Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những loài có triển vọng

HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP CÁC LOÀI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LOÀI CÓ TRIỂN VỌNG Chuyên ngành: CÔNG N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC LOÀI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LOÀI

CÓ TRIỂN VỌNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THỊ HAI

TP Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả trong

Đồ án là trung thực Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu

LỜI CÁM ƠN

Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2010 – 2014

Xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi trường đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn

Xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ

em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này

Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa và đặc biệt là em Huỳnh Nhi đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng em trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn bên cạnh,

cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này

Tp HCM, Ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu

- i -

MỤC LỤC

- -

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi 3

1.1.1 Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011) 3

1.1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001) 4

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ 5

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam 6

1.1.5 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005) 7

1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma 12

1.2.1 Phân loại 12

1.2.2 Đặc điểm hình thái 12

1.2.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J Samuels, 2004) 13

1.2.4 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng (Gary J Samuels, 2004; Gary E Harman và cộng sự, 2005) 14

1.2.5 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt Nam 18

- ii -

1.3 Giới thiệu với nấm Aspergillus 20

1.3.1 Phân loại 20

1.3.2 Đặc điểm hình thái 20

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh 21

1.3.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt Nam 22

1.4 Bệnh do nấm Rhizoctonia spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 23

1.5 Bệnh do nấm Fusarium spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas, 2005) 25

1.6 Bệnh do nấm Colletotrichum spp gây ra 28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.2 Vật liệu 31

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập 31

2.2.2 Nguồn nấm bệnh 31

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 31

2.2.4 Hóa chất 32

2.2.5 Các loại môi trường 33

2.3 Nội dung nghiên cứu 33

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios, 2005) 34

2.4.2 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 35

- iii -

2.4.3 Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh

(Agrios, 2005) 36

2.4.4 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tô Duy Khương, 2007) 37 2.4.5 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và cộng sự, 2012) 38

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi 40

3.1.1 Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi 40

3.1.2 Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1 41

3.1.3 Kết quả định danh đến loài của 3 chủng nấm T1, T2 và A1 44

3.1.4 Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro 47

3.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của hai loài Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi 51 3.3 Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro 52

3.3.1 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp 53

3.3.2 Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp 55

3.3.3 Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp1 57

3.3.4 Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp2 59

3.3.5 Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3 61

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

3 MSM: Minimal Synthetic Medium

4 PGA: Potato D-Glucose Agar

5 TN: Thí nghiệm

6 VSV: Vi sinh vật

- vi -

DANH MỤC BẢNG

-  -

Bảng 1.1 Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm 10

Bảng 2.1 Nguồn nấm Linh chi bị bệnh 31

Bảng 3.1 Tần suất xuất hiện các chủng nấm phân lập được trên nấm Linh chi bệnh

41

Bảng 3.2 Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo 48

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của T virens và T harzianum phân lập ban đầu 50

Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải của hai loài nấm Trichoderma virens và

Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy 52

Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Fusarium 54

Bảng 3.6 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Rhizoctonia

- vii -

DANH MỤC HÌNH ẢNH

-  -

Hình Trang Hình 1.1 Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum) 3 24 Hình 1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ 5

Hình 1.3 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm 9

Hình 1.4 Hình thái nấm Trichoderma harzianum 12

Hình 1.5 Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu (Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh)) 15

Hình 1.6 Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy vách tế bào nấm bệnh 16

Hình 1.7 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma hazianum 17

Hình 1.8 Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus 21

Hình 1.9 Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra 25

Hình 1.10 Héo Fusarium trên cây chuối do F oxysporum f.sp.cubense 26

Hình 1.11 Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fuasarium spp gây ra trên cây cà chua 27

Hình 1.12 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên các loại trái cây nhiệt đới 28

Hình 1.13 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên trái ớt và lá ớt 29

Hình 1.14 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên trái thanh long và cành thanh long 30

Hình 2.1 Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp 40

Hình 3.1 Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuôi cấy trên môi trường PGA 42

Hình 3.2 Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 42

Hình 3.3 Hình thái đại thể chủng nấm T2 nuôi cấy trên môi trường PGA 43

- viii -

Hình 3.4 Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 43 Hình 3.5 Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuôi cấy trên môi trường PGA 44 Hình 3.6 Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X 44 Hình 3.7 Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T1 45 Hình 3.8 Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm T2 46 Hình 3.9 Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của chủng nấm A1 47 Hình 3.10 Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây bệnh nhân tạo 49

Hình 3.11 Vòng phân giải chitin và CMC của 2 loài nấm Trichoderma virens và Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy 53 Hình 3.12 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Fusarium

sp 55

Hình 3.13 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Rhizoctonia sp 57 Hình 3.14 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp1 59 Hình 3.15 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp2 61 Hình 3.16 Khả năng đối kháng của T virens và T harzianum với nấm Colletotrichum sp3 63

trong quản lý bệnh hại cây trồng Enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma

có khả năng tấn công trực tiếp lên nấm Linh chi các loài nấm khác Trong số các

enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma spp thì Endochitinase và Glucanase

1,3-beta-glucosidase đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động kí sinh của nấm

Trichoderma spp (Margolles Clark và cộng sự, 1995) Hầu hết vách tế bào nấm

bệnh đều có cấu bởi chitin và glucan (Agrios, 2005) Vì vậy, các loài nấm kí sinh trên nấm Linh chi sẽ có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh khác Một số

chủng Trichoderma cũng đã được thông báo có khả năng phòng trừ được nấm Colletotrichum (Stanley Freeman và cộng sự, 2004) Đây là loài nấm nguy hiểm

cho sản xuất nông nghiệp vì gây hại trên rất nhiều loại cây trồng và trong bảo quản sau thu hoạch nhiều loài hoa quả (Agrios, 2005)

Cũng như trên thế giới, nấm Linh chi đang được trồng khá phổ biến ở nhiều tỉnh thành của Việt Nam Theo Lê Duy Thắng (2001), nấm Linh chi bị một số loài

nấm kí sinh gây hại Trong số này có nấm Trichoderma là loài gây hại nghiêm trọng

nhất, nhóm mốc này tấn công trên bịch đã có tơ ăn đầy, thậm chí trên cả tai nấm

Linh chi và ức chế mạnh lên sự phát triển của tơ nấm Nấm Trichoderma đã được

nghiên cứu và sử dụng nhiều ở Việt Nam nhưng chủ yếu được phân lập từ đất và để phòng trừ nấm gây hại cây trồng có trong đất (Dương Minh và cộng sự, 2005) Việc

phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linh chi và lợi dụng chúng để phòng trừ bệnh

hại cây trồng chưa được quan tâm Bên cạnh đó, biện pháp quản lý nấm gây hại trên

lá và quả các loài cây trồng chủ yếu nhờ vào các loại thuốc hóa học và chưa có tác

- 2 -

nhân sinh học nào tỏ ra có hiệu quả đối kháng với loài nấm bệnh này Vì vậy, việc phân lập và lợi dụng các chủng nấm kí sinh trên nấm Linh chi để quản lý một số bệnh hại cây trồng trên mặt đất là khả thi và rất cần thiết

Xuất phát từ lý do trên, sinh viên tiến hành đề tài “ Phân lập các loài vi nấm

kí sinh trên nấm Linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại cây trồng của những loài có triển vọng”

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập và định danh đến loài các vi nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi Tuyển chọn các loài vi nấm có triển vọng ứng dụng kháng nấm bệnh hại cây trồng

3 Mục tiêu nghiên cứu

− Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến loài các chủng nấm phân lập được

− Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh

− Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh có tiềm năng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro

- 3 -

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

1.1.1 Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011)

Nấm Linh chi có trên khoa học là Ganoderma lucidum, thường được tìm

thấy ở các nước Á Đông Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ… Ở mỗi nơi nấm Linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan) Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc) Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao Gang Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập

Nấm Linh chi xuất thân từ loài nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng trăm loài khác nhau cùng họ nấm gỗ (Ganodermataceae) Trong đó, chi Ganoderma có đến 80 loài có màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, cam, đỏ tía rất đa dạng.Vị trí phân loại của nấm Linh chi như sau:

- 4 -

1.1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001)

Nấm Linh chi là một loại nấm hóa mộc, cứng khi khô nhưng khi tiếp xúc với nước trở nên hơi mềm Quả thể nấm Linh chi gồm:

Mũ nấm: mặt trên thường có một lớp bóng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử nếu cắt ngang có dạng tổ ong Ngoài thiên nhiên, nấm luôn có dạng bất đối xứng, tức là cuống nấm thường ở một bên như vị trí tay quạt Đối với nấm trồng, mũ nấm tròn và gần như đối xứng, cuống nấm ở giữa trung tâm do được trồng theo từng đơn vị, không có sự chèn ép và ảnh hưởng môi trường bên ngoài

Bào tử: hình thuẩn có gai lõm Một đầu tròn lớn, một đầu nhỏ có lỗ, nơi đây bào tử sẽ nảy mầm cho ra khuẩn ty ăn luồn vào thân cây Bào tử nấm tương tự như một loại phấn hoặc hạt mầm, có thể phát triển thành một cây nấm hoàn chỉnh, nhưng khác ở chỗ nó được cấu tạo từ một tế bào duy nhất Đường kính của bào tử nấm Linh chi chỉ từ 5 – 8 µm So sánh cùng trọng lượng, bào tử nấm Linh chi có dược tính mạnh hơn quả thể 75 lần, gồm các dược chất thiên nhiên như triterpenoids, polysaccharides (β - D - glucans), germannium và các hoạt chất khác

Cuống nấm: cuống nấm đặc và cứng, sậm màu, bám vào đài vật như thân cây Chân nấm có thể dài cũng có thể ngắn, là bộ phận giúp nấm lấy chất dinh dưỡng

- 5 -

Hình 1.2 Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ: A: Nấm mọc tự nhiên; B: Nấm trồng

nhân tạo; C: Bào tử nấm; D: Hình thái cấu trúc giải phẫu nấm

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ

Thành phần trong nấm Linh chi tươi thì nước là chủ yếu, chiếm 90% khối lượng Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%, carbohydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 - 10% Ngoài ra, nấm Linh chi còn có các thành phần vi lượng như một số loại vitamin và các khoáng chất khác nhau như là kali, can-xi, phốt pho, magiê, selen, sắt, kẽm…(Borchers và cộng sự, 1999) Trong một nghiên cứu của các thành phần không bay hơi của Linh chi cho thấy rằng nấm chứa tro 1,8%, 26 - 28% carbohydrate, 3 - 5% chất béo thô, 59% chất xơ thô, và 7 - 8% protein thô (Mau và cộng sự, 2001)

Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001) Đặc biệt thành phần protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang và cộng sự, 1996 ; Borchers và cộng sự, 1999)

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất sinh học có tác dụng dược lý trong nấm Linh chi bao gồm các nhóm chính: polysaccharides, triterpenoids, protein, peptide, adenosine và nucleoside ( Zhou và

- 6 -

cộng sự, 2007; Zhang W và cộng sự, 2008)

Đến nay, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào nhóm polysaccharides

và nhóm triterpenoids Hơn 200 polysaccharides đã được phân lập từ quả thể và sợi nấm của loại nấm này, trong số đó β - 1 - 3 và β - 1 - 6 D - glucans là những thành phần có hoạt tính sinh học chính (Bao X và cộng sự, 2002) Nhiều tác dụng dược lý của chúng chẳng hạn như điều hoà miễn dịch, chống oxy hóa, hoạt động kháng u…đã được chứng minh trong nhiều mô hình động vật (Gou L và cộng sự, 2009; Chang KC và cộng sự, 2007) Cho đến nay, hơn 130 triterpenes đã được

phân lập từ G lucidum và các hợp chất này được chú ý do tác dụng bảo vệ gan, ức

chế sự tăng trưởng khối u (Kimura Y và cộng sự, 2002) Đặc biệt trong nấm Linh chi, có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 – 8 lần) (Boh B và cộng sự, 2007)

Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cáp cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000)

1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam

Linh chi đã được dùng cách đây hàng ngàn năm và đã được chọn lọc thành những chủng thương phẩm, trồng nhiều ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam…

Năm 1997 sản lượng Linh chi được thống kê trên thế giới như sau: 4.300 tấn trong đó Trung Quốc sản xuất đã là 3.000 tấn Hàn Quốc là nước sản xuất Linh chi nhiều thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sản lượng của Hàn Quốc năm 1998 là

1307 tấn

Hơn 90 thương hiệu của các sản phẩm Gerdonama lucidum đã được đăng kí và

bán trên thị trường quốc tế (Lin S, 2000) Tiêu thụ trên toàn thế giới hiện nay ước tính khoảng vài ngàn tấn và thị trường đang phát triển nhanh chóng Mặc dù không có những dữ liệu gần đây công bố liên quan đến tổng giá trị các sản phẩm Linh chi trên thế giới nhưng năm 1995, tổng giá trị ước tính hàng năm được đưa ra bởi các nguồn thương mại khác nhau là 1628 triệu USD (Chang và Buswell, 1999) Nhiều sản phẩm

- 7 -

Gerdonama lucidum được sản xuất từ các bộ phận khác nhau của nấm, hiện đang có

sẵn trên thị trường (Chang và Buswell, 2008)

Tại Việt Nam, nấm Linh chi thương phẩm được trồng đầu tiên năm 1987 tại

“Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu Tp.HCM” Sau đó, phong trào trồng nấm Linh chi dần dần lan rộng khắp cả nước Sau 25 năm, sản lượng Linh chi của cả nước ước chừng 50 tấn/ năm Trong đó, Trung tâm đã là 30 tấn, còn 20 tấn còn lại là do các trang trại hoặc các hộ nông dân của các tỉnh trồng

Hiện nay trên thị trường cả nước và nhất là thành phố Hồ Chí Minh bày bán các sản phẩm được chế biến từ Linh chi và nhiều nhất là tai nấm Linh chi Linh chi có nhiều chủng loại, giá bán thị trường tùy thuộc vào chất lượng và giá trị sử dụng của nấm, hiện nay giá nấm cao nhất là nấm có nguồn gốc Hàn Quốc Bên cạnh đó, việc tiêu thụ Linh chi ở Việt Nam tương đối khó do phải bảo đảm chất lượng và giá thành còn cao so với thu nhập kinh tế của người dân Việt Nam nên phong trào trồng Linh chi

ở Việt Nam không được mạnh so với các nước trong khu vực

1.1.5 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005)

Tương tự như bất kì loại vật nuôi hay cây trồng nào khác, nấm cũng có thể bị rất nhiều bệnh Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chất lượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng Bệnh có thể xảy ra ở bất kì giai đoạn nào của quá trình nuôi trồng nấm và có 2 dạng chủ yếu là bệnh sinh lý và bệnh nhiễm

Bệnh sinh lý là do sợi tơ nấm rất mỏng manh và yếu ớt nên dễ bị tác động của các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, pH, oxy và cả độ ẩm của môi trường Thường tơ yếu dần đến khi sức đề kháng giảm, dễ nhiễm bệnh và chết

Bệnh nhiễm với yếu tố gây bệnh rất đa dạng đa số là các nhóm vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, nấm nhầy… Trong đó, vi khuẩn và nấm mốc có tốc độ sinh sản nhanh, đặc biệt bào tử nấm mốc phát tán rộng nên khả năng lây nhiễm của chúng thường nhiều hơn Các tác nhân này ảnh hưởng gián tiếp đến sinh trưởng và phát triển của nấm, bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, sống kí sinh hút dinh dưỡng hay thay đổi

pH của môi trường…Hậu quả là tai nấm mọc chậm, thưa, thậm chí ngừng lại Quả thể

- 8 -

không tạo thành hoặc dị dạng, năng suất giảm Bên cạnh đó, cơ chất dùng nuôi cấy hoặc trồng nấm cũng có thể là thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật khác

Đối với nhiễm bịch phôi có thể gặp mốc cam Neuroora.sp, đây là mốc hoại

sinh, xuất hiện giai đoạn đầu sau cấy giống Mốc tăng trưởng nhanh sinh tơ ăn đầy bịch phôi, tơ có màu vàng hoặc hồng Sau đó xuất hiện khối thịt nấm màu cam qua miệng bịch hoặc vết rách trên bịch Bệnh lây lan nhanh nên cần cô lập và dập ngay nguồn bệnh

Tác nhân gây bệnh khác có thể gặp trong nuôi trồng là nấm nhầy Exomycetes

Nguyên nhân do vệ sinh kém, nơi trồng ẩm ướt, nhà trồng hoặc dàn kệ bằng gỗ hay nguyên liệu xử lý không tốt Bệnh biểu hiện dạng bọt trắng hay đục sữa, nhưng phổ biến vẫn là những vết lan thành hình rễ cây màu trắng hoặc vàng Thể sinh sản gồm các túi mang bào tử Bệnh làm giảm chất lượng nấm và cạnh tranh một phần thức ăn, nhưng nấm vẫn có thể tạo tai và phát triển bình thường

Ngoài ra, nấm có thể bị bệnh mốc xanh gây ra bởi loài Trichoderma, là một vấn

đề nghiêm trọng cho những người trồng nấm trên toàn thế giới, bao gồm Croatia

(Hatvani L và cộng sự, 2012) Nhiều chủng nấm Trichoderma được phân lập xem như

là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sò (Pleurotus ostreatus) nhiễm mốc xanh ở Croatia Một nghiên cứu công bố loài

Trichoderma longibrachiatum là tác nhân gây bệnh nấm mốc xanh làm thiệt hại đáng

kể trong sản xuất nấm trồng, bao gồm nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sò (Pleurotus ostreatus) (Kredics và cộng sự, 2010) Đây là nấm mốc kí sinh và khả năng gây hại rất lớn, thậm chí trên cả tai nấm (Linh chi) (Lê Duy Thắng, 2005)

Theo A K Mukherjee và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tiềm năng kiểm

soát sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm hoang dã và vỏ cây cũng cho thấy chủng Trichoderma harzianum CICR-G được phân lập và xem là

một tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngoài tự nhiên

- 9 -

Hình 1.3 Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm: A: Nấm mốc cam Neurospora

sp nhiễm trên miệng bọc phôi trồng nấm; B: Nấm nhầy Exomycetes sp nhiễm trên phôi trổng nấm tạo; C: Nấm Trichoderma sp kí sinh trên tai nấm Linh chi

Trong nuôi trồng, nhiều khi xuất hiện những nấm ngoài ý muốn, gọi là nấm dại Nấm dại thực ra là một trong những loài nấm lớn Chúng có sẵn trong nguyên liệu, do không khử trùng hoặc khử trùng không đúng quy cách, bào tử của những nấm này tồn tại và phát sinh trở lại trên cơ chất trồng nấm Bào tử nấm dại cũng có thể xâm nhập vào qui trình trồng nấm ở một giai đoạn nào đó Chúng phát triển và cạnh tranh thức

ăn với nấm trồng, kết quả làm sản lượng giảm và đôi khi cản trở sự phát sinh quả thể

của nấm trồng Thường gặp nhất là loài Coprinus (nấm đậu ) Quả thể nấm tương tự

nấm rơm, tai nấm lúc non dạng búp, trưởng thành có dạng dù, nhưng mau tàn, mũ nhanh chóng chảy rữa ra thành dịch nước đen, nên còn có tên gọi nấm mực hoặc hắc thủ… Nấm phát triển tốt trên cơ chất có nhiều urê, pH thấp và độ ẩm cao, là một trong những đối tượng cạnh tranh với nấm rơm và một số loài nấm trồng khác

Ngoài Coprinus, nhiều loài nấm phá hoại gỗ khác, như Schizophyllum commun, Trametes sp., Poria sp., Hypoxylon sp.… Các loài này chủ yếu cạnh tranh về thức ăn

với nấm trồng và thường xuất hiện khi trồng với gỗ khúc…

- 10 -

Bảng 1.1 Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2001)

Tai nấm bệnh không

bị biến dạng nhưng nơi vết bệnh chuyển sang đen, chất lượng giảm

2 Dactylium dendroides

(Bệnh mạng nhện)

Tơ phủ lên quả thể như mạng nhện ban đầu màu trắng sau đó chuyển sang hơi hồng rồi vàng

Đỉnh bào tử hình trứng và sinh theo dạng chùm Một số kí sinh nấm lớn

Tai nấm, đặc biệt là phiến, bị mềm nhũn, đôi khi trở nên cứng Thịt nấm chuyển sang nâu

Hoại sinh

Ức chế sự tăng trưởng của tơ nấm, làm tơ không mọc được Nguyên liệu phủ trắng sau chuyển sang vàng và cam

4 Mycogone permiciosa

(Bệnh nối ruồi)

Tơ ngắn cuộn đầu, màu trắng quanh tai nấm Hậu bào tử hình thành sau vài ngày, màu sẫm (làm vết bệnh có màu nâu)

Bệnh lan truyền bằng đính bào

tử Kí sinh trên nấm lớn

Quả thể chết non Tai nấm mềm nhũn.Bề mặt tai nấm có những giọt màu nâu

do nhiễm trùng tạo mùi hôi khó chịu

- 11 -

5 Penicillium spp

(Bệnh mốc xanh)

Tơ mảnh, mọc sát cơ chất và co cụm lại Vết bệnh lúc đầu có màu trắng chuyển sang màu lục tối, sống hoại sinh

Ức chế sự tăng trưởng của tơ, nhất là bào ngư Làm giảm sản lượng nấm

6 Trichoderma spp

(Bệnh mốc xanh)

Tơ mảnh, mọc bung dạng bong trên cơ chất Vết bệnh trải rộng nhanh, bào tử thành dễ, mịn, lúc đầu có màu trắng chuyển sang lục lam Nấm sống hoại sinh, một số kí sinh trên nấm lớn Bệnh lan do bào tử

Ức chế mạnh lên sự tăng trưởng của tơ

7

Verticillium fungicola

Tơ phát triển trên bề mặt tại nấm, tạp nhiều lỗ hang và các vết nứt Hiện tượng bệnh khác với vi khuẩn là nhầy nhớt và hôi thối Sống kí sinh trên nấm lớn, bệnh lan do ruồi và người hái nấm

Tai nấm biến dạng và ngừng tăng trưởng, phẩm chất kém

- 12 -

1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma

1.2.1 Phân loại

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc

định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chưa được biết đầy đủ Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào

sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh

sản bào tử vô tính Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại:

Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes

Sợi nấm của Trichoderma có tốc độ phát triển rất nhanh, chúng có thể

đạt đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy Trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch

- 13 -

của môi trường PGA hóa vàng (Bùi Xuân Đồng, 1982)

Sợi nấm Trichoderma không màu, có vách ngăn, cành bào tử không màu,

cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử đính ở đỉnh Bào tử thường có màu xanh, hình tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà

Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp

chất dinh dưỡng Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng

sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng

nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Gary

J Samuels, 2004)

1.2.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J Samuels, 2004)

Nấm Trichoderma phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận

nhiệt đới, chúng hiện diện trong đất, trên rễ cây hay sống trên xác bã hữu cơ hay kí

sinh trên những loại nấm khác Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở

trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5 Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5 Nhiệt độ để

Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 300C Một vài dòng phát triển tốt ở

350C Một số ít phát triển được ở 400C Hình thái khuẩn lạc và bào tử của

Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường,

ở 370C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối

kháng với Trichoderma Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy

mầm Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được nghiên cứu nhiều

tế bào), tiết kháng sinh kháng nấm, cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống

Cho đến nay, nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam

quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua…(Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007)

a Kí sinh nấm

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Weidling (1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma kí sinh nấm gây bệnh và đặt tên

cho hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm”

Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm này lên một nấm khác Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên là nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công, xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh Một số chi tiết

của cơ chế này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ

Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá

trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn

Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh

Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm kí chủ Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma (Elad và cộng sự, 1983) Sau khi

tơ nấm Trichoderma đã đến tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và cuộn

quanh tơ nấm kí chủ, ép chặt sợi nấm và phát triển song song với nấm kí chủ Kết

thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme.

- 15 -

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào

Trichoderma có thể kí sinh trên các loài nấm khác nhau, mọc trên sợi nấm

nhờ tiết ra các enzyme phân giải (như enzyme cellulase, chitinase, Glucanase…) biến, phá huỷ thành tế bào nấm bệnh (Elad và cộng sự, 1983)

Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành những lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh

Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh

Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm

bệnh, phá huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó.Sự phá hủy các chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi

Hình 1.5 Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu

(Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh))

(Hubbard và cộng sự, 1983)

b Tiết kháng sinh

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp

xúc và kí sinh đã làm cho nấm bệnh chết Tuy nhiên, ở những điểm không có sự

tiếp xúc của nấm Trichoderma nhưng nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là do tác động của chất kháng sinh peptaibols từ nấm Trichoderma sinh ra

- 16 -

gây độc cho nấm gây bệnh (Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007)

Hình 1.6 Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy

vách tế bào nấm bệnh (Susanne Zeilinger và cộng sự)

Mendoza-Mendoza (2003) chỉ ra rằng những chủng T virens đột biến

mất khả năng kí sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh cho

hiệu quả kiểm soát sinh học chống lại R solani và hạch nấm của S sclerotiorum

tương đương với chủng tự nhiên Kết quả này đã chỉ ra rằng kí sinh không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể Sự sinh kháng sinh cũng

là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma Nó là một trong

những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác

Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 amino acid có chứa nhiều α -aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus

và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T

polysporum , hazianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên

kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh (Francesco Vinale và cộng sự, 2008)

Francesco Vinale và cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng

của Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T hazianum bổ sung vào

- 17 -

môi trường nuôi cấy của chủng Penicilium ultimum Kết quả cho thấy ở đĩa (1) môi trường có chứa kháng sinh thì nấm Pythium ultimum bị ức chế không phát triển được Trong khi đó đĩa (2) môi trường không chứa kháng sinh thì nấm Pythium

ultimum phát triển rất mạnh và không bị ức chế

Hình 1.7 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được

tiết ra từ Trichoderma hazianum ( Francesco Vinale và cộng sự, 2008)

c Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống:

Không chỉ có cơ chế kí sinh, sự sinh kháng sinh hay tiết enzyme là hiệu quả trong kiểm soát sinh học mà cơ chế cạnh tranh cũng được coi là cơ chế có ý nghĩa hết sức quan trọng vì sự thiếu dinh dưỡng là nguyên nhân gây chết phổ biến đối với vi sinh vật Cơ chế này có thể được xem là sự đối kháng gián tiếp, được ứng dụng nhiều và hiệu quả trong kiểm soát sinh học các bệnh do nấm (Gary E Harman và cộng sự, 2005)

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn cacbon, nitơ và yếu tố tăng trưởng khác với nấm bệnh Nấm Botrysis spp và Sclerotina spp gâ y bệ n h c ho c â y

bằng cách xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền

tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe Nấm Trichoderma có khả năng cạnh

tranh, cũng sử dụng những mô già và mô chết của cây làm nguồn dinh dưỡng,

bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp và Sclerotina spp Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T hazianum sử dụng

- 18 -

đế kiểm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp bằng cách sử dụng dịch tiết đó vì thế mà các bào tử Pythium spp không thể nảy mầm Trichoderma còn

đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh

Bên cạnh đó, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ như loại

bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trưởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm

mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzym

bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đó giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh

1.2.5 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới, những sản phẩm có chứa Trichoderma rất được quan tâm đưa vào ứng dụng đối kháng với nấm bệnh gây hại trên một số cây trồng

Một số sản phẩm thương mại của nấm Trichoderma được sản xuất ở

các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng trên một loạt các loại cây trồng Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm và bào tử vách dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc chất lỏng

lên men.(Harman và Cs, 2004) Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa nấm

Trichoderma harzianum sử dụng trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani,

Sclerotium rolfssi, Pythium spp Sản phẩm T22 và T22HB, Bio-Trek (USA) chứa nấm Trichoderma Harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia spp., Sclerotium spp., Fusarium spp và một số loại nấm khác Sản phẩm Ecofit (Ấn Độ) chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium , Rhizoctonia, Phytophthora spp trên cây bông vải, cây hướng dương, thuốc lá và

nhiều loại cây rau Sản phẩm BINAB-T WP ( Thụy Điển) chứa 2 loại nấm

Trichoderma harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống nấm

- 19 -

bệnh gây hại trên rễ cây trồng trong nhà kính Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm

chứa nấm Trichoderma ở nhiều nước trên Thế giới được ứng dụng trong phòng

chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (CABI, 2001)

Ở Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma

của nhiều đơn vị khác nhau đã và đang góp phần hạn chế các loại nấm bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau như hồ tiêu, ca cao, cà chua, dưa hấu dưa leo, cam quýt…

Các kết quả nghiên cứu và ứng dụng sử dụng nấm Trichoderma chủ yếu là dạng rải (thành phẩm sau khi đã trộn nấm Trichoderma với phân hữu cơ, ủ với xác

bã thực vật) hoặc tưới, phun xịt (dạng lỏng, bào tử nấm) để phòng và trừ một số bệnh trên cây trồng do nấm gây ra

Năm 2005, Đinh Mạnh Hiệp và cộng sự bước đầu đã hoàn tất việc khảo sát

sự phân bố các chủng nấm Trichoderma tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh

miền Đông Nam Bộ Đồng thời nhóm nghiên cứu này cũng đã nghiên cứu sâu về

hoạt tính đối kháng của vi nấm Trichoderma đã phân lập đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng phổ biến như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Phytophthora primulae và thử nghiệm ứng dụng chế phẩm Trichoderma tại một số nơi như xã

Bầu Lâm (Huyện Xuyên Mộc, Tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu), trạm bảo vệ thực vật Long Khánh…đã thu được một số kết quả ban đầu khá tốt

Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM đưa ra thị trường sản phẩm phân

bón BIMA dạng rải và dạng phun chứa nấm đối kháng Trichoderma trong phòng

trị bệnh trên cây cà phê, hồ tiêu, cây ăn trái, rau mau…và ủ chất hữu cơ, phụ phẩm nông nghiệp như rơm rạ, vỏ cà phê đạt những hiệu quả nhất định Nhóm nghiên

cứu Đại học Cần Thơ đã phối hợp các chủng nấm Trichoderma thành các sản

phẩm phòng trị hiệu quả theo từng nhóm đối tượng gây bệnh như: Tricô - ĐHCT

có khả năng phòng trị hiệu quả bệnh thối rễ trên cây ăn trái, rau màu do

Rizhoctonia spp và Fusarium spp gây ra; Tricô - Lúa Von phòng trị bệnh lúa Von

do F moniliforme; Tri cô - Phytoph trị bệnh do Phytophthora spp trên cây sầu riêng, hồ tiêu, cao su…; Tri cô - Khóm trị được bệnh do nấm Phytopphthora spp

- 20 -

và Fusarium spp gây hại trên khóm ( Dương Minh và Cs, 2010)

Sử dụng nấm Trichoderma bảo vệ cây trồng khỏi các tác nhân gây bệnh sẽ

giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học để tiêu diệt nấm gây bệnh, giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.Việc sử dụng nấm đối kháng đóng vai trò là một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng còn là biện pháp an toàn và hiệu quả, làm tăng năng xuất cây trồng, giữ được phẩm chất nông sản

1.3 Giới thiệu với nấm Aspergillus

1.3.1 Phân loại

Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó

có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có giá trị sử

dụng trong sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ,…

Vị trí phân loại :

Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Aspergillus

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt, một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ở các loài khác nhau

Giống nấm này rất đặc biệt do chúng có hệ bào tử đính Bào tử đính phát triển từ thành tế bào dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình Từ bộ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử được sinh ra, gọi là bào tử đính Không có một giống nấm sợi nào khác ngoài giống nấm này có hệ bào tử đính

- 21 -

tương tự (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Hình 1.8 Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus

A- Túi; B- Bộ cuống đính bào tử đầu tiên; C- Bộ cuống đính bào tử thứ hai; D- Bào tử đính; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

Một đại diện là nhóm Aspergillus niger khi nuôi cấy trên môi trường thạch

PDA ở 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu đen với việc tạo vô số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi

trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt thạch Aspergillus niger

có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn có kích thước 4,0 - 5,0µm, màu nâu, hơi đen và có gai Túi và sợi cuống thường có màu nâu bóng (Bùi Xuân Đồng, 1984; Nguyễn Đức Lượng, 2006)

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh

Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, rất nhiều trong các vùng

khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng phân bố rộng rãi và dễ thích nghi vì chúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh

trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C Wainwright

và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus awamori là khoảng 5,0 – 7,0 Độ pH quá acid (khoảng 2 – 3) sẽ ngăn cản sự tạo

thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm (Bùi Xuân Đồng, 1982)

Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger,

gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase… Ngoài ra

- 22 -

chitinase của nấm này cũng được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về

Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao

nhất là 370C “Nguồn: The 7 th International Aspergillus Meeting (2010)”

Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng

không có hại, không tạo mycotoxin, nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến

động vật và con người Sự an toàn của Aspergillus niger được đề cập đến trong

nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng sự (2003), Blumenthal (2004), Olemsp.ka - Beer và cộng sự (2006), theo thông tin tóm tắt từ những bài báo của các tác giả này, khoảng 3 – 10% các chủng

Aspergillus niger có khả năng sinh ra độc tố ochratoxin A trong những điều kiện

nuôi cấy xác định (Zofia Olempska - Beer, 2008)

1.3.4 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở Việt Nam

Các loài nấm thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự

nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp, ở nhiều vùng địa lý trên thế giới, được nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau Đặc biệt loài

Aspergillus oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống để

chế biến thực phẩm ở nhiều nước Châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản…

Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae trong công nghiệp sản xuất

enzyme (α-amylase, pectinase, protease, cellulase), trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong công nghệ sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic…

Một số loài có khả năng tạo ra các chất kháng sinh như Aspergillus candidus tạo thành candidulin, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamatti tạo thành

acid kojic có tác dụng ức chế đối với một số vi khuẩn Trong đó đã thực sự được

dùng trong công nghiệp dược phẩm chỉ có loài Aspergillus fumigatus để sản xuất

- 23 -

fumagilin làm thuốc chữa lị amip Đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các

độc tố gây ung thư gan như các loài Aspergillus flavus, Aspergillus paraticus tạo thành aflatoxin, Aspergillus versicolor tạo thành sterigmatocystin

Ở Việt Nam, nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae có hoạt tính α-amylase và

glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn (N.B.Ngà và N.L.Dũng, 1984);

Nghiên cứu thu nhận và sử dụng enzyme protease từ Aspergillus oryzae trong sản

xuất nước chấm (Q.V.Thịnh, 1977), để khử lông da súc vật (L.V.Nhương và Cs.,

1977); nghiên cứu sử dụng sinh khối một số chủng thuộc loài Aspergillus niger để

nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi (N.L.Dũng và Cs, 1984); nghiên cứu khả

năng sinh tổng hợp acid citric của một số chủng thuộc loài Aspergillus niger

(N.T.Hương và N.L.Dũng, 1984); nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphate khó

tan và cellulose của Aspergillus japonicus (P.V.Ty và Đ.T.Lương, 1998); nghiên

cứu hệ vi nấm đối kháng với các vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam, trong đó

có 14 loài thuộc chi Aspergillus có hoạt tính này (Bùi Xuân Đồng và Cs, 1978)…

(Trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000)

1.4 Bệnh do nấm Rhizoctonia spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

2005)

Ở Việt Nam có nhiều bệnh do nấm Rhizoctonia gây ra Một số loài phát

triển, xâm nhiễm, gây bệnh trên thân cây và bề mặt lá trong điều kiện thời tiết ấm,

mưa hoặc ẩm độ cao Nấm Rhizoctonia thường gây bệnh ở rễ, phần thân sát mặt

đất ở cây non và trên bắp, thân và lá ở cây trưởng thành Một số triệu chứng

thường gặp do Rhizoctonia gây ra bao gồm: thối rễ, lở cổ rễ cây non, teo thắt thân,

Nấm Rhizoctonia solani là một nấm có thể kí sinh trên rất nhiều loại cây

trồng Nấm phát triển rất nhanh, hạch nấm và sợi nấm có thể tồn tại trên các mô cây sống hoặc tồn tại trong tàn dư cây trồng và trong đất trong thời gian dài vì chúng chứa một lượng lớn chất dự trữ Sự xâm nhiễm của đất bắt đầu từ hạch nấm, nguồn hạch nấm có thể từ đất, rễ, tàn dư cây trồng, hạt hay củ giống bị bệnh Hạch nấm khi nảy nầm có thể tạo thành sợi nấm, sợi nấm tiếp xúc với mô cây, xâm nhiễm trực tiếp xuyên vào trong tế bào cây Trong một số trường hợp, sợi nấm xâm nhiễm qua mô chết hay qua các vết thương cơ giới trên cây Quá trình xâm nhiễm làm cản trở quá trình hút nước và trao đổi chất dinh dưỡng, kết quả làm cho

mô cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống Bên cạnh đó, nấm

Rhizoctonia solani còn sản sinh enzyme cellulilitic và pectinolitic và độc tố thực

vật Độc tố này giết chết mô chủ, khi mô chủ bị chết và bị phân hủy giải phóng chất hữu cơ làm trăng sự sinh trưởng tiếp tục của nấm Kết quả làm cho mô cây bệnh chuyển màu nâu hoặc thối và cây bị đổ rạp xuống

Rhizoctonia có thể gây hại trên cay rau màu quanh năm, nhưng phổ biến

nhất là trong vụ Xuân Tại Việt Nam, nấm thường xuất hiện trên bắp cải, ngô và các loại cây rau màu Thời tiết nóng ẩm rất thích hợp cho nấm phát triển, triệu chứng bệnh có thể xuất hiện từ 3 – 7 ngày sau khi diễn ra quá trình xâm nhiễm

- 25 -

Hình 1.9 Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra: (a) triệu chứng nhọn như đầu mác

ở rễ bệnh, (b) bệnh khô vằn trên lúa, (c) hạch nấm trên bắp cải bị bệnh,

(d) bệnh trên vỏ ngô (Burgess LW và cộng sự, 2008)

1.5 Bệnh do nấm Fusarium spp gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,

Fusarium là nấm hoại sinh phổ biến trong đất Nấm này phân bố khắp các nơi trên

thế giới, một vài loài có xu hướng xuất hiện khắp nơi trong khi một số loài chủ yếu xuất hiện ở nhiệt đới, bán nhiệt đới, ôn đới

Nấm Fusarium sp tấn công chủ yếu vào bộ rễ Đặc biệt, bệnh gây hại nặng nề

trong diều kiện stress nước, dùng phân bón quá nhiều hay rễ cây bị tổn thương

- 26 -

Hình 1.10 Héo Fusarium trên cây chuối do F oxysporum f cubense sp.:

(a) các triệu chứng héo trầm trọng, (b) triệu trứng nứt thân, (c) hóa nâu mạch dẫn

Héo Fusarium trên cẩm chướng do F.oxysporum f callistephi sp.: (d) héo trầm

trọng gây chết cây, (e) thân héo với nhiều khối bào tử phân sinh màu trắng trên bề

mặt (Burgess LW và cộng sự, 2008) Bệnh héo vàng là một trong những bệnh nguy hiểm gây thiệt hại cho cây trồng ở nước ta, bệnh phổ biến ở hầu hết các vùng trồng cây khoai tây, cà chua, đậu

đỗ Hầu hết các loài gây héo nằm trong nhóm Fusarium oxysporum complex Nhóm Fusarium oxysporum complex có rất nhiều dạng chuyên hóa khác nhau, mỗi nhóm

gây hại trên một nhóm kí chủ nhất định

Bệnh gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ của cây khoai tây và cà chua Ở gốc cây, vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc, gây hiện tượng thối khô tóp lại, cắt ngang phần thân cây bệnh thấy có đường bó mạch tròn quanh thân màu nâu xám Triệu chứng ban đầu là có một vài lá khô héo vàng loang lổ và rụng xuống, sau đó toàn bộ lá héo rũ vàng dẫn đến chết cây Lúc đầu trên ruộng chỉ có một vài cây héo vàng, nếu bị nặng có thể cả ruộng bị héo vàng và chết

- 27 -

Hình 1.11 Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fusarium spp gây ra trên cây cà

chua (Steve Bost, 2013)

Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium sp là: bón

phân đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ vi sinh vật trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ

tối ưu cho nấm Fusarium sp Nấm phát triển và gây hại nặng trong điều kiện ấm và

ẩm, khi nhiệt độ đất ở 25 - 300C và độ ẩm cao kết hợp với điều kiện cây sinh trưởng yếu thì nấm dễ dàng gây bệnh Nấm xâm nhiễm vào cây trồng qua vết thương cơ giới trên rễ cây Nấm gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài Chúng lan truyền từ vùng này sang vùng khác thông qua hạt giống, cây giống, nguồn nước tưới…

- 28 -

1.6 Bệnh do nấm Colletotrichum spp gây ra

Nhiều nhà nghiên cứu bệnh cây thường dùng từ “thán thư” để chỉ các bệnh

do Colletotrichum gây ra Triệu chứng của bệnh là việc hình thành các vết đốm hoại tử màu đậm, lõm xuống, vết bệnh thường có vòng tròn Nấm Colletotrichum

spp có khả năng tấn công lên hầu hết những cây trồng vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, là nguyên nhân gây ra thiệt hại to lớn đối với sự tạo trái hoặc quả của cây trồng do sự ra hoa của cây giảm khi nấm tấn công lên lá, chồi, hoa, trái của nhiều loại cây: ca cao, tiêu, cà phê, cà chua,thanh long, chuối, xoài, táo, nho, đu đủ, dâu tây và một số loại cây trồng khác (Holliday, 1980; Agrios, 2005) Bên cạnh đó, bệnh này không chỉ gây hại ngoài đồng mà còn gây hại trên quả sau khi thu hoạch (Hadden và Black, 1989)

Hình 1.12 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra trên các

loại trái cây nhiệt đới: A Cam; B Ổi; C Xoài; D.Đu đủ; E Mận (Phoulivong S,

2012)

- 29 -

Nấm Colletotrichum coffeanum gây bệnh trên cây cà phê làm trái còn non

bị hư hỏng, hạt cà phê hư hỏng từ 20 – 80% Khi bệnh mới xuất hiện trên lá, cành, thân làm rụng lá, cành trơ trụi khô đen Bệnh thường phát sinh gây hại từ giai đoạn

cà phê ra hoa đến khi quả già, nhất là trong thời tiết ẩm thấp, mưa nhiều

Bệnh thán thư trên cây tiêu do nấm Colletotrichum gloeosporiodies Bệnh

thường gây hại ở đầu mép lá tiêu, làm lá bị cháy, trường hợp nhiễm nặng lá sẽ bị rụng, có thể gây hại thân, nhánh cây tiêu làm tháo đốt, khô cành Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường phát triển vào mùa mưa

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum lagenarium là bệnh gây thiệt hại

nghiêm trọng đến năng suất ớt trên toàn cầu (Kim, 2007) Bệnh tấn công lên lá, thân và quả làm giảm năng suất

Hình 1.13 Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên

trái ớt và lá ớt (Jaw-Fen Wang, 2010) Năm 2009, Masanto Masyahit được xem là người đầu tiên ở Malaysia báo

cáo bệnh thán thư trên thanh long do tác nhân chính là Colletotrichum gloeosporioides Theo kết luận của báo cáo thì bệnh chịu tác động của yếu tố điều

kiện môi trường và kỹ thuật canh tác hơn là những yếu tố khí hậu