăng không gây tăng huyết áp như Nhân sâm

Các thí nghiệm trên chuột cho thấy, Đinh lăng có khả năng gây tăng tiết niệu trên năm lần so với người bình thường Làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ cao

tầng, kéo dài thời gian sống của chuột khi bị nhiễm kí sinh trùng sốt rét Plasmodium

berghei và làm tăng tác dụng của thuốc chống sốt rét cloroquin

Thực nghiệm trên người cho thấy, Đinh lăng làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội

và vận động viên thể thao Tác dụng tăng cân, tăng lực và bổ cũng đã được thực nghiệm trên người và chuột

Ngoài ra Đinh lăng giúp cơ thể người bị suy mòn, mới khỏi ốm nhanh chóng hồi phục, ăn ngon, ngủ tốt Dùng Đinh lăng nấu nước uống hằng ngày như thuốc bổ Các

hợp chất polyacetylen như: (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol trích từ cây

Panax vietnamensis và Polyscias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng chuẩn khuẩn

Gram dương, kháng nấm Candida albican nhưng không kháng được chủng khuẩn Gram âm

Từ năm 2000, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã nghiên cứu về cao phối hợp giữa

rễ và lá Đinh lăng (hay còn gọi Cao Đinh lăng), nhưng tập trung chủ yếu vào lá vì đây

là nguồn nguyên liệu dễ thu hái Dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm về tác dụng chống stress và trầm cảm Kết quả cho thấy Cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress ở mức liều 45 – 180 mg/kg thể trọng Ở khoảng liều này cũng có các tác dụng khác như: tăng lực, kích thích hoạt

động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch

Theo dân gian, Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ chữa suy nhược cơ thể, mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho ra máu, đau tử cung, làm thuốc lợi tiểu và chống độc Một số bài thuốc dân gian có sử dụng Đinh lăng:

Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 5 g Thêm 100 ml

nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2 - 3 lần uống trong ngày

Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau, tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh

lăng tươi (rễ, cành) 30 g, lá vỏ chanh 10 g, vỏ quýt 10 g, sài hồ (rễ, lá, cành) 20 g, lá tre tươi 20 g Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần trong ngày

Chữa sưng vú: cành lá Đinh lăng 30 – 40 g Thêm 300 ml, sắc còn 200 ml, uống

nóng Ngày uống 1 - 2 lần

Thuốc lợi sữa: lá Đinh lăng tươi 50 – 100 g, bong bóng lợn 1 cái, thái nhỏ, trộn với

gạo nếp, nấu cháo ăn

Chữa đau tử cung: cành và lá Đinh lăng rửa sạch, sao vàng, sắc uống thay chè

Chữa mẩn ngứa do dị ứng: lá Đinh lăng 80 g, sao vàng, đổ 500 ml nước sắc còn 250

ml uống trong ngày Dùng liên tục trong 2 – 3 tháng

Chữa thiếu máu: rễ Đinh lăng, hà thủ ô, thục địa, hoàng tinh, mỗi vị 100 g, tam thất

20 g Tán bột, sắc uống ngày 100 g

Chữa viêm gan mạn tính: rễ Đinh lăng 12 g, nhân trần 20 g, ý dĩ 16 g, hoài sơn, biển

đậu, rễ cỏ tranh, xa tiền tử, ngũ gia bì, mỗi vị 12 g, uất kim, nghệ, ngưu tất, mỗi vị 8 g Sắc uống ngày một thang

Chữa liệt dương: rễ Đinh lăng, hoài sơn, ý dĩ, hoàng tinh, hà thủ ô, kỷ tử, long nhãn,

cám nếp, mỗi vị 12 g Trâu cổ, cao ban long, mỗi vị 8 g Sa nhân 6 g Sắc uống, ngày một thang

Chữa sốt rét: rễ Đinh lăng, sài hồ, mỗi vị 20 g Rau má 16 g Lá tre, cam thảo nam,

mỗi vị 12 g Bán hạ sao vàng 8 g, gừng 6 g Sắc uống

Bồi bổ cơ thể, ngừa dị ứng: lá Đinh lăng tươi (150 – 200 g) đun sôi trong 200 ml

nước Sau khi đun sôi 5 – 7 phút, chắt ra để uống nước đầu tiên, đổ tiếp thêm khoảng

200 ml nước, nấu sôi lại lần thứ hai

Chữa tắc tia sữa: rễ Đinh lăng 40 g, gừng tươi 3 lát, đổ 500 ml nước sắc còn 250 ml,

chia làm hai lần uống trong ngày, uống khi thuốc còn nóng

Ho suyễn lâu năm: rễ Đinh lăng, bách bộ, đậu sắn, rễ cây dâu, nghệ vàng, rau tần dày

lá, mỗi vị đều 8 g Củ xương bồ 6 g, gừng khô 4 g, đổ 600 ml nước, sắc còn 250 ml, chia làm hai lần uống trong ngày, uống lúc còn nóng

Phong thấp, thấp khớp: rễ Đinh lăng 12 g, cối xay, hà thủ ô, huyết rồng, rễ cỏ xước,

thiên niên kiện tất cả 8 g Vỏ quýt, quế chi 4 g (riêng vị quế chi bỏ vào sau cùng khi sắp nhắc xuống) Đổ 600 ml nước vào sắc còn 250 ml, chia làm 2 lần uống trong ngày Uống khi còn nóng

Ngoài ra, lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật

Ở Ấn Độ, người ta cho là cây có tính săn nên dùng trong điều trị sốt

Ở Campuchia, người ta dùng lá phối hợp với các cây thuốc khác làm bột hạ nhiệt, thuốc giảm đau Lá dùng xông để ra mồ hôi, chữa chứng chóng mặt, dùng tươi hoặc giã nát đắp ngoài trị viêm thần kinh khớp và vết thương Lá nhai nuốt với chút phèn trị hóc xương cá

Bảng 2.1 Tóm tắt những tác dụng dược lý quan trọng của Đinh lăng tương tự Sâm Việt Nam

1.Tăng thể lực, chống nhược sức Suy nhược cơ thể

2 Kích thích các hoạt động não bộ Suy nhược thần kinh

3.Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục Suy nhược sinh dục

4.Antistress, giải lo âu và chống trầm cảm Các bệnh lý gây bởi stress

5.Tác dụng tăng cường chức năng gan và bảo vệ tế bào Xơ gan, giải độc gan

6.Giảm cholesterol huyết, giảm lipid Xơ vữa động mạch

8.Gia tăng sức đề kháng không đặc hiệu Sự miễn dịch

2.2 GIỚI THIỆU VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

2.2.1 Khái niệm HCBVTV

Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp quốc (FAO) đã đưa ra định nghĩa

về thuốc BVTV như sau: “Thuốc BVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của động vật và thực vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn

nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng Thuốc BVTV còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm thưa cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng sớm Cũng có thể dùng thuốc BVTV cho trồng cây trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển”

2.2.2 Phân loại thuốc BVTV

Thuốc BVTV được sử dụng rộng rãi với số lượng và chủng loại ngày càng tăng Vì thế, để thuận tiện trong quá trình sử dụng và công tác quản lý người ta thường phân loại thành các nhóm khác nhau Sự phân loại này cũng rất đa dạng tùy thuộc mục đích như: theo cấu tạo hóa học, theo mục đích sử dụng, theo nguồn gốc hay theo độc tính… Theo công dụng thì thuốc BVTV được phân loại như sau: trừ sâu, trừ nấm, trừ cỏ, trừ chuột, trừ nhện, trừ vi khuẩn, trừ ốc sên …

Thuốc trừ sâu là chất nào đó hoặc hỗn hợp các chất có thành phần hóa học hoặc sinh học dùng để đẩy lùi, phá hủy và kiểm soát sâu bệnh hay điều hòa sự sinh trưởng của thực vật

Thuốc trừ nấm là thuốc có tác dụng bảo vệ cây trồng và hạt giống, không để cho nấm bệnh xâm nhập và gây hại, hoặc có tác dụng tiêu diệt nấm bệnh

2.2.3 Mức dư lượng tối đa trong dược liệu

Các nước trên thế giới đều có mối quan tâm chung là nông nghiệp sạch, đặc biệt là rau sạch và hiện nay mối quan tâm hàng đầu của ngành Dược là dược liệu sạch dùng để làm thuốc, không còn tồn dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật mà có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người Mặc dù vậy nhưng hiện nay các nghiên cứu về thuốc BVTV ở

nước ta còn rất hạn chế

Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên hiệp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đưa ra qui định Codex về dư lượng tối đa cho phép của một số hoạt chất thuốc BVTV trong nông sản, trong đó qui định cụ thể về thuốc BVTV trên từng nền mẫu Dư lượng là phần còn lại của hoạt chất, các sản phẩm chuyển hóa và các thành phần khác có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nước sau một thời gian dưới tác động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh

MRL (Maximun Residue Limit): là lượng tối đa một loại thuốc bảo vệ thực vật được chấp nhận tồn tại trong nông sản, thực phẩm mà không gây hại cho con người MRL được biểu thị bằng miligam thuốc bảo vệ thực vật trong một kilogam thực phẩm (mg/kg) (Bộ Y Tế, 2016)

ADI (Acceptable Daily Intake): lượng chất độc chấp nhận hấp thu vào cơ thể, không gây hại cho người hay vật nuôi trong một ngày, được tính bằng mg hoặc µg hợp chất độc cho đơn vị thể trọng (Bộ Y Tế, 2016)

Mỗi thuốc BVTV có MRL riêng trên từng nền mẫu khác nhau Tuy nhiên, với sự phát triển của ngành công nghệ hóa học thì hàng loạt thuốc BVTV ra đời nên có rất nhiều thuốc BVTV chưa có qui định MRL trên từng nền mẫu Để giải quyết vấn đề này, nhiều quốc gia trên thế giới như Nhật, Mỹ, châu Âu … sử dụng giá trị MRL chung cho tất cả thuốc BVTV là 0,01 mg/kg Vì thế, các phòng thí nghiệm ở Việt Nam cũng đã

sử dụng giá trị này trong kiểm nghiệm dược liệu (Trần Cao Sơn, 2015)

là nhóm chất gây kích thích thần kinh trung ương tương tự nicotin Imidacloprid được

sử dụng từ giữa những năm 1990 ở các nước Đông Nam Á và châu Âu Nó được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp như là một chất tăng trưởng cho cây bằng cách phun lên lá, xử lý giống và xử lý đất ở liều khá thấp Imidacloprid là một chất không màu, không mùi Gần đây, một số nước hạn chế sử dụng sử dụng những chất của nhóm này

vì có nhiều bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CDD (rối loạn sụt giảm bầy đàn) đối với ong mật Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự nhiên của ong mật nhạy cảm với nhiều trường hợp nhiễm trùng gây chết Hiện nay, ở Việt Nam các chất này vẫn được phép sử dụng làm HCBVTV trong nông nghiệp (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013)

N

N N

N

NO2

H

Bảng 2.2 Nghiên cứu về độc tính cấp của imidacloprid (Robert Krieger, 2001)

Bảng 2.3 Giới hạn tối đa dƣ lƣợng imidacloprid trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế, 2016)

Tên hóa học: Methyl

và di chuyển trong mạch gỗ đi đến thân, lá hoặc thấm qua bề mặt lá đi đến mép lá và rìa lá đang phát triển Azoxystrobin được sử dụng để hạn chế nguy cơ gây bệnh trên lá

và đất như bệnh nấm lá, bệnh đốm trắng, bệnh rụng lá và các mầm bệnh khác trên nhiều cây trồng

Bảng 2.4 Nghiên cứu về độc tính cấp của azoxystrobin

Động vật thí nghiệm Giới Đường dùng LD 50 (mg/kg) LC 50 (mg/l)

Bảng 2.5 Giới hạn tối đa dư lượng azoxystrobin trong một số thực phẩm (Bộ Y Tế,

Các loại rau họ đậu, rau xà lách, lá rau diếp

3

Sâm khô (kể cả sâm đỏ) 0,3

2.2.6 Ưu, nhược điểm và vị trí của ngành thuốc BVTV hiện nay (Michelangelo

Anastassiades et al., 2003)

Ưu điểm:

- Diệt dịch hại nhanh, có khả năng chặn đứng và phòng trừ khi xảy ra các trận dịch

- Cho hiệu quả trực tiếp, rõ rệt và tương đối triệt để

- Nâng cao năng suất rõ rệt

- Dễ ứng dụng rộng rãi ở nhiều nơi, nhiều vùng khác nhau

Nhược điểm:

- Dễ gây độc cho người trực tiếp sử dụng thuốc (pha chế, phun thuốc …)

- Ảnh hưởng sâu sắc đến các quần thể sinh vật gây mất cân bằng sinh thái

- Tác động mạnh mẽ đến môi trường sống xung quanh nhất là những thuốc có độ bền lớn và thời gian lưu trong đất dài Với DDT phải mất đến 10 năm để phân hủy 95% thuốc

- Gây ra hiện tượng kháng thuốc Là một vấn đề đang cần được quan tâm hàng đầu, do sử dụng một loại thuốc liên tục trong nhiều năm

Với những ưu và nhược điểm trên, hiện nay trên thế giới đã có xu hướng hạn chế sử dụng thuốc BVTV có độc tính cao gây hại cho môi trường, thay vào đó cố gắng để tìm

ra những loại thuốc mới có ưu điểm tốt và tránh được những nhược điểm trên

2.3 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HCBVTV

2.3.1 Tình hình sử dụng HCBVTV trên thế giới (Trần Cao Sơn, 2015)

Trên thế giới, thuốc BVTV ngày càng đóng vai trò quan trọng trong việc phòng trừ sâu bệnh bảo vệ sản xuất, đảm bảo an ninh lương thực thực phẩm Theo tính toán của các chuyên gia, trong những thập kỷ 70, 80, 90 của thế kỷ 20, thuốc BVTV góp phần bảo

vệ và tăng năng suất khoảng 20 – 30 % đối với các loại cây trồng chủ yếu như lương thực, rau, hoa quả

Theo Sarazy, Kenmor (2008 - 2011), ở các nước châu Á trồng nhiều lúa, 10 năm qua (2000 - 2010) sử dụng phân bón tăng 100 %, sử dụng thuốc BVTV tăng 200 – 300 % nhưng năng suất hầu như không tăng, số lần phun thuốc trừ sâu không tương quan hoặc thậm chí tương quan nghịch với năng suất Lạm dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật còn tác động xấu đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe cộng đồng phá vỡ sự bền vững của phát triển nông nghiệp Ngoài ra còn làm tăng tính kháng thuốc, suy giảm hệ ký sinh - thiên địch để lại dư lượng độc trên nông sản, đất và nước, ảnh hưởng đến chất lượng môi trường, nhiễm độc người tiêu dùng nông sản

Do những hệ lụy và tác động xấu của việc lạm dụng thuốc BVTV cho nên ở nhiều nước trên thế giới đã và đang thực hiện việc đổi mới chiến lược sử dụng thuốc BVTV

Từ “Chiến lược sử dụng thuốc BVTV hiệu quả và an toàn” sang “Chiến lược giảm

nguy cơ của thuốc BVTV”

Chiến lược sử dụng thuốc BVTV mới này đã mang lại hiệu quả ở nhiều nước, đặc biệt

là các nước Bắc Âu, đã thành công trong việc giảm thiểu sử dụng thuốc BVTV mà vẫn quản lý được dịch hại tốt Trong vòng 20 năm (1980 - 2000) Thụy Điển giảm lượng thuốc BVTV sử dụng đến 60 %, Đan Mạch và Hà Lan giảm 50 % Tốc độ gia tăng mức tiêu thụ thuốc BVTV trên thế giới trong 10 năm lại đây đã giảm dần, cơ cấu thuốc BVTV có nhiều thay đổi theo hướng gia tăng thuốc sinh học, thuốc thân thiện với môi trường, thuốc ít độc hại,…

2.3.2 Tình hình sử dụng HCBVTV ở Việt Nam (http://kinhtevadubao.vn)

Việt Nam là một trong số những nước có lượng tiêu thụ thuốc bảo vệ thực vật rất lớn

Ở một số địa phương được khảo sát cho thấy có hiện tượng một số nông dân còn thiếu hiểu biết cũng như không tuân thủ đúng những quy định sử dụng thuốc BVTV khi phun cho cây (như quy định đối với việc sử dụng thuốc BVTV thuộc danh mục hạn chế sử dụng, lạm dụng thuốc BVTV, không thực hiện đúng quy định về xử lý bao bì đựng thuốc BVTV sau khi sử dụng xong và đặc biệt là việc tuân thủ thời gian an toàn cho thu hái dược liệu sau khi phun thuốc điều này có thể dẫn đến lượng tồn dư thuốc BVTV trong các dược liệu vượt ngưỡng cho phép)

Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng trong nông nghiệp đến năm 2015

đã lên tới 1.699 hoạt chất, trong khi, các nước trong khu vực chỉ có khoảng từ 400 -

600 loại hoạt chất như: Trung Quốc 630 loại, Thái Lan 400 - 600 loại

Từ năm 2011 đến nay, hàng năm Việt Nam nhập và sử dụng từ 70.000 - 100.000 tấn thuốc bảo vệ thực vật Trong đó, thuốc trừ sâu chiếm 20,4 %, thuốc trừ bệnh 23,2 %, thuốc trừ cỏ 44,4 %, các loại thuốc bảo vệ thực vật khác, như: thuốc xông hơi khử trùng, bảo quản lâm sản, điều hòa sinh trưởng cây trồng chiếm 12 % Khối lượng và chủng loại thuốc bảo vệ thực vật trên đã vượt gấp nhiều lần nhu cầu sử dụng cho sản xuất nông nghiệp

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HCBVTV

2.4.1 Phương pháp truyền thống (Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2013)

Để chống lại các loài sinh vật gây hại, từ lâu người ta đã sử dụng thuốc trừ sâu một cách rộng rãi trong nông nghiệp như: trồng lúa, rau, cây ăn quả và phổ biến hiện nay là dược liệu Mục đích của phương pháp phân tích đa dư lượng là phân tích đồng thời nhiều thuốc BVTV trong cùng một lần thực hiện, do đó kỹ thuật chiết cũng hướng đến chiết được càng nhiều thuốc BVTV càng tốt Đồng thời phương pháp phải được thực hiện nhanh chóng và dễ dàng, cùng với việc sử dụng một lượng dung môi tối thiểu mà vẫn chiết được tất cả thuốc BVTV có trong nền mẫu

Đã có một vài phương pháp được sử dụng để xác định dư lượng thuốc trừ sâu tồn dư trong trái cây và nước ép trái cây như: chiết lỏng, chiết với sự hỗ trợ của vi sóng, chiết

vi pha rắn, chiết siêu tới hạn…Các phương pháp này thường tốn rất nhiều thời gian Phương pháp phân tích đa dư lượng đầu tiên và nổi tiếng nhất là phương pháp Mills được phát triển vào những năm 1960 bởi Cục quản lý dược và thực phẩm Mỹ (FDA) bởi nhà hóa học P.A.Mills Vào thời gian đó, các thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ là nhóm chính được phân tích Với phương pháp Mills, thuốc trừ sâu nhóm clo và các chất không phân cực khác được chiết xuất trên mẫu thực phẩm không chứa chất béo bằng acetonitril Sau đó pha loãng với H2O và các thuốc trừ sâu được phân vào một dung môi không phân cực (petroleum ether) Vì thế mà các thuốc trừ sâu phân cực trung bình như là thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ bị mất một phần trong phương pháp này Sự cần thiết khi phân tích nhiều thuốc trừ sâu phân cực khác nhau và nhóm phospho hữu cơ trong nông nghiệp, là phát triển một số cách thay thế để xác định các hợp chất không được chiết xuất bởi phương pháp Mills Những cách này thường chỉ đơn giản thay đổi bằng cách sử dụng dung môi ACN chiết xuất ban đầu nhưng khác

nhau bởi bước phân vùng, làm sạch và xác định thuốc BVTV (Anastassiades et al., 2003)

Phương pháp chiết lỏng – lỏng là một phương pháp dùng một dung môi để tách một chất hoặc nhóm hợp chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Sau đó chuyển chất phân tích từ một dung môi sang dung môi thứ hai không đồng tan với dung môi thứ nhất Cô thu hồi dung môi thu được chất phân tích Tùy vào bản chất của chất cần phân tích mà lựa chọn dung môi thích hợp để tránh hao hụt chất cần phân tích Cần phải chú ý đến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết như: độ tan của chất phân tích trong dung môi, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hòa tan khác Ngoài ra việc lựa chọn dung môi thích hợp còn giúp loại bỏ được một số tạp chất có trong mẫu Có thể sử dụng một số tác nhân vật lý hỗ trợ như lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm… Đối với các mẫu nhiều tạp chất có thể phối hợp thêm các quá trình làm sạch khác

Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng thường được áp dụng để

- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu

- Phân chia cao thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Năm 2009, Tiến sĩ Nguyễn Thị Bích Thu đã công bố đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng sắc

ký khối phổ để phân tích dư lượng một số hóa chất bảo vệ thực vật thường dùng” Trong đó sử dụng phương pháp chiết mẫu bằng siêu âm, sau đó làm sạch mẫu bằng cột nhồi silicagel + 10 % than hoạt và đem định lượng bằng GC/MS

2.4.2 Phương pháp QuEChERS (Trần Cao Sơn, 2015)

Trong những năm gần đây có sự thay đổi đáng kể là sự ra đời của phương pháp QuEChERS (viết tắt của quick - nhanh, easy - dễ, cheap - rẻ, effective - hiệu quả, rugged - ổn định, và safe - an toàn) Phương pháp QuEChERS được báo cáo đầu tiên bởi Anastassisdes và Lehotay, được phát triển bởi United States Department of Agriculture (Sở nông nghiệp Hoa Kỳ) vào năm 2003 Là phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc trừ sâu trên nhiều loại nền mẫu khác nhau, chỉ cần có khoảng 70 – 100 % nước trong thành phần (mẫu khô được cho thêm nước)

Phương pháp này được phát triển dùng để chiết xuất thuốc BVTV trên trái cây và rau quả, đồng thời kết hợp với quá trình làm sạch mẫu như là đường, acid béo, acid hữu

cơ, sterol, protein, chất màu và loại nước thừa Phương pháp này mang đến những thuận tiện hơn so với phương pháp truyền thống như chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn Phương pháp này đơn giản và khá hiệu quả trong việc chiết và làm sạch một số mẫu có nền phức tạp Quá trình này bao gồm hai bước Đầu tiên, các mẫu đồng nhất được

chiết xuất và phân chia bởi dung môi hữu cơ và dung dịch muối Sau đó, phần nổi trên mặt được tách ra và làm sạch bởi kỹ thuật chiết phân tán pha rắn (d-SPE)

Năm 2005, Lehotay và các cộng sự nghiên cứu thẩm định phương pháp này cho thấy phương pháp cho kết quả tốt với 207 chất trong số 235 thuốc trừ sâu trong các nền mẫu rau quả Tuy nhiên, độ thu hồi của những chất nhạy với pH bị ảnh hưởng rõ rệt Sau đó Lehotay thay đổi phương pháp gốc bằng cách sử dụng đệm acetat pH 4,8 - 5,0

để tăng độ thu hồi của thuốc trừ sâu Phương pháp này sau đó đã được nghiên cứu trong 13 phòng thí nghiệm ở 7 quốc gia đối với 30 thuốc trừ sâu và trở thành phương pháp chính thức của AOAC 2007.01 vào năm 2007 Cùng thời gian đó, Anastassiades

và cộng sự phát triển một phương pháp QuEChERS khác sử dụng đệm citrat ở pH khoảng 5 Phương pháp này đã được thẩm định liên phòng ở nhiều phòng thí nghiệm ở Đức và trở thành phương pháp châu Âu CEN 15662

+ 6 g MgSO4; 1,5 g

NaOAc

Lắc, ly tâm

+ 150mg MgSO4; 50mg PSA

+ 50mg C18; 7,5mg GCB (lựa chọn thêm)

Lắc, ly tâm, lọc

Phương pháp AOAC 2007.01 (Đệm acetat pH 4,8-5)

Lắc, ly tâm

+ 150 mg MgSO4; 50 mg PSA

+ 50 mg C18; 7,5 mg GCB (lựa chọn thêm)

Lắc, ly tâm, lọc

Phương pháp EN 15662 (Đệm citrat pH 5)

Ưu điểm của phương pháp QuEChERS (Michelangelo Anastassiades, 2003)

 Nhanh (8 mẫu trong khoảng 30 phút)

 Đơn giản (các bước thực hiện không quá khó, sai số tối thiểu)

 Rẻ (không tốn kém nhiều khi chuẩn bị mẫu)

 Lượng dung môi sử dụng thấp (10 ml acetonitril)

 Hầu như không cần dụng cụ thủy tinh

 Được dùng trên phạm vi rộng các thuốc trừ sâu (chất phân cực, chất phụ thuộc vào pH)

 Chiết xuất với acetonitril (được phân tích bởi sắc ký khí và sắc ký lỏng)

Ở Việt Nam hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật ngày càng tiên tiến cũng đã có một số tác giả áp dụng phương pháp mới trong phân tích đa dư lượng thuốc BVTV trong nông nghiệp Trên cơ sở lý thuyết của phương pháp QuEChERS, tác giả

có thay đổi một số bước cho phù hợp với điều kiện thực tế, tối ưu hóa qui trình một cách hợp lý nhất

Năm 2005, Ths Trần Việt Hùng thực hiện nghiên cứu xác định thuốc BVTV trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng, chiết lạnh hoặc chiết Sohxlet kết hợp với sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) để làm sạch và làm giàu mẫu Sau đó đem phân tích bởi sắc ký khí

2.5 KỸ THUẬT SẮC KÝ HPLC/UV-VIS

HPLC là từ viết tắt của High Performance Liquid Chromatography, còn được gọi là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp này ra đời từ năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Áp dụng rất lớn cho ngành kiểm nghiệm đặc biệt là kiểm nghiệm thuốc Là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng Ngày nay cũng đã ứng dụng nhiều trong dược liệu

2.5.1 Nguyên tắc

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột

và của chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện

gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình

2.5.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Việc tách xảy ra khi hỗn hợp các chất tương tác khác nhau với pha tĩnh Do tính chất lí hóa và cấu trúc phân tử nên chúng tương tác khác nhau và di chuyển với tốc độ khác nhau để tách ra khỏi nhau

2.5.3 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Hình 2.8 Cấu tạo hệ thống HPLC Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động 2 - Bộ phận khử khí 3 - Bơm cao áp 4 -

Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler) 5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt 6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu) 7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống 8 – Thiết bị in dữ liệu

Pha động là một yếu tố quan trọng trong quá trình sắc ký quyết định việc tách được các chất ra khỏi hỗn hợp hay không Các dung môi pha động có độ phân cực khác nhau, cần phải lựa chọn sao cho phù hợp với nghiên cứu hoặc có thể phối hợp 2 đến 3 dung môi trong một lần phân tích Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến pha động sẽ gây ra kết quả phân tích không đạt yêu cầu như: pH, tỷ lệ pha động, thành phần pha động, bọt khí, dung môi không tinh khiết còn lẫn tạp… Dung môi chạy sắc ký đòi hỏi phải tinh

khiết dùng cho HPLC Tất cả các mẫu thử phải được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào cột

Trong HPLC, bơm được xem là bộ phận quan trọng hàng đầu Vì thế đòi hỏi yêu cầu khá cao: phải có khả năng cung cấp chính xác và nhịp dòng chảy tự do, có khả năng chịu được áp lực cao lên đến 5000 psi, cung cấp được số lượng lớn các dung môi pha động

Bộ phận tiêm mẫu giúp đưa mẫu với một lượng nhất định vào cột sắc ký,với dung tích

từ 5 – 100 µl Có hai cách tiêm mẫu: tiêm mẫu bằng tay và tiêm mẫu tự động

Cột sắc ký được xem là trái tim của quá trình sắc ký Thường được làm bằng thép không gỉ, với hình dạng thẳng và thể tích có thể thay đổi Pha tĩnh nhồi trong cột được lựa chọn tùy thuộc vào kỹ thuật sắc ký Trước khi mẫu đi qua cột chính thì cần phải qua tiền cột hay còn gọi là cột bảo vệ để đảm bảo tuổi thọ của cột phân tích

Detector là bộ phận phát hiện chất cần phân tích, là não bộ của HPLC Tùy thuộc vào bản chất cần phân tích mà sử dụng detector phù hợp Ngày nay có rất nhiều đầu dò khác nhau như: detector khối phổ (MS), detector chuỗi diod quang (DAD), detector huỳnh quang (FLD), detector khúc xạ, detector ion hóa ngọn lửa … Nhưng sử dụng rộng rãi nhất là đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) với độ nhạy rất cao

2.5.4 Ứng dụng của HPLC trong dược liệu

- Ứng dụng quan trọng nhất là định tính các thành phần các chất trong dược liệu, trong dịch chiết dược liệu hay phát hiện các tạp chất, các chất giả mạo pha trộn trong dược liệu hoặc các thành phẩm dược liệu

- Xác định hàm lượng các chất thông dụng trong các phương pháp phân tích hiện đại Có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp

- Có thể dùng để theo dõi, đánh giá sự thay đổi thành phần (hàm lượng) các chất của dược liệu trong quá trình bảo quản hay trong dịch chiết trong quá trình chiết xuất

- Dùng để phân lập các chất tinh khiết từ dược liệu