Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp và lactobacillus spp đối với một số nấm mốc aspergillus spp sinh aflatoxin

Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường ..... Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG

MSSV: 1515100007 Lớp: 15HSH01

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác với bất kì hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình

TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm nay

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em

đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ

có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực hiện, hoàn thành đồ án này

Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe

TP HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

TRANG

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm: 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4

1.1.3 Tác hại của nấm 5

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây cho người và động vật 5

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây cho thực vật 6

1.1.4 Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm 6

1.2 Tổng quan về hợp chất kháng nấm: 7

1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học 10

1.2.2 Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học 10

1.2.3 Hợp chất kháng nấm trong sinh học 13

1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13

1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17

a Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp 17

b Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp 19

1.3 Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc: 21

1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn) 21

1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23

1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): 25

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26

2.2 Thời gian nghiên cứu: 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26

2.3.1 Giống vi sinh vật: 26

2.3.1 Hóa chất và môi trường sử dụng 26

2.3.1.1 Hóa chất: 26

2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26

2.4 Thiết bị và dụng cụ: 27

2.4.1 Thiết bị: 27

2.4.2 Dụng cụ: 28

2.5 Phương pháp luận: 28

2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.6.2 Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: 30

2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với nấm mốc: 30

2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35

2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp với nấm mốc: 39

2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 43

2.6.6.1 Nhuộm gram 43

2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44

2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 44

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45

3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 45

3.1.1 Nhuộm Gram: 45

3.1.2 Nhuộm bào tử: 46

3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47

3.2 Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: 48

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc: 50

3.4 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc: 66

3.5 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 2 chủng VK Bacillus spp và Lactobacillus spp với các chủng nấm mốc 81

3.6 So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90

KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC

Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn

Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

53

Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus

spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

54 Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn

62 Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi

khuẩn 63 Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn

Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán

68 Bảng 3.8 So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán

69 Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán

76

Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch

tán 77 Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi

khuẩn Bacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp

84 Bảng 3.12 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Bacillus spp trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp 85

Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi

khuẩn Lactobacillus spp theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp

89 Bảng 3.14 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn

Lactobacillus spp trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 90 Bảng 3.15 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp theo từng phương pháp

dựa theo xếp hạng LSD 91

Bảng 3.16 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo từng phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Metalaxyl 10

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Manocozeb 11

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole 11

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Pyrones 14

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của Viridines 15

Hình 1.6 Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20

Hình 1.7 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn 21

Hình 1.8 Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015)

22

Hình 1.9 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23

Hình 1.10 Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp với các loại nấm (trích từ Kumar và các cộng sự,2009) 24

Hình 1.11 Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa 25

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn có lợi đối với nấm mốc 29

Hình 2.2 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường 31

Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.3 Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi

khuẩn 35

Hình 2.4 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 36

HÌnh 2.5 Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán 37

Hình 2.6 Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 38

Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch 40

Hình 3.1 HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 45

HÌnh 3.2 Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 46

Hình 3.3 Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn 47

Hình 3.4 Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA 48

Hình 3.5 Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến 49

Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm 55

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ đất 56

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải 57

Hình 3.13 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem 63

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc

Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin, tricothecenes, zearalenone… Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng cao sẽ gây chết người Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật

Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác

như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học Nhưng

việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm

Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng

nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc

khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau Từ đó,

em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng

và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm

của trường Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phương pháp

đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp và

Lactobacillus spp đối với một số nấm mốc Aspergillus spp sinh aflatoxin”

lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng trong bảo quản nông sản”

(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm

thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp Của vi khuẩn Lactobacillus L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)…

 Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn

lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong-

75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer,2001)

3 Mục đích nghiên cứu:

Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả

nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp của

phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường

4 Mục tiêu nghiên cứu:

Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ

thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực

Phẩm- Môi Trường

5 Nhiệm vụ nghiên cứu:

 Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp và 10 chủng Lactobacillus spp đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp tiềm năng sinh

aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method)

 Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(Agar

 Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method)

 Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm

6 Phương pháp nghiên cứu:

a Phương pháp luận:

Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp và Lactobacillus spp đã được phân

lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt giống cây trồng

b Phương pháp xử lí số liệu:

 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu

7 Kết quả đạt được từ đề tài:

 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp

có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm

 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn (Dual Culture Two Line Culture Method)

 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug Diffusion Method)

 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method)

 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí nghiệm

 Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu được

 Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được

và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm:

1.1.1 Giới thiệu chung về nấm:

 Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier Antonio Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794-1874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể) Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng mắt thường Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm khác Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao đổi chất

 Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose

và một số thành phần khác có hàm lượng thấp Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium) Có 2 loại sợi:

 Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm

 Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử)

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra:

 Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo

ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có

vú, gia cầm và con người

 Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu Tuy nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm Được tạo ra từ 5 chi

nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng

bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2),

Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin,

Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin…

 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon,

T-2 toxin

 Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl

Ether Alternarion

 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà

 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin Chúng là

độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,

thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng) Phản ứng gây độc chủ yếu của chúng là trong gan Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu dài sẽ gây ra bệnh ung thư

 Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin

Penicillium và Aspergillus tiết ra Độc tố Zearalenon và Tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium

và Fumonisin tiết ra

1.1.3 Tác hại của nấm mốc:

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:

 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng Chúng có thể là nấm mốc trong

nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma

Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn Ngộ độc do

ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêu hóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trong

thức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong

 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như: Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystic Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở

người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben, cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm

Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây ra cho thực vật:

 Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho

ngành nông nghiệp và lâm nghiệp Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus Chúng làm thối rễ, tổn

thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất

lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,

1.1.4 Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:

 Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống

nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus,

Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào

thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,…

 Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây

đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết Nhiều công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định

có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai

1.2 Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:

Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực phẩm và các vật liệu khác

1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học:

 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil,

…

Bảng 1.1: Một số hợp chất kháng nấm hóa học thường gặp trong

thuốc bảo quản hạt giống (Mathre và các cộng sự,2011)

 Các hoạt chất kháng nấm hóa học phổ biến như metalaxyl, mancozeb và hexaconazole… chúng đều thông qua tế bào mô thực vật tiêu diệt các nấm gây bệnh phát triển trong đó

 Metalaxyl có tên hóa học là methyl

N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DL-alaninate là hoạt chất trừ nấm thuộc nhóm Alanine, đặc biệt hiêu quả với

nhóm nấm Oomycetes mà hai đại diện điển hình là Phytophthora và Pythium gây nên các bệnh nghiêm trọng cho cây trồng Hoạt chất Metalaxyl có tác dụng nội hấp và lưu dẫn mạnh, thuốc được hấp thụ qua

lá, thân, rễ của cây trồng sau đó vẫn chuyển, lưu dẫn trong cây, ức chế sự tổng hợp protein, can thiệp vào quá trình tổng hợp ARN ribosome của tế bào nấm Phòng trừ hiệu quả các loại nấm phát sinh từ đất và các loại nấm phát tán bào tử trong không khí (trích Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng,2015)

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Metalaxyl

 Manocozeb có tên hóa học là Manganese Ethylene bisdithiocarbamate

phức hợp với kẽm, là hoạt chất thuộc nhóm thuốc diệt nấm Dithiocarbamate Manocozeb là phức hợp của kẽm và muối mangan, dạng bột màu vàng hung, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác, bền trong môi trường khô nhưng thủy phân trong môi trường nóng, ẩm và acid Hoạt chất này không diệt nấm trực tiếp chỉ khi tiếp xúc với nước, manocozeb mới bị hoạt hóa, giải phóng ethylene bisthiocyanate sunfua (EBIS) Dưới tác động của tia cực tím, EBIS chuyển hóa thành ethylene bisthiocyanate (EBI) EBIS và EBI tác động tới các enzyme có chứa nhóm sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014)

 Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC Là hoạt chất trừ nấm phổ rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới Chất này được mô cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole

1.2.2 Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:

 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm

có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm Nếu liều lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài

từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)

 Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóa học biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạt động ở

hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa hô hấp, bài tiết, gây các tổn thương bệnh

lý ở các cơ quan từ mức độ nhẹ đến nặng thậm chí tàn phế và tử vong Ví

dụ: hoạt chất Mancozeb gây bệnh da đối với người tiếp xúc, hoạt chất Metalaxyl gây độc cấp tính thấp nhưng gây kích ứng ở mắt ở mức trung

bình và nhóm độc II về tác động kích thích mắt

 Đối với môi trường xung quanh: các hợp chất hóa học sẽ diệt hết tất cả các loài côn trùng, sâu bệnh và nấm gây bệnh có thể làm mất đi sự cân bằng tự nhiên trong của hệ sinh thái gây ô nhiễm môi trường, đất, nước

và không khí Các chất tồn dư, không phân hủy ở trong đất và nước có thể làm cho động vật, cây trồng sống ở đó bị nhiễm các chất đó lâu dài, con người khi ăn các sản phẩm trồng trọt và chăn nuôi bị nhiễm chất hóa học hằng ngày một cách gián tiếp, lâu ngày sẽ rất có hại đến sức khỏe

 Đối với các loại thực vật, chúng sẽ hình thành sự kháng thuốc và có khả năng sẽ tạo ra các loại vi sinh vật hay nấm gây bệnh mới, mạnh hơn các

loài vi sinh vật và nấm gây bệnh cũ Chẳng hạn như: hoạt chất Metalaxyl

khi sử dụng liên tục dễ hình thành tính kháng thuốc của vi sinh vật gây

hại; còn hoạt chất Manocozeb chỉ có tác dụng phong bệnh tiếp xúc, sau

khi phun thuốc lên thực vật thi chỉ ngăn ngừa sự hình thành mầm bệnh, không xâm nhập được vào bên trong mô thực vật, do đó chúng không có tác dụng khi nấm mốc hình thành và xâm nhiễm bên trong cây trồng

1.2.3 Hợp chất kháng nấm sinh học:

1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật:

 Các vi khuẩn có lợi thường tạo ra các chất có hoạt tính sinh học nhằmức chế được các tác nhân gây bệnh, trong đó có 1 số chất như là chất có thể chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp hoặc chất có tính kháng sinh Các chất đó giúp cho vi khuẩn có thể ức chế hay tiêu diệt các loại vi sinh vật cạnh tranh với chúng trong cùng điều kiện sống thích hợp Thật vậy, ta

có thể tìm thấy một số hợp chất thứ cấp từ các vi khuẩn có lợi khác nhau đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học trong quá trình phát hiện bệnh trong cây trồng, chúng đã và đang được mọi người trên

học Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp khôn những giúp cho thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh từ nấm mốc mà còn giúp chúng tăng trưởng và phát triển tốt hơn Điển hình là hợp chất thứ cấp được tiết ra từ nấm

Trichoderma, chúng chống lại được phytopathogens và một số chất khác

ảnh hương đến sự trao đổi chất của thực vật

 Chất gây hại chủ yếu trong các bệnh của cây trồng chủ yếu là phytopathogenic, các hợp chất thứ cấp trong sinh học có thể kháng lại chúng mà không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến con người

và động vật, ít tốn kém, quan trọng hơn hết là không làm cho các chất hây hại có khả năng kháng thuốc nhanh như các chất hóa học

 Các hợp chất thứ cấp (SM) là sự chuyển hóa hóa học các hợp chất khác nhau có trọng lượng phân tử tương đối thấp (<3kDa) và được sản xuất dựa bởi các vi sinh vật và thực vật có liên quan đến các chi, loài hay chủng Các hợp chất thứ cấp này được chuyển hóa bằng con đường sinh tổng hợp từ các chất chuyên biệt (như polypeptide hhay con đường bắt nguồn từ Acetyl Co-enzyme A hoặc các amino aicd) Các hợp chất này còn có một số tác nhân sinh học ảnh hưởng đến sự sống, các chức năng của cơ thể hay cạnh tranh với các vi sinh vật khác

 Đối với nấm, việc sản xuất các hợp chất thứ cấp thường tương quan đến các giai đoạn như sự khác biệt về cấu trúc, hình thái và giai đoạn tăng trường

 SM còn biểu hiện một số chức năng sinh học và đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự tương tác giữa các vi sinh vật Ví dụ: phytotoxins là hợp chất thứ cấp của nấm mốc tiết ra để gây hại cho cây trồng, độc tố nấm là hợp chât thứ cấp được sản xuất ra để gây hại cho cây trồng và có khả năng gây hại cho con người và động vật, kháng sinh

là các chất trong tự nhiên có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt đối thủ cạnh tranh của vi sinh vật Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp từ nấm có thể thay đổi sự tăng trưởng và trao đổi chất cho cây nhằm mục đích kéo dài sự

hình thành bào tử và sơi nấm Chính vì vậy, người ta tập trung nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nấm có lợi và vai trò của nó để chống lại các

vi sinh vật và nấm gây bệnh khác

 Trong các nghiên cứu cho thấy,sự phân lập nấm Trichoderma tiết ra hợp

chất thứ cấp quan trọng có hoạt tính kháng nấm và gây độc chống lại

phytopathogenic Trong nấm Trichoderma có chứa các chất kháng nấm

như là pyrones, viridins, butenolides và Hydroxy-lacton…

 Pyrones hay còn có tên gọi là 6-pentyl-2H-pyran-2-one (6PP): là chất được chuyển hóa từ các loại nấm Trichoderma spp khác nhau( T.viride, T.atroviride, T.harzianum, T.koningii) Hợp chất này đã thể hiện được khả năng kháng lại một số nấm gây bệnh trong cả in vitro

và in vivo Ngoài ra, còn có cytosporone S thuộc nhóm hợp chất pyrones được phân lập từ Trichoderma có hoạt tính kháng sinh đối

với 1 số loài vi sinh vật và nấm gây bệnh

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Pyrones

 Viridins là hợp chất steroid được chuyển hóa từ sự phân lập các loài nấm Trichoderma spp, hợp chất này ngăn chặn sự tăng trưởng từ các loài nấm gây bệnh như: Aspergillus Niger, Fusarium caeruleum, Penicillium expansum…

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Viridins

 Butenolides và Hydroxy-Lactones cũng là các hợp chât thứ cấp được phân lập từ các chủng Trichoderma spp khác nhau và thông qua các nghiên cứu trong in vitro thấy được khả năng kháng nấm gây bệnh

của chúng, đặc biệt là chống lại được phytopathogenic

1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn:

Một số loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện và môi trường khác nhau, sinh ra các khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi là thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật Trong thực tế, trong môi trường nuôi cấy nấm gây bệnh sẽ có sự hiện diện của rất nhiều loài vi sinh vật khác tranh dành chất dinh dưỡng, không gian sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên

sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Theo Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận,1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005)

a Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus spp.:

 Trước tiên, vi khuẩn Bacillus spp tạo thành khối xung quanh các nấm gây

bệnh ngăn chặn và không cho chúng bám lên vật chủ để gây bệnh

 Sau đó, Bacillus spp sẽ tiết ra hỗn hợp gồm nhiều chất lipopeptid (hay

còn gọi là serenade) làm thủng vách tế bào và màng tế bào của các loại nấm gây bệnh đó, vì vậy ngăn chặn sự phát triển của chúng Serenda có thể được bảo quản và được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm không gây ngộ độc tới các loài động vật như cá hồi, ong mật, chim cút sâu đất…

 Serenda gồm có 3 nhóm lipopetid có tên là surfactin, agrastatin và iturin

Ba nhóm chất này kết hợp lại với nhau sẽ làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh gây hại như nấm mốc và các bào tử gây bệnh của chúng

 Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid

Bản thân của chất này không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với inturin thì sẽ trở thành hợp chất diệt nấm Sufactin có khả năng làm thủng vách tế bào của nấm gây bệnh và bảo tử của chúng hỗ trợ cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng

 Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống

như sufactin và iturin

 Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt

nấm mốc, bản chất của chúng là lipopeptide được chiết từ môi

trường nuôi cấy Bacillus spp Iturin diệt nấm bằng cách tác dụng lên

màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành nhiều lỗ thủng làm mất đi tính thẩm thấu và chọn lọc của màng

 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng của

Aspergillus spp và Bacillus spp.:

 Trong nước:

Nguyễn Đình Đào (1993) đã kiểm tra đối kháng của Bacillus subtilis

ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân,

1995)

Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã tiến hành sử dụng

Bacillus subtilis để ức chế sự sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavusvà Aspergillus parasiticus trên đậu phộng (trích

Lâm Thanh Thúy, 1995)

 Ngoài nước:

Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của

một số chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus

Norio Kimura (1990) đã sử dụng Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu phộng và bắp Các chủng Bacillus subtilis

NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc và tổng hợp aflatoxin (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995)

b Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic:

 Khả năng ức chế của các vi khuẩn Lactic liên quan đến sự ức chế các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng kháng nấm

và các thành phần ức chế đã tìm thấy và được công nhận qua các nghiên cứu

 Các vi khuẩn Lactic có thể sản xuất ra các chất kháng sinh như acid lactic

và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm Các vi khuẩn Lactic đã được biết đến trong nhiều năm và có vai trò quan trọng trong việc sản xuất các sản phẩm lên men phục vụ vho đời sống con người Lợi ích của chúng mang lại là ảnh hưởng quan trọng đến đường tiêu hóa của con người

(Cogan và cộng sự,1995; Hafidh và cộng sự, 2010) Giống Lactobacillus

đã được báo cáo có hoạt tính kháng nấm đánh giá bằng thử nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng Hoạt chất kháng nấm của

L.coryniformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH

3-4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001)

 Hầu hết các nghiên cứu kháng nấm của vi khuẩn Lactic là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hoạt chất proteinaceous và một số các vi

khuẩn Lactic L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ

và đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học duy nhất là Nisin có thể thêm được vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn Lactic (Gardiner và cộng sự,2003; Corcoran và cộng sự,2004)

 Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế lại nấm mốc và các loại nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.1).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005)

Bảng 1.2:Một số hợp chất đƣợc xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm

men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống

Caproic-, propionic-, buturic-,

acetic-, formic- and n-valeric acid

Lactibacillus sanfranciscensis CB1

 Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại

Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này

(Roy và cộng sự, 1996)

 Vi khuẩn Lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các tổ hợp khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl… Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, các vi khuẩn Lactic cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-Nezami và cộng sự, 2004)

1.3 Các phương pháp sàng lọc các chủng VSV kháng nấm mốc:

 Từ cuối những năm 50 và đầu các thập niên 60, các nhà khoa học đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm mốc của các vi khuẩn có lợi thông qua nhiều phương pháp khác nhau để từ đó, các nhà khoa học có thể khẳng định được sự kháng nấm của các vi khuẩn có lợi sẽ ức chế được sự tăng trưởng và phát triển của các bào tử và sợi nấm của các chủng nấm gây hại,

đặc biệt là chủng nấm Aspergillus spp

 Dựa trên tiêu chí đó, để lựa chọn ra được chủng vi khuẩn có lợi từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm có khả năng kháng nấm mốc hiệu quả thích hợp nhất, em đã thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau: phương pháp đối kháng trực tiếp, phương pháp đặt thạch khuếch tán và phương pháp đối kháng che phủ Từ đó, dựa trên sự đường kính của sợi nấm đánh giá được mức độ đối kháng của vi khuẩn có lợi nào mạnh nhất và cũng như phương

pháp nào tối ưu nhất

1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (phương pháp ria 2 đường vi khuẩn):

Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005): Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặt vào tâm dĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấm phát triển Tiếp theo, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào dĩa và đặt cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm dĩa trên cùng một đường kính) Cuối cùng, ủ các dĩa thạch trong 72h, nhiệt độ phòng Hoạt động ức chế sẽ dựa trên đường kính của sợi nấm

Hình 1.6: Phương pháp cấy ria 2 đường vi khuẩn thể hiện sự đối kháng của vi

khuẩn LAB với nấm mốc (trích từ Brunner và cộng sự (2005)

Hình 1.7: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của các vi khuẩn có

lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuân

1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đảt thạch khuếch tán):

 Phương pháp khuếch tán(Agar Plug Diffusion Method) này được phát triển vào năm 1940, là phương pháp thông dụng được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng để thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh thông thường Hiện nay, nhiều tiêu chuẩn đã chấp nhận và phê duyệt được công bố bởi CLSI cho vi khuẩn và nấm mốc thử nghiệm, mặc dù không phải hầu hết các vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng trên phương pháp này nhưng cũng đã thành công trên một số vi khuẩn và thể hiện rõ sự ức chế của chống đối với nấm mốc

 Phương pháp này được mô tả như sau: Đầu tiên, ta trang huyền phù của nấm với mật độ 105/ml nấm trên dĩa thạch PDA cho khô Tiếp theo, sử dụng cây khoanh thạch đục lỗ vi khuẩn chỉ thị đặt vào 3 điểm đã xác định trên dĩa petri

có chứa nấm Cuối cùng, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.Hoạt động ức chế sẽ dựa trên sụ phát triển của đường kính nấm

Hình 1.8: Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng

giữa vi khuẩn Bacillus spp với C.albicans (trích dẫn Mounyr Balouiri,

2011)

Hình 1.9: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn

có lợi theo phương pháp khuếch tán

1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ: (phương pháp đỗ dĩa)

Phương pháp che phủ (Overlay Method) này như mô tả của Kumar và các cộng sự, 2009 Sử dụng dịch tăng sinh của vi khuẩn chỉ thị được cấy trang lên môi trường đặc thù của chúng, sau đó ủ 24h trong nhiệt độ phòng Tiếp theo, chúng được phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm có chứa 105/ml nấm ủ hiếu khí trong vòng 72h Sau 72h nuôi cấy, vùng ức chế sẽ hiện ra.Hoạt động ức chế dựa trên độ bao phủ của nấm thể hiện trên dĩa

Hình 1.10: Phương pháp đối kháng che phủ của vi khuẩn Bacillus spp với nấm mốc - Nấm Trichorphyton sp (a) - Nấm Microsporum

fulvum (b) (trích dẫn Kumar và các cộng sự, 2009)

Hình 1.11: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm với các vi khuẩn có lợi

theo phương pháp đõ dĩa

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu:

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM

2.2 Thời gian thực hiện:

Đề tài được thực hiện từ 20/3/2016 đến 30/7/2016

2.3 Vật liệu nghiên cứu:

2.3.1 Giống vi sinh vật:

 Các giống vi khuẩn Bacillus spp.:

 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1+, CS1b,VK4

 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus

 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3

 Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp.:

2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy:

 Môi trường NA- NB

 Môi trường PDA

 Môi trường MRS-broth và MRS agar

2.4.2 Dụng cụ:

 Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, ống đong

 Pipet thủy tinh 10ml, 20ml, pipetman 100-1000µl

 Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch,que đục lỗ thạch, dao phẫu thuật, đèn cồn

 Bông thấm nước, bông không thấm nước, lame, lamell, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa

 Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc Aspergillus spp

 Khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của 1 số chủng vi khuẩn

 Đánh giá khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp cấy 2 đường

vi khuẩn của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp với nấm

mốc Aspergillus spp

 Xác định khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp khuếch tán

của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp với nấm mốc

Aspergillus spp

 Khảo sát khả năng đối kháng thông qua phương pháp che phủ của 2 chủng

vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc Aspergillus spp

 So sánh kết quả để lựa chọn ra phương pháp đối kháng mạnh nhất của 2

chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp

2.6 Phương pháp nghiên cứu:

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: