Cây khoai tây (Solanum tuberosum) có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao 2000 đến 5000m. Cây khoai tây đã từ Nam Mỹ du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 và Anh Quốc vào năm 1590. Sau đó, nó được lan truyền khắp châu Âu và tiếp theo là châu Á (Hawkes 1994). Thế kỷ 17, người Châu Âu đã bắt đầu ăn khoai tây và nó đã trở thành một cây lương thực quan trọng của thế giới. Hiện nay, trên thế giới cây khoai tây là một trong những cây lương thực chính được xếp vào hàng thứ 4 trong số những cây lương thực quan trọng nhất của thế giới và được trồng ở 148 nước kéo dài từ 71 độ vĩ tuyến Bắc đến 40 độ vĩ tuyến Nam. Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc năm 2008 diện tích khoai tây trên thế giới là 18.380.000 ha với tổng sản lượng 323 triệu tấn. Trong đó, diện tích trồng khoai tây của Châu âu chiếm 52,6% chiếm 52,3% của thế giới. Châu á diện tích trồng khoai tây chiếm 30,6% chiếm 28,2% tổng sản lượng của thế giới. Hiện tại khoai tây đứng vào hàng thứ tư về nguồn lương thực nuôi sống con người, cùng với ngô, lúa mì và gạo.
Trang 1CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Lựa chọn bộ chủng vi sinh vật hữu ích
3.1.1 Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật
Để phục vụ cho công tác nghiên cứu sản xuất chế phẩm, đã tiến hành lựa chọn bộchủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh cao dựa vào hồ sơ chủng giống
vi sinh vật hữu ích của đề tài được lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh vật, Viện Thổ nhưỡng Nông
hóa Trong nghiên cứu đề tài đã sử dụng 03 chủng vi khuẩn có hoạt đối kháng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh khoai tây với đặc điểm hình thái khuẩn lạc được thể hiện
Sinh tổng hợpAIA
Chú thích: (+) có hoạt tính; (-) không có hoạt tính
Chủng CX6 thuộc nhóm vi khuẩn (gram -) sống hiếu khí, khi được nuôi cấy trên môitrường thạch King B cho khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, trung bình, nhày, vàng chanh, sau 2 ngàynuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,5 - 1,8 mm
Trang 2Chủng H7 thuộc nhóm vi khuẩn (gram +) sống hiếu khí, khi được nuôi cấy trên môitrường thạch King B cho khuẩn lạc có màu trắng ngà, dẹt, bề mặt nhăn Sau 2 ngày nuôi cấykhuẩn lạc có đường kính từ 1,5 - 2,0 mm.
Chủng C10 thuộc nhóm vi khuẩn (gram +) sống hiếu khí, khi được nuôi cấy trên môitrường thạch King B cho khuẩn lạc có màu trắng ngà, nhăn, tâm lồi tạo múi, nhày Sau 2ngày nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 2,0 - 2,5 mm
Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật được tổng hợp trongbảng 2
Hình 2 Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn Bảng 2 Hoạt tính sinh học của chủng vi sinh vật
sau 2 ngày nuôi cấy dao động từ 24,55 – 30,61 µgAIA/ml Tính chất đa hoạt tính sinh học
này của các chủng trên rất có ý nghĩa trong việc làm tăng hiệu quả của chế phẩm vi sinhphòng trừ bệnh héo xanh sau này
3.1.2 Đánh giá khả năng tổ hợp của các chủng vi khuẩn lựa chọn
A Mối quan hệ của các chủng vi sinh vật
Trong tự nhiên, các chủng vi sinh vật có khả năng bổ trợ cho nhau, sản phẩm trao đổichất của chủng này có thể là cơ chất cho chủng kia, do đó chúng có thể sinh trưởng tốt hơn
Trang 3Tuy nhiên, chúng cũng có sự kìm hãm, ức chế sinh trưởng phát triển lẫn nhau Hiện tượng
ức chế có thể xảy ra khi trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chủng vi sinh vật này đãthải ra môi trường sống các sản phẩm trao đổi chất gây ức chế sự sinh trưởng và phát triểncủa chủng kia hoặc cũng có thể do khả năng sinh trưởng và phát triển của một chủng vi sinhvật nào đó kém hơn các chủng kia nên không thể cạnh tranh được dinh dưỡng và môi trườngsống nên bị ức chế Do đó, xác định mối quan hệ của các chủng vi khuẩn hữu ích trước khiđưa vào sản xuất chế phẩm là việc làm cần thiết
Trên cơ sở đánh giá mối tương tác giữa chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứuđối với quần thể vi sinh vật đất nói chung và các loài vi sinh vật hữu ích nói riêng, đã xácđịnh mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn lựa chọn, theo phương pháp cấy vạch tiếp xúcgiữa các chủng vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu Kết quả được tổng hợp ở bảng 3
Hình 3 Sự kìm hãm sinh trưởng phát triển lẫn nhau của các chủng vi sinh vật
Bảng 3 Mối quan hệ giữu các chủng vi sinh vật lựa chọn
-Ghi chú: (-) không ức chế nhau; (+) ức chế nhau
Qua kết quả ở bảng trên cho thấy 3 chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu đều cókhả năng sinh trưởng phát triển trên cùng một môi trường dinh dưỡng và không thấy có hiệntượng ức chế sinh trưởng và phát triển lẫn nhau Do đó, có thể sử dụng hỗn hợp của 3 chủng
vi khuẩn trên để sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh khoai tây
B Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường dịch thể
Để xác định chính xác khả năng cùng sinh trưởng và phát triển trong cùng một môitrường sống của các chủng vi khuẩn lựa chọn Đã tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng
và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trong môi trường dịch thể Các chủng vikhuẩn lựa chọn được nuôi cấy riêng lẻ và hỗn hợp trên môi trường dịch đặc hiệu Sau 48 giờ
Trang 4đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng theo phương pháp đã nêu ở trên Kếtquả được tổng hợp tại bảng 4.
Bảng 4 Khả năng sinh trưởng phát triển của các chủng trong môi trường dịch thể
STT Ký hiệu chủng Mật độ tế bào các chủng vi khuẩn hữu ích (x 10
C Khả năng sinh trưởng và phát triển của tổ hợp chủng vi sinh vật trong chất mang
Để xác định chính xác khả năng cùng sinh trưởng và phát triển trong cùng một môitrường sống của các chủng vi khuẩn lựa chọn Đã tiến hành đánh giá khả năng cùng tồn tại
và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trong chất mang là than bùn khử trùng Bachủng vi khuẩn được cấy theo tỷ lệ 1% vào các túi than bùn đã khử trùng Nuôi ở 300C, tiếnhành kiểm tra mật độ tế bào các chủng sau 15, 30 và 45 ngày Kết quả được tổng hợp tạibảng 5
Hình 4 Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lựa chọn
ở dạng riêng lẻ và hỗn hợp Bảng 5 Khả năng tồn tại của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi trong
cơ chất vô trùng theo thời gian
Ngày Hình thức nuôi cấy Mật độ tế bào các chủng vi khuẩn (× 105 CFU /g)
Trang 5Qua số liệu bảng 5 cho thấy mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn khi nuôi hỗn hợp
và riêng lẻ trong điều kiện cơ chất vô trùng đều tăng trong thời gian 15 ngày đầu Sau 30ngày mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn giảm dần Điều này xảy ra có thể docác chủng vi khuẩn được nuôi trong các túi cơ chất trong không gian hẹp, các chất dinhdưỡng không được truyền theo mao dẫn để cung cấp thường xuyên như ngoài môi trường,nên đã cạn dần theo thời gian
Qua bảng 5 cũng cho thấy, tốc độ giảm mật độ tế bào khi nuôi riêng lẻ nhanh hơn sovới khi nuôi hỗn hợp Điều này một lần nữa chứng tỏ rằng khi nuôi ở dạng hỗn hợp, cácchủng vi khuẩn lựa chọn đã có tác dụng bổ trợ lẫn nhau hoặc tiết ra hệ enzym đầy đủ hơn để
sử dụng các cơ chất trong môi trường hoặc sử dụng các sản phẩm trao đổi chất của nhau
D Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi được nuôi cấy ở dạng riêng lẻ
và hỗn hợp trong dịch thể và trong chất mang
Cùng với khả năng tồn tại trong điều kiện hỗn hợp thì họat tính sinh học của cácchủng vi khuẩn tuyển chọn đóng vai trò quan trọng quyết định chất lượng của chế phẩm.Các chủng vi khuẩn tuyển chọn có thể cùng tồn tại trên cùng một chất mang nhưng không
có ý nghĩa nếu hoạt tính sinh học của chúng không còn hoặc còn nhưng yếu Vì vậy, việcduy trì và nâng cao được hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong chếphẩm là việc làm cần thiết và mang tính quyết định
Đã tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn song songvới việc đánh giá mật độ tế bào trong quá trình nuôi hỗn hợp và riêng rẽ Hoạt tính của cácchủng trong môi trường dịch được kiểm tra sau 2 ngày nuôi cấy, còn trong cơ chất khử trùngthì được kiểm tra sau 15 ngày Các chủng này được phân lập lại rồi xác định hoạt tính sinhhọc theo các phương pháp đã nêu ở trên Kết quả được tổng hợp ở các bảng 6
Trang 6Hình 5 Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn Bảng 6 Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn lựa chọn khi nuôi cấy
trong dịch thể và cơ chất
STT Ký hiệu
chủng
Điều kiệnnuôi cấy
Ức chế vi khuẩn gây bệnh
(mm)
Sinh tổng hợp AIA(µgAIA/ml)Riêng lẻ Hỗn hợp Riêng lẻ Hỗn hợp
đã có những tương tác bổ trợ nhất định với nhau để làm tăng mật độ cũng như hoạt tính sinhhọc của chúng
Qua bảng 6 cũng thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn khi được nuôi cấy trong môitrường dinh dưỡng ở dạng dịch cho hoạt tính sinh học cao hơn so với khi được nuôi trong cơchất vô trùng Điều này là do sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường dịch thì sự sinh trưởng
và phát triển của các chủng này đang ở cuối pha log, đầu pha ổn định nên mật độ tế bàocũng như hoạt tính sinh học đang trong giai đoạn cao và ổn định nên hoạt tính sinh học củachúng cao hơn khi được nuôi cấy sau 15 ngày trong cơ chất vô trùng, với nguồn dinh dưỡngngày càng cạn dần
Trang 7Qua các kết quả trên cho thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn có khả năng sinh trưởng
và phát triển trong cùng một môi trường sống Khi cùng sinh trưởng và phát triển trên môitrường sống chúng có những tác động bổ trợ lẫn nhau, giúp cho mật độ tế bào cũng như hoạttính sinh học cao hơn hẳn khi sống đơn lẻ Như vậy, có thể sử dụng 3 chủng vi khuẩn lựachọn này để sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh khoai tây
3.1.3 Đánh giá tác động của tổ hợp chủng vi lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hạn chế bệnh héo xanh cây khoai tây ở quy mô nhà lưới
Để có thể sử dụng các chủng vi khuẩn đối kháng như là một tác nhân trong biện phápphòng trừ sinh học thì chúng phải thể hiện được hoạt lực đối kháng cao trong điều kiện tựnhiên, vì theo một số nghiên cứu cho thấy, một số chủng vi khuẩn thể hiện hoạt lực đối
kháng với R solanacearum trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhưng lại không thể hiện
hoặc thể hiện rất yếu trên cây chủ ở ngoài tự nhiên Vì vậy, các chủng vi khuẩn đối khángnày cần được thử nghiệm trên khoai tây trong điều kiện nhà lưới
A Ảnh hưởng của tổ hợp vi khuẩn lựa chọn tới khả năng sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây
Đã tiến hành đánh giá tác động của tổ hợp chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn đếnkhả năng sinh trưởng và phát triển cây khoai tây ở quy mô nhà lưới theo phương pháp đãnêu ở trên Kết quả thu được là giá trị trung bình sau 3 lần lặp lại và được thể hiện tại bảng7
Hình 6 Ảnh hưởng của tổ hợp vi khuẩn đối kháng tới khả năng sinh trưởng, phát triển và
hạn chế bệnh héo xanh của cây khoai tây Bảng 7 Ảnh hưởng của tổ hợp vi sinh vật đối kháng tới khả năng sinh trưởng, phát triển
của cây khoai tây
Công thức Chiều cao cây (cm) Số thân/khóm Diện tích tán lá (%)
Trang 8Kết quả theo dõi thu được trình bày tại bảng 7 cho thấy, giữa các công thức thínghiệm và đối chứng có sự thay đổi về các chỉ số sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây.Tuy nhiên mức độ sai khác về diện tích tán lá giữa các công thức thí nghiệm và công thứcđối chứng có sự thay đổi không đáng kể Sự thay đổ chính mà kết quả thu được đó là sựthay đổi về chiều cao của cây khoai tây Trong các công thức thì chiều cao trung bình củacây trong công thức 2 là thấp nhất và chỉ đạt 52,8 cm thấp hơn so với công thức 1 là 3,1 cm,thấp hơn công thức 3 là 12,6 cm Với cùng một điều kiện chăm sóc như nhau nhưng côngthức 2 có chiều cao cây thấp hơn hẳn các công thức khác có thể là do trong công thức có cácchủng vi sinh vật gây bệnh héo xanh, nhưng do một số nguyên nhân nào đó mà chưa gâybệnh được cho cây nhưng cũng đã làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của cây Còntrong công thức 3, mặc dù cũng có vi khuẩn gây bệnh nhưng chiều cao cây vẫn đạt cao nhất
có thể là do được bổ sung thêm tổ hợp các chủng vi khuẩn đối kháng, do đó nó không nhữnglàm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mà còn sinh ra các chất kích thích sinhtrưởng
Như vậy, theo số liệu bảng 7 cho thấy tổ hợp vi khuẩn đối kháng đã có những ảnhhưởng nhất định đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây Tuy nhiên, mức độnày mới chỉ thông qua được một số chỉ tiêu nhất định Để có thể xác định được rõ ảnhhưởng của loại phân bón này, cần theo dõi các chỉ tiêu khác
B Ảnh hưởng của tổ hợp vi khuẩn đối kháng tới khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn của cây khoai tây
Để đánh giá khả năng hạn chế và phòng ngừa bệnh héo xanh vi khuẩn, đã tiến hànhtheo dõi tình hình héo xanh vi khuẩn trên cây khoai tây Kết quả thu được là giá trị trungbình sau 3 lần lặp lại và được thể hiện tại bảng 8
Bảng 8 Khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn khoai tây của tổ hợp
Trang 93.1.4 Phân loại các chủng vi khuẩn lựa chọn
Phân loại các vi khuẩn lựa chọn bằng phương pháp giải trình tự gen phần tử 16SrARN theo Ludwig và Schleifer (2000)
Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm Clustal W 1.83 Trình tự gen đã lắpráp được so sánh bởi chương trình NCBI BLAST với các ADN của GenBank Kết quả đượcchọn là kết quả có Max Ident (phần trăm trình tự được dùng để so sánh với cơ sở dữ liệu) vàQuerry coverage (phần trăm trình tự tương đồng với cơ sở dữ liệu) cao nhất Kết quả thuđược như sau:
* Trình tự 16S rARN của chủng vi khuẩn đối kháng CX6
GCGAGCGGCGGACGGGTGAGtAATGCCTAGGAATCTGCCTAGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATTAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGtAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT
Trang 10Burkholderia cocovenenans_ AB021389
Pseudomonasaeruginosa_DQ683361
CX6
87
Pseudomonas veronii_AB056120 Pseudomonas aurantiaca_DQ682655 Pseudomonas mandelii_AF058286 Pseudomonas cannabina_AJ492827 Pseudomonas meliae_AB021382 Pseudomonas tremae_AJ492826 Pseudomonas savastanoi_DQ318862 Pseudomonas congelans_AJ492828 Pseudomonas syringae_AY574913 Pseudomonas ficuserectae_ AB021378
5469
89
7759
54
10077
10063
Pseudomonasfluorescens_AJ278812
CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCAT
Trình tự gen 16S rARN của chủng CX6 tương đồng 99,9% (1448/1450 bp) với đoạn
16S của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens và tương đồng 99,4% (1441/1450 bp) với đoạn 16S rARN của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.
Vị trí phân loại của chủng vi khuẩn CX6 được thể hiện ở hình 7:
Hình 7 Vị trí phân loại chủng vi khuẩn CX6 và các loài có quan hệ họ hàng gần
Trang 11* Trình tự 16S rARN của chủng vi khuẩn đối kháng H7
AGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTtTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAG
GAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT
Trang 12Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus isabelae_AM503357 Bacillus pumilus_AY741720 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus axarquiensis_DQ993670 Brevibacterium halotolerans_ AJ620368
H7
Bacillus polyfermenticus_ AY149473
Bacillus amyloliquefaciens_ EF176772
52
64
5489
98
Trình tự gen rARN 16S của chủng H7 tương đồng 99,9 % (1449/1450 bp) với đoạn
16S của vi khuẩn Bacillus polyfermenticus; tương đồng 99,9 % (1448/1450 bp) với Bacillus amyloliquefaciens; tương đồng 99,9 % (1448/1450 bp) với Bacillus subtilis và tương đồng 99,8 % (1447/1450 bp) với Bacillus velezensis
Vị trí phân loại của chủng vi khuẩn H7 được thể hiện ở hình 8
Hình 8 Vị trí phân loại chủng vi khuẩn H7 và các loài có quan hệ họ hàng gần
• Trình tự 16S rARN của chủng vi khuẩn đối kháng C10
GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAG
Trang 13GTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGGATCACCTCCTTT
Trình tự gen rARN 16S của chủng C10 tương đồng 100 % (1490/1490 bp) với
đoạn 16S của vi khuẩn Bacillus subtilis; tương đồng 99,9 % (1488/1490 bp) với
Trang 14Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus megaterium_AJ71738
Bacillus catenulatus_AY523411 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158
69
Bacillus isabelae_AM503357 Bacillus pumilus_AY741720 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus nematotocita_AY820954 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus axarquiensis_DQ993670 Brevibacterium halotolerans_ AJ620368 Bacillus mojavensis_AB021191
C10
Bacillus amyloliquefaciens_ EF176772
74939751
Vị trí phân loại của chủng vi khuẩn C10 được thể hiện ở hình 9
Hình 9: Vị trí phân loại chủng vi khuẩn C10 và các loài có quan hệ họ hàng gần
Đề tài đã tiến hành đánh giá mức độ an toàn sinh học dựa trên việc so sánh tên cácchủng vi sinh vật đã định danh với tên các chủng vi sinh vật trong danh mục đánh giá mức
độ an toàn của các chủng vi sinh vật; kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật lựa chọn đềunằm trong nhóm an toàn cấp độ 1
3.2 Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh
3.2.1 Nghiên cứu sản xuất sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn
3.2.1.1 Ảnh hưởng của pH
Trang 15Trong quá trình lên men nhân sinh khối, do ảnh hưởng của các sản phẩm của quátrình trao đổi chất nên pH của môi trường nuôi cấy luôn bị thay đổi Mỗi loài vi sinh vật đều
có một pH môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển, cho nên sự thay đổi pH củamôi trường nuôi cấy trong quá trình lên men nhân sinh khối sẽ có những ảnh hưởng tiêu cựcđến sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật đó Do vậy, việc xác định được pHmôi trường tối ưu cho các chủng vi sinh vật nghiên cứu là hết sức cần thiết
Dựa trên cơ sở nghiên cứu của những đề tài trước, đã tiến hành xác định pH môitrường thích hợp trong quá trình lên men cho các chủng vi khuẩn lựa chọn ở các pH 5,0; 5,5;6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 theo phương pháp đã nêu ở trên Kết quả được tổng hợp tại bảng 7
Bảng 7 Ảnh hưởng pH môi trường đến mật độ và hoạt tính sinh học của các
Qua số liệu bảng 7 cho thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn có khả năng sinh trưởng
và phát triển trong môi trường nuôi cấy có pH dao động trong khoảng 5,0 – 8,0 Tuy nhiên,khả năng sinh trưởng và phát triển các chủng vi khuẩn lựa chọn ở các điều kiện pH môitrường khác nhau có sự biến động khá rõ rệt Mật độ của các chủng vi khuẩn lựa chọn đạtcao nhất khi môi trường nuôi cấy có pH dao động trong khoảng 6,5 - 7,5, còn nếu môitrường nuôi cấy có pH cao hơn hoặc thấp hơn khoảng pH này thì mật độ tế bào của cácchủng đều giảm Như vậy, có thể lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn ở môitrường có pH nằm trong khoảng 6,5 – 7,5
3.2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của visinh vật và hiệu quả của quá trình lên men nhân sinh khối Vì mỗi loài vi sinh vật đều cómột mức nhiệt độ tối ưu khác nhau để sinh trưởng và phát triển
Trang 16Để xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối, các chủng vikhuẩn lựa chọn được lên men nhân sinh khối ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (150C,
200C, 250C, 300C, 350C, 400C) Các yếu tố khác không thay đổi, với pH = 7,0; tốc độ sục khí0,75 lít không khí/lít môi trường/phút; tốc độ cánh khuấy 350 vòng/phút Kết quả đánh giáảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựachọn được tổng hợp ở bảng 8
Bảng 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn
và phát triển tốt nhất khi nhiệt độ nuôi cấy nằm trong khoảng 25- 350C Trong khoảng nhiệt
độ nuôi cấy này, mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn đều đạt mật độ tối đa từ 108– 109 CFU/ml Ở các khoảng nhiệt độ nuôi cấy dưới 250C và cao hơn 350C thì các chủng vikhuẩn này sinh trưởng phát triển kém, mật độ tế bào cao nhất cũng chỉ đạt 107 CFU/ml
Như vậy, khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vikhuẩn lựa chọn là từ 250C đến 350C
3.2.1.3 Ảnh hưởng của ôxy
Ôxy là một trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men nhân sinhkhối vi sinh vật vì mỗi loài vi sinh vật đều có nhu cầu ôxy khác nhau Do đó, nghiên cứuxác định được nồng độ oxy thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinhvật hữu ích trong quá trình lên men nhân sinh khối là cần thiết
Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ ôxy thích hợp cho quá trình lên men nhân sinhkhối các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 9
Bảng 9 Ảnh hưởng của ôxy đến mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Trang 17Kết quả bảng 9 cho thấy, các chủng vi khuẩn lựa chọn đều có khả năng sinh trưởng
và phát triển với lượng ôxy cung cấp vào quá trình lên men dao động từ 0,60 - 0,85 lít/lítmôi trường /phút Các chủng vi khuẩn lựa chọn sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi lượngôxycung cấp vào trong quá trình lên men là 0,70 - 0,75 lít/lít môi trường /phút, với lượngôxynày thì mật độ tế bào của các chủng đều đạt từ 108 - 109 CFU/ml Khi lượng ôxycungcấp vào thấp hơn 0,70 hoặc cao hơn 0,75 lít/lít môi trường /phút thì mật độ tế bào đều thấp
và chỉ đạt mật độ từ 107 – 108 CFU/ml
Như vậy, các chủng vi khuẩn lựa chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhấttrong quá trình lên men khi lượng ôxy cung cấp vào nằm trong khoảng 0,70 - 0,75 lít/lít môitrường /phút
3.2.1.4 Ảnh hưởng tốc độ cánh khuấy
Tốc độ cánh khuấy ảnh hưởng đến diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinhdưỡng, ngoài ra nó còn có tác dụng ngăn cản sự kết lắng của tế bào Do đó, nó ảnh hưởngrất lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến sự sinh trưởng và phát triểncủa các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 10
Bảng 10 Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến mật độ tế bào của các chủng
Kết quả bảng 10 cho thấy, mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn đạt caonhất khi tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 350 – 400 vòng/phút, với mật độ tế
Trang 18bào đạt 108 - 109 CFU/ml Qua bảng 10 cũng cho thấy, ở các mức độ tốc độ khuấy thấp hơnhoặc nhanh hơn mật độ tế bào vi sinh vật chỉ đạt 107 – 108 CFU/ml Điều này có thể do tốc
độ khuấy chậm sẽ làm hạn chế khả năng hoà tan ôxyvào môi trường, còn tốc độ khuấy cao
sẽ cản trở sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của các chủng vi khuẩn lựa chọn
Như vậy, tốc độ cánh khuấy thích hợp nhất cho quá trình lên men các chủng vi khuẩnlựa chọn là 350 - 400 vòng/phút
3.2.1.5 Môi trường nhân sinh khối
Việc nghiên cứu và lựa chọn được những loại môi trường dinh dưỡng vừa có giáthành thấp, vừa đảm bảo cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và pháttriển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trong quá trình lên men nhân sinh khối để sản xuấtchế phẩm là một trong những nhân tố quan trọng quyết định tới giá thành chế phẩm
Đã tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựachọn trên 6 loại môi trường khác nhau theo phương pháp đã nêu ở trên Trong đó, có môitrường King B được dùng làm môi trường đối chứng vì đây là loại môi trường đã đượcnhiều nhà nghiên cứu khẳng định là thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọntrên các loại môi trường khác nhau được thể hiện trong bảng 11
Bảng 11 Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn trên
các loại môi trường khác nhau
Trang 19trường King B Trong các môi trường sản xuất thì chỉ có ở môi trường SX3 (rỉ đường –nước chiết đậu), mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn đạt mức cao nhất và tươngđương với ở môi trường King B với mật độ tế bào đạt 108 – 109 CFU/ml.
Như vậy, có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng có thành phần như môi trường SX3(rỉđường – nước chiết đậu) để lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn để sản xuấtchế phẩm sinh học phòng trừ bệnh héo xanh trên quy mô lớn
3.2.1.6 Tỷ lệ giống cấp 1
Trong quá trình lên men nhân sinh khối ngoài các yếu tố về dinh dưỡng, điều kiệnnuôi cấy thì lượng giống cấp một bổ sung vào quá trình lên men cũng hết sức qua trọng, nóquyết định chất lượng và giá cả của sản phẩm tạo thành Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra một
tỷ lệ giống cấp 1 thích hợp trong quá trình lên men là rất cần thiết
Kết quả xác định tỷ lệ giống cấp 1 thích hợp cho quá trình lên men nhâ sinh khối cácchủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 12
Bảng 12 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 1 đến mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn
đó, để tiết kiệm chi phí sản xuất thì lượng giống cấp 1 bổ sung vào cho quá trình lên mencác chủng vi khuẩn lựa chọn là 1% là thích hợp nhất
3.2.1.7 Lựa chọn thời gian lên men nhân sinh khối
Mỗi loài vi sinh vật đều có thời gian sinh trưởng và phát triển thích hợp riêng Do đó,việc nghiên cứu lựa chọn được thời gian lên men thích hợp cho các chủng vi khuẩn lựa chọn
là cần thiết vì vừa giúp giảm công lao động vừa thu được sản phẩm có chất lượng cao
Trang 20Dựa vào các kết quả nghiên cứu ở trên, tiến hành lựa chọn thời gian nhân sinh khốithích hợp cho các chủng vi sinh vật hữu ích trên cùng một điều kiện lên (t0 = 300C; pH =7,0; tốc độ sục khí 0,75 lít O2 /lít môi trường/phút; tỷ lệ giống cấp 1 là 1%), kết quả đượctổng hợp trong bảng 13.
Bảng 13 Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn theo các khoảng thời gian nuôi cấy
Kết quả nghiên cứu trình bày trong bảng 13 cho thấy các chủng vi khuẩn lựa chọnđều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt và mật độ tế bào đạt cao tại thời điểm từ 36 -
48 giờ và sau đó tương đối ổn định
Như vây, thời gian lên men nhân sinh khối của các chủng vi sinh vật hữu ích để sảnxuất phân bón vi sinh vật đa chức năng là từ 36 - 48 giờ
3.2.1.8 Hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn sau quá trình lên men nhân sinh khối
Hiệu quả của chế phẩm vi sinh phụ thuộc hoạt tính sinh học, khả năng cạnh tranh với
vi sinh vật có sẵn trong đất và khả năng thích ứng với điều kiện môi trường đất của cácchủng vi khuẩn lựa chọn trong chế phẩm Do đó, việc duy trì sự ổn định hoạt tính sinh họccủa các chủng vi khuẩn lựa chọn sau quá trình lên men nhân sinh khối là cần thiết Kết quảđánh giá hoạt tính sinh học của chủng vi khuẩn lựa chọn sau quá trình lên men được tổnghợp trong bảng 14
Hình 10 Hoạt tính sinh học của một số chủng sau quá trình lên men Bảng 14 Hoạt tính sinh học của chủng vi sinh vật hữu ích sau quá trình lên men
STT Ký hiệu
chủng
Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật
Ức chế vi khuẩn gậy bệnh héo xanh
(mm)
Sinh tổng hợp AIA (µg AIA/ml)