Thiết lập môi trƣờng dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất prodigiosin từ vi khuẩn s marcescens SH1

So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an toàn để sử dụn

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

LỞI CẢM ƠN

Em xin được trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức nền tảng, những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoài Hương, người

cô đáng kính, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em về nội dung cũng như các kỹ năng, phương pháp, cách thức tiến hành thí nghiệm để em có thể hoàn thành đồ

án tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp của em

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ, thương yêu và dành cho con những điều tốt đẹp nhất trong suốt quá trình học tập cũng như trong cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

Sinh viện thực hiện

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả là trung thực

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung đồ án của mình Trường Đại học Công Nghệ TP HCM không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện

TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014 Sinh viên thực hiện

Mở Đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài

Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn như thực vật, vi sinh vật, động vật

có xương sống và không xương sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học Một số lượng lớn các loại thuốc đã được phát triển trong ngành

y từ các sản phẩm tự nhiên (Amador và cộng sự 2003) Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của peniciline, các vi sinh vật đã được sử dụng như một nguồn đặc biệt của các tác nhân hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng các ứng dụng điều trị của các chất chuyển hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm cholesterol (ví dụ : lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thư (ví dụ: doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin)

Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên được chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ cũng như từ vi sinh vật đã được sử dụng trong việc làm thuốc đông y, mỹ phẩm, thực phẩm , Nhưng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên

đã được nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng như cách tổng hợp bằng phương pháp hóa học, bởi người ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản xuất thấp Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu được quan tâm

So với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh vật ngày càng được quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên và an toàn để sử dụng, sản xuất được quanh năm trong các điều kiện địa lý khác nhau và do sự tăng trưởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản xuất xuống còn chỉ một vài ngày So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng được kiểm soát và dự đoán sản lượng (Francis, 1987; Taylor, 1984) Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất prodigiosin được biết đến với ý nghĩa quan trọng

Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp

sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene) (C20H25N3O = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996; Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005) Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng

sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997)

Dựa trên cơ sở lợi ích rất quan trọng của hợp chất prodigiosin được tách từ việc

nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, đề tài “THIẾT LẬP MÔI TRƯỜNG

DINH DƯỠNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ SẢN XUẤT PRODIGIOSIN

TỪ VI KHUẨN S MARCESCENS SH1” được tiến hành nhằm tìm ra được môi

trường và điều kiện nuôi cấy để tổng hợp ra prodigiosin cao nhất

2 Mục tiêu của nghiên cứu

Khảo sát các loại môi trường tổng hợp prodigiosin cao nhất

Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tổng hợp prodigiosin cao nhất

3 Ý nghĩa khoa học

Tìm ra được môi trường nuôi cấy tốt nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất Thiết lập được điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để tổng hợp prodigiosin nhiều nhất

4 Ý nhĩa thực tiễn

Prodigiosin là hợp chất thứ cấp vi sinh vật được nghiên cứu phát triển dược phẩm nên được bán trên thị trường với giá rất cao Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc tìm được môi trường tốt nhất và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất

và ứng dụng hợp chất prodigiosin

CHƯƠNG 1 TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

1.1.1 Hợp chất thứ cấp

Hợp chất thứ cấp là chất được tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, thường được gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trường xung quanh Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất được vi sinh vật tạo ra từ quá trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp

1.1.2 Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật

Vi sinh vật đã được sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử sinh học như thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị Có sự quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các thành phần tự nhiên Các thành phần, chẳng hạn như hợp chất thứ cấp, được xem là tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học như động vật, thực vật hoặc

vi sinh vật Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật được sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến cá, ví dụ như để tăng màu hồng của cá hồi nuôi Hơn nữa, một số hợp chất

tự nhiên có tiềm năng thương mại để sử dụng như chất chống oxy hóa Ngành công nghiệp hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm hoặc vật liệu dệt Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và

vi sinh vật sản xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn) Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh vật cung cấp một số lượng hợp chất rất lớn như: carotenoid, melanin, flavin, quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse, 2009) Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng như có thể dễ dàng tối ưu hóa quy trình công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997)

Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất

cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams

và cộng sự, 1971a) Các chi vi sinh vật khác như: Rhodotorula, Bacillus,

Achrombacter, Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lượng lớn hợp

chất thứ cấp (Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây

chết hoặc kìm hãm vi sinh vật phát triển, được một số vi sinh vật (fungi,

actmomycetes, bacteria) tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc

sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình Bảng 1.1 tóm tắt về một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật

Bảng 1.1 Danh sách một số hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi vi sinh vật

Ức chế tạo polymer vách tế bào vi khuẩn,

ức chế hấp thu amino acid và protein, ức chế tạo enzyme

Streptomyces griceus

Streptomycin

Ức chế vi khuẩn Gram âm và ram dương Trị bệnh lao, bệnh viêm màng não, ho gà

Ức chế ghép nối một

số amino acid vào protein, tác động lên

hệ enzyme của vi khuẩn tham gia chuyển pyruvate vào chu trình Creb…

Steptomyces

venezuelae

Chloramphenicol

Ức chế đối với bệnh lỵ, sốt cao, sốt phát ban

Ức chế đặc hiệu sinh tổng hợp protein vi khuẩn liên quan đến peptidyl transferase trong tiểu đơn vị Ribosome 50s, ngăn không cho tạo liên kết peptide

Streptomyces

erythraeus

Erythromycin

Chữa bệnh do tụ cầu khuẩn streptococcal gây

Tác động giống như streptomycin và neomycin

1.2.1 Khái niệm về prodigiosin

Prodigiosin là một tripyrrole được phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc

trưng của vi khuẩn Serratia marcescens Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc

từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu Prodigiosin được tìm thấy ở dạng túi bên ngoài tế bào cũng như các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991)

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, được sản xuất bởi các vi khuẩn

như Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,

Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và

các xạ khuẩn Gram dương, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và

Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006) Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của các hợp chất đại diện của prodigiosin

Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)

1.2.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin được tổng hợp

bởi Serrattia marcescens mới được biết đến (Rapoport và Holden, 1962) Do sự tiến

bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,

mà cấu trúc của prodigiosin dần được nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000)

Prodigiosin với tên gọi methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N3O và trọng lượng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng

(5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-sự, 2006; Williamson và cộng (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-sự, 2006)

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp với nhau, còn vòng thứ ba được gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams, 1972; Gerber, 1975) Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và được miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008)

Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan được trong nước Prodigiosin

có thể tan tương đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977; Khanafari

và cộng sự, 2006)

Bảng 1.2 Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)

Loài Tên sắc tố Danh pháp

prodigiosin

Trọng lương phân tử và công thức

Serratia marcescens Prodigiosin

Methoxy-prodigiosene

tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009)

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng

một số vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus,

Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Tuy nhiên, hoạt động kháng khuẩn của prodigiosin

đối với các vi khuẩn Gram dương lại cao hơn so với các vi khuẩn Gram

âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012)

1.2.3.2 Hoạt tính chống tế bào ung thư

Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng

tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010) Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999) Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế

Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ yếu là do ảnh hưởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đường prodigiosin gây sự tự hủy của các tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011) Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin được mô tả cụ thể như sau:

Hình 1.2 Cơ chế kháng tế bào ung thư của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,

2011) Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004) Acid hóa nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tương tự như prodigiosin gây ra sự tự hủy ở tế bào ung thư ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005)

Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đường tự hủy của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài Tăng tính thấm của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c, nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy Prodigiosin được biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004) Tương tự như vậy, các nghiên cứu cũng đã chứng minh trước đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự hủy BCL-XL nhưng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và cộng sự, 2007)

Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase Survivin hoặc XIAP cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thư (Schimmer

và cộng sự, 2006; Altieri, 2008) Một nghiên cứu trước đó của các tác giả thấy rằng

cả survivin và XIAP đều được giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong

tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007)

Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thư, prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thư bằng cách gây ra quá trình ngừng chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào Để làm điều này, undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997) Tương tự như vậy, prodigiosin gây ra ngừng tăng trưởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2

và cyclin A-CDK2, cũng như bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003) Một nghiên cứu gần đây của Soto-Cerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1

Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến sự tử vong do bệnh ung thư và làm tăng nhu cầu về thuốc chống

di căn Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã được chứng minh trong một mô hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005) Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự, 2005)

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu Ức chế tăng sinh tế bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng

tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Ngoài ra, prodigiosin cũng được tìm thấy gây độc tế bào ung thư phổi và các tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng thuốc (Lagostera và cộng sự, 2005)

1.2.3.3 Hoạt tính ức chế miễn dịch

Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự

ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào lympho B (Han và cộng sự, 2001) Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như: undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprodigiosin,…

Bảng 1.3 Ảnh hưởng prodigiosin đến khả năng tồn tại của các tế bào miễn dịch

(Hwanmook và cộng sự, 2003)

Prodigiosin (nM)

Khả năng tồn tại (%) Ngay thứ

nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin

1.3.1 Điều kiện tổng hợp prodigiosin

Helvia và cộng sự (2010), đã tối ưu hóa quá trình sản xuất proodigiosin

bởi Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nước thải từ công nghiệp

chế biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ Kết quả cho

thấy Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l

Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ưu hóa sản xuất

prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của

prodigiosin Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu cho việc sản xuất prodigiosin trong môi trường Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ Và quá trình chiết xuất prodigiosin được thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid (9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1) Ngoài ra, prodigiosin thu nhận được có tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm

Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng kháng

khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh như

Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., hơn nữa,

prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hưởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu

Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất

prodigiosin trong Serratia marcescens Họ nhận thấy rằng trong số các môi

trường dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp

San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản như một nguồn

carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011 Hơn nữa,

nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn trùng

Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ

chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn như Alteromonas

sp và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự

cũng đã sử dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy

LD50 khoảng 50 μg/ml

1.3.2 Cơ chế tổng hợp prodigiosin

Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon lớn Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp ATCC 39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC

274 (Sma 274) đã được báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001)

Prodigiosin được hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất tripyrrole, được gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene Có rất ít thông tin về con đường sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mô tả về phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm pyrrole của MBC Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy (Williams và Qadri, 1980)

Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC

39.600, Sma 274 và các cụm sinh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử

Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001)

Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các

chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu

một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi khuẩn Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin Việc tách trình tự của DNA mã hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống

nhân bản vector ở Escherichia coli cosmid đã được báo cáo (Dauenhauer và cộng

sự, 1984)

Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp ATCC 39.006 được biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử

nghiệm), mặc dù nó đã không được biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn

khác thuộc Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000) Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin được quy định

bởi nhiều yếu tố, bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003) Điều thú vị là việc sản xuất prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine

lacton (OHHL) tùy thuộc vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp

carotovora, mặc dù sau này, việc sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã được thực

hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng sự, 2000)

Nhóm sắc tố Serratia được quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia

và Streptomyces coelicolor và được bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm

gene tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), được mô

tả ở hình 1.4 Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại (PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức

hợp Thứ tự gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể

hiện kích thước và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và cộng sự, 2001)

1.3.3 Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004) Bản chất màu đỏ tươi

của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009) Nhiều yếu tố, chẳng hạn như: nhiệt độ, pH,

độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trường ảnh hưởng đến quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994; Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005)

Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với

nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004) Hơn nữa, môi trường thông thường được sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi

các chủng Serratia marcescens là môi trường phức tạp và rất giàu dinh dưỡng

(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004) Một số chất dinh dưỡng như thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng ức chế sản lượng prodigiosin

Hình 1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi

Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009)

Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên

các môi trường khác nhau như: môi trường hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol broth, Các môi trường cũng được so sánh tốc độ tăng trưởng và khả năng xuất prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau Các thí nghiệm này cũng giúp quan

sát vai trò của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn Trên môi trường peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi trường như nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có bổ sung đường cũng không thể làm được điều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các

loại đường metabolizable khác do sự giảm pH trong canh trường nuôi cấy Khanafari và cộng sự, 2006) Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất sắc tố Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là môi trường này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cường việc sản xuất sắc tố, trong trường hợp sử dụng môi trường sesame broth thì nguồn carbon ở dạng các acid béo Maltose và glucose được thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đôi năng suất so với chỉ sử dụng môi trường nutrient broth hoặc peptone glycerol broth Điểm thứ hai là sự sản xuất sắc tố được tăng cường trong môi trường peptone glycerol broth ở 30o

C và trong nutrient broth ở

28oC, điều này có thể là do sự hiện diện của glycerol như là một nguồn carbon Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ tăng trưởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silicagel vào môi trường

lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất

prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001) Hơn nữa, prodigiosin thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như SDS vào môi trường nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005)

Bảng 1.4 So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các

môi trường và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

STT Môi trường sử dụng Nhiệt độ Tác giả

3 Canh dinh dưỡng 0,52 0,354 0,111 Giri and cs, 2004

4 Cang pepton glycerol 0,302 0,569 0,111 Giri and cs, 2004

5 Môi trường hạt mè 16,68 9,3 0,319 Giri and cs, 2004

6 Canh dinh dưỡng bổ sung 0,5%

10 Môi trường dầu mè 0,767 1,006 0,107 Giri and cs, 2004

11 Môi trường hạt đậu phộng 38,75 25,98 1,49 Giri and cs, 2004

12 Môi trường dầu đậu phộng 2,89 0,559 0,111 Giri and cs, 2004

13 Môi trường từ dừa 1,94 1,39 0,1736 Giri and cs, 2004

14 Môi trường dầu dừa 1,42 0,05 0,117 Giri and cs, 2004

Prodigiosin được phân lập từ Serratia marcescens Hiển thị kháng khuẩn, chống

ung thư, gây độc tế bào, ức chế miễn dịch, và chống các hoạt động đào thải trong quá trình cấy ghép Prodigiosin gây ra ức chế trong tế bào ung thư máu và các tế bào có nguồn gốc từ các loại ung thư khác của con người, bao gồm cả dạ dày và đại

tràng không có độc tính đáng kể trong các dòng tế bào ác tính Vì vậy, prodigiosin được sản xuất mang tính thương mại trên toàn thế giới, điều đó được thể hiện trong bảng 1.5

Bảng 1.5 Giá trị thương mại prodigiosin trên thế giới (Santa Cruz Biotechnology,

Merck Millipore, Biovision incorporated)

Hoạt động như một mTORC1

và mRTOC2

ức chế chất phát triển phức tạp Chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không sử dụng cho người

- Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C

- Điểm nóng chảy: 151-152ºC

Hoạt động như một kháng sinh Chỉ sử dụng cho nghiên cứu, không sử dụng cho điều trị ở người

3 159 GBP/200 𝜇g >95% - Nguồn: marcescens Serratia Một ứng dụng

- Đóng gói khí trơ

hợp chất tế bào thẩm thấu

có hiển thị ức chế miễn dịch

và chống khối

u đặc tính không phân biệt tình trạng p53 và kháng

Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây được đề xuất là nên thực hiện để xác định một hợp chất chưa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994)

- Phổ khả kiến (𝜇max )

- Sắc ký lớp mỏng (Rf)

- Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lưu mẫu)

- Phương pháp phổ khối (khối lượng phân tử)

- NMR (chuyển hóa về mặt hóa học)

Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh sạch prodigiosin như sau:

- Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) được chiết xuất từ

môi trường nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và

petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong một cốc nước sôi (hay trong một

bể cách thủy) và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980)

- Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất được chiết

xuất bằng acetone, hòa với một ít ethyl acetate, và được sấy khô bằng natri sulfat Các chất chiết xuất được hòa tan và được thực hiện quét từ bước sóng 200 – 700

nm Hỗn hợp dung môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5: 0,5 đã được sử dụng để tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp mỏng Cột silicagel có kích thước từ 80 – 100 mesh đã được sử dụng để phân tách các tạp chất không màu từ các sắc tố Mẫu tinh khiết cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất tại 535 nm trong quang phổ UV Nó được tiếp tục phân tích để xác định trọng lượng phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối Các sắc tố prodigiosin tinh khiết được đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng lượng phân tử là 324 Da (Giri và cộng sự, 2004)

- Prodigiosin được chiết xuất bằng cách lắc môi trường nuôi cấy tế bào

Serratia marcescens 2170 với methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml

methanol) và dịch trong suốt được làm cho bay hơi trong chân không Sắc ký lỏng cao áp của các chiết xuất được thực hiện trên silicagel với dung môi chloroform và methanol Các sắc tố thu được sẽ được rửa giải trong methanol và phân tích bởi phương pháp phổ khối (ESI-MS) Sau đó, các sắc tố chưa tinh khiết đã thu được sẽ tiếp tục được thực hiện phương pháp HPLC Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 vm) đã được sử dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile) Việc

rửa giải được theo dõi bằng cách sử dụng cả hai máy dò UV diode-array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003)

- Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trường được lấy

từ những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã acid hóa (pH 3,0) được thêm vào IAB Các sắc tố được chiết xuất bằng cách sử dụng một vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly tâm Sau đó, nó được thu bằng cách sử dụng nước và chloroform để tách pha Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dưới của pha chloroform và được cô đặc bằng cách cho bốc hơi Prodigiosin được phân tách bằng sắc ký cột silicagel (2,5 × 30 cm) Nó được rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl acetate (2: 1, v/v) Các sắc tố cô đặc đã được tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5 (v/v) trong TLC Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã được thu nhận và hòa tan trong acetone Các sắc

tố chưa tinh khiết sẽ tiếp tục được thực hiên phương pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform: methanol: diethyl ether là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)) Sau đó, nó được tách rửa với hỗn hợp methanol: nước (7:3, v/v) đã được điều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N HCl với tốc độ dòng chảy là 20 ml/ phút Một lưới thép không gỉ lớn với kích thước lỗ 0,5 cm đã được sử dụng như sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong Nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra được ước tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535 nm sử dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã được acid hóa (0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968) Khối lượng phân tử của chất màu tinh khiết được xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu màu được ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3 Các dịch chuyển hóa đã được đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu Phổ FT-IR của các sắc tố được ghi nhận (Song và cộng sự, 2006)

1.3.4.2 Định lượng

Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất tại bước sóng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004) Chính vì vậy,

nồng độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra được thu nhận trong methanol đã acid hóa (với 0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ được ước tính bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt

- TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu được (μg/L)

- A: Độ hấp thụ của sắc tố được chiết xuất trong methanol ở 535 nm

- D: Hệ số pha loãng

- V1: Thể tích methanol bổ sung vào V2: Thể tích canh trường ban đầu

- 7.07×104: Hệ số hấp thụ của prodigiosin

1.4 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens

Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin được biết đến là một hợp chất tự nhiên

có thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và được sản xuất bởi các vi sinh vật

như Vibrio psychroerythrus (D’ Aoust và Gerber, 1974), Serratia marcescens,

Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964)

Đặc trưng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ không có khả năng

khuếch tán prodigiosin nên khuẩn lạc có màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự,

1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989) S marcescens cũng là một

tác nhân gây bệnh cơ hội ở người với những chủng không sản xuất sắc tố gây đe dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989) Những chủng sản xuất sắc tố phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ không tan trong nước này lại được báo cáo là có hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng

sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự, 1997) Các prodigiosin tốt nhất được biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn

với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004) S marcescens cũng

sản xuất một chất hòa tan trong nước, có màu đỏ hồng tím superoxidase dismutase (Hardjito và cộng sự, 2002)

Ở S marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu không có màu, màu đầu tiên xuất hiện gần đường kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000) S

marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định Bizio và Sette đã

phân lập được sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nó như

là một loại thuốc nhuộm cho mục đích thương mại Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết

nó quá nhạy cảm với ánh sáng khi được sử dụng thực tế (Furstner, 2003)

Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, có thể phát

triển tốt trong điều kiện môi trường kỵ khí và hiếu khí Nó phát triển tốt trên các môi trường tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau như một nguồn carbon duy nhất Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các môi trường và phát hiện ra trên môi trường từ hạt đậu phộng làm tăng một lượng đáng

kể prodigiosin

Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silicagel vào môi trường lỏng

của S marcescens cũng dẫn đến sự tăng trưởng tế bào, sản xuất prodigiosin và

serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001) Ngoài ra, prodigiosin thường nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn như sodium dodecyl sulface (SDS) cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và Chen, 2005) Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi chủng phi lâm sàng (non-clinical) có ý nghĩa khoa học và quan trọng, có một mối quan hệ giữa quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid Do đó,

sản xuất sắc tố do chủng phi lâm sàng của S.marcescens đã được quan tâm

nghiên cứu sâu hơn để xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả

năng gây bệnh Đặc điểm sắc tố của S marcescens cũng khác nhau (Hardjito và

cộng sự, 2002), chịu ảnh hưởng của cả hai yếu tố di truyền và môi trường Sản xuất các sắc tố tan trong nước được tăng cường bằng cách bổ sung polymyxin B (Suzuki và cộng sự, 2001), gramicidin và valinomycin vào môi trường tăng trưởng (Hardjito và cộng sự, 2002)

Không nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S marcescens sẽ tiếp tục hấp dẫn

các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sư công nghệ sinh học Gần đây, prodigiosin

đã được xem là hiệu quả như một tác nhân kiểm soát sinh học với tảo có hại trong môi trường biển tự nhiên, do đó, prodigiosin phải sản xuất với số lượng lớn để có thể đáp ứng nhu cầu trong tương lai (Someya và cộng sự, 2001)

1.5 Tổng quan về Serratia marcescens

1.5.1 Phân loại Serratia marcescens

Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan

với nhau về hình thái và trình tự DNA Trong đó, loài điển hình của chi

Serratia là Serratia marcescens

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau:

- Loài: Serratia marcescens

1.5.2 Đặc điểm của Serratia marcescens

1.5.2.1 Đặc điểm sinh lý

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi Serratia

marcescens có hình que, đường kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –

2,0 μm Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40oC

và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012)

Hình 1.5 Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)

Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar được mô tả

là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng

chính là sắc tố thường thấy trong các khuẩn lạc Các sắc tố của Serratia

marcescens thường bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012)

Hình 1.6 Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trường nutrient agar ở

250C sau 48 giờ (David, 2012)

Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trường thạch, tạo

thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%); các cụm tế bào này có chiều dài từ

5-30 μl Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học

1.5.2.2 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trường có oxy hoặc trong

trường hợp không có oxy Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên

men để lấy năng lượng và nhờ có các enzyme như superoxide dismutase, calatase, peroxidase,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và

gelatinase (Giri và cộng sự, 2004) Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định

Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như

nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997) Trong đó, thủy phân

casein là một đặc điểm chung của Serratia marcescens Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo Serratia

marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide

(CO-NH) trong casein Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens được thể

hiện qua bảng 1.6 sau:

Bảng 1.6 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010)

STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả

10 Gelatinase +

12 Triple sugar iron Môi trường chuyển sang acid, không

sinh khí và không sinh H2 S

13 Hydrogen sulphide peoduction -

14 Lysine decarboxylase +

15 Ornithine decarboxylase +

1.5.2.3 Đặc điểm phân bố

Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nước, trong đất, trong

thực vật, côn trùng, cũng như trong ống tiêu hóa của người và động vật có xương sống

- Trong nước và đất: đã có 150 chủng Serratia được phân lập trong nước sông

và Serratia marcescens chiếm 75% Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể

đóng một vai trò quan trọng trong chu kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng như hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964)

- Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài

côn trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm

ưu thế Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm

năng đối với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006)

Hơn nữa, Serratia marcescens cũng được tìm thấy nhiều trong thực phẩm, nhất

là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng trưởng của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001)

Gần đây, người ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong

các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006) Và trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ

Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae

1.5.3 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens

Brigida và cộng sự (2006), đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng của

Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của Serratia marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh

Jaiganesh và cộng sự (2007), đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát

Pyricularia oryzae gây bệnh trên cây lúa bằng cách sử dụng Serratia marcescens

Nghiên cứu của Gursharan và cộng sự (2007) đã sử dụng chitin, nấm,… làm

chất nên cho quá trình sản xuất enzyme chitinase bởi Serratia marcescens GG5

Maria và cộng sự (2012), đã tiến hành thử nghiệm về quá trình lây

nhiễm Serratia marcescens cùng tuyến trùng Steinernema cerpocapsae vào ấu trùng Galleria mellonella và đạt được kết quả gây chết 100% ấu trùng

1.5.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens

1.5.4.1 Sắc tố

Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin được tổng hợp từ vi

khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), được biết đến như là một yếu

tố đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin Trong đó, khả năng ức chế miễn dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin

và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008)

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup

A1 và A2/6, nó không được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT (Grimont, 1977) Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6 thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont, 1977; Williams và Qadri, 1980) Một số gene mã hóa sinh tổng hợp

prodigiosin đã được biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự,

1984) Các dòng được tạo thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006) Prodigiosin được biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của

cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể

người, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997)

Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là carboxymethylmuconic semialdehyde acid, được sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias

2-hydroxy-5-và cộng sự, 1988) Enzyme này được cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các

chủng Serratia marcescens Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a,

đã bị mất khả năng phát triển trên các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc

tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006)

1.5.4.2 Biosurfactants

Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia

marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động như một chất thấm Chất

thấm này được sản xuất với số lượng lớn ở 30°C nhưng không được sản xuất ở37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trưởng Ba aminolipid, từ W1 đến W3, có các hoạt động thấm ướt và đã được tách bằng sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986) Trong đó, W1 được xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide mà trước đó đã từng được phát hiện bởi Wasserman và cộng sự (1961)

1.5.4.3 Acid béo

Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia marcescens

là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và octadecanoic acid Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế bào, trong

đó, ntetradecanoic acid chiếm tỉ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983)

1.5.4.4 Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease,

chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải

có chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước,… (Joshi và cộng sự, 1989)

Serratia marcescens có khả năng tiết ra các loại enzyme:

- Thủy phân casein không phải là một đặc điểm chung và do đó rất hữu ích

trong việc phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đường ruột và tập hợp Pseudomonadaceae.Serratia marcescens sử dụng các enzyme ngoại bào được

gọi là protease để phá vỡ các lien kết peptide (CO-NH) trong casein

- Tương tự như vậy, một loại enzyme ngoại bào được gọi là gelatinase phân hủy gelatin, một loại protein không đầy đủ mà thiếu trytopan Thủy phân gelatin biến đổi protein thành các acid amin

- Enzyme Catalase

- Enzyme Esculinase

- Enzyme Dnase

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm

Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là hai chủng Serratia marcescens do

Nguyễn Hoàng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng EPN, tại phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, khoa Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Đại học

Công nghệ TP HCM Trong đó, chủng SH1 được phân lập từ Heterorhabditis

indica CP 16 (H.CP 16) và chủng SS1 được phân lập từ Steinernema quangdongsense XT (S.XT) Được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

có số đăng kí trên genbank là KF534508.1

2.2.2 Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng

2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy ( thành phần môi trường xem phụ lục)

- Môi trường Nutrient agar;

- Môi trường Nutrient broth;

- Môi trường Peptone glycerol broth;

- Môi trường Mac Conkey;

- Môi trường Triple sugar iron agar;

- Môi trường Tryptone broth;

- Môi trường Citrate broth;

- Môi trường huyền phù đậu phộng;

- Môi trường huyền phù đậu phông gelatin;

- Môi trường huyền phù đậu phộng pepton;

- Môi trường huyền phù đậu phông với các loại đường;

- Môi trường huyền phù đậu phộng pepton dầu hướng dương;

2.2.2.2 Hóa chất sử dụng

- KIT API 20E (Biomerieux)

- Hóa chất nhuộm Gram;

Dụng cụ

Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm, đĩa petri, Eppendorf, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, …

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khẳng định các chủng vi sinh vật nghiên cứu thuộc loài Serratia

marcescens qua khảo sát đặc điểm nuôi cấy, có sử dụng KIT API 20E

- Chọn chủng có khả năng tổng hợp prodigiosin cao nhất

- Xác định điều kiện nhân giống

- Xác định môi trường nuôi cấy

- Xác định điều kiện nuôi cấy

2.4 Phương pháp luận

Prodigiosin là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thường trễ hơn pha tăng trưởng tế bào Dịch môi trường và và điều kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp Nghiên cứu này dựa trên các báo cáo trước đó của các tác giả ngoài nước để xác định môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Để đạt được mục tiêu của đề tài, người thực hiện tiến hành với các nội dung theo sơ đồ hình 2.1 Các công việc được tiến hành theo các trình tự sau:

2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S marcescens

Từ các chủng vi khuẩn đã được phân lập trong phòng thí nghiệm, tiến hành nhân giống cấp 1 bằng môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng

Sau đó, thu dịch vi khuẩn, tiến hành pha loãng và cấy trang trên môi trường đĩa thạch Mac Conkey và NB Để nhiệt độ phòng trong 24 giờ, kiểm tra khuẩn lạc trên thạch đĩa (có khi để thêm 24 giờ), sau đó tiến hành tới các kiểm tra sinh hóa theo sơ

đồ sau:

Hình 2.2 Sơ đồ kiểm tra độ thuần khiết và khẳng định là S marcescens

2.5.1.1 Tiến hành thí nghiệm kiểm tra độ thuần khiết

Khả sát hình thái khuẩn lạc

Cấy ria chủng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường Mac, NA Dùng dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc Quan sát dưới kính hiển vi ở hai góc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X

Nhuộm Gram

Tăng sinh chủng vi khuẩn phân lặp được và hai chủng đối chứng là E coli và Bacillus subtilis trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 vòng/phút trong tối Quan sát vi sinh vật dưới vật kính 100X với một giọt dầu soi kính Vi khuẩn gram

âm sẽ bắt màu hồng, vi khuẩn gram dương sẽ bắt màu tím

Thử nghiệm TSI

Pha các thành phần môi trường TSI trong nước cất, trộn đều, đun nóng

và thỉnh thoảng lắc Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E coli vào sâu vào phần sâu của ống thạch nghiêng cách đáy ống nghiệm khoảng 1cm, sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng

Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 370C trong 24 giờ Ghi nhận sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng và sự tạo thành màu đen bởi FeS

Thử nghiệm khả năng sinh Indol

Pha môi trường Tryptone Broth Dùng que cấy vòng cấy sinh khối của chủng vi sinh vật thử nghiệm và đối chứng E coli vào ống nghiệm môi trường Tryptone Broth Sau khi cấy giống, các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ

Trước khi bổ sung thuốc thử Kovac’s bổ sung 1 ml petroleum ether, lắc đều để tách indol trên lớp dung môi hữu cơ Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac’s vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ