Khảo sát môi trường phát triển nấm mốc trichoderma konigii, ứng dụng khả năng thủy phân tiêu đen tạo sản phẩm tiêu trắng

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen.. Ảnh hưởng của thời gian ngâm ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme.. Kết quả khảo sát ảnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là do tự bản thân thực hiện và không sao chép các công trình nghiên cứu của người khác để làm sản phẩm của riêng mình Các thông tin thứ cấp sử dụng trong luận án là có nguồn gốc và được trích dẫn rõ ràng Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính xác thực và nguyên bản của luận án

Tp.HCM, tháng 7 năm 2014

Vũ Thùy Dung

LỜI CẢM ƠN

Thời gian qua, được sự đồng ý Ban Lãnh Đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới, sự chấp thuận của Ban Giám Hiệu trường Đại học Công nghệ Tp.HCM nói chung và khoa Công nghệ Sinh học Thực phẩm- Môi trường nói riêng, em đã có cơ hội thực hiện đề tài tại Viện Nhờ đó, em có điều kiện trao dồi thêm nhiều kiến thức bổ ích ngoài những điều đã được học ở trường, giúp em có cái nhìn cụ thể và chi tiết hơn đối với ngành nghề em đang học để có định hướng rõ ràng cho công việc trong tương lai Đó thật sự

là một trải nghiệm vô cùng quý báu và cần thiết

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học, cùng toàn thể thầy cô đã giảng dạy và chỉ dẫn em trong suốt quá trình học tập tại trường

Cô Đỗ Thị Tuyến và thầy Nguyễn Tiến Thắng đã tận tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em thực hiện và hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này Ban Lãnh đạo cùng toàn thể các cô, chú, anh chị là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã chỉ bảo, hỗ trợ cũng như cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài

Con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bố mẹ, anh chị đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bước vào trường đời

Kết lời, em xin chúc Viện đạt được nhiều thắng lợi trong những chặng đường sắp tới, kính chúc Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM, toàn thể cán bộ, công nhân viên nhiều sức khỏe và thực hiện công tác tốt

Tp HCM ngày 25 tháng 7 năm 2014

Vũ Thùy Dung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC VIẾT TẮT ix

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH xii

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ xiii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ xiv

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Mục tiêu nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về cây hồ tiêu 5

1.1.1 Đặc tính sinh học 5

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây hồ tiêu 8

1.1.3 Mùa vụ và vùng trồng 10

1.1.4 Cấu trúc cơ bản của hạt tiêu đen 12

1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế biến tiêu trắng 13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế biến tiêu trắng trên thế giới 13

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế biến tiêu trắng ở Việt Nam 15

1.3 Cấu trúc và cơ chế thủy phân vách tế bào thực vật bằng enzyme 18

1.3.1 Cấu trúc và cơ chế thủy phân cellulose 19

1.3.1.1 Cấu trúc của cellulose 19

1.3.1.2 Cơ chế thủy phân cellulose 20

1.3.2 Cấu trúc và cơ chế thủy phân pectin 22

1.3.2.1 Cấu trúc của pectin 22

1.3.2.2 Cơ chế thủy phân pectin bởi enzyme pectinase 23

1.3.3 Cấu trúc và cơ chế thủy phân xylan 28

1.3.3.1 Cấu trúc của xylan 28

1.3.3.2 Cơ chế thủy phân xylan bởi enzyme 28

1.4 Giới thiệu về nấm Trichoderma 29

1.4.1 Phân loại 29

1.4.2 Đặc điểm hình thái 30

1.4.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh học 31

1.4.4 Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng 31

1.4.5 Nấm mốc Trichoderma koningii 31

1.5 Tổng quan về công nghệ lên men bán rắn 32

1.5.1 Các loại cơ chất 32

1.5.1.1 Cám gạo 32

1.5.1.2 Trấu 34

1.5.1.3 Bã mía 34

1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hình thành bào tử trên môi 35

trường lên men bán rắn 35

1.5.2.1 Nguồn carbon 35

1.5.2.2 Nguồn nitơ 35

1.5.2.3 Các nguyên tố khoáng 36

1.5.2.4 Ảnh hưởng của độ ẩm 36

1.5.2.5 Ảnh hưởng của cơ chất 37

1.5.2.6 Ảnh hưởng của độ thoáng khí 37

1.5.2.7 Ảnh hưởng của pH 38

1.5.2.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ 38

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 39

2.2 Vật liệu 39

2.2.1 Nguồn vi sinh vật 39

2.2.2 Nguyên liệu và cơ chất 39

2.2.3 Hóa chất 40

2.2.4 Dụng cụ 40

2.2.5 Thiết bị 41

2.2.6 Môi trường 41

2.2.6.1 Môi trường giữ giống PGA 41

2.2.6.2 Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khoáng cho môi trường lên men bán rắn) 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu 42

2.3.1 Phương pháp cấy chuyền giữ giống, nhân giống và thu sinh khối nấm mốc Trichoderma koningii trên môi trường lên men bán rắn 42

2.3.2 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu 43

2.3.3 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 44

2.3.4 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí 45

2.3.5 Phương pháp xác định độ ẩm của môi trường lên men bán rắn 46

2.3.6 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu tiêu đen 47

2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 48

2.5 Ứng dụng chế phẩm enzyme thương mại trong sản xuất tiêu sọ 49

2.5.1 Khảo sát độ ẩm hạt tiêu theo thời gian ngâm 49

2.5.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen bằng enzyme 49

2.5.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm đến hiệu suất

bóc vỏ hạt tiêu đen 50

2.5.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen 50

2.5.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thanh trùng đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật 52

2.5.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật 53

2.5.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen 54

2.5.2.6 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme 56

2.5.2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme 58

2.5.2.8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme 60

2.6 Ứng dụng chế phẩm vi sinh T.koningii trong sản xuất tiêu trắng 62

2.6.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của T koningii trên môi trường lên men bán rắn 62

2.6.1.1 Khảo sát nồng độ giống bổ sung thích hợp 62

2.6.1.2 Khảo sát thời gian nuôi ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng Trichoderma koningii 63

2.6.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng Trichoderma koningii 65

2.6.2 Phương pháp lên men bán rắn thu nhận bào tử nấm sợi T koningii 66

2.7 Phương pháp bố trí và xử lý số liệu thực nghiệm 67

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68

3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm hạt tiêu theo thời gian ngâm 68

3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng bóc vỏ tiêu đen khi sử dụng chế phẩm enzyme Cellusoft L 69

3.2.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm 69

3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến khả năng trương nở của lớp vỏ tiêu và hiệu suất bóc vỏ 70

3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thanh trùng đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật 72

3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật 73

3.2.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến hiệu suất bóc vỏ tiêu đen 75

3.2.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất bóc vỏ tiêu đen 76

3.2.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme 78

3.2.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất bóc vỏ tiêu đen 79

3.3 Ứng dụng chế phẩm vi sinh Trichoderma koningii trong sản xuất tiêu trắng 81

3.3.1 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng T.koningii 81

3.3.1.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống bổ sung đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng T.koningii 81

3.3.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng T.koningii 83

3.3.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng T.koningii 86

3.3.2 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành bào tử của chủng Trichoderma koningii trên môi trường lên men bán rắn 87

3.3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm 87

3.3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất 89

3.3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng bổ sung 90

3.3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 92

3.4 Đề xuất quy trình ứng dụng chế phẩm enzyme và chế phẩm vi sinh trong

sản xuất tiêu sọ từ tiêu đen 94

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 97

4.1 Kết luận 97

4.2 Kiến nghị 98

NL : NN Nguyên liệu : nước ngâm

TSVKHK Tổng số vi khuẩn hiếu khí

v/w Phần trăm thể tích – khối lượng

w/w Phần trăm khối lượng – khối lượng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng các chất trong cám gạo 33

Bảng 1.2 Nồng độ chất khoáng cần thiết cho sinh trưởng nấm mốc và xạ khuẩn 36

Bảng 2.1 Hàm lượng các chất trong môi trường PGA 41

Bảng 2.2 Thành phần các chất trong môi trường Czapek 42

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:nước ngâm đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu 70

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến HSBV hạt tiêu đen 72

Bảng 3.3 kết quả TSVKHK khi thanh trùng ở các nhiệt độ khác nhau 73

Bảng 3.4 kết quả TSVKHK khi thanh trùng ở các thời gian khác nhau 75

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme đến HSBV hạt tiêu đen 76

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến HSBV hạt tiêu đen 78

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ ủ đến HSBV hạt tiêu đen 79

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến HSBV hạt tiêu đen 81 Bảng 3.9 Kết quả HSBV của chủng Trichoderma koningii ở các nồng độ bào tử bổ sung khác nhau 82

Bảng 3.10 Kết quả HSBV của chủng Trichoderma koningii theo thời gian nuôi ủ 85

Bảng 3.11 Kết quả HSBV hạt tiêu đen của chủng nấm mốc Trichoderma koningii theo

chế độ ủ 87

Bảng 3.12 Kết quả mật độ bào tử của chủng Trichoderma koningii theo độ ẩm 89

Bảng 3.14 Kết quả mật độ bào tử của chủng Trichoderma koningii theo nồng độ dinh

dưỡng 90

Bảng 3.15 Kết quả mật độ bào tử của chủng Trichoderma koningii theo thời gian nuôi

cấy 92

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hồ tiêu 5

Hình 1.2 Trồng tiêu trên cây trụ sống 7

Hình 1.3 Tiêu đen và tiêu trắng 8

Hình 1.4 Tiêu đỏ và tiêu xanh 8

Hình 1.5 Quả hồ tiêu 9

Hình 1.6 Sản lượng tiêu của các nước sản xuất chính 11

Hình 1.7 Cấu trúc cắt ngang hạt tiêu đen 12

Hình 1.8 Cấu trúc vách tế bào thực vật 19

Hình 1.9 Cấu trúc cellulose 19

Hình 1.10 Quá trình phân giải cellulose của cellulase 22

Hình 1.11 Cấu trúc pectin 23

Hình 1.12 Cấu trúc pectin 25

Hình 1.13 Vị trí tác động của Endo – PMG – I 26

Hình 1.14 Vị trí tác động của Exo – PMG – III 26

Hình 1.15 Vị trí tác động của Endo – PG – II 27

Hình 1.16 Vị trí tác động của Exo – PG – IV 28

Hình 3.1 Sự phát triển tơ nấm T koningii trên tiêu ở các nồng độ khác nhau 84

Hình 3.2 Sự phát triển của tơ nấm Trichoderma koningii trên tiêu ở các thời gian khác

nhau 87

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Độ ẩm hạt tiêu theo thời gian ngâm nước 69

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ NL : NN đến HSBV của hạt tiêu đen 71

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của ngâm nước đến HSBV của hạt tiêu đen 72

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ thanh trùng đến khả năng tiêu diệt VSV 75

Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến khả năng tiêu diệt VSV 76

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến HSBV hạt tiêu đen 77

Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của pH đến HSBV hạt tiêu đen 78

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến HSBV hạt tiêu đen 80

Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến HSBV hạt tiêu đen 81

Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng của mật độ bào tử nấm mốc bổ sung đến HSBV của chủng T.koningii 83

Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng của thời gian nuôi ủ đến HSBV của chủng T.koningii 85

Đồ thị 3.12 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến HSBV của chủng T.koningii 88

Đồ thị 3.13 Ảnh hưởng của cơ chất đến mật độ bào tử chủng T.koningii 89

Đồ thị 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến mật độ bào tử chủng T.koningii 91

Đồ thị 3.15 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến mật độ bào tử chủng T.koningii 92

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Hệ thống phân loại enzyme pectinase 24

Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm 49

Sơ đồ 2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm đến HSBV hạt tiêu đen 52

Sơ đồ 2.3 Ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến HSBV hạt tiêu đen 53

Sơ đồ 2.4 Khảo sát nhiệt độ thanh trùng 54

Sơ đồ 2.5 Khảo sát thời gian thanh trùng 55

Sơ đồ 2.6 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến HSBV hạt tiêu đen 56

Sơ đồ 2.7 Ảnh hưởng của pH đến HSBV hạt tiêu đen 59

Sơ đồ 2.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến HSBV hạt tiêu đen 61

Sơ đồ 2.9 Ảnh hưởng của thời gian ngâm ủ đến HSBV hạt tiêu đen 62

Sơ đồ 2.10 Ảnh hưởng của nồng độ giống bổ sung đến HSBV của Trichoderma koningii

Sơ đồ 2.11 Ảnh hưởng của thời gian nuôi ủ đến HSBV của Trichoderma koningii

Sơ đồ 2.12 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến HSBV hạt tiêu đen

Sơ đồ 3.1 Quy trình ứng dụng chế phẩm enzyme và chế phẩm vi sinh trong sản xuất tiêu sọ từ tiêu đen

LỜI MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cho đến nay, không ai trong giới kinh doanh gia vị và nông sản trên khắp thế giới không biết đến hồ tiêu Việt Nam Người ta biết đến hồ tiêu Việt Nam như là một nhà sản xuất và xuất khẩu số một thế giới Hơn thế nữa, hồ tiêu Việt Nam còn là một thị trường đầy tiềm năng và triển vọng, là một ngành hàng uy tín và chất lượng Không chỉ

là loại hạt gia vị quen thuộc trong gia đình mà còn là loại cây công nghiệp mang lại giá trị kinh tế cao cho người nông dân Hàng năm đem lại nguồn thu ngoại tệ lớn cho đất nước Những năm gần đây, cây tiêu đã trở thành một trong những loại cây trồng chủ lực của cây công nghiệp, không chỉ giúp người dân xóa đói giảm nghèo mà còn là cây mang lại cuộc sống giàu có cho nhiều hộ nông dân Vì thế việc trồng, chế biến và xuất khẩu hồ tiêu đã được nước ta ưu tiên chú trọng đầu tư và phát triển

Trên thị trường thế giới có nhiều sản phẩm của tiêu nhưng chủ yếu là tiêu đen, tiêu trắng và một lượng nhỏ là nhựa dầu hồ tiêu Tiêu đen được chủ yếu tiêu thụ chủ yếu ở các nước đang và kém phát triển với giá thấp Tiêu trắng được thị trường các nước phát triển ở Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Á ưa chuộng do có màu sắc hấp dẫn, mùi thơm nồng và ít tạp nhiễm vi sinh vật Vì thế, tiêu trắng được sử dụng ngày càng rộng rãi trong chế biến thực phẩm ở nhiều nước

Ở nước ta, tiêu trắng được sản xuất với sản lượng thấp hơn rất nhiều so với tiêu đen trong khi ở các nước xu hướng chung là phát triển sản xuất và chế biến tiêu trắng Lâu nay, người trồng tiêu thường có thói quen, sau khi thu hoạch chỉ phơi khô, sau đó đem vào máy chà để loại cuống và lá rồi bán cho các thương lái, hoặc sản xuất bằng cách ngâm nước, chà rửa và sử dụng hóa chất để làm tiêu sọ Chưa ai thực sự quan tâm đến khâu phơi, sơ chế đúng tiêu chuẩn, nên hạt tiêu đen thường bị nhiễm bụi, vi khuẩn, nấm mốc gây tác hại cho người tiêu dùng, giá lại thấp, nhất là không có giá trị xuất khẩu Trong khi tiêu trắng (tiêu sọ) vừa đảm bảo các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực

phẩm, lại có giá trị xuất khẩu khá cao (gấp 2 - 2,5 lần tiêu đen) Theo số liệu của Hiệp Hội hồ tiêu: năm 2008, Việt Nam xuất khẩu 90.000 tấn, chiếm khoảng 35% sản lượng tiêu của thế giới nhưng chủ yếu là tiêu đen (90%) và một lượng nhỏ tiêu trắng (khoảng 10%) nên giá trị kinh tế không cao Thị trường xuất khẩu tiêu của Việt Nam có trên 30% nước chủ yếu là ở Châu Âu, Châu Á, Châu Mỹ và Châu Phi Tiêu trắng đươc xuất khẩu với giá 5.112 USD/tấn cao xấp xỉ 1,6 lần tiêu đen (3.235 USD/tấn) Đây là sự thiệt thòi lớn cho người nông dân và nền kinh tế đất nước ta

Hiện nay, việc sản xuất tiêu trắng chủ yếu là sản xuất thủ công và bán công nghiệp đi từ tiêu đen theo phương pháp ngâm nước Quá trình ngâm dài ngày và thay nước nhiều lần đến khi vỏ tiêu thối nhũn mới đem xát vỏ Vì vậy sau khi xát vỏ tiêu thường sậm màu, mùi thối khó chịu và phải khử màu, khử mùi bằng hóa chất

Việc phân rã vỏ tiêu chủ yếu là phân rã tự nhiên, chỉ tiêu vi sinh của tiêu trắng thường không đạt tiêu chuẩn, do vậy phải sấy tiêu ở nhiệt độ cao trong thời gian dài để khử khuẩn, gây tổn thất các hợp chất thơm bay hơi, làm giảm chất lượng sản phẩm Hơn nữa, quá trình ngâm ủ và thay nước dài ngày tiêu tốn rất nhiều nước, gây ô nhiễm môi trường

Gần đây, xu hướng sử dụng các phương pháp sinh học để thu được các sản phẩm sạch, chất lượng tốt, giảm ô nhiễm môi trường được quan tâm nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi Ở nước ta, việc ứng dụng các phương pháp sinh học vào sản xuất tiêu sọ cũng

đã được chú ý

Công trình nghiên cứu của tác giả Bùi Văn Miên (Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, 2004), tổng thời gian sản xuất là 6-7 ngày, hiệu suất bóc vỏ đạt 95%.Tiêu trắng sản xuất theo công nghệ này đạt được các tiêu chuẩn về cảm quan, vật lý và hóa học.[7]

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đức Lượng (2002-2005) sử dụng chế phẩm sinh

học Biovina (là chế phẩm xử lý nước thải, chất thải hữu cơ) gồm các chủng nấm mốc Asperillus, Penicillium và xạ khuẩn Actinomyces để xử lý vỏ hạt tiêu giúp rút ngắn thời

gian sản xuất còn 7 ngày: tiêu đen được phân loại qua hệ thống xoắn ốc, hiệu suất tróc

vỏ >82%.[6]

Nhìn chung, các Công nghệ này vẫn còn những hạn chế nhất định về mặt an toàn

vệ sinh thực phẩm, thời gian ngâm nước trước khi lên men khá dài nên việc triển khai ứng dụng chưa phổ biến đại trà

Vì vậy, với mong muốn nâng cao chất lượng tiêu trắng đáp ứng nhu cầu tiêu dùng

và xuất khẩu, giải quyết các vấn đề còn tồn tại của phương pháp sản xuất thủ công hiện

nay, đề tài “Khảo sát môi trường phát triển nấm mốc Trichoderma koningii, ứng dụng

khả năng thủy phân tiêu đen tạo sản phẩm tiêu trắng” được nghiên cứu thực hiện Sản xuất tiêu trắng bằng phương pháp sinh học là xu thế tất yếu do có các ưu điểm như: thời gian ngâm ủ ngắn và tiết kiệm nước, hạn chế sự tổn thất các hợp chất thơm, chất lượng sản phẩm đồng đều và tốt hơn, hạn chế sự ô nhiễm mùi và nước thải tại nơi sản xuất

2 Mục đích nghiên cứu

- Ứng dụng chế phẩm enzyme trong chế biến tiêu trắng

- Ứng dụng chế phẩm sinh học có chứa vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase và cellulase phân giải pectin, cellulose là thành phần chính cấu tạo nên vỏ hạt tiêu để sản xuất tiêu trắng (tiêu sọ)

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: tỷ lê nguyên liệu : nước ngâm, thời gian ngâm, nhiệt độ thanh trùng, thời gian thanh trùng, nồng độ chế phẩm enzyme, pH, nhiệt độ ủ, và thời gian thủy phân đến hiệu suất bóc vỏ của tiêu đen bằng enzyme

Cenllulase có tên thương mại: Cellusoft L

- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: độ ẩm môi trường, tỷ lệ cơ chất, nồng độ

dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy lên sự hình thành bào tử nấm T konigii trên môi trường

lên men bán rắn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây hồ tiêu

-Chi : Hồ tiêu (Piper)

-Loài : Hồ tiêu (Piper Nigrum L.)

Hình 1.1 Hồ tiêu [41]

Cây tiêu có tên khoa học là Piper nigrum L., thuộc họ Hồ tiêu Piperaceae, có

nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, đã du nhập vào Việt Nam khá lâu, mang nhiều đặc trưng cuả cây trồng miền nhiệt đới.[41]

Cây tiêu thích hợp với khí hậu vùng xích đạo và nhiệt đới, nhiệt độ trung bình 22-280C, lượng mưa cần thiết 2.000 -3.000mm/năm, phân bố đều trong tháng 7 và 8, sau đó là 3-5 tháng không mưa ở giai đoạn ra hoa và thu hoạch

Hồ tiêu có thể trồng được trên nhiều vùng đất nhưng đất thích hợp phải là đất tơi xốp, nhiều mùn, pH 5,5 - 7, thoát nước tốt Ở Việt Nam các vùng đất nâu đỏ bazan rất phù hợp cho việc trồng tiêu Mật độ trồng thích hợp nhất của hồ tiêu từ 2.000 - 2500 nọc/ha Đất dốc cần bố trí hàng tiêu theo đường đồng mức để giảm bớt rửa trôi dinh dưỡng và xói mòn đất

Cây hồ tiêu có nguồn gốc từ tán rừng thưa nên ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp với yêu cầu sinh lý của cây tiêu hơn là trực xạ Trồng tiêu trên cây trụ sống vừa tạo được

độ che bóng cho vườn tiêu vừa đảm bảo trụ cho tiêu leo bám.[8]

Hình 1.2 Trồng tiêu trên cây trụ sống

Theo y học cổ truyền, tiêu vị cay, tính nóng, có tác dụng kích thích tiêu hóa nên thường được dùng làm gia vị Ngoài ra, tiêu còn có tác dụng giảm đau, chống nôn Hạt tiêu còn được dùng để chữa hen (Trung Quốc) hay chữa dịch tả ( Ấn Độ)

Các sản phẩm chế biến từ quả tiêu:

- Tiêu đen: Hái quả còn xanh, vào lúc xuất hiện một số quả chín trên chùm (tốt nhất có trên 5% quả chín có màu vàng, đỏ) về phơi hoặc sấy khô ở 40 – 50oC; các quả sau khi phơi vỏ quả sẽ săn lại, ngả màu đen gọi là tiêu đen

- Tiêu trắng: Hái quả chín có màu đỏ (tốt nhất trên 20% quả chín), loại bỏ lớp vỏ ngoài rồi phơi khô, thu được hồ tiêu sọ có màu trắng ngà, xám, ít nhăn nheo, ít thơm nhưng cay hơn

Hình 1.3 Tiêu đen và tiêu trắng

- Tiêu đỏ: là loại hồ tiêu chín cây hoặc được thu hái khi rất già rồi ủ chín Màu đỏ của quả tiêu được giữ lại bằng cách ngâm vào dung dịch nước muối cùng với chất bảo quản thực phẩm, sau đó được khử nước [9]

– Tiêu xanh: các quả được hái khi còn xanh, bảo quản trong nước muối, giấm hoặc acid citric để giữ lại màu xanh tự nhiên và hương vị của hạt tiêu tươi

Hình 1.4 Tiêu đỏ và tiêu xanh

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây hồ tiêu

Thân: Hồ tiêu dạng dây leo bằng rể phụ Thân tròn nhẵn, tầy lên những mấu, mọc uốn éo [16] Loại thân thảo mềm dẻo được phân thành nhiều đốt, tại mỗi đốt có một lá đơn [12]

Lá: Lá có cuống, mọc so le Hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 11 - 15 cm, rộng 5

- 9 cm, gốc tròn, đầu nhọn, có những chấm trong rất mờ, mặt trên lục sẫm bóng, mặt dưới màu xám nhạt, gân lá lồi rõ, cuống lá dài 2 - 3 cm [16]

Hoa: Cụm hoa mọc đối diện với lá thành bông ngắn hơn lá Lá bắc thuôn dài, cùng lớn lên với trục bông, hoa khác gốc, đôi khi tạp tính được bao bọc bởi lá bắc, nhị

2, bao phấn hình thận, bầu thượng hình tròn [16] Hoa hồ tiêu ra không tập trung mà ra thành nhiều lứa Hoa tự của hồ tiêu hình gié, treo lủng lẳng, dài 7 - 12cm tùy giống và tùy điều kiện chăm sóc Trên hoa tự có bình quân 20 - 60 hoa xếp thành hình xoắn ốc, hoa lưỡng tính hay đơn tính Các giống hồ tiêu cho năng suất cao thường có tỷ lệ hoa lưỡng tính nhiều hơn [12]

Quả: Quả hồ tiêu thuộc loại quả hạch, không có cuống, quả hình cầu [12] Khi chín màu đỏ, đem phơi khô thành đen, đường kính 3 - 4 mm, hạt tròn Mặt ngoài màu nâu đen, có nhiều vết nhăn hình vân lưới nổi lên Đỉnh đầu quả có vết của vòi nhụy nhỏ hơi nổi lên, gốc quả có vết sẹo của cuống quả Quả cứng Vỏ quả ngoài có thể bóc ra được Vỏ quả trong màu trắng tro hoặc màu vàng nhạt, mặt cắt ngang màu trắng vàng Quả có chất bột, trong có lỗ hổng nhỏ Mùi thơm, vị cay [16]

Hình 1.5 Quả hồ tiêu

Mùa hoa quả: Tháng 5-8 [16]

Thành phần hóa học của hạt tiêu: Tinh dầu 1,2-2%, Piperin 5-9%, Chanvixin 6%, Chất béo 8% ,Tinh bột 36% , Tro 4%

2,2-1.1.3 Mùa vụ và vùng trồng

Mùa thu hoạch tiêu khác nhau ở từng nước, tùy thuộc vào điều kiện khí hậu So với các quốc gia khác thì Sri Lanka, Ấn Độ và Thái Lan là các nước có thời gian thu hoạch tiêu lâu nhất Tại Ấn Độ, thời điểm thu hoạch tiêu bắt đầu từ tháng 11 và kéo dài cho đến tháng 3 năm sau Ở Indonesia, thời gian thu hoạch từ tháng 7 đến tháng 10 Ở Brazil, thời gian thu hoạch kéo dài từ tháng 8 đến tháng 10 Ở Việt Nam, thu hoạch tiêu bắt đầu từ tháng 2 và kết thúc vào tháng 5 [2]

Tháng 3/2005 Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam được kết nạp vào Hiệp hội Hồ tiêu Quốc tế (IPC) gồm có 6 nước thành viên là các quốc gia sản xuất, xuất khẩu hồ tiêu hàng đầu thế giới như: Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Brazil và Việt Nam Các quốc gia này chiếm trên 80% sản lượng và số lượng xuất khẩu, là nhân tố chủ yếu chi phối điều tiết thị trường giá cả hạt tiêu toàn cầu [42]

Hiện nay, Việt Nam là nước sản xuất tiêu lớn nhất trên thế giới chiếm 1/3 sản lượng thế giới tiếp theo là Ấn Độ, Brazil và Trung Quốc.[2]

Hình 1.6 Sản lượng tiêu của các nước sản xuất chính

Theo Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, năm 2013, xuất khẩu hồ tiêu cả nước ước đạt 134.000 tấn với kim ngạch đạt 899 triệu USD, tăng gần 15% về lượng và tăng hơn 13% về kim ngạch so với năm 2012 Theo dự báo của Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam (VPA), năm 2014 có thể đạt kim ngạch 900 triệu USD, tức tương đương vụ năm 2013 Tuy nhiên, cảnh báo từ các tổ chức nghiên cứu về nông sản thế giới cho thấy, từ năm

2015 trở đi, sản lượng hồ tiêu thế giới có thể tăng, do đó giá cả có thể biến động theo chiều hướng giảm Cùng với đó, thị trường nhập khẩu sẽ đòi hỏi chất lượng càng ngày càng khắt khe hơn.[43]

Xuất khẩu hồ tiêu của Việt Nam đang giữ vững vị trí số 1 về sản lượng và số lượng xuất khẩu trên thế giới, có vai trò quan trọng trong việc điều tiết lưu thông, bình

ổn giá cả và thị trường Theo Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, hiện có khoảng 95% sản lượng hồ tiêu sản xuất trong nước để xuất khẩu đến hơn 80 quốc gia, vùng lãnh thổ, còn lại 5% là tiêu thụ trong nước Việt Nam có khoảng 15 doanh nghiệp xuất khẩu hồ tiêu ở vị trí đầu thế giới, chiếm trên 50% thị phần xuất khẩu Hiện nay, Hoa Kỳ là thị trường xuất khẩu tiêu số 1 của Việt Nam, với kim ngạch liên tiếp đạt mức tăng trưởng cao Tiếp theo là thị trường Đức, UAE…

Ở Việt Nam, do vị trí địa lý thuận lợi, điều kiện thiên nhiên ưu đãi, cây Hồ tiêu đã được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau từ Quảng Trị đến Kiên Giang, nhưng tập trung trọng điểm 6 tỉnh: Bình Phước, Gia Lai, Đắc Nông, Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu

và Đắc Lắc

Các tỉnh trồng tiêu trọng điểm chiếm gần 80% diện tích và 75% sản lượng tiêu cả nước Đây là vùng nguyên liệu tập trung có lợi thế đặc biệt cho quá trình sản xuất và chuyên môn hóa, phát triển cơ sở hạ tầng cho thu mua, chế biến tại vùng nguyên liệu, giảm chi phí cho xuất khẩu

1.1.4 Cấu trúc cơ bản của hạt tiêu đen

Cấu trúc cắt ngang của hạt tiêu đen gồm ba phần: [5]

– Lớp vỏ ngoài: dày khoảng 0,5 mm; bám chặt và bao bọc sọ tiêu Khi ngâm nước, lớp vỏ ngoài trở nên lỏng lẻo và tách biệt với phần hạt bên trong

– Lớp vỏ lụa: là một lớp màng rất mỏng, bao quanh sọ tiêu, có màu trắng ngà Chính lớp vỏ lụa này tạo nên màu sắc đặc trưng của tiêu sọ

– Sọ tiêu: được bao bọc bởi một lớp màng cứng màu nâu Bên trong là phần nội nhũ màu vàng kem, chứa tinh bột, dầu bay hơi, piperine…tạo nên hương vị đặc trưng của hạt tiêu

Hình 1.7 Cấu trúc cắt ngang hạt tiêu đen (Nguồn: tác giả)

– Lớp vỏ ngoài được cấu tạo chủ yếu là sợi libe, hệ sợi mộc và ống mạch Cấu trúc vách tế bào khá dày, ở dạng vô định hình Do vậy, để phân hủy lớp vỏ ngoài cần thiết phải phá vỡ được cấu trúc vách tế bào

1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế biến tiêu trắng

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế biến tiêu trắng trên thế giới

Các phương pháp sản xuất tiêu trắng:

 Phương pháp ngâm nước:

+ Ngâm ở sông hoặc suối: tiêu xanh sau khi tách cuống được cho vào túi (khoảng 20 - 25 kg/túi) buộc chặt rồi ngâm ở sông hoặc các dòng suối từ 2 - 3 tuần Trong quá trình ngâm nước, lớp vỏ ngoài bị phân hủy dần dần Sau thời gian ngâm, các túi tiêu được vớt lên rồi chà bằng chân và rửa bằng nước Hạt tiêu sau khi chà rửa đem phơi nắng 2 - 3 ngày Phương pháp này chỉ ứng dụng được ở những vùng gần sông suối, rất khó mở rộng quy mô sản xuất và thời gian chế biến quá dài

+ Ngâm trong các bể xi măng: là phương pháp được sử dụng chủ yếu ở Ấn

Độ Theo Sudarsan (2000) việc sản xuất tiêu trắng được thực hiện theo cách thức như sau: tiêu đen ngâm trong nước khoảng 12 ngày Tiêu sau khi ngâm được xát vỏ bằng phương pháp cơ học, rửa sạch và phơi khô đến khi đạt độ ẩm cần thiết (khoảng 8-12%) Hoặc tiêu xanh được ngâm nước trong các bể xi măng, thời gian phân hủy lớp

vỏ mất hơn 9 ngày

Nhược điểm của các phương pháp ngâm nước là thời gian ngâm dài (khoảng 10 -

15 ngày), nước ngâm bốc mùi hôi thối ảnh hưởng rất xấu đến môi trường xung quanh

và ám vào sản phẩm rất khó loại trừ, tiêu bị sậm màu và tạp nhiễm các vi sinh vật, chất lượng sản phẩm không tốt

 Phương pháp chôn dưới đất ẩm:

Tiêu được ủ chín rồi chôn dưới đất ẩm khoảng 5 ngày đem xát vỏ, rửa sạch rồi phơi khô Hạn chế của phương pháp này là phải có mặt bằng rộng và sản phẩm rất

dễ tạp nhiễm vi sinh vật

 Phương pháp sử dụng hóa chất

Tiêu đen được ngâm nước với tỉ lê 1 : 5 trong 4 ngày, sau đó đem luộc trong NaOH 4% kết hợp với khuấy để tách vỏ Sản phẩm sau khi tách vỏ được tẩy trắng bằng dung dịch H2O2 2,5%, rửa nước rồi phơi khô

Hiện nay, hầu hết các phương pháp kể trên đều ít được dùng trong sản xuất tiêu trắng vì cho sản phẩm có chất lượng không tốt, mức độ tạp nhiễm vi sinh vật cao, tiêu tốn nhiều nước và tốn chi phí nhân công Việc sản xuất tiêu trắng theo hướng sinh học càng được sử dụng do có ưu điểm vượt trội là rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm

Các nghiên cứu sản xuất tiêu trắng gần đây chủ yếu là nghiên cứu sử dụng vi khuẩn và enzyme phân hủy lớp vỏ ngoài của hạt tiêu Vi sinh vật được sử dụng để phân

rã vỏ tiêu là các chủng vi khuẩn hoặc nấm mốc có các hoạt tính cellulose và pectinase Sản xuất tiêu trắng bằng enzyme chủ yếu là các enzyme có khả năng phân hủy các thành phần cấu trúc vỏ tiêu Có thể dùng 1 loại hay kết hợp nhiều loại enzyme trong quá trình ngâm không những vừa rút ngắn thời gian sản xuất, hạn chế ô nhiễm môi trường mà còn làm giảm lượng vi sinh và cải thiện chất lượng sản phẩm Phương pháp này đơn giản và dễ nhân rộng quá trình sản xuất

Gopinathan (2004) nghiên cứu sử dụng enzyme pectinase để phân hủy lớp vỏ

ngoài của hạt tiêu Đối với tiêu đen mất khoảng 40 - 45 giờ đạt hiệu suất 67 - 73% Chất lượng sản phẩm tiêu trắng tạo ra theo phương pháp này được cải thiện đáng kể so với phương pháp truyền thống, sản phẩm có màu sáng hơn và mức độ tạp nhiễm vi sinh vật thấp hơn hẳn

Namiki Takashi và cộng sự (2007) sử dụng các enzyme cellulase, hemicellulase,

pectinase và protopectinase để phân hủy vỏ tiêu Tiêu xanh đã tách cuống hoặc tiêu đen được ủ với enzyme trong điều kiện thích hợp Sau khi ủ, tiêu trắng được chà rửa với nước, rồi phơi khô hoặc sấy Tiêu trắng sản xuất bằng phương pháp enzyme có chất lượng cao hơn hẳn về màu sắc và hương vị so với tiêu trắng sản xuất theo phương pháp truyền thống

Ngoài các nghiên cứu về phương pháp sản xuất tiêu, phương pháp bảo quản tiêu đóng vai trò quan trọng nhằm duy trì chất lượng sản phẩm trong suốt quá trinh bảo quản và lưu thông phân phối

Catherine và cộng sự (2008) đã nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của các phương

pháp bảo quản (dùng hơi nóng hoặc chiếu xạ) đến các chỉ tiêu lý hóa và vi sinh của tiêu đen Phương pháp dùng hơi nóng làm giảm hàm lượng piperine và gây sậm màu của sản phẩm trong quá trình bảo quản, trong khi phương pháp chiếu xạ làm giảm đáng kể lượng vi sinh nhưng ít ảnh hưởng tới chất lượng hóa lý Việc bảo quản tiêu thành phẩm

ở nhiệt độ thấp (40C) cũng hạn chế được sự thất thoát của piperin

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế biến tiêu trắng ở Việt Nam

Phương pháp sản xuất tiêu trắng truyền thống: tiêu tươi hoặc tiêu chin già (chùm xuất hiện trái chín đỏ) đem ủ 2 - 3 ngày đêm, bỏ vào bao đem ngâm ở dòng nước chảy hay trong bể ngâm thay nước hàng ngày Ngâm từ 7 - 10 ngày (vào mùa lạnh thời gian ngâm lâu hơn) cho đến khi vỏ nát rời, cho vào rổ hay máy chà xát, sau đó đãi hết vỏ và phơi 1 - 2 nắng đến khi hạt có độ ẩm 12 - 13% là có thể đem bảo quản và tiêu thụ Chế biến thủ công không thể sản xuất theo dạng hàng hóa vì chất lượng sản phẩm không đồng đều Hơn nữa, thời gian kéo dài khó đáp ứng xuất khẩu

Chế biến tiêu trắng bán công nghiệp từ tiêu đen: tiêu đen được phân loại để loại các hạt nhẹ Tiêu hạt nặng được cho vào bao rồi ngâm nước trong các bể xi măng từ 7 -

8 ngày Hai ba ngày thay nước một lần cho đến khi vỏ hạt tiêu thối nhũn, đem ra xát để

bóc vỏ hạt rồi đãi sạch Hạt tiêu sau khi đãi sạch vỏ có màu nâu vàng Theo yêu cầu của thị trường, tiêu được làm trắng bằng H2O2 trong 30 phút để oxi hóa các chất hữu cơ

và các chất màu Tiêu sau khi tẩy trắng được phơi hoặc đem sấy 50 - 600C trong nhiều giờ liên tục để đạt độ ẩm 12%

Với cách chế biến này, chất lượng tiêu trắng không đồng đều Ngoài ra, vấn đề ô nhiễm môi trường xảy ra trong vùng, mùi hôi thối từ các bể ngâm tiêu bốc lên nồng nặc

Chế biến tiêu trắng xuất khẩu ở quy mô lớn: tương tự như chế biến ở quy mô bán công nghiệp nhưng công nghiệp hơn ở các công đoạn ngâm ủ, xử lý an toàn thực phẩm, sấy và xử lý nước thải chế biến Nhiều nhà máy bên cạnh việc mua tiêu đen loại tốt để chế biến còn thu mua tiêu sọ đã qua chế biến bán thủ công của nông dân về gia công thêm khâu làm trắng, sấy và đóng bao bì đạt tiêu chuẩn xuất khẩu

Cho đến nay, các nghiên cứu về sản xuất tiêu trắng tại Việt Nam không nhiều và chưa hoàn thiện nên rất khó để triển khai ứng dụng rộng rãi Có 2 công trình nghiên cứu sản xuất tiêu trắng chủ yếu theo phương pháp ngâm nước và ủ kín như sau:

Công trình nghiên cứu của tác giả Bùi Văn Miên (Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, 2004) sử dụng tiêu đen có dung trọng 600 g/L ngâm nước (tỷ lệ 1 : 5) trong 3 ngày để làm mềm vỏ (thay nước 2 lần/ngày) Sau khi ngâm, xả hết nước và đóng vào cấc bao nylon 50 kg ủ kín trong 3 ngày để phân rã vỏ, sau khi ủ dùng chân chà, hiệu suất bóc vỏ đạt 95%, tỷ lệ hạt còn dính vỏ 1%, tỷ lệ hạt vỡ 1% Hạt tiêu sau khi tách vỏ được tẩy trắng bằng dung dịch H2O2 50% trong 20 phút, rửa sạch rồi phơi khô Với phương pháp này, tổng thời gian sản xuất là 6 - 7 ngày, lưu ý trong quá trình ủ kín, nhiệt độ có thể tăng đến 630C nên cần phải thêm nước để tránh cho tiêu bị khô Tiêu trắng sản xuất theo công nghệ này đạt được các tiêu chuẩn về cảm quan, vật lý và hóa học Phương pháp này sử dụng rất nhiều nước, chỉ riêng công đoạn làm mềm vỏ trước khi ủ, lượng nước sử dụng gấp 30 lần so vơi lượng nguyên liệu sử dụng nhiều nước

trong quá trình sản xuất làm tăng chi phí và gây khó khăn cho việc xử lý nước thải, nên quy trinh này khó triển khai rộng rãi trong thực tế sản xuất [7]

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đức Lượng (2002 - 2005) sử dụng chế phẩm sinh học Biovina (là chế phẩm xử lý nước thải, chất thải hữu cơ) gồm các chủng nấm mốc Asperillus, Penicillium và xạ khuẩn Actinomyces để xử lý vỏ hạt tiêu giúp rút ngắn thời gian sản xuất còn 7 ngày: tiêu đen được phân loại qua hệ thống xoắn ốc, chọn tiêu

có dung trọng > 570 g/L cho vào bao PP (50 - 100 kg) đem ngâm nước trong 4 ngày, sau đó trộn với chế phẩm Biovina (6%) ủ khoảng 3 ngày, xát vỏ bằng máy rồi rửa sạch, hiệu suất tróc vỏ >82% Tác giả sử dụng H2O2 hoặc phèn chua để tẩy trắng rồi dùng nước rửa sạch, sấy ở 800C trong 3 giờ Có thể rút ngắn thời gian sản xuất còn 4 ngày khi dùng nguyên liệu là tiêu xanh Nguyên liệu được ngâm nước để loại bỏ hạt lép, hạt non, cuống…sau đó vớt tiêu ra trộn với chế phẩm Biovina, rồi ủ bằng bao bố hoặc đào

hố để ủ Công nghệ này vẫn còn những hạn chế nhất định về mặt an toàn vệ sinh thực phẩm, thời gian ngâm nước trước khi lên men khá dài nên việc triển khai ứng dụng chưa phổ biến đại trà [6]

Nhìn chung, các nghiên cứu về sản xuất tiêu trắng chưa hoàn thiện cả về qui trình công nghệ và thiết bị sản xuất, nên việc triển khai ứng dụng trong thực tiễn chưa phổ biến Sản phẩm tiêu trắng có chất lượng cảm quan không đồng đều, kém hấp dẫn nên

tỷ trọng tiêu trắng xuất khẩu còn thấp, chủ yếu là tiêu thụ nội địa

Do đó, đề tài “Khảo sát môi trường phát triển nấm mốc Trichoderma koningii,

ứng dụng khả năng thủy phân tiêu đen tạo sản phẩm tiêu trắng” đặt ra mục tiêu sử dụng enzyme thương mại và tận dụng enzyme ngoại bào như cellulase, xylanase,

pectinase được tiết ra từ các chủng Trichoderma koningii nhằm cải thiện chất lượng

cảm quan của hạt tiêu sọ: sản phẩm có màu sắc và mùi vị hấp dẫn, rút ngắn thời gian sản xuất, dư lượng vi sinh vật trên sản phẩm thấp, giảm thiểu sự ô nhiễm mùi và ô nhiễm nước thải tại nơi sản xuất

1.3 Cấu trúc và cơ chế thủy phân vách tế bào thực vật bằng enzyme

Vách tế bào thực vật là cấu trúc bao quanh màng tế bào có vai trò bảo vệ và cố định hình dạng tế bào Vách tế bào thực vật còn non và đang trong quá trinh tăng trưởng được gọi là vách sơ cấp Vách tế bào sơ cấp bao gồm cellulose, pectin, hemicelluloses, một lượng nhỏ glycoprotein và các hợp chất phenolic

Cellulose là thành phần cấu trúc chính trong vách tế bào thực vật Các chuỗi cellulose liên kết với nhau tạo thành cấu trúc vi sợi

Hemicelluloses cũng là thành phần rất quan trọng của vách tế bào, có vai trò như các cầu nối liên kết các chuỗi cellulose và làm tăng sức căng của cellulose Hemicellulose là polymer của xylose, glucose và mannose hoặc mannose với glucose bởi các liên kết -1,4 và -1,3 glucozit Các loại hemicelluloses chủ yếu là xylan, lichenin, -D glucan và laminarin Khi các tế bào trưởng thành hoặc chết, vách tế bào

sơ cấp được phát triển thành vách thứ cấp Ngoài thành phần chính là cellulose và hemicelluloses, trong vách thứ cấp còn có thêm lignin – được hình thành bởi quá trình đồng phân hóa các dẫn xuất phenylpropan như cumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol

Hình 1.8 Cấu trúc vách tế bào thực vật[26]

1.3.1 Cấu trúc và cơ chế thủy phân cellulose

1.3.1.1 Cấu trúc của cellulose

Cellulose là thành phần polysaccharit chủ yếu trong cấu trúc của vách tế bào thực vật, được cấu tạo bởi các đơn phân -D-gluco pyranose liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit Mỗi đơn phân glucose xoay một góc 1800 với phân tử liền kề tạo thành cấu trúc dạng chuỗi tử 2.000- 25.000 đơn phân.[15]

Hình 1.9 Cấu trúc cellulose

(http://forum.dayhoahoc.com/threads/hoa-tan-xenluloz.54522/)

Trong tự nhiên, các chuỗi cellulose liên kết với nhau bởi liên kết hydro và Vanderwal tạo nên cấu trúc vi sợi và thường có 2 vùng:

- Vùng kết tinh: có cấu trúc trật tự rất cao, không thấm nước và lực căng rất lớn,

có khả năng chống lại sự phân hủy hóa học và sinh học cao

- Vùng vô định hình: có cấu trúc không chặt do đó kém bền hơn Vùng này có thể hấp thu nước và trương lên

1.3.1.2 Cơ chế thủy phân cellulose

Quá trình phân hủy cellulose tự nhiên nhờ phức hệ cellulose, bao gồm chủ yếu là enzyme C1, CX và -1,4-glucosidase Cơ chế tác động phối hợp của C1, CX và glucosidase như sau:[36]

- Những vùng có mức độ kết tinh thấp trong sợi cellulose bị các enzyme endoglucanase tấn công tạo ra các đầu tự do

- Các enzyme exoglucanase phân cắt từ đầu tự do của các chuỗi, tạo ra các cellobiose

- Cellobiose dưới tác động của enzyme -glucosidase bị phân hủy thành glucose

Cơ chế tác động phối hợp của chúng như sau:

• Enzyme C1 là một enzyme không đặc hiệu Dưới tác dụng của enzyme này, các loại cellulose tự nhiên bị trương lên và chuẩn bị cho tác động của enzyme khác tiếp theo

• Enzyme CX còn gọi là enzyme -1,4-glucanase Enzyme này thủy phân cellulose thành cellobiose CX được chia thành 2 loại:

- Exo--1,4-glucanase (1,4--D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) Enzyme exoglucanase phân cắt chuỗi cenllulose từ đầu không khử và giải phóng cellobiose Enzyme exoglucanase không thủy phân cellulose kết tinh cũng như cellulose hòa tan (carboxymethyl cellulose) nhưng có thể thủy phân được cellulose đã

bị cắt ngắn mạch Vai trò chính của enzyme này là giúp cho enzyme endocellulase tác động được lên vùng cellulose kết tinh

- Endo-glucanase (1,4--D-glucanohydrolase, EC 3.3.1.4) Enzyme endoglucanase thủy phân liên kết -1,4-glucozit một cách ngẫu nhiên để giải phóng cellodextrin, cellobiose và glucose Enzyme endoglucanase phân giải mạnh mẽ các cellulose vô định hình nhưng tác động rất yếu trên cellulose kết tinh và chúng không có khả năng phân giải cellobiose Chính nhờ sự phân cắt trước của endoglucanase tạo ra các đầu không khử, enzyme cellobiohydrolase dễ dàng thủy phân hoàn toàn cellulose kết tinh

• Enzyme -1,4-glucosidase hay cellobiase (EC 3.2.1.21): thủy phân cellobiose và các cello-oligosaccharid mạch ngắn thành glucose Enzyme -1,4-glucosidase phân cắt hai loại cơ chất là cellobiose và cellohexanose (gồm 6 đơn vị glucose), enzyme này thủy phân cellobiose nhanh hơn cellohexanose

Hình 1.10 Quá trình phân giải cellulose của cellulase [36]

1.3.2 Cấu trúc và cơ chế thủy phân pectin

1.3.2.1 Cấu trúc của pectin

Trong vách tế bào sơ cấp chứa một hàm lượng tương đối cao pectin (khoảng 35%) Cấu tạo của pectin chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid -D-galacturonic hay acid pectic

Hình 1.11 Cấu trúc pectin

pectin-va-ung-dung.html

Trong tự nhiên, pectin có 2 dạng chủ yếu:

- Dạng pectin hòa tan, chủ yếu ở dịch tế bào

- Dạng protopectin không tan trong nước, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào và các lớp gian bào, thường ở dạng liên kết với polysaccharit khác như arabinan, tinh bột, cellulose

Pectin giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín của quả Khi quả còn xanh và đang phát triển, protopectin phân tán ở thành tế bào với tỷ lệ khá cao làm quả cứng Khi quả bắt đầu chín, protopectin chuyển dần sang dạng pectin hòa tan dưới tác dụng của acid hữu cơ và enzyme protopectinase trong quả, quả càng chín càng mềm, pectin hòa tan tăng cao, ngược lại protopectin không tan sẽ giảm dần

1.3.2.2 Cơ chế thủy phân pectin bởi enzyme pectinase

Pectinase là một nhóm enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside có trong mạch polymer của pectin [17]

Enzyme pectinase chứa một vùng có 8 - 10 vòng xoắn  kép về phía phải với 2 vòng sẽ tạo thành một khe liên kết với cơ chất Người ta nhận thấy rằng trung tâm hoạt động của enzyme này có chứa 2 acid amin là aspartate và lysine và một histidine nằm gần trng tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme

Hệ enzyme pectinase thủy phân pectin bao gồm hai enzyme chính là enzyme pectinesterase (PE) và polygalacturonase (PG)

Sơ đồ 1.1 Hệ thống phân loại enzyme pectinase

• Enzyme pectinesterase (PE) (EC 3.1.1.11): xúc tác sự thủy phân liên kết ester phức tạp của pectin và protopectin PE chỉ thủy phân liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và –COOH tự do PE có ái lực với nhóm metoxyl ở vị trí thứ 5 lớn hơn với các nhóm ở vị trí thứ 3 và 7 Như vậy, sự phân cắt nhóm metoxyl sẽ xảy ra một cách tuần

tự bắt đầu từ nhóm –COOH tự do, kết quả là tạo thành acid pectic hoặc acid pectinic và methanol

Hình 1.12 Vị trí tác động của enzyme pectinesterase (PE) [18]

• Enzyme polygalacturonase (PG) (EC 3.2.1.15): tham gia quá trình thủy phân liên kết -1,4-glucozit của acid pectic và các polygalacturonic khác, tách các gốc acid D-galacturonic thành các phân tử D-galacturonic tự do PG là một phức hợp enzyme gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, được chia thành 2 nhóm nhỏ là polymethylgalacturonase (PMG) và polygalacturonase (PG)

Polymethylgalacturonase – PMG có 2 kiểu: [15]

+ Kiểu I: Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase (Endo – PMG – I): Xúc tác sự thủy phân liên kết glucoside nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao, pectin có mức độ metoxyl hóa càng cao thị bị thủy phân bởi enzyme này càng nhanh

Hình 1.13 Vị trí tác động của Endo – PMG – I [18]

+ Kiểu III: Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase (Exo – PMG – III): là enzyme đường hóa, enzyme này có thể cắt từng acid galacturonic ra khỏi acid pectinic hoặc pectin Exo-PMG-III có ái lực cao với các gốc acid galacturonic đã được metoxyl hóa, nghĩa là phân cắt các liên kết -1,4-glucozit ở đầu mạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm COOCH3

Hình 1.14 Vị trí tác động của Exo – PMG – III [18]