Chế tạo và thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư để phát hiện một số virus gây bệnh

Hiện nay chưa có nhóm nghiên cứu nào trong nước phát triển một bộ kit tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng màng/cột silica hay hạt từ tính bọc silica, vì thế hầu hết các bệnh viện và phòng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Huyền

CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA

TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƯ

ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Huyền

CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM BỘ KIT TÁCH CHIẾT DNA

TỪ CÁC TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH MẪU MÔ UNG THƯ

ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ VIRUS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh

XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng chấm luận văn

thạc sĩ khoa học

PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh PGS.TS Bùi Thị Việt Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình thực hiện luận văn Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn GS.TS

Phan Tuấn Nghĩa, TS Phạm Thị Thu Hường đã tư vấn và góp ý cho các kết quả

nghiên cứu trong luận văn

Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ và tập thể nhóm nghiên cứu tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme & Protein của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, những người đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã mang đến kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn thuộc Khoa Sinh

lý Bệnh, Học viện Quân Y, cảm ơn Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện TƯQĐ 108,

PGS.TS Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein - Đại học Y Hà

Nội, PGS.TS Nguyễn Hoàng Nam, Trung tâm Nano và Năng lượng - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã cung cấp mẫu cho chúng tôi trong quá trình nghiên cứu

Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của đề tài mã số QG.16.22

do ĐHQGHN tài trợ, PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn sát cánh động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó!

Hà Nội, tháng năm 2017 Học viên

Nguyễn Thị Huyền

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Mô FFPE

Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue (Mô cố định bằng formalin và đúc trong thể vùi parafin)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 UNG THƯ VÕM MŨI HỌNG (UTVMH) VÀ VIRUS GÂY UTVMH 3

1.1.1 Giới thiệu chung về UTVMH 3

1.1.2 Epstein-Barr virus (EBV) tác nhân gây UTVMH 4

1.1.3 Human Papilloma virus (HPV) tác nhân gây UTVMH 8

1.2 TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÔ FFPE 13

1.2.1 Vai trò quan trọng của việc tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE 13

1.2.2 Tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE 14

1.3 SỰ CẦN THIẾT PHẢI TRIỂN KHAI VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 NGUYÊN LIỆU 20

2.1.1 Mẫu mô đúc trong thể FFPE 20

2.1.2 Hạt nano từ bọc silica 20

2.1.3 Các bộ kit thương mại tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE 21

2.1.4 Các cặp mồi, probe 21

2.1.5 Các hóa chất và nguyên liệu khác 22

2.1.6 Máy móc và thiết bị 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP 23

2.2.1 Chế tạo bộ đệm cho kit tách chiết 23

2.2.2 Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư bằng hạt nano

từ bọc silica và bộ đệm pha chế 24

2.2.3 Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư bằng hạt nano

từ bọc silica bằng bộ kit thương mại MagMAX FFPE DNA Isolation kit

(Thermo Scientific) 25

2.2.4 Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của nucleic acid tách chiết

được dựa trên quang phổ kế 27

2.2.5 Nhân bản đoạn gen đặc hiệu Braf 27

2.2.6 Real-time PCR phát hiện EBV 28

2.2.7 Real-time nested PCR phát hiện HPV 29

2.2.8 Giải trình tự gen 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 31

3.1 CHẾ TẠO BỘ KIT TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE SỬ DỤNG HẠT

TỪ BỌC SILICA 31

3.1.1 Đệm Lysis Buffer, Binding Buffer phù hợp với tách chiết DNA

từ mô FFPE 31

3.1.2 Hạt Magsi nano phù hợp với tách chiết DNA từ mô FFPE 34

3.1.3 DNA tách chiết từ mô FFPE phù hợp làm khuôn cho PCR

và giải trình tự gen 36

3.1.4 Xây dựng bộ kit tách chiết từ mô FFPE hoàn chỉnh 38

3.2 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG TÁCH DNA TỪ MÔ FFPE CỦA BỘ KIT TRÊN CÁC MẪU MÔ FFPE Ở BỆNH NHÂN UTVMH ĐỂ PHÁT HIỆN

EBV-DNA VÀ HPV-DNA 42

3.2.1 Bước đầu so sánh chất lượng bộ kit với kit thương mại và đánh giá

khả năng tách chiết DNA của virus EBV và HPV từ mẫu mô FFPE UTVMH 42

3.2.2 Thử nghiệm phát hiện EBV và HPV từ mẫu cố định mô UTVMH 46

KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Ảnh chụp vòm họng của bênh nhân ung thư vòm mũi họng [43] 4

Hình 1.2: Hình ảnh Epstein Barr Virus dưới kính hiển vi điện tử [44] 5

Hình 1.3: Cấu trúc EBV [53] 6

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của Epstein Barr virus trong cơ thể người bị nhiễm [45] 7

Hình 1.5: Hạt virus và cấu trúc gen của HPV [54] 10

Hình 1.6: Hình ảnh minh họa mẫu mô đúc trong khối nến [47] 14

Hình 1.7 : Liên kết chéo trong mẫu mô FFPE [38] 15

Hình 1.8: DNA liên kết với silica trong môi trường có nồng độ muối cao và

chất diện hoạt sức căng bề mặt thấp [55] 16

Hình 2.1: Ảnh chụp hạt nano từ bọc silica dưới kính hiển vi điện tử

(Transmission Electron Microscope, TEM) 21

Hình 3.1: So sánh nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi 3 bộ đệm (n=3) 32

Hình 3.2: Kết quả điện di PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA của

Bệnh nhân 2 tách bởi ba bộ đệm tương ứng 33

Hình 3.3 : Đồ thị nồng độ DNA của 5 bệnh nhân khi tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano khác nhau (n=3) 34

Hình 3.4: Ảnh điện di kết quả PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu DNA của

bệnh nhân 6 tách bởi ba loại hạt nano từ bọc silica 36

Hình 3.5: Các peak trình tự acid nucleic của một đoạn gen Braf tách từ

bệnh nhân số 1 và bệnh nhân số 2 (B) 37

Hình 3.6: So sánh kết quả giải trình tự đoạn gen Braf của hai bệnh nhân với

cơ sở dữ liệu trên NCBI 38

Hình 3.7: Sơ đồ tách chiết DNA từ mô FFPE từ hạt magsi nano và bộ đệm

pha chế 40

Hình 3.8 : Hình ảnh bộ kit Magpure FFPE DNA mini kit 41

Hình 3.9: Hàm lượng DNA của 10 bệnh nhân tách bằng kit Magpure và

MagMAX 43

Hình 3.10: Tín hiệu real-time PCR phát hiện EBV và real-time nested PCR

phát hiện HPV sử dụng DNA khuôn tác từ 2 bộ kit Magpure và MagMAX

ở BN7 và BN 45

Hình 3.11: Tín hiệu chạy real-time PCR phát hiện EBV sử dụng khuôn DNA tách từ mô bệnh phẩm của 3 bệnh nhân ung thư vòm họng FFPE bằng kit Magpure 48

Hình 3.12: Tín hiệu chạy Real-time nested PCR SYBR Green phát hiện HPV

sử dụng khuôn DNA tách từ mô FFPE của 3 bệnh nhân UTVMH bằng kit Magpure 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc diểm của 3 loại hạt nano từ bọc silica 20

Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi, probe 22

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen Braf 27

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng Real-time PCR phát hiện EBV 29

Bảng 3.1: Kí hiệu và thành phần các bộ đệm 31

Bảng 3.2: Kết quả đo độ tinh sạch DNA của 5 bệnh nhân tách bởi 3 bộ đệm

khác nhau 33

Bảng 3.3: Kết quả đo độ tinh sạch DNA của 5 bệnh nhân tách bởi 3 loại hạt

khác nhau 35

Bảng 3.4: Các thành phần trong Magpure FFPE DNA nano kit (100 pứ) 42

Bảng 3.5: Kết quả đo độ tinh sạch DNA tách chiết từ 10 mẫu mô FFPE của

bệnh nhân UTVMH tách bằng bởi 2 bộ kit Magpure và MagMAX 43

Bảng 3.6: Kết quả real-time PCR phát hiện EBV 26 mẫu dương tính EBV và

real-time nested PCR phát hiện HPV sử dụng DNA khuôn tách từ 2 bộ kit

Magpure và MagMAX trên 10 bệnh nhân UTVMH 44

Bảng 3.7: Kết quả real-time PCR 26 bệnh nhân dương tính virus EBV trên

35 bệnh nhân nghi UTVMH 47

Bảng 3.8: Kết quả real-time nested PCR 16 bệnh nhân dương tính virus HPV trên 35 bệnh nhân nghi UTVMH 49

MỞ ĐẦU

Ung thư là một trong những căn bệnh nguy hiểm gây tử vong hàng đầu trên thế giới Có nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư như: yếu tố di truyền, tác nhân hóa học, tác nhân vật lý, lây nhiễm virus … Một trong số những bệnh ung thư

có liên quan tới nhiễm virus được nghiên cứu nhiều nhất là ung thư vòm mũi họng (UTVMH) Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chưa được xác định rõ ràng, tuy vậy có rất nhiều giả thuyết, trong đó giả thuyết được đề cập nhiều nhất là do Epstein Barr virus (EBV) và Human Papilloma virus (HPV) Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cho thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus EBV, HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [4, 27, 36]

Để phát hiện sự có mặt của EBV và HPV ở các bệnh nhân nghi UTVMH, kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng vì độ chính xác và đặc hiệu cao cho phép định tính, định lượng số lượng virus trong các mô UTVMH [6, 34] Việc tách chiết DNA

từ mô người là bước đầu tiên không thể thiếu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo như PCR và real time PCR phát hiện EBV, HPV, giải trình tự, xác định đột biến hay chẩn đoán ung thư, bệnh học Hiện nay, các mẫu mô cố định bằng formalin

và đúc trong thể vùi parafin (Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue- FFPE Tissue; mô FFPE) được lưu trữ rất nhiều tại các khoa bệnh học của bệnh viện cho mục đích chẩn đoán, nghiên cứu hồi cứu về mô bệnh học và di truyền phân tử Do

ưu điểm bảo quản được toàn vẹn cấu trúc mô trong thời gian dài từ vài năm đến hàng chục năm, các mẫu mô FFPE là giải pháp được nhiều bệnh viện, phòng xét nghiệm lựa chọn để giữ lại các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư, trong đó có UTVMH [8]

Tuy nhiên, việc sử dụng formalin, các tác nhân vùi như nhiệt độ làm xuất hiện các liên kết chéo giữa nucleic acid với protein và giữa các nucleic acid với nhau gây khó khăn cho quá trình tách chiết đồng thời DNA tách chiết được bị đứt gãy rất nhiều [23, 30, 38] Hiện nay, các hãng nổi tiếng về sinh học phân tử trên thế giới

chiết DNA từ mô FFPE sử dụng cột màng silica hoặc hạt micro từ tính bọc silica đi cùng với các bộ đệm Theo nguyên lý của Boom và cộng sự, DNA được bám trên

bề mặt của màng silica hoặc hạt micro từ tính thông qua cầu nối Na+ để liên kết với silica và giữ lại bởi nam châm, còn các tạp chất khác được loại bỏ [9-11, 28] Hiện nay chưa có nhóm nghiên cứu nào trong nước phát triển một bộ kit tách chiết DNA

từ mô FFPE sử dụng màng/cột silica hay hạt từ tính bọc silica, vì thế hầu hết các bệnh viện và phòng thí nghiệm đều sử dụng kit ngoại nhập với giá thành cao

Trong các công bố gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano

và Ứng dụng, PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein phối hợp với Trung tâm Nano

và Năng lượng, hạt oxit sắt từ tính bọc silica (Fe3O4@SiO2) kích thước nano được chế tạo và thử nghiệm cho việc tách chiết DNA từ virus, tế bào máu, mô tươi vì ưu điểm có tổng diện tích bề mặt tương tác với DNA lớn nên có khả năng gắn kết hiệu quả với DNA hơn dạng cột/màng silica hay hạt micro từ tính bọc silica [5, 35, 40] Xuất phát từ thực tế nhu cầu sử dụng kit tách chiết DNA từ mô FFPE cho phát hiện

các tác nhân virus gây bệnh ung thư, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Chế tạo và

thử nghiệm bộ kit tách chiết DNA từ các mẫu tiêu bản mô ung thư sử dụng hạt nano từ bọc silica và bộ đệm phù hợp để phát hiện một số virus gây bệnh” với các

mục tiêu sau:

 Chế tạo bộ kit tách DNA từ mô FFPE sử dụng hạt từ bọc silica

 Thử nghiệm khả năng tách DNA từ mô FFPE của bộ kit trên các mẫu mô FFPE ở bệnh nhân UTVMH để phát hiện EBV-DNA và HPV-DNA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƯ VÒM HỌNG (UTVMH) VÀ VIRUS GÂY UTVMH

1.1.1 Giới thiệu chung về UTVMH

Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là một dạng ung thư xuất phát từ các tế bào biểu mô ở vùng vòm mũi họng (phần cao nhất của họng, có hình vòm) UTVMH thường gặp ở nam giới và để lại nhiều hậu quả như đau đớn và khó khăn

trong quá trình ăn uống với hầu hết bệnh nhân, tỉ lệ tử vong vì căn bệnh này cao

UTVMH có thể gặp ở mọi lứa tuổi nhưng đặc biệt hay mắc phải là ở nam giới, tuổi

từ 40 đến 60 UTVMH là thể ung thư thường gặp nhất trong số các ung thư ở vùng đầu cổ và là một trong mười ung thư phổ biến nhất tại Việt Nam Những người hay uống rượu, hút thuốc, có tiền sử gia đình bị bệnh… cũng có nguy cơ mắc UTVMH Nhưng các triệu chứng lại không điển hình, hầu hết là các triệu chứng của các cơ quan lân cận như: tai, mũi, thần kinh, hạch…do đó việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Vẫn chưa có một thống kê đầy đủ, chính xác nhưng theo thống kê của Bệnh viện K - Hà Nội (1998) thì UTVMH đứng hàng thứ 5 sau ung thư phổi, tử cung, buồng trứng, vú, ung thư gan và là bệnh đứng đầu trong các ung thư vùng đầu, cổ với tỷ lệ: 9 - 10 bệnh nhân/100.000 dân/năm [1, 3, 5]

Nguyên nhân gây ra UTVMH cho tới nay chưa được xác định rõ ràng tuy vậy

có rất nhiều giả thuyết, trong đó giả thuyết được đề cập nhiều nhất là do EBV và HPV Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới cho thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus EBV, HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [7, 8] Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện về sự liên quan giữa EBV, HPV và UTVMH còn là vấn đề gây tranh cãi Bằng kĩ thuật PCR, Hording phát hiện ra sự có mặt của HPV trong nhiều mẫu UTVMH mà các mẫu này hoàn toàn âm tính với EBV [27] Trong khi

đó, cũng bằng kĩ thuật này Rassekh phát hiện tỷ lệ các mẫu mô tươi UTVMH có HPV là 88% và tỷ lệ có chứa EBV là 53% [36]; Du- Bois và cs nghiên cứu trên mẫu mô FFPE UTVMH chỉ phát hiện được tỷ lệ mẫu dương tính với EBV là 25%

và 19,4% với HPV[20] Một số nghiên cứu khác cho thấy kháng thể chống virus

Hình 1.1: Ảnh chụp vòm họng của bênh nhân ung thư vòm họng [44]

1.1.2 Epstein-Barr virus (EBV) tác nhân gây UTVMH

Biếu mô vùng vòm mũi họng là vị trí chủ yếu cho EBV tìm kiếm tế bào thích ứng thực hiện sự nhân lên tạo ra nhiều thể virus hoàn chỉnh mới Ngoài ra, vùng mũi họng còn có hệ thống dẫn lưu bạch huyết rất phong phú, nên trong UTVMH các hạch vùng cổ thường bị di căn rất sớm UTVMH được xếp vào các khối u đường tiêu hóa và hô hấp trên Về mặt lâm sàng, UTVMH có triệu chứng khá phong phú, dễ bị chẩn đoán nhầm với các bệnh thông thường khác trong tai mũi họng Do vậy, các bệnh nhân thường đến khám và được chuẩn đoán ở các giai đoạn muộn của bệnh, điều này làm ảnh hưởng tới kết quả điều trị bệnh [19]

Tại Việt Nam, đã có nhiều nhóm nghiên cứu mối liên quan của EBV và UTVMH Tác giả Phạm Huy Tần và cộng sự thuộc Trường ĐH Y Hà Nội đã nghiên cứu phát hiện nồng độ DNA của EBV trong huyêt tương ở 74 bệnh nhân UTVMH giai đoạn I và II-IVB và phát hiện thấy tỷ lệ EBV dương tính lên tới khoảng 63-67% Nhóm tác giả cũng chỉ ra có mối tương quan giữa nồng độ EBV với tình trạng

di căn hạch và giai đoạn ung thư (giai đoạn II đến IV) của bệnh nhân [4] Tác giả Nghiêm Đức Thuận tại Học Viện Quân Y cũng đã công bố về nghiên cứu phát hiện DNA của biểu mô sống không sừng hóa là 55% Tác giả Phạm Thị Trà, tại phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein đã công bố về phát hiện EBV trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân nghi có triệu chứng của bệnh UTVMH với tỷ

lệ mẫu dương tính phát hiện chỉ là 9% [5]

1.1.2.1 Giới thiệu chung về EBV

Nhóm tác giả Epstein, Barr và Pulvertafl phân lập được loại virus ở dòng lymphoblast trong khối u LB (Lympho’s Burkitt) bằng kính hiển vi điện tử [21] từ năm 1964 và từ đó, virus này được mang tên là Epstein Barr virus Tác giả Nadol và cộng sự phân lập được các hạt (virion) của EBV trong tế bào biểu mô ung thư vòm bằng kính hiển vi điện tử Đây là lần đầu người ta quan sát được các thể virus thuộc

họ Herpesviridae trong tế bào ung thư ở người, do đó EBV bị nghi ngờ là nguyên nhân gây ung thư ở người [1]

Hình 1.2: Hình ảnh Epstein Barr Virus dưới kính hiển vi điện tử [44]

EBV thuộc họ virus Herpesviridae, có hệ gen thuộc loại DNA sợi đôi xoắn

kép mạch hở, kích thước hệ gen khoảng 184 kb nếu tính cả phần lặp lại ở hai đầu

Hệ gen EBV có tổ hợp 6 gen mã hóa cho các loại protein kháng nguyên nhân (Epstein Barr virus nuclear antigen), được ký hiệu là: EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB và 3 gen mã hóa cho protein màng tiềm tàng (latent membral protein), được ký hiệu là: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B [16] Vai trò của 6 protein EBNA có liên quan đến quá trình nhân lên của EBV trong tế bào lympho B ở giai đoạn đầu xâm nhiễm còn 3 loại protein LMP có liên quan đến chu

kỳ nhân lên của EBV trong tế bào lympho B

Gen mã hóa cho protein EBNA-2 là một phân đoạn cơ bản trong gen EBNA của hệ gen EBV EBNA-2 có vai trò biệt hóa tế bào lympho B thành tế bào mầm

được sao chép sớm nhất do vai trò của nó trong quá trình điều tiết sự nhân lên của tế bào bị nhiễm EBNA-2 điều hòa quá trình sao chép gen và tổng hợp protein của cả virus và tế bào bị nhiễm EBV, protein EBNA-2 được coi là yếu tố quan trọng trong cảm ứng tăng sinh dòng tế bào lympho B [35]

Toàn bộ hệ gen của EBV được chứa trong một vỏ capsid Vỏ capsid này có hình thái đối xứng hình khối, đó là cấu trúc protein đóng kín bảo vệ nhân DNA của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV (kháng nguyên VCA), được xác định bởi 20 mặt bên, 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng Vỏ capsid lại được bao bọc bởi một vỏ bao ngoài khác gọi là vỏ ngoài (envelope) cấu trúc từ thành phần chủ yếu là glycoprotein Vỏ bao ngoài này cũng được mã hóa bởi gen virus và cũng dấu hiệu ấn miễn dịch (Hình 1.3)

Hình 1.3: Cấu trúc EBV [54]

1.1.2.2 Cơ chế gây bệnh của EBV

EBV sau khi nhiễm vào cơ thể có các hướng tiến triển được minh họa ở Hình 1.4 gồm hai trường hợp sau:

1 EBV xâm nhập trực tiếp vào tế bào biểu mô và nhân lên ((1))

2 Gây nhiễm trực tiếp vào tế bào lympho B, có tiềm năng cảm ứng biến đổi

tế bào nhiễm tiến triển gây ung thư ((2) (3) (4) (5) (6) (7) (8))

 Đối với trường hợp thứ nhất, EBV tìm thấy sự kích ứng trong tế bào biểu

mô và sự nhân lên của EBV thuộc loại hình gây nhiễm sinh tan Các thể EBV hoàn chỉnh có thể nhân lên trong tế bào biểu mô hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang lây nhiễm thứ cấp vào tế bào lympho B

 Trường hợp thứ hai, EBV nhiễm khởi phát vào tế bào lympho B có trong vùng họng, thực hiện xâm nhập và nhân lên trong tế bào lympho B và gây chuyển dạng tế bào này Những virus trong các tế bào lympho này tiếp tục tiến triển theo hướng: i) EBV nhân lên hàng loạt và ly giải (sinh tan) tế bào B, các thể virus hoàn chỉnh có thể đi theo các con đường bài tiết qua nước bọt, xâm nhiễm vào tế bào B hay xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô ((6), (7), (8)); ii) EBV tồn tại ở dạng tiềm tan trong tế bào B và gây ra đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Ở trạng thái tiềm tan có thể EBV thực hiện sự biến đổi tế bào lympho B, non hóa các tế bào này

và biệt hóa chúng tăng sinh và tiến triển chúng thành UTVMH Tuy nhiên, quá trình ung thư do EBV còn chịu nhiều tác động của các yếu tố đến từ bên ngoài và bên trong cơ thể mà cho tới nay các nhà khoa khọc vẫn đang làm rõ

Hình 1.4: Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của Epstein Barr virus trong cơ thể

1.1.2.3 Các phương pháp phát hiện EBV

Hiện nay có hai phương pháp phát hiện EBV đang được sử dụng trong các phòng xét nghiệm ở các bệnh viện, bao gồm:

 Phương pháp miễn dịch học: ELISA phát hiện kháng thể kháng EA (early antigen- kháng nguyên sớm) Tuy nhiên, kháng thể này chỉ xuất hiện trong khoảng vài tuần sau khi nhiễm EBV do đó khó có thể biết được sự biểu hiện của EBV trong

cơ thể người nhiễm khi đã qua giai đoạn đầu sau khi nhiễm vài tuần Kháng thể kháng lại VCA (kháng nguyên vỏ capsid) gồm có hai loại là IgG và IgM Tương tự như kháng thể kháng EA, kháng thể IgM cũng chỉ xuất hiện trong khoảng vài tuần sau khi nhiễm EBV Kháng thể IgG tồn tại suốt đời trong cơ thể người bệnh sau khi nhiễm nên kết quả chuẩn đoán thường không có ý nghĩa do không phân biệt được người đã từng bị nhiễm trong quá khứ đã khỏi bệnh và người đang bị nhiễm EBV Chính vì vậy, phương pháp miễn dịch thường không đem lại hiệu quả nhiều trong chẩn đoán và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan tới EBV [25]

 Phương pháp Real-time PCR sử dụng khuôn là DNA tổng số của virus để phát hiện trình tự gen đích của virus EBV trong mẫu bệnh phẩm bằng cách sử dụng thiết kế đầu dò (probe) có khả năng phát huỳnh quang dưới tác động của nguồn sáng kích thích Do vậy, chất lượng và hàm lượng DNA có vai trò rất quan trọng quyết định tới kết quả của phản ứng Real-time PCR Phương pháp phát hiện EBV bằng kỹ thuật Real-time PCR với độ chính xác và độ nhạy cao cho phép định tính, định lượng số lượng virus EBV trong mẫu mô bệnh phẩm của người nhiễm hỗ trợ cho chuẩn đoán, điều trị, tiên lượng các bệnh do tác nhân gây ra [34] Với các ưu điểm mà Real-time PCR mang lại thì phương pháp này hiện đang được sử dụng rộng rãi tại các các phòng xét nghiệm và các bệnh viện

1.1.3 Human Papilloma virus (HPV) tác nhân gây UTVMH

Nhiễm HPV là nguyên nhân dẫn đến rất nhiều bệnh lý nguy hiểm, trong đó có UTVMH UTVMH là một trong năm loại ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam và là

loại hay gặp nhất trong các ung thư vùng tai mũi họng Nghiên cứu của Hording và

cs 1994, Rassekh và cs 1998 hay nghiên cứu gần đây của Du- Bois và cs 2017 cho thấy UTVMH có liên quan đến sự có mặt của virus HPV trong máu hoặc niêm mạc họng [20 27, 36] Hording phát hiện ra sự có mặt của HPV trong nhiều mẫu UTVMH mà các mẫu này hoàn toàn âm tính với EBV Trong khi đó, cũng bằng kĩ thuật này Rassekh phát hiện tỷ lệ các mẫu có HPV là 88%; Năm 2017, Du- Bois chỉ phát hiện được 19,4% tỷ lệ mẫu dương tính với với HPV Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh mối liên quan giữa HPV và UTVMH

1.1.3.1 Giới thiệu chung về HPV

Papilloma virus là các thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy

trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con người Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papilloma virus đặc thù cho loài đó Các Papilloma virus gây bệnh cho người gọi là Human Papilloma virus (HPV)

HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ Hạt virus có đường kính 55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu) Cả 2 protein cấu trúc đều

52-do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước 55 kDa và chiếm 80% tổng số protein của virus Protein capsid phụ (L2) có kích thước 70 kDa [3333] HPV là virus có vật liệu di truyền là DNA, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-DNA) DNA của virus liên kết với histone tạo thành cấu trúc phức hợp giống Chromatin (Chromatin-like conplex) nằm trong lớp vỏ capsid protein

DNA của HPV là một mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại ở dạng siêu xoắn hình vòng, chứa khoảng 7800- 8000 cặp base, có 10 khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) Bộ gen HPV chia làm 3 vùng:

- Vùng điều hòa thượng nguồn chiếm 10% chiều dài bộ gen, có 800- 1000 cặp base, là vùng rất biến động Trình tự của vùng này gồm trình tự tăng cường để gắn kết các nhân tố phiên mã; promoter cho sự phiên mã để tổng hợp RNA và điểm khởi đầu sao chép ORF

- Vùng gen sớm: Có 6 gen, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF Sản phẩm vùng này là các protein chức năng giúp cho quá trình nhân lên của DNA, gây hiện tượng tăng sinh và biến đổi tế bào, hình thành tế bào bất tử

- Vùng gen muộn: Gồm 2 gen tổng hợp protein L1 và L2, là protein cấu trúc capsid của virus Đây là vùng gen mã hóa muộn hơn, do đó vùng chứa gen L1 và gen L2 còn được gọi là vùng sao chép muộn [12, 33]

Hình 1.5: Hạt virus và cấu trúc gen của HPV [55]

HPV là nhóm Papilloma virus gây bệnh trên người có nhiều genotype nhất HPV có thể được lây truyền trực tiếp qua da, niêm mạc hay các vết thương hở từ người bệnh sang người lành trong đó hơn 100 genotype được biết đến xác định được khoảng 40 genotype có khả năng gây bệnh và lây truyền qua đường tình dục [24] Dựa vào khả năng gây ung thư, HPV được chia thành 3 nhóm [12, 15, 17, 26]:

- Nhóm genotype HPV “nguy cơ thấp” (Low-risk type): những genotype thuộc nhóm này chỉ gây mụn cóc hoặc khối u lành tính DNA của chúng ở dạng vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể (NST) Các genotype HPV trong nhóm “nguy cơ thấp” thường gặp là: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81, 89 và CP6108

- Nhóm genotype HPV “nguy cơ cao” (High-risk type): gồm những genotype

có khả năng tích hợp DNA vào hệ gen người, làm rối loạn quá trình nhân lên của tế bào chủ gây ra hiện tượng tăng sinh và bất tử hóa tế bào hình thành các khối u Những genotype thuộc nhóm “nguy cơ cao” gồm: 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51,

52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82

- Nhóm genotype “chưa xác định nguy cơ” (Unknow-risk type): gồm đa số các genotype HPV chưa xác định được khả năng gây ung thư như: 2, 3, 7, 10, 13,

27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 91

1.1.3.2 Cơ chế gây bệnh của HPV

Human Papilloma virus (HPV) có DNA gồm 8000 cặp base Hai chuỗi, phân

tử DNA cuộn lại trong một vỏ protein bao gồm 2 phân tử L1 và L2 Bộ mã di truyền của HPV ngoài phần mã để tạo L1, L2 còn có phần mã hóa của 6 loại protein sớm từ E1 đến E7 cần thiết cho sự nhân đôi của DNA và sự thành lập hạt thể virion mới trong tế bào bị nhiễm HPV Các gen gây ung thư của HPV tác động vào gen của tế bào chủ vốn làm nhiệm vụ ức chế quá trình phát triển của tế bào (p53 và RB); do đó

sẽ gây ra sự phát triển hỗn loạn của nhóm tế bào bị nhiễm [42, 47]

Diễn tiến tự nhiên của HPV là khả năng lui bệnh đến khỏi hẳn, tuy nhiên, nhóm nguy cơ cao có thể gây tổn thương về mô học để hình thành ung thư [26, 42] HPV tác động vào tế bào biểu mô vảy không sừng hóa, với chức năng che chở, bảo

vệ, sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó được bong ra ngoài HPV sát nhập vào gen tế bào ký chủ, vùng gen E6, E7 điều khiển tổng hợp protein E6, E7 theo chiều hướng bất thường làm kích hoạt các chất sinh ung thư, bất hoại gen ức chế tạo khối u Các protein này làm vô hiệu hóa chức năng của protein điều khiển sự tăng trưởng tế bào làm tế bào tăng sinh liên tục và bất thường nên sinh ung thư Khi

tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô vảy, có khả năng lan rộng khỏi màng đáy vào lớp sâu hơn biểu mô vảy và hình thành ung thư giai đoạn xâm lấn [26, 42, 47]

1.1.3.3 Các phương pháp phát hiện HPV

Phương pháp xét nghiệm mô bệnh học: sau thời gian tồn tại tiềm ẩn trong cơ thể HPV sẽ kích hoạt tế bào cổ tử cung sinh sản nhanh dẫn đến các tổn thương dị sản tế bào ở mức độ nhẹ (CIN-1), vừa (CIN-2), nặng (CIN-3) rồi đến ung thư cổ tử cung Xét nghiệm mô bệnh học xác định sự có mặt của HPV thông qua sự thay đổi đặc hiệu cho những tế bào nhiễm HPV Nhược điểm của phương pháp này là chỉ phát hiện được HPV trong trường hợp sự xâm nhiễm của tác nhân đã gây ra những biến đổi tế bào, ở giai đoạn sớm hơn khi chưa có những thay đổi tế bào thì không thể phát hiện bằng phương pháp này [2]

HPV là loại virus có cấu trúc di truyền là DNA nên chúng không thể phát triển

trong điều kiện nuôi cấy tại phòng thí nghiệm mà phải thực hiện nghiên cứu invivo, các kháng nguyên capsid của virus xuất hiện không ổn định và kháng thể kháng protein của HPV vẫn tồn tại nên để tìm HPV cần phát hiện bộ gen có trong mẫu bệnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện DNA HPV chia thành hai nhóm: Nhóm có khuếch đại và không khuếch đại, trong

đó, nhóm khuếch đại được dùng trong nghiên cứu lâm sàng

Nhóm không có khuếch đại: Thường sử dụng là kỹ thuật Southern Blot Nhóm có khuếch đại: Được chia thành 2 nhóm là khuếch đại tín hiệu (thường

dùng là Hybrid Capture II (HCII) hoặc PCR- reverse Dot Blot) và khuếch đại chính

bộ gen của HPV (thường dùng PCR- Polymerase Chain Reaction)

Hiện nay, cơ bản có các phương pháp sau để phát hiện HPV

- Phương pháp mẫu dò trực tiếp (direct nucleic acid probe methods): Kỹ

thuật thường dùng là Southern Blot hoặc lai tại chỗ Đặc điểm của phương pháp này tương tự hóa mô miễn dịch là đánh giá sự hiện diện của nucleotid đích trong mẫu bệnh phẩm Các mẫu dò nucleotid được sử dụng trong phương pháp lai tại chỗ

là một đoạn gen ngắn đặc hiệu được đánh dấu Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ nhạy thấp, mất thời gian, cần nhiều DNA của HPV tinh khiết cao [2]

- Khuếch đại dấu hiệu lai (hybridization signal amplification) là phương

pháp được dùng khá phổ biến trong nghiên cứu và bước đầu đưa vào chẩn đoán, do một số hãng chuyên về chẩn đoán SHPT phát triển nhằm xác định các HPV genotype (Diagcor, Genoflow HPV DNA chip) Đại diện của phương pháp này là Hydrid capture II (HCII), là phản ứng lai đi kèm với khuếch đại tín hiệu, trình tự đích của khoảng hơn 33 HPV genotype khác nhau sẽ được khuếch đại bằng các primer có gắn biotin và lai trên DNA chip có blot các probe có trình tự đặc hiệu với sản phẩm PCR của từng genotype Sau khi phản ứng lai được tiến hành, tín hiệu biotin sẽ được phát hiện bởi streptavidin gắn enzym và khuếch đại bằng phản ứng hiện màu với cơ chất phù hợp.Tuy nhiên,việc định danh chính xác thường không thực hiện được Số bản DNA virus tối thiểu để xác định nhiễm HPV khi trong mẫu phải có từ 5000 bản sao trở lên [2, 7]

- Khuếch đại chuỗi đích (target amplification method): Polymerase Chain

Reaction (PCR) là phương pháp của khuếch đại chuỗi nucleotid đích, cho phép các vùng đặc hiệu của DNA nhân lên trong ống nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi đích để tạo ra nhiều bản sao từ một đoạn DNA hoặc RNA mà không cần sử dụng sinh vật sống Có nhiều kỹ thuật khác nhau như PCR đơn mồi, đa mồi, PCR tổ (nested PCR), PCR tổ không dừng (non- stop nested PCR), touch- down PCR, PCR sao chép ngược (RT- PCR) hoặc Real-time PCR… Trong đó, phương pháp phát hiện HPV bằng kỹ thuật Real-time PCR với ưu điểm thực hiện nhanh chóng (chỉ trong khoảng 1-2 tiếng), chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép định tính định lượng, phát hiện được các high-risk genotype HPV phục vụ cho chuẩn đoán, điều trị cho bệnh nhân Hiện nay, hãng Roche Diagnostics, Sacacae đã phát triển được kit chẩn đoán tới 14 high-risk HPV genotype bằng kỹ thuật real time Taqman PCR [2, 7, 26]

1.2 TÁCH CHIẾT DNA TỪ MÔ FFPE

1.2.1 Vai trò quan trọng của việc tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE

Sử dụng parafin trong bảo quản lâu dài các mô ung thư là một phương pháp hiệu quả giúp cung cấp nguồn mẫu dự trữ dồi dào và có chất lượng ổn định cho

dịch tễ học phân tử trên quy mô lớn Trong đó, việc tách chiết DNA từ các mẫu mô ung thư cố định bằng parafin là bước đi đầu tiên giúp phát hiện các biểu hiện phân

tử liên quan đến ung thư Để làm được điều đó, các kỹ thuật sinh học phân tử như: giải trình tự gen, real-time PCR thường được sử dụng nhằm xác định chính xác các đột biến gen hay định lượng mức độ biểu hiện của gen chỉ thị ung thư Qua đó, giúp các bác sỹ lâm sàng tiên lượng được bệnh, chẩn đoán chính xác hơn và chỉ định điều trị thuốc hướng đích hiệu quả Chẩn đoán ung thư học phân tử sẽ thất bại nếu không tách chiết được vật liệu di truyền từ các mẫu mô đã được xử lý formalin

và cố định bằng parafin [9, 26]

Trong đó, để tiến hành được các thí nghiệm như giải trình tự hay PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật gây bệnh thì yêu cầu đầu tiên đó là tách chiết được DNA từ các mẫu mô FFPE Với tầm quan trọng và thiết yếu như vậy đã có rất nhiều phương pháp tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE không ngừng được phát triển và cải tiến

Hình 1.6: Hình ảnh minh họa mẫu mô đúc trong khối nến [48]

1.2.2 Tách chiết DNA từ các mẫu mô FFPE

1.2.2.1 Thách thức của việc tách chiết DNA từ mô FFPE

Tách chiết DNA từ mô FFPE hiện tại vẫn là một thách thức lớn Formaldehyde (HCHO) - thành phần chính trong formalin dùng trong quá trình cố định mô tạo nên các liên kết chéo giữa protein và DNA hoặc ARN [32] Các liên kết

chéo này là nguyên nhân chính ức chế phản ứng khuếch đại của DNA sau tách chiết Hơn nữa, các tác nhân nhiệt độ, pH thấp, parafin trong quá trình tạo mẫu ban đầu cũng như xử lý nhiệt độ cao để loại bỏ liên kết chéo trong quá trình tách chiết khiến DNA bị đứt gãy thành các mảnh nhỏ, hàm lượng DNA tách chiết được ít, phản ứng PCR sau đó thường không đạt hiệu quả cao [23, 30, 38] Hiệu quả tách chiết DNA từ mô FFPE phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng mẫu và khâu xử lý ban đầu, nếu xử lý không tốt, liên kết chéo xuất hiện càng nhiều, việc tách chiết càng gặp khó khăn

Hình 1.7: Liên kết chéo trong mẫu mô FFPE [24]

1.2.2.2 Nguyên lý chung

Parafin phủ bên ngoài các mẫu mô bản chất là các hydrocacbon dạng ankan mạch thẳng khối lượng phân tử lớn, không hòa tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như ete, benzen hay một số este Để tách chiết được DNA từ mẫu

mô FFPE bước đầu tiên yêu cầu phải loại bỏ parafin Thông thường, xylen hoặc dầu khoáng sẽ được sử dụng để hòa tan lớp parafin phủ bên ngoài mô Sau đó dùng cồn rửa để loại hoàn toàn xylen hoặc dầu khoáng khỏi mẫu Bước tiếp theo phải phá vỡ

mô, tế bào để giải phóng nucleic acid Dung dịch dùng để phá vỡ mô và lớp vỏ protein thường có mặt chất tạo phức càng cua Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) để ức chế các nuclease thủy phân nucleic acid và Sodium Dodecyl Sulfate

chéo giữa nucleic acid với protein bằng cách ủ ở nhiệt độ cao trong thời gian dài [11, 23, 30, 38] Sau cùng các phương pháp khác nhau như sử dụng dung môi hữu

cơ phenol - chloroform, cột lọc có màng silica hoặc hạt nano bọc silica để thu được sản phẩm cuối cùng là DNA

1.2.2.3 Một số phương pháp tách chiết DNA từ mô FFPE

1.2.2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA từ mô FFPE bằng màng xốp silica

Phương pháp sử dụng màng xốp silica là phương pháp tiên tiến hiện nay đang được phát triển bởi nhiều công ty sinh học phân tử hàng đầu trên thế giới dựa trên nền tảng nguyên lý của phương pháp Boom [5, 40, 50, 52]

Hình 1.8: DNA liên kết với silica trong môi trường có nồng độ muối cao và

chất diện hoạt sức căng bề mặt thấp [56]

Sau khi mô, tế bào bị phá vỡ giải phóng DNA nhờ tác dụng của các enzyme ly giải, liên kết chéo trong DNA cũng bị loại bỏ bởi nhiệt cao Lúc này nhờ tác dụng của guanidine thiocyanate (GuSCN) với nồng độ cao đồng thời trong môi trường có sức căng bề mặt thấp, silica sẽ liên kết bền vững với các phân tử nucleic acid Trong cùng điều kiện đó, silica không có khả năng liên kết với protein, các đại phân tử sinh học khác Như vậy, khi hỗn hợp gồm nucleic acid, protein, và các đại phân tử sinh học khác cùng các mảnh xác tế bào khi đi qua cột có gắn màng xốp silica nhờ

ly tâm thì các phân tử nucleic acid sẽ được giữ lại vì liên kết với silica, còn các

thành phần khác sẽ bị rửa trôi Nucleic acid sau đó, được tách ra khỏi màng xốp silica nhờ dung dịch đệm thích hợp

Ưu, nhược điểm của phương pháp

Nucleic acid thu được có độ tinh sạch và nồng độ cao, không bị lẫn các dung môi hữu cơ như phenol Tiết kiệm thời gian khi tiến hành tinh sạch với số lượng mẫu nhỏ, nhưng sẽ gặp khó khăn khi số lượng mẫu quá lớn Một hạn chế khác nữa

là phương pháp này cần phải sử dụng máy ly tâm hoặc bơm hút chân không do đó không thể tự động hóa được quy trình tinh sạch

1.2.2.3.2 Phương pháp tách chiết DNA từ mô FFPE bằng hạt nano từ bọc silica

Tách chiết DNA sử dụng hạt nano từ là một trong các cải biến lớn của công nghệ sinh học Mở đầu với một bằng sáng chế của Trevor Hawkins tại Mỹ được công bố năm 1998 với tiêu đề “Tinh sạch và tách chiết DNA sử dụng hạt từ” [53], đến nay phương pháp này liên tục được cải biến, phát triển và ngày càng được áp dụng rộng rãi trong sinh học phân tử cho thấy tính tiên tiến và khả năng ứng dụng cao của hạt nano từ Nguyên lý của phương pháp này giống với phương pháp sử dụng màng xốp silica Thay vì sử dụng cột lọc có màng silica ở đây sử dụng hạt nano từ bọc silica cũng có khả năng liên kết với DNA tương tự như màng xốp silica Hạt nano từ có kích thước khoảng 20 nm bên trong chứa các hạt Fe3O4 có từ tính, và được phủ ngoài bởi lớp silica Trong môi trường nồng độ muối cao, pH thấp

và có mặt của các chất diện hoạt, DNA sẽ liên kết với các hạt nano từ thông qua cầu nối cation Na+ Mặc dù liên kết ion là liên kết yếu nhưng diện tích tiếp xúc lớn cộng với số lượng liên kết nhiều vẫn đảm bảo DNA được gắn chặt với hạt trong quá trình tách chiết [9-11, 28] DNA sau khi gắn chặt với hạt dễ dàng được loại bỏ hết các tạp chất nhờ hạt có từ tính nên phức hệ hạt từ - DNA được giữ lại bởi nam châm còn protein hay xác tế bào thì bị rửa trôi Cuối cùng DNA sẽ thu được dưới dạng tinh sạch khi tách ra khỏi hạt nano từ bọc silica bằng dung dịch đệm chiết đẩy phù hợp hoặc nước cất

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng hạt nano từ trong việc tách

sinh học hàng đầu như Qiagen, Thermo Fisher Scientific, Promega, Roche Diagnostic [49-52] Các công ty này nắm giữ bí quyết chế tạo các loại hạt nano từ

và thành phần đệm phù hợp để tách chiết DNA từ mô FFPE Trong nước, hiện tại chưa hề có các nghiên cứu về tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng hạt nano từ, tuy nhiên nhóm nghiên cứu của phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme & Protein của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã có các nghiên cứu tiền đề về sử dụng hạt nano từ bọc silica trong tách chiết DNA từ máu, mô sống và tinh sạch sản phẩm PCR [5, 35, 40]

Ưu, nhược điểm của phương pháp

Phương pháp tách chiết DNA từ mô FFPE sử dụng hạt nano từ bọc silica đem lại hiệu quả tách chiết cao, sử dụng hạt nano từ bọc silica làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc nên nồng độ và hàm lượng DNA thu được lớn hơn Thao tác khi tách chiết với hạt nano từ bọc silica cũng được đơn giản hóa so với các phương pháp khác Phương pháp này còn cho phép tách chiết trên số lượng lớn mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và tiết kiệm thời gian Điều đặc biệt, việc sử dụng hạt nano từ cho phép tiến hành tinh sạch một các tự động nhờ robot với quy trình đơn giản và thời gian tách chiết rút ngắn còn khoảng 3 tiếng cho 24-96 mẫu tùy vào số giếng trên giá nam châm của hệ thống tách chiết tự động Tuy nhiên, chỉ một số ít công ty công nghệ sinh học hàng đầu như Roche Diagnostic, Promega, Qiagen nắm giữ bí mật chế tạo hạt nano từ bọc silica, nên giá thành của phản ứng sử dụng phương pháp này là rất đắt

Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng hạt nano oxit sắt từ (chuyển giao công nghệ sản xuất hạt từ Trung Tâm Nano và Năng lượng, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên) để tinh sạch nucleic acid của virus trong huyết thanh vi khuẩn lao từ các mẫu bệnh phẩm khác nhau DNA từ tế bào máu sử dụng công nghệ tạo hạt nano Fe3O4 từ tính được bọc một lớp silica mỏng (Fe3O4@SiO2) [5, 35, 40]

1.3 SỰ CẦN THIẾT PHẢI TRIỂN KHAI VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Việc phát hiện sự có mặt của các virus EBV và HPV trong mẫu mô UTVMH

có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu sự tác động của EBV, HPV đối với UTVMH Để phát hiện sự có mặt của các virus trong mô ung thư, cần thiết phải tách được DNA tổng số từ các mô FFPE, lý do vì mô ung thư sinh thiết từ các bệnh nhân ung thư không được lưu trữ dưới dạng mô tươi mà đều được bảo quản ở dạng FFPE để phục vụ cho các xét nghiệm khác nhau và bảo quản mẫu được lâu dài ở nhiệt độ phòng Chính vì vậy, các quy trình và kết quả thu được trên mô sinh thiết tươi khó áp dụng trong thực tế chẩn đoán mà chỉ dừng ở ý nghĩa nghiên cứu Với những ưu điểm của hạt nano từ bọc silica mang lại trong việc tách chiết DNA từ

mẫu mô FFPE thì việc ứng dụng hạt nano từ tính trong tách chiết DNA từ các mô

FFPE UTVMH để sử dụng làm khuôn cho phản ứng real time PCR phát hiện virus EBV và HPV sẽ cho độ nhạy và chính xác cao hơn, nhờ đó sẽ đưa ra được mối liên quan giữa sự có mặt của virus EBV và HPV với bệnh UTVMH chính xác hơn

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Mẫu mô đúc trong thể vùi parafin

 Mẫu mô FFPE của bệnh nhân chẩn đoán mô bệnh học UTVMH được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Lĩnh Toàn, Khoa Sinh lý bệnh, Học viện Quân Y

 Mẫu mô FFPE của bệnh nhân chẩn đoán mô bệnh học ung thư đại trực tràng (UTĐTT) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Đại học Y Hà Nội

Trong đó kích thước lõi Fe3O4 của các hạt đều khoảng 10.7 nm và nồng độ đều

là 25 mg/ml (Bảng 2.1) Các loại hạt nano từ khác nhau ở độ dày của lớp bọc silica tạo nên đường kính của hạt tăng dần từ M1 đến M3 (24,5 nm đến 34,9 nm) Từ độ bão hòa của lõi Fe3O4 đều là 64 emu/g, sau khi bọc silica với các thời gian khác nhau tạo nên kích thước hạt càng lớn thì từ độ bão hòa càng giảm, từ 50,2 xuống 10,3 emu/g

Hình 2.1: Ảnh chụp hạt nano từ bọc silica dưới kính hiển vi điện tử

(Transmission Electron Microscope, TEM)

2.1.3 Các bộ kit thương mại tách chiết DNA từ mẫu mô FFPE

Bộ kit thương mại nhập ngoại được sử dụng thường quy tại tại bệnh viện TWQĐ 108 và Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Đại học Y Hà Nội được sử dụng trong nghiên cứu này: MagMAX FFPE DNA Isolation kit (96 phản ứng) có bản chất là hạt micro từ tính Fe3O4 của hãng Thermo Fisher Scientific (Mỹ)

2.1.4 Các cặp mồi, probe

Các cặp mồi và probe phục vụ cho nghiên cứu được ghi cụ thể trong Bảng 2.2

Betaglobin-P 5’-(HEX)-CTCXXXXXXXXXAGTC-(MGB)-3’

HPV- Fw1 5’- TTT AAT AAR CCA TAT TGG YTR CA - 3’

[26, 2713]HPV- Rv1 5’- ATT CAT AGT ATG WAT ATA KGY CAT - 3’

HPV- Fw2 5’- TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC - 3’

HPV- Rv2 5’- GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C - 3’

[57]

Ghi chú: XXXXXXXXX là trình tự xin phép không bộc lộ do liên quan tới các đề tài nghiên

cứu khác chưa nghiệm thu

2.1.5 Các hóa chất và nguyên liệu khác

 Muối Guanidine Hydrochloride (GuHCl), Kali acetate (KoAc) và Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Natriclorua (NaCl), CaCl2, Trixton-X20… của hãng Biobasic (Canada) dùng để pha chế các bộ đệm

 Các hóa chất master mix TOPreal™ qPCR 2X PreMIX, DNA Taq polymerase, dNTPs, pTOP T/A cloning kit được đặt mua từ hãng Enzynomics (Hàn Quốc), dùng trong phản ứng PCR và Real-time PCR, kết nối (ligase) khi nhân dòng chuẩn dương

 Kit tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng cột màng silica Anapure PCR & GEL purification mini kit của công ty ANABIO R&D (Việt Nam)

Các hóa chất khác như S-agarose, DNA ladder 100 bp (Enzynomics)…đạt tiêu chuẩn dùng trong nghiên cứu

2.1.6 Máy móc và thiết bị

Máy Real-time PCR (IQ5) của hãng BioRad, máy PCR Light cycler 96 của Roche Diagnostics, máy điện di ngang của GE Healthcare, máy soi gel tia UV-VIS của BioRad, máy Nano Drop ND-1000 (Thermo-Scientific, USA), cân điện 2

số và 4 số của Sartorius (Đức), máy vortex, máy khuấy từ gia nhiệt IKA (Đức), bể

ổn nhiệt…

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Chế tạo bộ đệm cho kit tách chiết

Chúng tôi xây dựng thành phần cơ bản của bộ kit bao gồm 5 loại đệm:

1 Lysis Buffer (LB): đệm có chức năng ly giải mẫu mô, cùng với tác động của proteinase K làm phá vỡ tế bào đồng thời giải phóng DNA hệ gen Đây là bước quan trọng quyết định tới việc tách DNA từ mẫu mô FFPE

2 Binding Buffer (BB): hay còn gọi là đệm gắn, sau khi DNA được giải phóng dưới tác động của LB và proteinase K thì việc gắn nó lên hạt từ silica là bước quan trọng thứ yếu quyết định hàm lượng và chất lượng DNA thu được

3 Washing Buffer 1 (WB1): đệm rửa nhằm loại bỏ mảnh xác tế bào, protein…

4 Washing Buffer 2 (WB2): có chức năng tương tự như đệm WB1, ngoài ra còn có vai trò rửa các muối còn lại của WB1, giúp DNA tinh sạch và không chứa chất ức chế các ứng dụng sau này

5 Elution Buffer (EB): đệm chiết đẩy DNA DNA tinh sạch được tách ra khỏi hạt MagSi nano bằng đệm EB và sử dụng trực tiếp cho ứng dụng mong muốn

LB và BB là hai đệm quan trọng nhất của bộ kit, có vai trò quan trọng quyết định tới việc tách chiết thành công DNA từ mẫu mô FFPE Còn các đệm WB1,

được mô tả bởi Hoa và cộng sự, Hùng và cộng sự [14,15] Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung nghiên cứu và chế tạo đệm LB và BB, các đệm còn lại được pha chế tương tự với các nghiên cứu trước

Đệm LB gồm 3 công thức đệm được pha chế và mã hóa với tên LB1, LB2, và LB3 Các đệm LB đều chứa một số thành phần cơ bản như Tris-HCl, SDS, Trixton-X100 và kết hợp với proteinase K để ly giải mô một cách hiệu quả Các đệm LB khác nhau cơ bản ở pH, pH ở đệm LB1, LB2, LB3 lần lượt là 7, 8, 9 Đệm BB cũng gồm 3 công thức đệm được pha chế và mã hóa với tên BB1, BB2, và BB3 Các đệm BB chứa thành phần cơ bản là GuHCl, TrisHCl và một số muối khác với pH phù hợp hỗ trợ việc gắn DNA lên hạt nano từ một cách tốt nhất Các đệm BB khác nhau cơ bản ở nồng độ GuHCl, nồng độ GuHCl ở đệm BB1 là 2 M, BB2 là 3 M và BB3 là 4 M

2.2.2 Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư bằng hạt nano

từ bọc silica và bộ đệm pha chế

Chia mẫu: Mẫu mô vùi parafin được cắt thành từng lát mỏng có độ dày khoảng

1mm, dài khoảng 20-50 mm Dùng cân tiểu ly cân các lát mô được cắt sao cho khối lượng mô khoảng 10 mg/phản ứng

Xử lý parafin: mẫu được xử lý với dung dịch dầu khoáng để loại bỏ lớp parafin Sau

đó, sử dụng cồn và nước để rửa sạch lượng dầu khoáng còn sót lại, chỉ giữ lại mô

Quy trình tách DNA từ mẫu mô FFPE:

Đầu tiên, 20 µl proteinase K và 200 µl LB (LB1, LB2, LB3) được bổ sung vào

10 mg mẫu mô ung thư đã được loại bỏ parafin bằng dầu khoáng Mẫu được ủ ở 60oC trong 1 giờ để ly giải mô giải phóng DNA, và tiếp tục ủ ở 90oC trong 1 giờ để loại bỏ liên kết chéo 400 µl BB (BB1, BB2, BB3), 200 µl isopropanol và 50 µl hạt nano từ bọc silica (M1, M2, M3) được bổ sung vào mẫu để DNA được gắn lên hạt MagSi nano Mẫu được đặt lên giá nam châm để tập trung phức hệ hạt gắn DNA và loại bỏ các tạp chất 500 µl WB1 và 500 µl WB2 lần lượt được bổ sung vào hạt để rửa bỏ các tạp chất còn sót lại trước khi chiết đẩy DNA ra khỏi hạt bằng 50 µl EB DNA được bảo quản ở -20oC hoặc sử dụng ngay cho phản ứng PCR tiếp theo

2.2.3 Tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư bằng hạt nano

từ bọc silica bằng bộ kit thương mại MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientific)

 Chuẩn bị RNase Solution: trước tiên, chuẩn bị RNase Solution, bảo

quản trên đá cho đến khi sử dụng: với tỷ lệ RNase A: Nuclease-Free Water là 1: 99 (thể tích RNase Solution cần dùng cho 1 phản ứng là 100 µl)

Bước 6: Sau khi ủ mẫu tại 80oC, thêm 620 μl Binding Solution vào mỗi giếng mẫu, spin đĩa mẫu trong 5 giây, ủ đĩa tại nhiệt độ phòng trong 5 phút

 Gắn DNA với Ncleic Acid Binding Beads

Bước 1: Thêm 20 μl Nucleic Acid Binding Beads vào mỗi giếng mẫu, sau đó lắc trong 3 phút với tốc độ 3-4, mix các giếng mẫu cẩn thận bằng pipet 10-12 lần Bước 2: Đặt đĩa mẫu lên đế từ 96 trong 3-5 phút hoặc cho đến khi dung dịch sạch

Bước 3: Cẩn thận hút và bỏ phần dịch nổi

 Rửa Nucleic Acid Binding Beads

Bước 1: Nhấc đĩa mẫu ra khỏi đế từ 96 và thêm 150 μl Wash Solution 1 vào mỗi giếng mẫu

Bước 2: Che đĩa mẫu và lắc với tốc độ 8 trong 1 phút