Phân lập các chủng vi sinh vật chuyển hóa nitơ, tạo biofilm và ứng dụng trong xử lí nước thải chăn nuôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Vũ Thị Huế PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ NITƠ, TẠO BIOFILM VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHĂN NU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Vũ Thị Huế

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ NITƠ,

TẠO BIOFILM VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ

NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Vũ Thị Huế

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CHUYỂN HOÁ NITƠ,

TẠO BIOFILM VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ

NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội, 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, người thầy đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hướng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh cũng như các Thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, Phòng Sau Đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã gi p đ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn b , những người đã động viên và tạo điều kiện thuận l i nhất cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Hà Nội, Ngày 28 tháng 11 năm 2017

Học viên

Vũ Thị Huế

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước hiện nay ở Việt Nam và Thế giới 3

1.1.1 Tình hình ô nhiễm môi trường nước 3

1.1.2 Tình hình ô nhiễm nước thải chăn nuôi 4

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa h p chất nitơ hiện nay.5 1.3 Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các h p nitrate 8

1.4 Màng sinh học và ứng dụng của màng sinh học trong việc xử lý ô nhiễm nước thải giàu nitơ……….……… 11

1.4.1 Màng sinh học 11

1.4.2 Vai trò và ứng dụng của sự hình thành màng sinh học 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên liệu 21

2.2 Hóa chất, thiết bị 21

2.2.1 Môi trường nuôicấy 21

2.2.2 Thiết bị ngiên cứu chính 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 22

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng hình thành biofilm 22

2.3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự hình thành màng sinh học 23

2.3.4 Phương pháp nhuộm Gram 24

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các h p chất nitơ 24

2.3.6 Phương pháp phân tích nitơ tổng số 25

2.3.7 Phương pháp phân tích hàm lư ng amoni (NH4+) 25

2.3.8 Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite 26

2.3.9 Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA 27

2.3.10 Phương pháp thống kê sinh học 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Vi khuẩn oxi hóa amoni 28

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn oxi hóa amoni 28

3.1.2 Khả năng tạo màng vi sinh vật 29

3.2 Vi khuẩn oxi hóa nitrite 30

3.2.1 Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn oxi hóa nitrite 30

3.2.2 Khả năng tạo màng vi sinh vật 31

3.3 Vi khuẩn phản nitrat hóa 33

3.3.1 Phân lập vi khuẩn phản nitrat hóa……… 33

3.3.2 Xác định khả năng phản nitrat hóa của các chủng phân lập đư c… 33

3.3.3 Xác định hoạt tính khử nitrat của các chủng tuyển chọn 33

3.4 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, tạo biofilm và hoạt tính chuyển hoá ni tơ của các chủng tuyển chọn khi kết h p với vật liệu mang 35

3.4.1 Hoạt tính oxi hóa amoni của vi khuẩn khi có vật liệu mang … 36

3.4.2 Hoạt tính oxi hóa nitrite của vi khuẩn khi có vật liệu mang ….… 37

3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 38

3.4.4 Ảnh hưởng của pH môi trường 40

3.4.5 Ảnh hưởng của nồng độ amoni và nitrit đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nitrate hóa tuyển chọn 43

3.5 Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của các chủng phân lập 45

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên 8

Hình 1.2 Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm 13

Hình 3.1 Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni 30

Hình 3.2 Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn oxi hóa nitrite 32

Hình 3.3 Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn khử nitrate 35

Hình 3.4 Hình ảnh tập đoàn vi sinh BNII-10 trong vật liệu mang polyurethane 37 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn ………39

Hình 3.6 Khả năng tạo màng vi sinh vật của chủng BNI-8 40

Hình 3.7 Khả năng tạo màng vi sinh vật của chủng BNII-9 40

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH tới chủng BNI-8 và BNII-9 41

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo màng và sinh trưởng 41

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo màng biofilm của chủng BNI-8 41

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo màng biofilm của chủng BNII-9.42 Hình 3.12 Ảnh hưởng của amoni, nitrit đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn 44

H nh 3.13 Cây phát sinh chủng loại các chủng phân lập BNI-8, BNI-9, BNII-9 và BNII-10 dựa trên trình tự gen mã hóa 16S RNAr 46

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Khả năng oxi hóa amoni của nhóm vi khuẩn oxi hóa amoni 28

Bảng 3.2 Khả năng tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn oxi hóa amoni 29

Bảng 3.3 Khả năng oxi hóa nitrite của nhóm vi khuẩn oxi hóa nitrite 31

Bảng 3.4.Khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi khuẩn lựa chọn 32

Bảng 3.5 Khả năng sinh khí của các chủng phân lập ……… 33

Bảng 3.6 Biến động hàm lư ng N-NO3 và N-NO2 trong môi trường nuôi vi khuẩn 34

Bảng 3.7 Khả năng tạo màng sinh học của các chủng nghiên cứu 35

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chất mang đến khả năng oxi hóa amoni của vi khuẩn 36

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của chất mang tới khả năng oxi hóa nitrite của các chủng 38

MỞ ĐẦU

Ô nhiễm nước thải hiện nay đang ở mức báo động Ô nhiễm nước là sự thay đổi theo chiều xấu đi các tính chất vật lý – hoá học– sinh học của nước, với sự xuất hiện các chất lạ ở thể lỏng, rắn làm cho nguồn nước trở nên độc hại với con người

và sinh vật Xét về tốc độ lan truyền và quy mô ảnh hưởng thì ô nhiễm nước là vấn

đề đáng lo ngại hơn ô nhiễm đất Xử lý nước thải trước hết nhằm mục đích cải thiện điều kiện vệ sinh môi trường sống của con người và xa hơn nhằm duy trì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển bền vững lâu dài cho loài người

Thành phần gây ô nhiễm trong nước thải, xét về khía cạnh tác động gây hại

và giải pháp công nghệ xử lý, có thể chia thành ba nhóm chính: nhóm chất hữu cơ

có khả năng sinh hủy, nhóm có thành phần dinh dư ng và nhóm loại h p chất hóa học nguy hiểm trong đó việc xử lý ô nhiễm từ nhóm thành phần dinh dư ng đư c quan tâm hơn cả

Thành phần dinh dư ng gây ô nhiễm hầu hết là h p chất nitơ Sự thâm nhập của các h p chất này vào nước gây ra hiện tư ng ph dư ng, th c đẩy tảo và các loại thủy thực vật phát triển mạnh khó kiểm soát về mật độ Hiện tư ng bùng nổ tảo dẫn đến khi tảo chết hàng loạt trong thời gian ngắn, chìm xuống đáy, tiếp tục bị phân hủy trong tình trạng yếm khí thay đổi điều kiện sống (pH, oxi hoà tan) là những tác nhân gây khó khăn, thậm chí là môi trường không thể sống đối với nhiều loài thuỷ, động vật

Nhiều các giải pháp kỹ thuật đư c sử dụng để xử lý nước thải đã và đang

đư c sử dụng trong các điều kiện khác nhau Mỗi giải pháp kỹ thuật đều có những

ưu, như c điểm riêng Hiện nay việc xử lý nước thải nói chung và nước thải ni tơ nói riêng theo hướng áp dụng các kỹ thuật sinh học đư c ch trọng phát triển do

ch ng có tính bền vững, thích nghi với nhiều điều kiện trong tự nhiên, đáp ứng

đư c mục tiêu bảo vệ nguồn nước, tiết kiệm năng lư ng, hóa chất vừa thu nhận và tiết kiệm đư c nguồn tài nguyên, phù h p với phương pháp luận “công nghệ xanh”

Nước thải chăn nuôi là loại nước thải có hàm lư ng các h p chất ni tơ cao Việc áp dụng phương pháp xử lý nước thải chăn nuôi bằng con đường vi sinh vật

còn góp phần tái sử dụng và thu hồi chất dinh dư ng từ phế thải

Vì vậy, ch ng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân lập các chủng

vi sinh vật chuyển hoá ni tơ, tạo biofilm và kết hợp với vật liệu mang trong xử lý nước thải chăn nuôi

Với nội dung nghiên cứu như sau:

 Phân lập và lựa chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa amoni, nitrite và đánh giá sự hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn này khi kết

h p và không kết h p với vật liệu mang

 Phân lập các chủng có khả năng phản nitrate hóa

 Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn đã đư c lựa chọn

 Định danh các chủng vi khuẩn đã đư c lựa chọn

Mục tiêu của nghiên cứu

 Phân lập và tuyển chọn đư c các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải nitơ (oxy hóa amoni, nitrite, phản nitrate hóa)

 Tối ưu đư c điều kiện nuôi cấy thích h p và đánh giá khả năng tạo biofilm

 Định danh đư c các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải nitơ đồng thời có khả năng tạo biofilm

Tính mới của nghiên cứu

Đã đóng góp và phát hiện đư c hệ gen vi sinh vật chuyển hóa nitơ, tạo biofilm

từ nước thải chăn nuôi tại Bắc Ninh

Đã nghiên cứu đư c các điều kiện tối ưu của môi trường trong việc chuyển hóa

và tạo màng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 T nh trạng ô nhiễm môi trường nước hiện nay ở Việt Nam và Thế giới 1.1.1 Ô nhiễm môi trường nước

Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang đư c quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới Nước thải là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường hiện nay Ô nhiễm nguồn nước không chỉ ảnh hưởng đến môi trường sống của con người, mà còn ảnh hưởng đến đa dạng sinh học, đến môi trường sống của các loài động, thực vật trên trái đất

Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trường nước mặt ở tất cả các chỉ

số đều vư t quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 08:2008/BTNMT Các chỉ số COD, BOD đều vư t quá tiêu chuẩn từ 5 đến 10 lần Hàm lư ng NH4+ trong môi trường nước bềmặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vư t quy chuẩn cho phép QCVN 08:2008/BTNMT cho nước mặt phù h p với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là là 0,2 mg/l Năm 2009, hàm lư ng NH4+ trong nước sông Nhuệ đo tại Cự Đà trên 10 mg/l vư t quá tiêu chuẩn 50 lần, sông Đáy đo tại Cầu Hoàng 3 mg/l vư t quátiêu chuẩn 15 lần, sông Cầu đo tại Thái Nguyên trên 22 mg/l vư t quá tiêu chuẩn 110 lần [2]

Theo Mulder, lư ng h p chất nitơ trong chuỗi thức ăn là 15 kg/người/năm, một phần trong đó đư c con người tiêu thụ, phần lớn đư c thải ra ngoài môi trường Tính theo đầu người, mỗi người thải ra 4,75 kg nitơ một năm Lư ng nitơ trong nước thải chiếm 30% lư ng nitơ tiêu thụ [41] Nước thải ở các đô thị chủ yếu ở dạng nitơ hữu cơ và amoni, trong đó 60% ở dạng hữu cơ và 40% ở trạng thái amoni

Ở Mỹ, hàm lư ng nitơ có trong nước thải phụ thuộc vào số dân và lưu lư ng nước thải hằng ngày Lư ng nitơ thải vào nguồn nước trung bình là 16g/người/ngày Hàm lư ng và các loại h p chất chứa nitơ thay đổi trong từng loại nước thải khác nhau Hàm lư ng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 đến 85 mg/l trong đó nitơ ở dạng h p chất hữu cơ trung bình từ 8 đến 35 mg/l, hàm lư ng N-NH3 từ 12 đến 50 mg/l [26]

1.1.2 Ô nhiễm nước thải chăn nuôi

Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn nước Ônhiễm nước thải chăn nuôi đặc trưng là ô nhiễm hữu cơ, hàm lư ng nitơ, photpho cao và vi sinh vật gây bệnh, hàm lư ng nitơ tổng số nằm trong khoảng từ

512 đến 594 mg/l, trong đó N- NH3 trong nước thải từ 304 đến 471 mg/l, hàm lư ng photpho tổng số dao động trong khoảng từ 13,8 đến 62 mg/l [6]

Trong những năm qua, mô hình chăn nuôi l n đã tạo nguồn thu nhập chính của nhiều hộ nông dân, đem lại nguồn thu nhập cũng như đóng góp vào sự phát triển kinh tế, cải thiện đời sống cho nhân dân địa phương Chăn nuôi l n tập trung hiện nay ở nước ta đã và đang phát triển mạnh cả về số lư ng trang trại, quy mô cũng như chất lư ng con giống

Qua kiểm tra thực tế kiểm tra nhiều các trang trại, gia trại nằm xen kẽ trong các khu dân cư, có quỹ đất nhỏ hẹp không đủ diện tích xây dựng các công trình bảo

vệ môi trường đảm bảo xử lý chất thải, nước thải đạt tiêu chuẩn cho phép, không đảm bảo khoảng cách vệ sinh đến khu dân cư gây ô nhiễm môi trường trầm trọng, ảnh hưởng đến đời sống, sinh hoạt của người dân xung quanh Trong số các trang trại chăn nuôi tập trung và các hộ gia đình chăn nuôi quy mô lớn đang hoạt động, mặc dù đã đầu tư xây dựng hệ thống xử lý nước thải bằng hệ thống hầm Biogas, qua lắng lọc sau đó thải ra môi trường, hoặc chất thải chăn nuôi đư c xử lý bằng đệm lót sinh học Tuy nhiên các biện pháp này chỉ giảm thiểu ô nhiễm khi số đàn gia s c gia cầm vừa đủ, nước thải sau xử lý vẫn có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường, đặc biệt là khi các cơ sở không tuân thủ quy trình sản xuất, quy trình vận hành hệ thống xử lý chất, nước thải đư c xả thẳng ra cống rãnh, ao hồ, sông suối Nhiều công trình nghiên cứu trong nước đã điều tra tình hình chăn nuôi và đưa ra một số giải pháp xử lý về chuồng trại, xử lý nước thải bằng biogas gi p giảm thiểu ô nhiễm môi trường Theo kết quả nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy kết quả xác định nồng độ khí độc tại chuồng trại nông nghiệp Nồng độ NH3:0,94 mg/m3;

H2S: 0,38 mg/m3; CO: 6,7 mg/m3; NO2- 0,25 mg/m3; SO2: 0,45mg/m3so với TCVN 5938-95; 5937-95 nồng độ này cao hơn mức cho phép từ 2-3 lần

Theo Cục chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), mỗi năm ngành chăn nuôi gia s c, gia cầm thải ra khoảng 75-85 triệu tấn chất thải Các chất này thường xuyên không đư c xử lý ổn định đã gây ra ô nhiễm môi trường trầm trọng Ngoài ra trong nước thải chăn nuôi còn có các vi sinh vật, các bào tử nấm, giun sán… Đây là nguyên nhân gây ra các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa Tổ chức

Y tế thế giới (WHO) đã cảnh báo, nếu không có biện pháp thu gom và xử lý chất thải chăn nuôi một cách sẽ ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người vật nuôi Không những thế, ô nhiễm môi trường còn phát sinh dịch bệnh như lở mồm long móng, bệnh tai xanh gây tổn thất cho ngành chăn nuôi

Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia tăng Ở Việt Nam, phương pháp xử lý rác thải chính vẫn là sử dụng các hố chôn lấp Nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm quanh khu vực Trong nước thải rỉ rác chứa rất nhiều thành phần độc hại khác nhau trong

đó đặc biệt là hàm lư ng chất hữu cơ cao Tổng hàm lư ng nitơ trong nước thải rỉ rác dao động trong khoảng từ 200 đến 2000 mg/l, hàm lư ng amoni cao, trung bình

200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l [6]

1.2 Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ

Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải đư c áp dụng như phương pháp cơ học, phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học Tất

cả các phương pháp xử lý hiện nay đều có những ưu, như c điểm Trong thực tế, quá trình xử lý nước thải cần có sự kết h p của nhiều phương pháp nhằm nâng cao hiệu quả và giảm thời gian xử lý Ví dụ, có thể sử dụng phương pháp cơ học gi p loại bỏ các chất thải có kích thước lớn ban đầu, sau đó có thể áp dụng các phương pháp hóa học, sinh học nhằm loại bỏ các chất độc bảo đảm tính bền vững cho môi trường

Phương pháp hóa học

Cơ sở của phương pháp hóa học là dựa trên các phản ứng hóa học Các phản ứng hóa học đư c ứng dụng trong xử lý nước thải như phản ứng oxy hóa, phản ứng

trung hòa, phản ứng keo tụ… giữa chất ô nhiễm và các hóa chất bổ sung

Quá trình xử lý nước thải chứa nitơ dựa trên nguyên tắc hóa học, nước thải

đư c đưa đến pH trong khoảng từ 10 đến 11 bằng cách thêm Ca(OH)2 để tạo thành

NH4OH, khi đó amoni chuyển từ trạng thái lỏng sang khí và sau đó đư c đưa ra ngoài không khí qua các tháp làm lạnh [56] Cheung và cộng sự đã sử dụng Ca(OH)2 với nồng độ là 10 g/l, sau thời gian xử lý là 24 giờ và ở nhiệt độ từ 20 đến

23oC Kết quả cho thấy đã xử lý 65 – 75% NH4+ khi lưu lư ng không khí bằng với môi trường, và 86 – 93% NH4+ khi lưu lư ng không khí là 5l/ ph t [16] Ozturk và cộng sự đã áp dụng phương pháp này, sau 2 giờ, đã xử lý đư c 72 – 85% lư ng amoni trong nước thải rỉ rác khi bổ sung Ca(OH)2 với hàm lư ng là 8 g/l và lưu

lư ng không khí là 7,6 l/ph t Tuy nhiên phương pháp này có chi phí xử lý cao do đòi hỏi lư ng không khí lớn và lư ng Ca(OH)2 sau đó phải đư c xử lý với H2SO4rước khi thải ra môitrường [48]

Li và cộng sự đã thử nghiệm một phương pháp để loại bỏ amoni trong nước thải thông qua việc kết tủa amoni dưới dạng (NH4)MgPO4.6H2O khi thêm MgCl2 và

Na2HPO4 trong quá trình xử lý Bằng phương pháp này, với tỷ lệ Mg: NH4: PO4 = 1:1:1 và pH trong nước từ 8,5 đến 9, nồng độ amoni trong nước thải rỉ rác giảm từ 5.600 mg/l xuống chỉ còn 110 mg/l trong 15 ph t [38] Phương pháp này cũng đã

đư c Yangin và cộng sự áp dụng đối với nước thải sinh hoạt, kết quả đã loại bỏ

đư c 66% lư ng amoni trong nước thải và phương pháp này còn có thể ứng dụng cho việc loại bỏ h p chất chứa photpho trong nước thải [66] Một phương pháp để

xử lý nitơ khác là bổ sung thêm clo vào nước thải trong quá trình xử lý Khi cho clo vào nước thải, NH3 sẽ phản ứng với clo dưới dạng HOCl để tạo ra các sản phẩm trung gian là NH2Cl, NHCl2, NCl3 Quá trình xử lý sẽ diễn ra liên tục khi thêm HOCl vào phản ứng để tạo ra sản phẩm cuối cùng là nitơ phân tử [56] Quá trình này diễn ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, thời gian xử lý và tỷ lệ HOCl/

NH3 [49] Với tỷ lệ HOCl/ NH3 đư c tính theo mol bằng 1 tại pH trong khoảng từ 7 đến 8 tất cả NH3 đều chuyển hóa thành NH2Cl Với tỉ lệ HOCl/ NH3 bằng 2 sản phẩm chủ yếu là NHCl2, khi tỉ lệ trên bằng 3 thì sản phẩm xử lý tạo ra chủ yếu là

Để xử lý nước thải chứa nitơ theo phương pháp sinh học Các nghiên cứu dựa trên cơ sở là trong tự nhiên luôn tồn tại các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa

h p chất nitơ Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên đư c trình bày ở hình 1.1 [53, 57]

Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng khác đều đư c tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng

lư ng hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của ch ng Các dạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết đư c các vi khuẩn amoni hóa chuyển hóa thành dạng NH4+ sau đó NH4+đư c chuyển hóa thành NO2- nhờ vi khuẩn nitrite hóa, NO2- sinh ra đư c nhóm sinh vật nitrate hóa chuyển hóa thành

NO3; cuối cùng nitrate đư c nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ quá trình khử nitrate (Hình 1.1) [23, 24]

Hình 1.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên [69, 70]

1.3 Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp nitrate

Nitrate (NO3-) đư c chuyển hóa bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter Winogradsky, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis

Nitrosomonas

NH4+ + 1,5O2 NO2- + H2O + 2H+ + 2H+ NO2- + 0,5O2

NH4+ + 1,5O2 NO3- + H2O + 2H+

4NO3- + 4 H+ + 5Chữucơ 5CO2 + 2N2 + 2H2O

Tế bào đặc trưng của nhóm vi khuẩn Nitrobacter trong dịch nuôi là dạng

hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động Khi điều kiện không thuận l i ch ng có thể liên kết với nhau thành tập đoàn

Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, thỉnh thoảng có dạng hình cầu,

không di động chất chứa nitơ trong xử lý ô nhiễm nước thải

Trong nước thải có nhiều thành phần khác nhau, bao gồm các h p chất hữu

cơ và vô cơ Trong đó các h p chất chứa nitơ và photpho chiếm tỷ lệ lớn

Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH4+ thành NO3- cung cấp năng lư ng cho vi sinh vật hoạt động Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO2 Hầu hết các vi sinh vật tự dư ng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có

khả năng thực hiện quá trình này Nitrate hóa qua 2 giai đoạn:

Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa amoni (NH4+) thành nitrite (NO2-) bởi một số

đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas,Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus Tất cả ch ng khá giống nhau về mặt sinh lý, sinh

hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu tr c tế bào Các đại diện của chi

Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục Trên môi trường lỏng, quá trình phát triển của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas trải qua một số giai

đoạn và phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường [12, 27]

Giai đoạn 2 củaquá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite (NO2-) thành và có đặc

trưng là liên kết tạo thành tập đoàn Nitrococcus mobili thì có dạng hình tròn, có

tiêm mao [5]

pH thích h p cho nhóm vi khuẩn Nitrosomonas là từ 7,8 đến 8, Nitrobacter là

từ 7,3 đến 7,5 Nitrobacter sẽ tăng trưởng chậm hơn ở các mức pH cao đặc trưng cho các thủy vực nước mặn Nitrosomonas sống ở những nơi giàu NH3 và các muối

vô cơ như trong bùn đáy ao, nước cống, nước ngọt, các thủy vực bị ô nhiễm chứa

nhiều h p chất nitơ nhằm tránh ánh sáng Nitrobacter không có khả năng di động và

cần phải bám vào bề mặt giá thể như đá, cát, hoặc một giá thể sinh học…

Nitrobacter không thể sống trong môi trường khô Trong môi trường nước, ch ng

có thể tồn tại trong khoảng thời gian ngắn ở các điều kiện bất l i nhờ vào việc sử dụng các chất dự trữ bên trong tế bào [31]

Oxy hóa amoni bao gồm hai phản ứng kế tiếp nhau nên tốc độ oxy hóa củaquá trình bị khống chế bởi gian đoạn có tốc độ thấp hơn Tốc độ phát triển của

Nitrosomonas chậmhơn Nitrobacter do đó nồng độ NO2- thấp hơn trong giai đoạn

ổn định Vì vậy trong quá trình động học người ta chỉ sử dụng các thông số liên

quan đến vi khuẩn Nitrosomonas để đặc trưng cho quá trình oxy hóa amoni [31]

Quá trình chuyển hóa các h p chất chứa nitơ không chỉ diễn ra do các chi vi khuẩn nói trên mà trong tự nhiên còn nhiều nhóm vi sinh vật khác cũng có khả năng chuyển hóa như vậy Nghiên cứu khả năng chuyển hóa amoni, nitrite, nitrate, Zhang

và cộng sự đã phân lập đư c chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri không chỉ có

khả năng chuyển hóa nitrite mà còn có khả năng chuyển hóa amoni Sau thời gian

18 giờ, chủng vi khuẩn này đã chuyển hóa đư c amoni hoàn toàn thành dạng khí

N2 với hiệu suất là 39% [47] Nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn Bacillus

methylotrophicus trong xử lý nitơ cho thấy trongmôitrườngở điều kiện pH từ 7 đến

8 và nhiệt độ là 37oC, chủng B.methylotrophicus đã làm nồng độ NH4+ ban đầu 146,71mg/l giảm xuống 38,29 mg/l sau 9 ngày nuôi cấy, với tốc độ chuyển hóa là 51,58 mg/l/ngày [38]

Nghiên cứu của Broda cho thấy sự tồn tại của các vi khuẩn gọi là anammox [15] Các vi khuẩn này có thể oxy hoá amoni trong điều kiện kị khí (Anaerobic Amoni Oxidation) hay còn gọi là anammox Các nhà khoa học Hà Lan và Đức đã

nghiên cứu và phát hiện các vi khuẩnnày thuộc năm chi gồm Brocadia,Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia và Scalindua, bộ Planctomycetales, ngành Planctomycetes [22, 32] Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử cũng như đặc điểm sinh

lý, sinh hóa Schmid cùng cộng sự đã phân loại đư c vi khuẩn Kuenenia stuttgartiensis thuộc nhóm vi khuẩn anammox [43] Ngoài phương pháp xử lý sinh

học kết h p hai quá trình nitrate hoá và khử nitrate có thể loại bỏ đư c amoni ra khỏi nước thải trong thực tế còn tồn tại một số vi khuẩn có khả năng oxy hoá amoni thành dạng khí N2 sử dụng nitrite đư c hình thành từ quá trình xử lý thay thế cho việc phải sử dụng oxy cấp từ nguồn bên ngoài vào [18, 30]

Trong tự nhiên, ngoài các chi Nitrosomonas, Nitrobacter có khả năng chuyển

hóa h p chất chứa nitơ có trong nước thải là NH4+

, NO2-,NO3- còn có một số chi vi

sinh vật khác như Bacillus, Pseudomonas…

NO3- là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa amoni chưa đư c coi làbền vững và còn gây độc cho môi trường nên cần phải chuyển hóa về dạng khí N2

Vi sinh vật thực hiện quá trình chuyển hóa là các vi sinh vật khử nitrate bao gồm

một số vi sinh vật thuộc các chi như Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas, Thiobacillus [22] Các vi sinh vật khử nitrate sử dụng oxy hoặc nitrate, nitrite làm

chất oxy hóa để cung cấp năng lư ng cho các quá trình sinh hóa

Quá trình khử nitrate thường đư c nhận dạng là khử nitrat kị khí, tuy nhiên

diễn biến quá trình sinh hóa không phải là quá trình lên men kị khí mà nó giống quá trình hô hấp hiếu khí nhưng thay vì sử dụng oxy, vi sinh vật sử dụng nitrate, nitrite

Để khử nitrate, vi sinh vật cần có chất khử (nitrate là chất oxy hóa), chất khử có thểlà chất hữu cơ hoặc vô cơ như H2, S, Fe2+ Phần lớn vi sinh vật khử nitrate thuộc loại dị dư ng, sử dụng nguồn cacbon hữu cơ để xây dựng tế bào ngoài phần sử dụng cho phản ứng khử nitrate Rất ít vi sinh vật khử nitrate thuộcloại tự dư ng, ví

dụ Thiobacillus denitrificant sử dụng lưu huỳnh làm chất khử [3, 27]

1.4 Màng sinh học và ứng dụng của màng sinh học trong việc xử lý ô nhiễm nước thải giàu nitơ

1.4.1 Màng sinh học

1.4.1.1 Định nghĩa về màng sinh học

Màng sinh học (biofilm) đư c định nghĩa là một tập h p của vi sinh vật liên kết với nhau thông qua mạng lưới polymer ngoại bào [21] Màng sinh học có thể hình thành do tập h p các tế bào của cùng một vi sinh vật hay các vi sinh vật khác nhau Trong tự nhiên, màng sinh học thường là sự liên kết của vi khuẩn, nấm, tảo,

xạ khuẩn Trong màng sinh học các tế bào tập h p thành các đơn vị cấu tr c là các

vi khuẩn lạc Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành màng cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các h p chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ tr tế bào như lông roi, lông nhung hỗ tr cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể [44]

1.4.1.2 Thành phần và quá trình hình thành màng sinh học

Cấu tr c của màng sinh học trong tự nhiên gồm hai thành phần chính là các tập h p tế bào vi sinh vật và mạng lưới các chất ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances - EPS) Các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám dính trên bề mặt nhất định (có thể là hữu sinh hay vô sinh) Các tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào Có thể nói màng sinh học là dạng sống khá phổ biến của nhiều loài vi sinh vật [37, 39]

Mạng lưới các chất ngoại bào (EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu tr c đặc trưng cho biofilm Mạng lưới ngoại bào có độ dày từ 0,2 đến1µm.Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn nằm trong khoảng từ 10 đến 30 nm [19] Mạng lưới các chất ngoại bào có vai trò quy định sự sắp xếp tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong biofilm nhờ đó mà các chất dinh

dư ng cũng như nước có thể lưu thông trong biofilm tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dư ng đến khắp các tế bào vi sinh vật trong biofilm cũng như loại bỏ đi những chất thải không cần thiết [35]

Về cơ bản màng sinh học đư c cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lư ng tế bào vi sinh vật chiếm từ 2 đến5% tổng khối lư ng biofilm Trong biofilm ngoài thành phần tế bào thì có tới 97% là nước, 3 đến 6% còn lại là EPS và ion Một tế bào vi khuẩn tùy thuộc vào điều kiện môi trường khác nhau có thể hình thành biofilm ở các dạng khác nhau Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và điều kiện hình thành nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysaccharide chiếm khoảng từ

40 đến 95%, từ 1 đến 60% là protein, từ 1 đến 10% là axit nucleic, và từ 1 đến 40% lipit về khối lư ng [19, 25] Các h p chất này thay đổi theo không gian và thời gian tồn tại của màng sinh học Về cơ bản màng sinh học càng dày và thời gian tồn tại càng lâu thì có hàm lư ng EPS càng nhiều

Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ sâu Trái lại, thành phần EPS lại phong ph hơn ở vùng phía trong biofilm Thành phần EPS trong biofilm cũng khác biệt so với ở dạng sống tự do của chính vi khuẩn

đó [19] EPS có thể chiếm 50% đến 90% của tổng cacbon hữu cơ của các màng sinh học và có thể coi là thành phần chính của màng sinh học EPS có thể thay đổi mộtvài tính chất hóa học và vật lý, nhưng thành phần chính của nó chủ yếu vẫn gồm các polysaccharides Có thể là các polysaccharides trung tính hay là polyanionic là thành phần chính của EPS vi khuẩn Gram âm Một số vi khuẩn Gram dương, thành phần hóa học của EPS có thể khác nhau và chủ yếu là cation [62]

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, sinh học phân tử, cùng với

những phân tích về mặt cấu tr c của màng sinh học, các nhà khoa học đã đưa ra một

mô hình cấu tr c màng sinh học cơ bản [18] Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và đư c bao quanh bởi một mạng lưới chất ngoại bào

gi p các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật Nhờ đó, dịch tế bào có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dư ng đến khắp các

tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải Sự hình thành biofilm là quá trình phát triển mà trong đó vi khuẩn trải qua những thay đổi trong cách thức tồn tại để chuyển từ dạng sống đơn bào, riêng rẽ sang dạng tập h p nhiều tế bào, cố định một chỗ và có sự sinh trưởng cũng như biệt hóa tế bào khác với dạng sống trôi nổi Có năm giai đoạn chính trong quá trình hình thành và phát triển của một biofilm (Hình 1.2) [40]

Hình 1.2 Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm [40]

1.Giai đoạn gắn kết, 2 Hình thành lớp tế bào, 3 Hình thành mạng lưới ngoại bào,

4 Hình thành màng sinh học hoàn chỉnh, 5 Quá trình tách rời

Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch lên giá thể

Trong một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn

có thể di chuyển hướng đến bề mặt bởi hóa ứng động và hình thành mối tương tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lựch ttình điện, liên kết hydro Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động

co r ttế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào gi p các

tế bào riêng rẽ đư c bao bọc trong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật Giai đoạn gắn kết thuận nghịch có vai trò quyết định một màng sinh học có thể đư c hình thành hay không [8, 46]

Giai đoạn 2: Hình thành lớp tế bào

Khi các tế bào đầu tiên bám dính chặt hơn trên bề mặt giá thể, l c này các tế bào sử dụng các chất hữu cơ trên bề mặt giá thể và trong môi trường để sinh trưởng phát triển tạo nên các vi khuẩn lạc đồng thời cũng trải qua những thay đổi về số

lư ng tế bào, số lư ng loài cũng như cấu tr c tế bào nhất định Sản sinh ra các h p chất ngoại bào, gi p cho các tế bào bám dính chặt, không thuận nghịch trừ khi có tác động của các tác nhân vật lý, hóa học Các tế bào giảm mức độ sinh trưởng, tiêu giảm các phần phụ tr tế bào

Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới ngoại bào

Các h p chất polymer ngoại bào tiếp tục đư c tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các khuẩn lạc

Ch ng cũng có vai trò trong việc thu h t các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh học cũng như lư ng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên Một màng sinh học dần

đư c hình thành

Giai đoạn 4: Hoàn thành một màng sinh học hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trưởng thành của màng sinh vật bắt đầu Các tế bào phân chia và phát triển, hình thành các cụm tế bào vi khuẩn và mở rộng về không gian, hình thành một cấu tr c màng sinh học hoàn chỉnh Từ một phạm vi ban đầu màng sinh học có thể mở rộng

về không gian cũng như độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trường Một màng sinh học hoàn chỉnh có cấu tr c giống như tháp hình nấm đư c bao quanh bởi các kênh vận chuyển nước có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dư ng và oxy vào bên trong màng [28]

Giai đoạn 5: Quá trình tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh học bị giới hạn do nhu cầu dinh dư ng

của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào Các phân tử này đư c giải phóng ra nhằmđáp ứng với những hạn chế về dinh dư ng, sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy [45] Trong một số trường h p, khi màng sinh học đạt đến khối lư ng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc Sự phân hủy các polymer ngoại bào có thể diễn ra trong điều kiện thiếu hụt dinh dư ng hay oxy bên trong màng sinh học

Quá trình này liên quan đến sự tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa cho enzyme phân hủy carbohydrate tạo nên các lực liên kết yếu hơn trong màng sinh học, dẫn đến sự phân tách các tế bào riêng rẽ đồng thời operon mã hóa cho protein lông roi đư c tăng cường biểu hiện để chuẩn bị cho các tế bào sống tự do khi tách rời khỏi màng [43, 45]

1.4.2 Vai trò và ứng dụng của sự h nh thành màng sinh học

1.4.2.1 Vai trò của sự hình thành màng sinh học

Sự hình thành màng sinh học mang lại l i ích cho chính bản thân vi sinh vật Trong quá trình hình thành màng sinh học, các tế bào phải trải qua một số thay đổi

về hình thái, đặc tính sinh lý và một trong những thay đổi quan trọng là việc hình thành mạng lưới các chất ngoại bào bao quanh Mạng lưới này gi p giữ lại chất hữu

cơ không hòa tan từ môi trường nước xung quanh tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển Đồng thời nó cũng có vai trò trong việc kiến tạo cấu tr c không gian 3 chiều đặc trưng cho màng sinh học bằng cách tạo nên một mức độ ổn định, một sự cân bằng nội môi cho các vi sinh vật

Bên cạnh đó một vai trò quan trọng của mạng lưới ngoại bào là đem lại khả năng chống lại các tác nhân kháng khuẩn cho các tế bào sinh sống trong một màng sinh học Theo Flemming, vi khuẩn có thể có khả năng kháng đối với các tác nhân gây hại (chất kháng sinh, chất hoạt động bề mặt ) cao gấp 1000 lần khi gắn kết với nhau tạo thành màng sinh học so với tế bào sống trôi nổi Mạng lưới các h p chấtngoại bào cũng đư c ghi nhận có khả năng gi p tế bào chống lại tác động của

kim loại nặng, các ion và chất độc, gi p tế bào tránh khỏi rất nhiều yếu tố gây tác động xấu tới vi sinh vật từ môi trường như tia UV, pH, sốc thẩm thấu và sự khô hạn [23]

Những kênh vận chuyển nước nằm xen kẽ trong cấu tr c của màng sinh học, giữa các vùng bao quanh vi khuẩn lạc đư c ví như là một hệ thống tuần hoàn

Ch ng hoạt động hiệu quả trong quá trình trao đổi chất với môi trường xung quanh,

do đó làm tăng hiệu quả trong việc sử dụng nguồn dinh dư ng cũng như loại bỏ các sản phẩm chuyển hóa có khả năng gây độc hại Nhờ vậy quá trình chuyển hóa các chất trong đó cũng mang những đặc trưng khác so với dạng sống tự do [7]

Mặt khác quá trình hình thàng màng sinh học gi p vi sinh vật tận dụng đư c nguồn chất hữu cơ bám dính trên bề mặt giá thể cũng như các cơ chất, chất dinh

dư ng tạo ra từ các loài vi sinh vật khác sống chung

Một màng sinh học có thể đư c hình thành do sự h p tác cùng chung sống của nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu tr c không gian phức tạp Các loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về dinh dư ng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ổ sinh thái” trong biofilm Chẳng hạn như những vi sinh vật nằm phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí cao trong khi những loài nằm phía trung tâm biofilm có xu hướng chịu đư c nồng

độ oxy thấp (vi hiếu khí)

Khả năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dư ng khác nhau gi p các loài

vi sinh vật tận dụng đư c nguồn dinh dư ng từ môi trường đồng thời hỗ tr lẫn nhau theo hướng cùngcó l i trong quá trình chuyển hóa vật chất Mối quan hệ h p tác giữa các loài trong biofilm cũng có ảnh hưởng lớn đến chu trình tuần hoàn của các nguyên tố trong tự nhiên Hầu hết các quá trình trong tự nhiên đòi hỏi sự phối

h p của nhiều nhóm vi khuẩn có cơ chế trao đổi chất khác nhau để cùng phân giải một h p chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau cùng cư trú trong biofilm sẽ góp phần th c đẩy các quá trình này diễn ra nhanh hơn [35] Quá trình truyền gen ngang đóng vai trò quan trọng trong việc th c đẩy sự tiến hóa của các cộng đồng vi sinh vật Trong đó cơ chế truyền gen phổ biến ở

visinh vật là truyền gen thông qua plasmid và cầu tiếp h p Tuy nhiên từ những hiểu biết rằng hầu hết các vi khuẩn trong tự nhiên định cư dưới dạng biofilm, liên kết với nhau bởi mạng lưới các chất ngoại bào thì việc tiếp h p giống như là cơ chế

mà nhờ đó vi khuẩn trong biofilm có thể truyền gen từ tế bào này sang tế bào khác [35]

1.4.2.2 Ứng dụng của màng sinh học trong xử lý ô nhiễm

Màng sinh học tác động đến rất nhiều lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày

Do vậy nhiều nghiên cứu hiện nay về màng sinh học có ý nghĩa thực tiễn quan trong

và ngày càng thu h t sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Một số ứng dụng cụ thể của màng sinh học nói riêng và các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học nói chung

là xử lý ô nhiễm

Trong công nghiệp lên men tại các bể lên men là nơi giữ lại sinh khối vi sinh vật Thông thường các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng đư c giữ lại trong các bồn lên men sau mỗi mẻ xử lý Khi đó để tiếp tục một qui trình mới lại phải bổ sung thêm một lư ng sinh khối nhất định và đ i thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới Qui trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành Ngư c lại khi đã đư c bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới biofilm sinh khối vi sinh vật có thể đư c giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý Những giá thể chất mang có sẵn mạng lưới biofilm có thể đư c tái sử dụng ở những lần xử lý tiếp theo mà không phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đ i thời gian phát triển [29]

Dầu thô và các sản phẩm từ dầu đư c loại bỏ bởi các vi khuẩn phân hủy hydrocarbon Các vi khuẩn đư c sử dụng có thể đư c thả trực tiếp xuống vùng dầu tràn hoặc có thể thả ở vùng ven bờ mà dầu tràn bị sóng đánh vào Lý do chính ở đây

là biofilm gi p tăng hiệu quả lọc nước và làm tăng độ kết dính của vi sinh vật với bề mặt giá thể nơi có dầu tràn Trong nghiên cứu, khi sử dụng các vi khuẩn thuộc chi

Acinetobacter và dùng một lớp phủ làm giá thể cho vi khuẩn là tảo, kết quả đã làm

giảm đư c 64-98% n-octadecane và khoảng 38-56% phenanthrene từ môi trường có chứa 0,03% của hydrocarbon sau 2 tuần [40] Trong nghiên cứu của Lê Thị Nhi

Công cùng cộng sự, đã phân lập từ biển nhóm vi khuẩn tạo biofilm và có hoạt tính chuyển hóa các chất hydrocacbon thơm đa vòng như napthalene, anthracene, pyren [17]

Một trong những ứng dụng của màng sinh học đang đư c quan tâm liên quan đến việc làm sạch nguồn nước thải, nguồn nước ngầm bằng công nghệ sinh học Ứng dụng này bắt nguồn từ thực tế là bản thân vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ trong môi trường tự nhiên thành các chất vô cơ đơn giản, ít độc Đã có nhiều phương pháp xử lý nước thải bao gồm những giai đoạn xử lý mà trong đó nước thải đư c lọc qua các biofilm nhằm mục đích tách và đồng hóa các h p chất hữu cơ có hại Một lư ng sinh khối lớn các vi sinh vật trong mạng lưới biofilm làm tăng sự h p tác trong quá trình trao đổi chất, gi p cho quá trình loại bỏ các chất gây

ô nhiễm trong nước diễn ra hiệu quả hơn so với dạng sống tự do Quá trình phân hủy các chất cũng tỏ ra hiệu quả hơn khi thường sản phẩm của chủng này lại là cơ chấtcho một chủng khác trong mạng lưới biofilm, ví dụ trong một mạng lưới biofilm xử lý nước thải có chứa h p chất nitơ, ion NH4+ đư c nhóm Nitrosomonas, Nitrobacter chuyển hóa thành ion NO3- rồi tiếp tục đư c các nhóm vi khuẩn yếm khíkhác sử dụng để cuối cùng tạo thành N2 đi vào khí quyển [37]

Một số nghiên cứu về vi khuẩn anammox có khả năng xử lý nitơ trong nước thải, đã chỉ ra rằng trong hệ thống các lớp siêu mỏng của lớp màng biofilm của

chủng vi khuẩn Planctomycetes có sự phân bố oxi theo lớp Các lớp phía trên là

những lớp giàu oxi trong khi các lớp ở phía dưới cùng nằm trong trạng thái kị khí

Sự phân chia theo lớp màng sinh học sẽ tạo điều kiện thuận l i trong quá trình ứng dụng xử lý nước thải giàu h p chất nitơ vì giai đoạn nitrate hóa là giai đoạn hiếu khí, giai đoạn khử nitrate là giai đoạn kị khí [31]

Những nghiên cứu về biofilm trong xử lý nước thải có chứa các h p chất nitơ và photpho, các nhà nghiên cứu đã sử dụng màng sinh học của vi tảo để thực hiện nghiên cứu này Kết quả cho thấy, màng sinh học đư c thiết kế dựa vào các vi tảo đã xử lý đư c nitơ là 1g/m2

/ngày và photpho là 0,13 g/m2/ngày [13]

Các nhà khoa học đã nghiên cứu khi sử dụng một vật liệu bám sinh khối, thả

nổi trong hệ thống xử lý làm giá thể cho các vi sinh vật có khả năng nitrate hóa, đã loại bỏ đư c đến 90% lư ng nitơ tổng số [48] Hoilijoki và cộng sự đã nghiên cứu khả năng nitrate hóa của vi sinh vật thuộc nhóm nitrate hóa Kết quả cho thấy, quá trình nitrate hóa chỉ xử lý đư c 61% amoni khi không có vật liệu bám cho vi sinh vật, và quá trình nitrate hóa xảy ra hoàn toàn khi có vật liệu bám cho vi sinh vật trong bể phản ứng bùn hoạt tính [30] Kết quả này cho thấy, quá trình xử lý nước thải sử dụng màng sinh học sẽ tăng hiệu quả xử lý khi có mặt vật liệu bám cho vi sinh vật

Bernet và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng khả năng chuyển hóa nitơ và tạo màng sinh học của vi sinh vật Mẫu ban đầu có hàm lư ng NH4+ là 250 mg/l, sau 2 ngày, hàm lư ng NH4+ giảm xuống chỉ còn 5 mg/l, hiệu quả của quá trình xử lý lên đến 98% [12]

Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học trong xử lý ô nhiễm nước thải đặc biệt là nước thải giàu nitơ hiện nay chưa nhiều Các công trình công bố liên quan đến lĩnh vực ứng dụng nghiên cứu này chưa nhiều, còn thiếu cả về số lư ng lẫn chất lư ng

Tại Việt Nam tình hình ô nhiễm nước thải ngày một gia tăng do đó việc cấp thiết là tìm một phương pháp xử lý hiệu quả là cần thiết [26, 32] Vì vậy, để phù

h p với mục đích nghiên cứu và ứng dụng xử lý ô nhiễm tại Việt Nam, ch ng tôi

đã tiến hành thực hiện đề tài phân lập nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học và có khả năng xử lý nước thải giàu h p chất nitơ với mục tiêu:

Phân lập các chủng có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có khả năng xửlý nitơ Bước đầu nghiên cứu tối ưu các điều kiện cho sự sinh trưởng phát triển của các chủng vi sinh vật này để có thể áp dụng trong công nghệ xử lý nước thải giàu nitơ

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Các mẫu nước thải tại khu vực chăn nuôi thuộc xã Phù Lương, huyện Quế

Võ, tỉnh Bắc Ninh với vị trí, độ sâu khác nhau của địa điểm lấy mẫu

Nước thải lấy từ tầng giữa bể biogas đã ngưng sử dụng; Nước thải lấy từ tầng đáy bể biogas đã ngưng sử dụng và mẫu nước thải trực tiếp chảy ra từ bể biogas đang sử dụng

Vật liệu mang polyurethane kích thước 111 cm đư c cung cấp từ Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường đư c sử dụng để phân lập vi sinh vật trong quá trình chuyển hoá các h p chất chứa nitơ bao gồm:

Môi trường

Winogradsky 1

Môi trường Winogradsky 2

Môi trường Luria Betani (LB) (g/l)

(NH4)2SO4: 2 g NaNO2: 1 g Peptone: 10 g

MgSO4: 0,5 g MgSO4: 0,5 g Cao nấm men: 5 g

Các môi trường đư c khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút

Các hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết cho nghiên cứu

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu chính

Nồi khử trùng (ALP–Nhật), Máy lắc (Satorius–Đức), Box cấy vi sinh vật (Aura vertical–Ý), Máy đo mật độ quang học (Bionate–Anh), Máy đo pH (Horiba–Nhật Bản), Cân Kern (Satorius–Đức), Cân phân tích (Presica, Ý)

Tủ ấm (Memmert–Đức), Máy ly tâm Sigma 3K30 (Sartorius–Đức), Tủ sấy (Memmert–Đức), Máy khuấy từ (IKA–Đức), Kính hiển vi điện tử quét JSM–5421LV (Nhật Bản)

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Dùng các đĩa petri có chứa môi trường Winogradsky đã khử trùng Pha loãng các mẫu ở các nồng độ 10-1

, 10-2, 10-3, 10-4 và 10-5 Dùng pipet lấy 100 µl dịch mẫu

đã pha loãng cho lên mặt thạch Dùng que cấy gạt đã vô trùng gạt đều trên mặt thạch cho đến khi nào mặt thạch khô thì dừng lại Các mẫu đã cấy gạt cho vào tủ

ấm ở 37oC trong thời gian từ 3 đến 5 ngày

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng h nh thành biofilm

Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dư ng thích h p và môi trường nuôi cấy tĩnh các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể Phát hiện, quan sát biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế bào Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [45, 46] Các chủng vi khuẩn đư c lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa môi trường LB trong

24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào tại bước sóng 620 nm (OD620) ở vào khoảng 0,2 đến 0,3 H t 100 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700 µl LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC

Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy đư c loại bỏ khỏi các ống eppendorf Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp so màu ở bước sóng 620 nm dịch nuôi cấy vi khuẩn

Quan sát khả năng hình thành biofilm: Mỗi ống eppendorf đư c rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng Bổ sung vào mỗi ống eppendorf 1 ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 25 ph t ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh

Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng các tinh thể tím bám trên thành eppenodorf đươc hòa tan trong 1 ml etanol 70% Mật độ tế bào trong biofilm đư c xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại

bước sóng 570 nm

Quan sát cấu tr c biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) Chuẩn bị mẫu biofilm nổi: bổ sung dịch nuôi cấy lắc vi khuẩn vào bình tam giác chứa 20 ml môi trường LB Nuôi cấy tĩnh 24 giờ ở 37o

2.3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự h nh thành màng sinh học

Vi sinh vật có khả năng hình thành màng sinh học tốt ở những điều kiện khác nhau Nhiệt độ, pH không thích h p sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và khả năng tạo màng sinh học của ch ng

Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy

Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ: 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn nghiên cứu

Ảnh hưởng của pH môi trường nuôicấy

Đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của các chủng vi khuẩn trong môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở các pH: 4, 5, 6, 6.5, 7, 7,5, 8, 9 Sau 1 ngày nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng hình thành màng sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu

2.3.4 Phương pháp nhuộm Gram

Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm