Khảo sát ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, một số muối kim loại và dịch chiết tự nhiên lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan hồ điệp phalaenopsis amabilis

Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy .... Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của Th.S Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên trường đại học Công Nghệ TP.HCM Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu

lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM Các số liệu, bảng trong bài là hoàn toàn trung thực

Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

TP.HCM, ngày 17, tháng 08, năm 2016

Sinh viên thực hiện

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô hiện đang giảng dạy trong khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường cùng toàn thể quý thầy cô đang công tác của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quãng thời gian học tập và bồi dưỡng tại trường

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này em xin đặc biệt chân thành cảm ơn cô Th.S Trịnh Thị Lan Anh là người đã tận tình diều dắt, hướng dẫn, giúp đỡ và góp

ý cho em

Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn, các em trong phòng Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ nhiệt tình, hỗ trợ, đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình làm đồ án, giúp em có thể thực hiện tốt đề tài

Mặc dù em đã cố gắng để hoàn thiện đồ án này bằng tất cả sự nhiệt huyết

và năng lực của mình, tuy nhiên không trách khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn

TP.HCM, Ngày 17, tháng 8, năm 2016

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hoàng Cẩm Tú

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC HÌNH viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

7 Kết quả đạt được 3

8 Kết cấu của đề tài 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro 5

1.1.1 Khái niệm 5

1.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy in vitro ở Việt Nam 5

1.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy in vitro 6

1.3 Các bước nhân giống in vitro 7

1.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 7

1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro 8

1.5.1 Auxin 8

1.5.2 Gibberellin (GA) 10

1.5.3 Cytokinin 11

1.5.4 Abscisic acid (ABA) 13

1.5.5 Ethylene 13

1.6 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro 14

1.7 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam 16

1.7.1 Tình hình nghiên cứu hoa Lan trên thế giới 16

1.7.2 Tình hình nghiên cứu hoa Lan tại Việt Nam 17

1.8 Sơ lược về chitosan 20

1.8.1 Giới thiệu 20

1.8.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của chitosan 21

1.9 Sơ lược về các chất kháng ethylene 27

1.9.1 Ảnh hưởng của ethylene lên thực vật 27

1.9.2 Các chất kháng ethylene 29

1.10 Dịch chiết xuất hữu cơ từ trái cây, củ quả 30

1.11 Sự phát sinh hình thái thực vật 33

1.12 Sự hình thành và phát sinh hình thái của mô sẹo 34

1.12.1 Sự hình thành mô sẹo 34

1.12.1.1 Nuôi cấy mô sẹo 34

1.12.1.2 Vai trò loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo 37

1.12.1.3 Môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo 38

1.12.2 Các hình thức phát sinh hình thái của mô sẹo 39

1.12.3 Lịch sử nghiên cứu về mô sẹo 41

1.13 Giới thiệu về lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 42

1.13.1 Nguồn gốc và phân bố 42

1.13.2 Phân loại khoa học 45

1.13.3 Đặc điểm hình thái 45

1.13.4 Điều kiện sinh thái của lan Hồ Điệp 47

1.13.5 Các phương pháp nhân giống lan Hồ điệp 49

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 52

2.1 Địa điểm nghiên cứu 52

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 52

2.2.1 Nguồn mẫu 52

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 52

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 53

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 53

2.3 Bố trí thí nghiệm 53

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 53

2.3.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 54

2.3.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 55

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 56

2.3.5.Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 57

2.4 Phương pháp thống kê và xử lý số liệu 57

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 59

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của gibberellin lên sự hình thành PLB và tạo chồi

từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 67

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 74

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 81

3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự hình thành PLB và tạo chồi từ mô sẹo lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 89

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 97

4.1 Kết luận 97

4.2 Kiến nghị 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO 99

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ABA : Absisic acid

DNA : Deoxynucleotic acid

IAA : 3- indoleacetic acid

IBA : 3- indolebutyric acid

GA3 : Gibberellic acid

MS : Murashige và Skoog, 1962

NAA : Napthaleneaxetic acid

PLB : Protocorm like body

2,4-D : 2,4-dichlopophenoxyacetic acid

2,4,5-T : 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan

Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 54

Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi

lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 55

Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan

Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 55

Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi

lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 56

Bảng 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan

Hồ điệp Phalaenopsis amabilis 57

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp

Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy 60

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy 68

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy 75

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy 82

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp

Phalaenopsis amabilis sau 8 tuần nuôi cấy 90

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của chitosan lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 61Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp sau 8 tuần nuôi cấy 61Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của gibberellin lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 69Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp sau 8 tuần nuôi cấy 69Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của AgNO3 lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của

PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 76Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp sau 8 tuần nuôi cấy 76Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 83Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLBvà tạo chồi lan Hồ

điệp sau 8 tuần nuôi cấy 83Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng của dịch chiết lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của PLB lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 91Biểu đồ 3.10 Ảnh hưởng của lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8

tuần nuôi cấy 91

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 β-Indolaxetic Acid (IAA) 9

Hình 1.2 Gibberellic Acid (GA3) 11

Hình 1.3 6-benzylaminopurine 12

Hình 1.4 Absisic Acid (ABA) 13

Hình 1.5 Ethylene 14

Hình 1.6 Sự đa dạng về hình dáng và màu sắc của lan Hồ điệp 44

Hình 1.7 Lan Hồ điệp trắng (Phalaenopsis amabilis) 45

Hình 3.1 Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 62

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 63

Hình 3.3 Ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 70

Hình 3.4 Ảnh hưởng của gibberellin lên sự hình thành PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 71

Hình 3.5 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 77

Hình 3.6 Ảnh hưởng của AgNO3 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 78

Hình 3.7 Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 84

Hình 3.8 Ảnh hưởng của Co(NO3)2 lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 85

Hình 3.9 Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp sau 8 tuần nuôi cấy 92

Hình 3.10 Ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ

điệp sau 8 tuần nuôi cấy 93

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lan Hồ điệp là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp

có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành cũng như hoa trồng chậu trên thế giới Đã

có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ lúa, hoa màu sang trồng lan và đạt hiệu quả kinh tế cao gấp 2 – 3 lần so với cây trồng khác

Tuy nhiên, ở Việt Nam, nghề trồng lan phát triển chậm hơn so với các nước khác rất nhiều, số lượng sản xuất cây lan hiện nay vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của thị trường Việc trồng lan trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh lâu nay chủ yếu do tự phát nên diện tích trồng còn nhỏ, trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, chưa chủ động được nguồn giống Hơn nữa, lan

Hồ điệp là loài sinh trưởng chậm và là một loài rất khó nhân giống, thường cho

hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm Ngoài ra, lan Hồ điệp rất dễ xảy ra biến dị nên việc gieo hạt không thể tạo được một số lượng lớn cây con có tính đồng nhất Để có được số lượng lớn cây giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất còn gặp nhiều khó khăn

Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường là tạo ra được số lượng hoa lớn, nguồn hoa mới ổn định,… thì việc nghiên cứu để đạt hiệu quả nhân giống cao trên cây trồng rất đáng được quan tâm Phương pháp nghiên cứu hình thành PLB từ mô sẹo lan Hồ điệp không những tạo ra được nguồn PLB lớn mà từ PLB có thể tạo cây hoàn chỉnh trong một thời gian ngắn góp phần nhân nhanh giống lan Hồ

Lan Hồ điệp với đặc tính là cây sinh trưởng chậm, khó nhân giống, tỷ lệ nảy mầm của hạt trong tự nhiên khá thấp thì việc thúc đẩy quá trình trao đổi chất

để giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn rất đáng được quan tâm Các nghiên cứu trước đó cho thấy nguồn đạm và nguồn tinh bột có ảnh hưởng đặc biệt đến

sự hình thành PLB từ mô sẹo Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong

nuôi cấy in vitro như nước dừa, các loại tinh bột, peptone,… đều là những nhân

tố đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống lan Hồ điệp

Để tìm hiểu thêm về sự hình thành PLB từ mô sẹo và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống lan Hồ điệp, tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, một số muối kim loại và dịch chiết tự nhiên lên

sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, một số muối kim loại và dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên lên khả năng tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp nhằm thiết lập môi trường thích hợp cho sự hình thành PLB góp phần nhân

nhanh giống lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là PLB lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis được sử

dụng làm nguồn mẫu để nghiên cứu về ảnh hưởng của chitosan, gibberellin, bạc

nitrate, cobalt nitrate và dịch chiết lên sự hình thành PLB

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của

lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Khảo sát ảnh hưởng của gibberellin lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của

lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Khảo sát ảnh hưởng của bạc nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của

lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Khảo sát ảnh hưởng của cobalt nitrate lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi

của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết (Khoai Tây, Cà Rốt, Chuối, Táo) lên

sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

5 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên, đơn yếu tố Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình Các số liệu sau khi thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm Statistical Analysis Systems 9.0 (SAS) và chương trình MicroSoft Excel 2010®

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học:

Kết quả nghiên cứu của đề tài lên sự tăng sinh PLB và tạo chồi của lan Hồ điệp sẽ giúp tạo ra nguồn PLB lớn trong một thời gian ngắn, giúp đạt hiệu quả nhân giống cao Từ đó, góp phần phục vụ cho những ứng dụng thực tế quan trọng, giúp nâng cao chất lượng cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế

Ý nghĩa thực tiễn:

Nghiên cứu sự tăng sinh PLB của lan Hồ điệp góp phần rất lớn trong công tác nhân nhanh giống cây trồng đồng thời mở ra triển vọng trong việc tạo được cây hoa lan Hồ điệp có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây giống, góp phần giải quyết vấn đề thiếu hụt trầm trọng cây giống lan Hồ điệp chất lượng cao ở Việt Nam trong giai đoạn hiện nay

7 Kết quả đạt được

- Xác định được nồng độ chitosan thích hợp cho sự tăng sinh PLB và tạo

chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Xác định được nồng độ gibberellin thích hợp cho sự tăng sinh PLB và

tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Xác định được nồng độ bạc nitrate thích hợp cho sự tăng sinh PLB và

tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Xác định được nồng độ cobalt nitrate thích hợp cho sự tăng sinh PLB và

tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

- Xác định được loại dịch chiết (Khoai Tây, Cà Rốt, Chuối, Táo) thích hợp

cho sự tăng sinh PLB và tạo chồi lan Hồ điệp Phalaenopsis amabilis;

8 Kết cấu của đề tài

Đề tài bao gồm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy in vitro

1.1.1 Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là

thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng

1.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy in vitro ở Việt Nam

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960

ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm 1980 Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bậc

Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển, nhờ vậy mà một người có thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng

Ở miền Bắc, nhân bản vô tính ở thực vật được ứng dụng hầu hết các nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gốc quý như: Vù hương – loại gốc tiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gốc, chè Vang – một loại chè rất khó trồng Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía,…

Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa Học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla

Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây

Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương

Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu vực Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây

trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô

Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và Trung tâm ứng dụng khoa học kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm Hương, Bạch Đàn Urophylla, cây Hồng, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao

Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, từ một số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y

đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng – loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới,…

1.2 Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy in vitro

Trong công tác giống cây trồng, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển những cơ sở lý thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý thực vật học như Nguyễn Văn Uyển (1993) và một số nhà nuôi cấy mô nước ngoài đã nhận định:

- Đó là tính toàn thể của mô và tế bào thực vật, cho phép tái sinh được cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi cấy tách rời Đây là một điểm rất quan trọng, bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện được những kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và cả lai tạo giống cây trồng

- Khả năng loại trừ virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính Vấn đề này được các nhà khoa học khai thác để phục tráng các giống khoai tây, cây ăn trái (Cam, Quýt)

- Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protôcm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất: cây lương thực (Khoai Tây), cây cảnh (Phong Lan), cây lâm nghiệp (Bạch Đàn, )

- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm, khả năng trao đổi Quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm

- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó tạo

ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo

- Khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen

- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó khả năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống

- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast tái sinh cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai

- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào Đồng thời nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình nghiên cứu di truyền thực vật, vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong ngành kinh tế Hai nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học thực vật ở nước ta là tạo ra các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen và nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nguyễn Văn Uyển, 1995)

1.3 Các bước nhân giống in vitro

- Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy;

- Tạo thể nhân giống in vitro;

- Nhân giống in vitro;

- Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh;

- Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm.

1.4 Môi trường nuôi cấy in vitro

Công thức môi trường của Murashige và Skoog (1962) là thích hợp cho

phần lớn các trường hợp nuôi cấy in vitro

Môi trường gồm các nhóm chất căn bản sau:

• Các chất vô cơ đa lượng: N (NO3- và NH4+), P, K, S, Ca và Mg

• Các nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo

• Các vitamin: nhiều loại (nicotinic acid, biotin,…) mà quan trọng nhất là thiamine (vitamin B1) dưới dạng thiamine -HCl

• Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose

• Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: các auxin và cytokinin, kích thích

sự phân bào, kiểm soát sự phân bào, kiểm soát sự biệt hóa tế bào và phát sinh hình thái Các auxin thường dùng: 2,4-D (2,4 Dichlorophenoxyaceticacid), IAA (indole acetic acid), IBA (indole 3-butyric acid) Các cytokinin có BAP (6-benzylaminopurine), zea (zeatin),… Ngoài ra còn có GA (gibberellic acid) và ABA (abscisic acid)

• Agar sử dụng cho môi trường đặc Hệ thống chiếu sáng hợp lý cần cho sự phát triển của tế bào thực vật

Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy Nhiều yếu tố của môi trường đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu như môi trường khoáng cơ bản, nồng độ và các loại đường, chất điều hòa sinh trưởng thực vật

1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro

Chẩt sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó ở thực vật, ở những nồng độ thấp Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các vitamin dùng trong thực vật

Hiện nay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành 5 nhóm chính: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylene

Hình 1.1 β-Indolaxetic Acid (IAA)

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và gibberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng

Ở thực vật bậc cao, auxin được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh ngọn chồi và từ

đó được vận chuyển xuống dưới (hướng gốc) Ngoài đỉnh ngọn, các cơ quan khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng và cả tầng phát sinh cũng có khả năng tổng hợp auxin

Các có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo, đặc biệt là 2,4-D, tạo phôi vô tính, tạo rễ,…

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ,… Đối với nuôi cấy mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA (3-indoleacetic acid), NAA (napthaleneaxetic acid), 2,4-D và 2,4,5-T (trichlorophenoxyacetic acid) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển mô sẹo Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH pha loãng

Auxin có tác dụng tốt đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt,…

Auxin kích thích sự sinh trưởng của tế bào Nhưng nếu kích thích với hàm lượng cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược trở lại, lúc này auxin sẽ trở thành chất ức chế

• Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin

- Kích thích phân chia và sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều

ngang của tế bào

- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên Ưu thế chồi đỉnh làm ức chế sinh trưởng của chồi nách Nếu ngắt bỏ chồi đỉnh sẽ dẫn đến sự phát chồi nách Nếu thay thế vai trò của chồi đỉnh (đã bị ngắt bỏ) bằng một lớp chất keo có chứa IAA thì chồi nách vẫn bị ức chế sinh trưởng Cơ chế ức chế của chồi đỉnh liên quan đến một chất điều hòa sinh trưởng khác là ethylene Auxin (IAA) kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng của chồi đỉnh

- IAA đóng vai trò kích thích sự phân hóa của mô dẫn

- Auxin gây ra tính hướng động của cây

- Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn

- Auxin kích thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ trong nuôi cấy mô

- Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo

kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính So với auxin và cytokinin, gibberellin hiếm khi được dùng GA3 có tính hòa tan trong nước

Hình 1.2 Gibberellic Acid

Gibberellin được tổng hợp trong phôi đang sinh trưởng, trong các cơ quan đang sinh trưởng khác như lá non, rễ non, quả non,… và trong tế bào thì được

tổng hợp mạnh ở trong lục lạp

• Vai trò sinh lý của gibberellin

- Kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng

Hiệu quả này có được là do gibberellin kích thích mạnh lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc

- Kích thích sự phân chia tế bào, nảy mầm, nảy chồi của các mầm ngủ

- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào, ví dụ kéo dài thân và đòng lúa sau khi phun GA3, kéo dài đốt thân Các cây lùn thường bị thiếu gibberellin

- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ phá ngủ khoai tây sau thu hoạch

- Ức chế sự hình thành rễ bất định

- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trường của ống phấn

- Có thể làm chậm sự hóa già ở lá và quả cây có múi

1.5.3 Cytokinin

Việc phát hiện ra cytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1955, Miller và Skoog phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi là kinetin Sau đó người ta phát hiện cytokinin có ở trong tất cả các loại thực

vật khác nhau và là một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây Trong các loại cytokinin thì các loại sau đây là được dùng phổ biến nhất: kinetin, BA (6-benzylaminopurine), 6-benzin-aminopurin và zeatin tự nhiên Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng

Hình 1.3 6-benzylaminopurine

Cytokinin được hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ, ngoài ra một số cơ quan còn non đang sinh trưởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin như chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh,…

• Vai trò sinh lý của cytokinin

- Cytokinin là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và cộng sự, 1969;

Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 1993)

- Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

- Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi

- Cytokinin ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt và của củ Vì vậy cytokinon có thể phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ và chồi ngủ, làm tăng sự nở hoa

- Cytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây chuyên vẹn

- Cytokinin gây nên sự hình thành chồi trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bướu ở các cây gỗ lâu năm

(Nester et al., 1985; Taiz et al., 1991)

1.5.4 Abscisic acid

Acid absisic (ABA) được tổng hợp ở hầu hết tất cả các bộ phận của cơ thể như rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt, củ,… và được tổng hợp nhiều trong các bộ phận già và các bộ phận đang ngủ nghỉ của cây Nó được vận chuyển trong cây không phân cực

Hình 1.4 Absisic Acid (ABA)

• Vai trò sinh lý của acid absisic

- Trong nuôi cấy mô tế bào, ABA có tác dụng tạo phôi vô tính, kích thích sự

chín của phôi, kích thích sự phát sinh chồi ở nhiều loài thực vật

- Kích thích sự xuất hiện và nhanh chóng hình thàhn tầng rời ở phần cuống,

điều chỉnh sự rụng của các cơ quan của cây

- Acid absisic có chức năng điều chỉnh sự đóng mở của khí khổng

- Tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây sự nứt quả

- Acid absisic thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như

mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng

- Tham gia vào sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy

trong tất cả các mô của cây và là một sản phẩm tự nhiên của quá trình trao đổi chất ở trong cây

Hình 1.5 Ethylene

• Vai trò sinh lý của ethylene

- Gây già hóa lá, kích thích sự rụng lá và quả

- Ethylene là hormone xúc tiến sự chín của quả, được sản sinh mạnh trong quá trình chín và rút ngắn thời gian chín của quả

- Ethylene cùng tương tác với acid absisic gây sự rụng của lá, hoa, quả

- Hoạt hóa sự hình thành tế bào tầng rời ở cuống của các bộ phận

- Sự rụng của các cơ quan phụ thuộc vào tỷ lệ auxin/ethylene Nếu tỷ lệ này cao thì ngăn ngừa sự rụng, còn tỷ lệ này thấp thì ngược lại

- Ethylene kích thích sự ra hoa của một số thực vật

- Gây nên tính hướng của cây, ức chế sự sinh trưởng của chồi bên, xúc tiến sự vận chuyển của auxin, tăng tính thấm của màng

- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hóa, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh

1.6 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro

❖ Ưu điểm:

Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

Sản phẩm cây giống đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

Tiết kiệm không gian: vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

Nâng cao chất lượng cây giống: nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng nuôi cấy mô thường tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc

Lợi thế về vận chuyển: các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi

xa dễ dàng và thuận lợi

❖ Nhược điểm

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: trong điều kiện hiện nay, không phải tất

cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến

nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp

Chi phí sản xuất cao: vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài

và tăng hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

1.7 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam

1.7.1 Tình hình nghiên cứu hoa Lan trên thế giới

Năm 1844, Newman, một nhà vườn Pháp làm nảy mầm hạt lan bằng cách rắc hạt lên các cục đất quanh gốc cây lan to và sự thành công này được lan rộng

nhưng chưa có lời lý giải cụ thể

Năm 1904, Noel Bernard thực hiện phương pháp gieo hạt cộng sinh với nấm để gây sự nảy mầm, ông nhận thấy rằng các cây lan con nảy mầm trong rừng đều bị nhiễm nấm, ông đã cô lập các nấm ở rễ cây lan con và cấy vào hạt lan, chính bằng cách này ông là người đầu tiên làm cho 100% hạt lan nảy mầm

Năm 1949, Rotor là người đầu tiên nhân giống lan Hồ điệp bằng cách sử dụng cành phát hoa Đây được coi là phương pháp chính để nhân giống vô tính lan Hồ điệp Phương pháp này vẫn tồn tại một tỷ lệ cao các chồi duy trì trạng thái ngủ hoặc có thể phát triển thành cuống hoa hay chồi sinh dưỡng

Năm 1977, các thí nghiệm của Tanaka và Sakanishi cho thấy chồi ở các phần phía trên có xu thế duy trì trạng thái ngủ bất chấp ảnh hưởng của nhiệt độ Các chồi nẩy mầm đặt ở 20oC hoặc 25oC sẽ tăng trưởng sinh sản (trừ một số chồi

ở phần gốc) và ở 28oC các chồi đều tăng trưởng sinh dưỡng Chồi nuôi cấy đang

ở trạng thái ngủ sẽ được kích thích nẩy mầm nếu bổ sung BA vào môi trường

Năm 1991, Sajise và Sagawa đã đưa ra báo cáo đầu tiên về sự hình thành

mô sẹo tạo phôi (embryogenic) và Tokuhara và Mii (2000) đã thực hiện cảm ứng thành công mô sẹo tạo phôi từ các mẫu cấy đỉnh chồi trên cuống hoa lan Hồ điệp trên môi trường NDM (New Dogashima Medium) và cấy chuyền thành công mô sẹo sang dạng huyền phù trong môi trường NDM lỏng

Năm 2000, Young và cộng sự đã thành công trong việc sử dụng bioreactor

để nuôi cấy PLB từ các đoạn cắt lá, sau 8 tuần nuôi cấy, họ đã thu được khoảng 18.000 PLB từ khoảng 1.000 PLB ban đầu trong 2 l môi trường Hyponex Các PLB này được chuyển sang môi trường Hyponex rắn để tạo cây con

Năm 2002, Young và cộng sự khảo sát tối ưu hóa quá trình tạo PLB từ lá, đưa ra quá trình hoàn chỉnh và kiểm chứng trên nhiều giống lan Hồ điệp khác nhau

Năm 2013, Samarfard và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tính ổn định

di truyền của PLB lan Hồ điệp dưới tác động của chitosan trong nuôi cấy in vitro

1.7.2 Tình hình nghiên cứu hoa Lan tại Việt Nam

❖ Nghiên cứu về thu nhập, chọn tạo và đánh giá nguồn gen

Nghiên cứu về cây lan ở Việt Nam những buổi ban đầu không rõ rệt lắm, nhiều tác giả cho rằng người đầu tiên có khảo sát về lan ở Việt Nam là Noureiro, nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha, ông này đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789, trong cuốn “Flora cohin chinensis” và sau này đã được Bentham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera Plantarum” (1862 – 1883) Sau khi người Pháp đến Việt Nam đã công bố những công trình nghiên cứu đáng kể

là Gagnepain và Gnillaumin mô tả 70 chi gồm 101 loài cho cả 3 nước Đông Dương trung bộ “Thực vật Đông Dương chí” do Lecomte chủ biên, xuất bản năm

1932 – 1934, có một số tác giả khác cũng đề cập đến lan Việt Nam như: Schumid, Tixer và Seidenfaden (1975) Bên cạnh đó cũng có một số nhà khoa học Việt Nam cũng có bước đầu nghiên cứu về lan như TS Phạm Hoàng Hộ với

289 loại được mô tả và vẽ hình trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam” Năm 1991, phân viện sinh học tại Đà Lạt (nay là Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên, viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam) đã tổ chức thu nhập các loại lan rừng của Lâm Đồng Việc xác định tên khoa học của các loài lan rừng được Vaveryano thực hiện, đến nay ở Lâm Đồng nói riêng đã xác định được tên khoa học của 217 loài, thuộc 64 chi, trong số 239 loài lan của bộ sưu tập và danh mục

217 loài đã xác định tên khoa học và được ghi nhận có hai loài mới của Việt Nam

là Liparis compress Lindl và Thriv spermum leucarachne Ridl

Từ năm 1996 – 1997, Nguyễn Xuân Linh và tập thể cán bộ trung tâm hoa cây cảnh Viện Di Truyền Nông nghiệp đã thu nhập được 88 loài lan thuộc 34 chi, trong 88 loài có 30 loài có khả năng nở hoa nở hoa tại Hà Nội Chúng được xem

là nguồn gen quý cho công tác lai tạo giống sau này Phạm Thị Liên và cộng sự

(2001), khi đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số loài lan Hồ điệp nhập từ Hà Lan đã đi đến kết luận: các loài lan Hồ điệp nhập nội đều có khả năng sinh trưởng, phát triển và cho tỷ lệ ra hoa tốt hơn các loài gieo hạt bản địa

❖ Những nghiên cứu về nhân giống hoa lan ở Việt Nam

• Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt

Đối với hoa lan việc tự thụ phấn là rất khó khăn, trong thực tế việc thụ phấn xảy ra nhờ con nguời hoặc nhân tạo bởi con người, nhân giống bằng hạt không phải là mới mẻ song do hạt lan rất khó nảy mầm nên phương pháp này cũng không được áp dụng phổ biến ở Việt Nam Năm 1990 các cán bộ kỹ thuật của Đà Lạt đã bắt đầu thực hiện các phép lai đầu tiên trên cơ sở chọn lọc những cây bố mẹ mang các đặc tính ưu việt, nhóm phong lan được chọn là các cây trong

chi Renanthera và Vanda, đã đáp ứng được phần nào các yêu cầu ngày càng đa

dạng về mặt sưu tập và từng bước tạo tiền đề cho việc khai thác kinh tế hoa lan cắt cành

• Nhân giống bằng phương pháp tách chiết

Là phương pháp đơn giản, dễ làm, không tốn kém nhiều, tuy nhiên hệ số nhân giống là không cao Nguyễn Việt Thái (2002) cho rằng bất kể tháng nào trong năm cũng có thể tách chiết lan để trồng, tuy nhiên thời điểm tốt nhất đối với lan đơn thân phần ngọn được tách ra trồng nhanh ra hoa hơn các đoạn ở phần thân Theo Nguyễn Công Nghiệp (2000) phương pháp nhân giống bằng tách chiết với 3 giả hành có thể dùng cho tất cả các loài lan đa thân, trừ một số chi

như Cymbidium, Phaius,… có thể dùng 2 giả hành duy nhất, đối với các loài thuộc chi Dendrobium khỏe như Dendrobium caesar Alba, Dendrobium caesar

Latil;… có thể cắt cây con để nhân giống khi giả hành trưởng thành, nếu cắt quá

non sẽ cho kết quả không tốt, còn đối với các loài Dendrobium yếu hơn như Dendrobium jacqueline Thomas, Dendrobium theodore Takiguchi,… Ta có thể

đợi cây con mọc thêm một giả hành mới thì nhân gống đảm bảo hơn

• Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2005), cây lan dễ nhân giống trong ống nghiệm và có hệ số nhân giống cao, môi trường chính cho nuôi cấy lan

là môi trường Knudson C, cùng với Trường Đại học Nông Nghiệp I, Trung tâm hoa cây cảnh kết hợp với Bộ môn nuôi cấy tế bào của Viện Di truyền Nông Nghiệp đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nhân nhanh và khả năng ra rễ của chồi và từ đây đã đưa ra quy trình nhân giống lan Hồ điệp bằng nuôi cấy mô tế bào

Hoàng Ngọc Thuận và cộng sự (2007) cho rằng: ngày nay, việc nhân

giống lan bằng hạt trong môi trường in vitro khá phổ biến ở nhiều phòng thí

nghiệm Việt Nam với các ưu điểm: thời gian cho cây con nhanh, hệ số nhân giống cao, giá thành thấp,…

• Những nghiên cứu về các biện pháp kỹ thuật trong sản xuất hoa lan

Nguyễn Xuân Linh (1998) cho rằng nên tưới phân cho lan vào buổi sáng sớm hoặc lúc chiều mát và không nên tưới vào buổi trưa, bình thường tưới một tuần một lần, nếu thời tiết mát mẻ thì nên tưới 10 – 15 ngày/lần, ngược lại vườn lan có nhiều ánh sáng có thể tưới 2 lần/tuần Sau khi tưới phân nên tăng lượng nước tưới của ngày sau đó để rửa bớt muối còn đọng lại trên cây lan

Nguyễn Công Nghiệp (2000) đã kết luận: mùa tăng trưởng của lan không nên dùng phân tổng hợp NPK loại: 30:10:10, khi chớm nở hoa phải dùng loại phân có nồng độ lân cao loại 10:10:20 hoặc 6:30:30, trước khi cây bước vào mùa nghỉ phải dùng loại phân có nồng độ potassium cao để tăng sức chịu đựng như: 10:20:30, cũng theo Nguyễn Công Nghiệp không nên dùng nồng độ phân bón quá 1g/l nước vì sẽ làm cây lan chết hoặc thoái hóa

Bên cạnh những nghiên cứu về phân bón cho lan các nhà khoa học cũng nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật canh tác như chọn giá thể, tưới nước, làm giàn che, lắp đặt hệ thống thông gió,… Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) cho rằng tưới nước cho lan ở giai đoạn cây con là rất quan trọng, tưới phải nhẹ nhàng bằng vòi phun sương và tưới thường xuyên 3 – 4 lần/ngày nếu quá khô Hoàng Thị Loan

(2006) khi nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của lan Đai Châu đã đi đến kết luận rằng giá thể than hoa kết hợp với rong biển thích hợp cho

sự sinh trưởng của lan Đai Châu nhập nội từ Thái Lan

• Những nghiên cứu về sâu bệnh hại

Hiện nay sự lo lắng nhất của các nhà vườn trồng lan là sâu và bệnh, trong thực tế cho thấy các loại côn trùng chỉ làm cho cây chậm phát triển chứ ít khi lan thành dịch nhưng ngược lại các loại bệnh có thể gây ra sự chết hàng loạt và dễ thành dịch, vì vậy việc phòng ngừa rất quan trọng và cần thiết đối với các nhà vườn trồng lan

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2000) bệnh hại chủ yếu là thối đọt, khô căn hành, bệnh đốm lá, thối nhũn,… Để phòng và trị các loại bệnh này nên dùng các loại thuốc sát khuẩn có gốc đồng có tác dụng ngăn ngừa vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào bên trong mô thực vật, phát triển rồi gây hại cho cây trồng Cũng theo tác giả trên lan thường bị một số côn trùng tấn công như: kiến, gián, rệp, sâu, bọ trĩ,… dùng Bassa, Malathion để phòng trừ

Tóm lại, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về lĩnh vực trồng và chăm sóc hoa lan, nhiều công trình đã được đưa vào thực tiễn và đang áp dụng rộng rãi cho hiệu quả cao Tuy nhiên, để cây lan phát triển mạnh mẽ và cạnh tranh được các giống lan của Thái Lan, Đài Loan,… cần phải có những nghiên cứu sâu hơn

về kỹ thuật nhân giống, các biện pháp chăm sóc,… Từ đó đưa ra quy trình cụ thể cho từng loài lan ở từng điều kiện tương ứng

1.8 Sơ lược về chitosan

1.8.1 Giới thiệu

Chitin là một polysaccharide tự nhiên, trong đó bao gồm một copolymer của N-acetyl-D-glucosamine và D-glucosamine dư lượng, liên kết bởi β-1,4 glycoside Nó hiện diện trong loạt các loài: trong vỏ của các loài giáp xác, trong lớp biểu bì của côn trùng và trong thành tế bào của nấm và một số loại tảo Các hình thức deacetylated của chitin là chitosan Các biopolymer chitosan có ứng dụng trong xử lý nước thải, giấy và bột giấy, các sản phẩm y tế và mỹ phẩm, công nghệ sinh học, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Trong nông nghiệp,

chitosan đã được sử dụng trong hạt, lá, trái cây và lớp phủ thực vật, như phân bón và hóa chất nông nghiệp trong kiểm soát phát hành để tăng sản phẩm nhà máy, để kích thích khả năng miễn dịch của cây, để bảo vệ cây chống lại các vi sinh vật và để kích thích tăng trưởng thực vật Trong các nghiên cứu sau này, một hiệu ứng tích cực của chitosan đã được quan sát thấy sự tăng trưởng của rễ, cành

và lá của cây khác nhau bao gồm hoa đồng tiền và một số cây trồng Rễ Orchid được phun với một lượng chitosan rất loãng kích thích tăng trưởng và tăng cường sức đề kháng chống lại nấm và virus

Chitin là một polymer bền, khó tan, khó tương tác hóa học Khi diacetyl hóa chitin 30 trong NaOH đậm đặc sẽ thu nhận được sản phẩm chitosan (polyglucosamine) Chitosan dễ tan trong acid hữu cơ như acid lactic, acetic Khi phân hủy chitosan bằng các tác nhân khác nhau như acid HCl, enzyme chitosanase, cellulase hoặc bức xạ maga sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều dài mạch ngắn hơn gọi là chitosan oligomer

1.8.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của chitosan

Chitin, chitosan và chitosan oligomer đều là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, không độc, có khả năng phân hủy sinh học và không gây ô nhiễm môi trường Được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, y dược học, nông nghiệp và bảo vệ môi trường

❖ Trong công nghiệp

Chitin, chitosan được ứng dụng khá rộng rãi trong công nghiệp, như dùng

để sản xuất tơ cao cấp trong công nghiệp dệt, sản phẩm bền đẹp, thoáng mát Chitin, chitosan còn được sử dụng trong công nghiệp in, sản xuất mực in, giấy cao cấp Nhờ khả năng tự phân hủy sinh học, chitin, chitosan đang được chú ý để sản xuất bao bì, bao gói tự hủy để giảm ô nhiễm do các polymer tổng hợp như túi nylon, PE, PP

Ngoài ra, trong công nghệ sinh học, chitin, chitosan còn được sử dụng làm vật liệu cố định enzyme, tế bào sử dụng trong các qui trình công nghệ sản xuất tự động, liên tục (Hirano, 1996, Nguyễn Anh Dũng, 1998; 1999) Chitosan còn

được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như bảo quản các sản phẩm thực phẩm để hạn chế mốc, nhiễm khuẩn

❖ Trong y dược học

Hiện chitosan, chitosan oligomer và glucosamine được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong y học Chitosan được sử dụng như là thực phẩm dinh dưỡng (health food) Chitosan có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu, tăng cường

hệ thống miễn dịch và có tác dụng hấp thụ lipid và giảm béo Chitosan còn được

sử dụng làm màng chữa bỏng, màng phủ vết thương (wound dressing), chỉ phẫu thuật tự hoại, làm mỹ phẩm Chitosan oligomer có tác dụng làm tăng hoạt tính lysozyme từ 4,4 µ/ml lên 9,2 µ/ml sau 5 ngày uống Chitosan oligomer còn có tác dụng điều hòa hệ thống miễn dịch của cơ thể, chống khối u (Newletter, 11/2000)

❖ Trong nông nghiệp

Chitin, chitosan và chitosan oligomer đang được nghiên cứu và từng bước đưa vào ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

(Hirano, 1996) Nguyễn Anh Dũng (2005) khi sử dụng chitosan oligomer tưới

cho tiêu số lượng xạ khuẩn, nấm mốc tăng rõ rệt, trong khi đó số lượng Fusarium

gây bệnh giảm đáng kể

• Bảo quản nông sản thực phẩm

Năm 1996, Ghaouth nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế các

loại nấm gây hại sau thu hoạch rau quả như Rhizopus, Colletotrichum, chitosan

bảo quản dâu tươi và các loại trái cây khác lâu hơn do hạn chế nấm gây hư thối

và ức chế hô hấp Fajado (1994) cho thấy chitosan ức chế nấm mốc sinh độc tố

A flavus trên lạc, đậu tương

Sử dụng chitosan để bảo quản trái cây cũng rất được chú ý Chitosan đã được sử dụng để bảo quản xoài, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002, Varaporn, 2002, Chucheep, 2002) Sử dụng chitosan bao trái cây (coating) có thể kéo dài thời gian bảo quản 15 ngày ở nhiệt độ phòng so với đối chứng

• Kích thích tăng trưởng thực vật

Hiện nay chitosan oligomer được xếp vào nhóm điều hòa sinh trưởng thế

hệ mới, đang được nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật cho phong lan Theo Zubay (2000) thì ngoài 5 nhóm điều hòa sinh trưởng thực vật cổ điển

đã được xác định và sử dụng là: auxin, gibberellin, cytokinin, ethylene và absicic acid thì còn có một nhóm điều hòa sinh trưởng mới là oligosaccharins Oligosaccharins là các oligosaccharide chứa vài chục đơn vị Oligosaccharins là những tín hiệu phân tử (molecular signals) hoạt hóa và điều hòa một số hệ thống gen của thực vật

Hadwiger (2002), chứng minh rằng chitosan oligomer là tín hiệu phân tử hoạt hóa trên 20 loại gen khác nhau của thực vật Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu cũng cho thấy oligoalginate, chitosan oligomer có thể kích thích sinh trưởng của thực vật gián tiếp, trực tiếp qua tăng hàm lượng diệp lục tố trong lá, kích thước lục lạp tăng, tăng cường độ quang hợp của cây

Chavagrit (2002), thử nghiệm chitosan chiếu xạ để kích thích sinh trưởng cho phong lan sau 30 ngày sinh khối rễ và cây tăng từ 20 – 60% so với đối chứng

ở nồng độ thích hợp nhất là 50ppm

Sasitorn (2002) phun chitosan cho rau cải để tăng năng suất từ 13 – 31% Hirano (1996), khi sử dụng chitosan oligomer xử lý củ giống khoai tây làm tăng năng suất khoai tây lên 50% so với đối chứng

Nagasawa (2000) khi bổ sung chitosan olygomer vào dung dịch thủy canh làm tăng quang hợp, chiều dài rễ, sinh khối của lạc, lúa

Nge và Steven (2006) nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer như là chất kích thích sinh trưởng thay thế các chất kích thích sinh trưởng truyền thống trong nuôi cấy mô phong lan Nồng độ chitosan oligomer sử dụng tối ưu cho tạo

protocorm là 15 ppm và tạo cây con là 20 ppm Khối lượng phân tử tối thích từ 1,

10 kDa

Nguyễn Anh Dũng (2004) thí nghiệm trên đậu tương cho thấy làm sinh trưởng, nốt sần và năng suất lên 36% so với đối chứng khi sử lý hạt giống với chitosan oligomer

Nguyễn Anh Dũng (2001) nghiên cứu phun chitosan oligomer cho rau cải xanh, với nồng độ 25 ppm làm tăng năng suất từ 20 – 30% so với đối chứng Cơ chế tác động của chitosan, chitosan oligomer đã được làm sáng tỏ bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Hadwiger (2002) đã chứng minh chitosan oligomer là tín hiệu phân tử hoạt hoá và tăng cường hoạt động của hàng loạt gen trong hệ thống đề kháng của thực vật và các gen liên quan đến trao đổi chất như chitinase, chitosanase, glucanase, tăng cường tổng hợp phytoalexin, proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp xenlulose, lignin,…

Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan và nhất là chitosan oligomer còn khá mới mẻ Nguyễn Quốc Hiến (1999) có nghiên cứu thu nhận các oligoalginate tách ra từ rong biển để sử dụng trong nông nghiệp Sau đó, Nguyễn Quốc Hiến, Phạm Thị Lệ Hà (1999) cũng nghiên cứu chế tạo chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ gamma

Lê Quang Luân (2002) cũng nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer được cắt bằng bức xạ gama trong nuôi cấy mô thực vật Kết quả cho thấy, 35 chitosan chiếu xạ gama với liều 100 kGy có hiệu ứng kích thích sinh trưởng của 4 loại cây

nuôi cấy mô là: dâu tây, Limonium latifolium, Eustoma grandiflorum và Chrysanthemum morifolium

Limpanavech (2008), chứng minh rằng chitosan oligomer với mức độ deacetyl hóa 80% đã làm tăng kích thước của lục lạp và bó mạch (vascular bundle) ở cây hoa lan Dendrobium Tác giả cũng chứng minh rằng phun chitosan oligomer làm cho cây ra hoa sớm hơn, số lượng cụm hoa/cây, số hoa/cụm hoa cũng tăng lên so với đối chứng

Nguyễn Anh Dũng (2002, 2004), nghiên cứu phun chitosan oligomer lên cây đậu tương và lạc Kết quả cho thấy ở nồng độ phun 30 ppm làm tăng hàm lượng diệp lục trong lá đậu tương và lạc lên từ 17 – 32% Nguyễn Anh Dũng (2007), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan, chitosan oligomer đến hàm lượng diệp lục khi phun lên lá cà phê Kết quả cho thấy, đối với chitosan thì nồng

độ thích hợp là 80 ppm, và 50 ppm với chitosan oligomer

Nge (2006), cũng nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer trong nuôi cấy

mô hoa lan Dendrobium thay thế các chất kích thích sinh trưởng truyền thống

Tác giả khảo sát nồng độ chitosan oligomer, khối lượng phân tử và nguồn chitosan oligomer sản xuất từ nấm và từ vỏ tôm Kết quả thấy chitosan oligomer thích sinh trưởng, làm tăng khối lượng của protocorm của mô hóa lan lên nhiều lần

Nguyễn Quốc Hiến và Nagasawa (2000), nghiên cứu ảnh hưởng của oligoalginate (cắt bằng bức xạ gamma) đến quang hợp, sinh trưởng của lúa mì, đậu lạc, lúa bằng cách bổ sung vào dung dịch thủy canh Oligoalginate, chitosan oligomer làm tăng cường độ quang hợp, sinh khối, chiều dài rễ của các loại cây này đều tăng mạnh so với đối chứng Với các thí nghiệm trên đồng ruộng, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy chitosan oligomer có tác dụng tăng hàm lượng diệp lục trong lá, kích thích tăng trưởng và tăng năng suất cây trồng

Chibu (2001), nghiên cứu hiệu ứng kích thích sinh trưởng của chitosan

100 kDa giúp các loại cây trồng như Xà Lách, Cà Chua, Lúa cạn xanh đậm, năng suất tăng mạnh

Nguyễn Anh Dũng (2004) trên cây lạc chitosan có tác dụng kích thích tăng trưởng chiều cao cây, sinh khối, và số cành hữu hiệu

So sánh hiệu quả kích thích tăng trưởng và năng suất lạc của chitosan oligomer với một số loại phân bón lá khác trên thị trường cho thấy chitosan oligomer hiệu quả cao hơn nhiều Thử nghiệm chitosan oligomer với nồng độ 30 – 40 ppm trên cây lúa được thực hiện tại Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cho kết quả khả quan, chitosan oligomer làm tăng năng suất lúa xấp xỉ 20% và hiệu

quả cao hơn một số phân bón lá khác Kết quả nghiên cứu này cho thấy năng suất tăng là do chủ yếu tăng số hạt chắc/bông và phần trăm hạt chắc

Nitar (2004), cũng nghiên cứu thử nghiệm trên cây lúa cho kết quả tương

tự Tác giả xử lý hạt giống với nồng độ 30 ppm, và phun tiếp 2 lần/vụ đã làm tăng năng suất lúa tới 40% ở Myanmar

Nguyễn Anh Dũng (2006) nghiên cứu thử nghiệm chitosan oligomer trên cây lúa tại huyện Ea Kar, tỉnh Đak Lak cho kết quả ở nồng độ phun 40 ppm làm gia tăng năng suất 12,35% so với đối chứng và đạt hiệu quả cao hơn so với hai chế phẩm Grow và AC Đặc điểm của ô thí nghiệm phun chitosan oligomer là lá lúa vẫn còn giữ màu xanh khi lúa đã chín Vì vậy khả năng quang hợp, tích lũy chất khô ở thí nghiệm phun chitosan oligomer mạnh hơn, cho tỷ lệ hạt chắc mẩy cao hơn

Thí nghiệm phun chitosan oligomer trên cây bông vải tại Trung tâm Nghiên cứu bông Tây Nguyên của Nguyễn Anh Dũng và Phạm Xuân Hưng (2007) cũng cho kết quả rất khả quan Kết quả cho thấy chitosan oligomer có tác dụng kích thích sinh trưởng chiều cao cây Sự khác biệt về chiều cao cây ở công thức có phun chitosan oligomer với đối chứng là có ý nghĩa thống kê Ảnh hưởng của chitosan đến các chỉ tiêu cấu thành năng suất cho thấy chitosan oligomer có tác dụng làm tăng số quả/bông và số quả/m2 Riêng khối lượng của quả thì không

có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Năng suất thực thu của thí nghiệm phun chitosan oligomer tăng so với đối chứng chăm sóc theo qui trình của công ty từ

15 – 40% Sarathchandra (2004), nghiên cứu xử lý hạt và phun lên lá cho cây kê Thời gian ngâm hạt là 3 – 9h Kết quả chitosan làm tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt

kê và sức sống của cây con cũng như các chỉ tiêu sinh trưởng khác như chiều cao cây, chiều dài bông, số hạt trên bông và khối lượng 1000 hạt

Uddin (2004), nghiên cứu phun chitosan và một số đường monosaccharide

lên hoa Cát tường Lisianthus (Eustoma grandiflorum) Kết quả cho thấy chitosan

làm tăng số nụ hoa và tăng hàm lượng anthocyan, nhờ vậy màu sắc của hoa đậm

đà hơn

Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác của Sasitorn (2002) phun chitosan cho rau cải tăng năng suất từ 13 – 31%

Nguyễn Quốc Hiến (1998, 2000) phun oligoalginate cho hoa cúc, trà, mía, lúa làm tăng năng suất từ 10 – 15%

• Thuốc bảo vệ thực vật sinh học

Chitosan và chitosan olygomer có hoạt tính kích thích tăng trưởng thực vật, tăng số lượng vi sinh vật có lợi và hạn chế các nấm gây hại trong đất, hoạt hóa tăng cường hệ thống đề kháng của thực vật

Cảm ứng hệ thống kháng chủ động đề kháng Hoạt tính kháng Vi sinh vật

Vi sinh vật gây bệnh Chitinase 39 Suwalee (2002), thử nghiệm phun chitosan cho cây ngô để trị bệnh bạc lá, kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng độ 80 ppm thì chitosan hiệu quả hơn và an toàn hơn so với các loại thuốc bảo vệ thực vật trên thị trường Nguyễn Anh Dũng (2004) nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer và

chitosan oligomer cải biến để kháng nấm Fusarium, vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho lạc Pseudomnas solanacerum và tuyến trùng ký sinh Meloidogine incognita,

số lượng tuyến trùng ký sinh giảm từ 6 – 8 lần sau khi tưới chitosan oligomer 3 tháng Rabea (2008) cũng nghiên cứu tổng hợp alkyl và aryl-chitosan sử dụng làm thuốc trừ nấm và trừ sâu Tóm lại, trên thế giới trong những năm gần đây đã

có nhiều nghiên cứu ứng dụng của chitosan, chitosan oligomer trong nông nghiệp như kích thích sinh trưởng, kháng bệnh cho cây trồng Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu còn ở qui mô phòng thí nghiệm, ít có các nghiên cứu thực tế trên đồng ruộng Đặc biệt là các nghiên cứu trên đồng ruộng với các loại cây công nghiệp ngắn ngày như bông vải, lạc và đậu tương

1.9 Sơ lược về các chất kháng ethylene

1.9.1 Ảnh hưởng của ethylene lên thực vật

Nhà khoa học Nga Neliubov là người đầu tiên (1901) phát hiện ethylene

có ảnh hưởng đến sinh trưởng của thực vật Vào những năm 20 của thế kỷ 20, tác động sinh lý của ethylene được phát hiện ngày càng rõ hơn, đặc biệt trong việc làm chín quả cam, quýt, chuối và nhiều quả khác (Denin, 1924) Năm 1934,

R.Gein đã chứng minh được chính thực vật nói chung và cây trồng nói riêng có khả năng tự tổng hợp ethylene và đó là một sản phẩm tự nhiên của quá trình trao đổi chất trong cây

Ngày nay, người ta đã thừa nhận ethylene là hormone của sự chín, sự già hóa và của các “stress” Nó là một phytohormone duy nhất ở dạng khí Các nhà khoa học đã chứng minh được ảnh hưởng, tác động của ethylene đến các quá trình sinh trưởng khác nhau của cây trồng như: sự phát triển và chín của quả, sự già hóa của hoa, sự phân hóa sinh trưởng của rễ cây, sự rụng cơ quan, sự ra hoa

và sự phân hóa giới tính của hoa, sự tổn thương cơ giới và các stress, sự già hóa của các cơ quan và toàn cây,…

Ethylene là hormone thực vật nguyên sinh tham gia vào quá trình lão hóa

thực vật, thúc đẩy quá trình vàng lá (Abeles et al., 1992; Reid và Wu., 1992) và một số lượng lớn của nó được tổng hợp sau khi hoa nở (Woodson et al., 1992; Shibuya et al., 2000)

Sinh tổng hợp của ethylene được quy định chặt chẽ bởi các tín hiệu nội bộ

và kích thích môi trường từ áp lực sinh học và phi sinh học, chẳng hạn như tấn công tác nhân gây bệnh, gây thương tích, tình trạng thiếu oxy, ozone, làm lạnh,

hoặc đông lạnh (Wang et al., 2002 ) Ethylene có vai trò trong việc định hình

hình thái của thực vật Trong nuôi cấy mô, ethylene là một chất đối kháng với

auxin (Kumar et al., 1998)

Ethylene khi xâm nhập vào thực vật lập tức sẽ tự sản sinh ra nhiều hơn Quá trình này được gọi là quá trình sản xuất ethylene tự xúc tác Nồng độ của ethylene không giống nhau từ vài ppb (tỷ phần) đến ppm (triệu phần) và có thể dẫn đến thiêt hại như :

Năm 1981, Halevy và Mayak đã sử dụng các ion kháng ethylene như Al3+,

Ca, Cu2+, Co2+, Ag+, Zn2+, Ni,… dưới dạng các muối ở nồng độ thích hợp để bảo quản nhiều loại hoa sau thu hoạch Theo nghiên cứu của họ thì ethylene thúc đẩy quá trình nở rồi tàn ở các loại hoa, việc bổ sung các muối chứa các ion khoáng trên các tác dụng ức chế ethylene giúp kéo dài tuổi thọ của những bông hoa sau thu hoạch

Các chất kháng ethylene được biết hiện nay chủ yếu bổ sung dưới dạng muối kim loại Các ion kim loại nặng có thể ức chế quá trình chuyển triptophan thành ACC (chất tiền thân của ethylene), do đó ethylene không được hình thành Chính vì vậy, chúng ta có thể kéo dài thời gian bảo quản Ngoài tác dụng kể trên, ion kim loại còn được biết như một chất kháng ethylene tiềm tàng Nó gây trở ngại đối với các vị trí liên kết của ethylene, ức chế sự trao đổi ethylene, hình thành một phức diethylene thực sự do đó có tác dụng như một chất kháng ethylene

❖ Ion Co 2+

Cobalt có mặt trong khoảng một nửa số lượng môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Nồng độ sử dụng là 1 µm, đôi khi người ta có thể sử dụng nồng độ cobalt cao gấp 10 lần Cobalt là thành phần kim loại trong vitamin B12 có liên quan đến sự sinh tổng hợp acid nucleic nhưng chưa có bằng chứng nào về tác động của nó lên sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của mô trên môi trường nuôi cấy