Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của cây bạc hà á mentha arvensis l

Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi cấy .... Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa k

GVHD: ThS Trịnh Thị Lan Anh SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân Lớp: 12DSH02

TP.HCM, tháng 8/ 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

KHOA CNSH–TP–MT



GVHD: ThS Trịnh Thị Lan Anh SVTH: Phạm Thụy Ngọc Trân Lớp: 12DSH02

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung đề tài 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

5 Kết quả đạt được của đề tài 3

6 Kết cấu của đồ án 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu sơ lược kỹ thuật nuôi cấy in vitro 5

1.1.1 Khái niệm 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam 5

1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô 6

1.1.4 Ưu và nhược điểm của kỹ thuận nhân giống in vitro 8

1.1.5 Thành phần các chất khoáng vô cơ 9

1.1.5.1 Các nguyên tố đa lượng 9

1.1.5.2 Các nguyên tố vi lượng 11

1.1.6 Dinh dưỡng hữu cơ 12

1.1.7 Các hợp chất tự nhiên 14

1.1.8 Carbon và nguồn năng lượng 17

1.1.9 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 18

1.1.10 Các thành phần khác 18

1.1.11 Sự phát sinh hình thái thực vật 20

1.2 Giới thiệu sơ lược về Bạc hà 21

1.2.1 Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và Việt Nam 21

1.2.2 Giới thiệu sơ lược về giống Bạc Hà Á Mentha arvensis L 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 31

2.2 Vật liệu 31

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2.2 Môi trường nuôi cấy 31

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm 31

2.3 Phương pháp 31

2.4 Bố trí thí nghiệm 32

2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả

năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L 32

2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hàm lượng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L 33

2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L 33

2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L 34

2.5 Chỉ tiêu theo dõi 35

2.6 Thống kê và xử lý số liệu 35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 37

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của hàm lượng của nước dừa đến khả năng

sinh trưởng và phát triển của Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần

nuôi cấy 45

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 52

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 60

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

4.1 Kết luận 67

4.2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa 15

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu xanh 16

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu đen 17

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên quá trình hình thành chồi

và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha

arvensis L 32

Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình hình thành chồi và

tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L 33

Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của đậu đen lên quá trình hình thành chồi và tạo

cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L 34

Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của đậu xanh lên quá trình hình thành chồi và tạo

cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà Á Mentha arvensis L 35

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình

hình thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau

8 tuần nuôi cấy 38

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình

thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8

tuần nuôi cấy 46

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình

thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8

tuần nuôi cấy 53

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình

hình thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà

sau 8 tuần nuôi cấy 60

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến trọng lượng tươi và trọng lượng

khô của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 39

Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà

Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 39

Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến đường kính lá, chiều dài lá,

chiều cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha

arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 40

Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 47

Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của nước dừa đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á

Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 47

Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của nước dừa đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều

cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L

sau 8 tuần nuôi cấy 48 Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của đậu đen đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 54

Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của đậu đen đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á

Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 54

Biểu đồ 3.9 Ảnh hưởng của đậu đen đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều cao

cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8

tuần nuôi cấy 55 Biểu đồ 3.10 Ảnh hưởng của đậu xanh đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô

của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 61

Biểu đồ 3.11 Ảnh hưởng của đậu xanh đến số lá, số chồi và số rễ của Bạc hà Á

Mentha arvensis L sau 8 tuần nuôi cấy 61

Biểu đồ 3.12 Ảnh hưởng của đậu xanh đến đường kính lá, chiều dài lá, chiều

cao cây và chiều dài rễ của mẫu cấy Bạc hà Á Mentha arvensis L

sau 8 tuần nuôi cấy 62

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bạc Hà Á Mentha arvensis L 23

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nồng độ than hoạt tính khác nhau lên quá trình hình

thành rễ và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi

cấy 41 Hình 3.2 Ảnh hưởng của các nồng độ nước dừa khác nhau lên quá trình hình thành

chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần nuôi

cấy 49 Hình 3.3 Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu đen khác nhau lên quá trình hình

thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần

nuôi cấy 56 Hình 3.4 Ảnh hưởng của các nồng độ bột đậu xanh khác nhau lên quá trình hình

thành chồi và tạo cây con hoàn chỉnh từ đoạn cắt thân Bạc hà sau 8 tuần

nuôi cấy 63

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam có điều kiện tự nhiên, khí hậu thuận lợi nên là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Tổng số loài thực vật ở Việt Nam được ước tính có khoảng 12.000 loài Trong số này, nguồn tài nguyên dược liệu rất phong phú và đa dạng, chiếm một phần lớn đáng kể

Qua các số liệu điều tra đã thống kê được trên 4.000 loài thực vật được dùng làm thuốc Từ lâu, cộng đồng các dân tộc Việt Nam đã biết dùng cây thuốc để chữa bệnh, với kinh nghiệm điều trị nhiều loại bệnh khác nhau

Hàng năm, nước ta có nhu cầu từ 40.000 - 60.000 tấn dược liệu và công tác phát triển dược liệu đã được Nhà nước quan tâm Nhiều địa phương đã đầu tư các vùng trồng dược liệu bền vững, góp phần tăng thu nhập cho người dân và đáp ứng nhu cầu nguyên liệu đảm bảo chất lượng

Hiện nay người ta có xu hướng quay trở về với cây thuốc và thuốc có nguồn gốc thiên nhiên tạo ra Xu hướng này đã tác động đến việc sản xuất, thu hái, chế biến, lưu thông, tiêu thụ và sử dụng dược liệu thảo mộc

Trước nhu cầu về dược liệu thiên nhiên, do sự tác động của người thu mua, nhận thức và ý thức của người dân, công tác quản lý chưa đáp ứng yêu cầu, nên việc khai thác tài nguyên dược liệu thường diễn ra bừa bãi, không chú ý đến khả năng tái sinh của các loài Do vậy đã làm nguồn tài nguyên dược liệu của Việt Nam suy giảm nghiêm trọng

Trong số các loài thảo dược phổ biến, thì cây Bạc hà Mentha arvensis L

thuộc họ hoa môi (Lamiaceae) là một trong những loài thảo mộc quý đang rất được

ưa chuộng, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược liệu, có giá trị kinh tế, sử dụng rộng rãi cả trong Tây y và Đông y ở nước ta và trên thế giới

Cây Bạc hà tuy được sử dụng rộng rãi, có tác dụng dược lý cao trong Đông y

và Tây y ở hầu hết các nước trên thế giới nhưng các nghiên cứu về chúng còn ít so với nhiều cây trồng và cây dược liệu khác Theo Khotin (1963), nhiều loài Bạc hà

để lấy tinh dầu có nguồn gốc ở một số nước phía Tây châu Âu; điều này phù hợp

với các nghiên cứu về phân loại thực vật bậc cao là bộ, họ Hoa môi phân bố tập trung ở vùng Địa Trung Hải, Tiểu Á và Trung Á, (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978)

Ở Việt Nam theo GS.TS Đỗ Tất Lợi, cây Bạc hà mọc hoang dại và được trồng ở nhiều vùng, chúng mọc hoang dại cả ở đồng bằng, trung du và miền núi như

ở Sa Pa (Lào Cai); Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Ba Vì (Hà Nội) và Bắc Kạn, Sơn La, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Từ năm 1955 nước ta đã trồng Bạc hà, đến năm 1972 cả nước đã tự sản xuất được khoảng 60 tấn tinh dầu Bạc hà

và 1 tấn menthol tinh thể

Hầu hết cây Bạc hà được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp truyền thống như giâm cành, gieo hạt,… Trong những nơi khô hạn, việc nhân giống của Bạc hà gặp nhiều khó khăn Vì vậy, kỹ thuật vi nhân giống được coi là phương pháp hữu hiệu cho phép nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật, trong đó có loài dược

thảo quan trọng như Bạc hà Mentha arvensis L Nhân giống in vitro đã được chứng

minh là công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch

et al., 2001; Martin, 2003; Azad, 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009)

Hiện nay, các công trình nghiên cứu về nhân nhanh giống cây trồng đã đạt nhiều thành tựu trên các loài thực vật có giá trị như Lan, Cúc, Lily,… tuy nhiên về cây Bạc hà vẫn còn hạn chế Một số công trình nghiên cứu nổi bật về Bạc hà như:

nhân giống in vitro Mentha arvensis L thông qua nuôi cấy mô sẹo (Maity, 2013),…

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình tăng trưởng và tạo chồi của

cây bạc hà Á Mentha arvensis L.” Với mục đích ứng dụng công nghệ sinh học

trong việc phát triển nông nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,không sâu, bệnh

2 Mục đích nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính, bột từ đậu đen, đậu xanh, và nước

dừa lên khả năng tăng trưởng của cây Bạc hà Á Mentha arvensis L

Xây dựng môi trường cải tiến để nhân giống cây Bạc hà Á Mentha arvensis L tốt nhất bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro

3 Nội dung đề tài

 Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính lên khả năng tăng trưởng Bạc hà Á

Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra một biện pháp kỹ thuật nhân giống Bạc hà Á

Mentha arvensis L bằng phương pháp in vitro để đánh giá hoạt tính kích thích tăng

trưởng khi bổ sung hoặc thay thế các yếu tố trong môi trường nuôi cấy Bạc hà Á

Mentha arvensis L Duy trì hình thái và khắc phục các trường hợp hay gặp trong

nuôi cấy mô khi môi trường đặc biệt sử dụng agar, cấy chuyền mẫu nhiều lần

Ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân

nhanh giống Bạc hà Á Mentha arvensis L ở quy mô lớn, cây sạch bệnh nhằm cung

cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

5 Kết quả đạt được của đề tài

 Xác định được nồng độ thích hợp của than hoạt tính lên khả năng tăng

trưởng Bạc hà Á Mentha arvensis L

 Xác định được nồng độ thích hợp của nước dừa lên khả năng tăng trưởng

Bạc hà Á Mentha arvensis L

 Xác định được nồng độ bột đậu đen thích hợp lên khả năng tăng trưởng của

cây Bạc hà Á Mentha arvensis L

 Xác định được nồng độ bột đậu xanh thích hợp lên khả năng tăng trưởng của

cây Bạc hà Á Mentha arvensis L

6 Kết cấu của đồ án

Đồ án bao gồm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro

1.1.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô (tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy vô

trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô

dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý,…

Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn

thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện

vô trùng với các mục đích khác nhau Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, các phytohormone, vitamin và đường

1.1.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm

1980 Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật:

Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương (loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè vang (một loại chè rất khó trồng) Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía,

Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla

Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở địa phương

Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô

Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học

Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao

Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân

giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một số tế

bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6 năm sâm mới cho thu hoạch Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt

chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) – loài lan duy nhất

có hương thơm trên thế giới,…

1.1.3 Kỹ thuật nuôi cấy mô

Các bước nhân giống:

Giai đoạn 1: chọn lọc cây mẹ và khử trùng mô nuôi cấy

Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế

độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá

Giai đoạn 2: tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

Giai đoạn 3: nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh Để tăng hệ số nhân, người ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng thực vật như: auxin, cytokynin, gibberellin,… và các chất

bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp

Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này

sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn 5: đưa cây ra vườn ươm

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra vườn ươm là bước cuối cùng

của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng

thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ở đồng ruộng

1.1.4 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro

Ưu điểm

 Phương pháp nhân giống in vitro có những ưu điểm vượt trội so với các

phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép,…) như:

 Cây con đồng nhất về mặt di truyền;

 Cây có hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng cây giống trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại;

 Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn,… mà ngoài tự nhiên không thể thực hiện được;

 Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng;

 Tạo dòng toàn cây cái (cây Chà là) hoặc toàn cây đực (cây Măng tây) theo mong muốn;

 Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm,…

 Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm;

 Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen;

 Ngoài ra, phương pháp nhân giống in vitro còn giảm được nhiều công sức

chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít không gian so với phương pháp nhân giống truyền thống

 Nhân giống trên môi trường bán rắn có giá thành sản xuất vẫn còn cao (do sử dụng agar) và thời gian cấy chuyền dài Khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, chi phí cho năng lượng và nhân công vẫn còn rất lớn

1.1.5 Thành phần các chất khoáng vô cơ:

Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật (Smith và Gould) và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiều loại cây trồng

Theo Lê Văn Hòa và cộng sự (1999) khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc Các nguyên

tố khoáng đa lượng gồm các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l

Các nguyên tố khoáng vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ thấp hơn 30 mg/l Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

1.1.5.1 Các nguyên tố đa lượng:

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính: N, P, K

Nitrogen (N)

Nitrogen là thành phần cấu tạo nên nucleotide, acid amine, protein, diệp lục

và một số hormone thực vật nên nitrogen là nguyên tố dinh dưỡng hàng đầu trong

nitrate (NO3-)

Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn nitrate là:

Ca(NO3)2: Calcium nitrate (15,5% N)

Các muối phổ biến dùng cung cấp nguồn ammononium là:

một hệ đệm làm ổn định pH của môi trường nuôi cấy Các dạng muối thường gặp:

• (NH4)2HPO4: Diammonium hydrogen phosphate (46% P2O5)

Potassium (K)

Potassium tham gia vào việc phân chia tế bào, hợp thành protein và diệp lục

tố, oxy hóa khử muối nitrate, tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc, đứng thẳng, giúp cây ra hoa,…

Trong môi trường nuôi cấy, muối potassium thường được sử dụng là:

K2SO4: Potassium sulfate (48% K2O)

KNO3: Potassium nitrate (44% K2O)

Calcium (Ca)

Tác dụng trọng yếu nhất của calcium là calcium được xem là tín hiệu thứ cấp trong phản ứng của cây đối với môi trường và hormone Ngoài ra còn giúp cây tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc,…

Các muối thường dùng (với nồng độ trung bình 2,57 mmol/l) là:

CaCl2.4H2O: Calcium chlorur

Ca(NO3)2.2H2O: Calcium nitrate

Muối Magnesium thường dùng là:

Đồng (Cu)

Thiếu đồng dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới

Manganse (Mn)

cung cấp Mn cho cây

Molydenum (Mo)

1.1.6 Dinh dưỡng hữu cơ

Vitamin được thêm vào môi trường nuôi cấy ở nhiều dạng và nồng độ khác nhau Vitamin cần thiết trong các chuỗi phản ứng sinh hóa của cây Hầu hết các môi trường nuôi cấy mô thực vật, Thiamine (Vitamin B1) được thêm vào Linsmaier và Skoog (1965) xác nhận rằng sau khi bổ sung vitamin vào môi trường MS thì ảnh hưởng đến sự phát triển của cây Tầm quan trọng của Thiamine cũng được nhấn mạnh bởi nhiều nhà nghiên cứu khác

Vitamin B1 (thiamine) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzyme xúc tác quá trình oxy hoá khử cacbon ở acid hữu cơ Nồng độ thường dùng từ 0,1- 10 mg/l

Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzyme khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các acidamin Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l

Inositol thường được đề cập như là một loại vitamin ảnh hưởng quan trọng đến quá trình lớn và phát triển của cây Myo - inositol cần được bổ sung một lượng khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô

Vitamin có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn carbon của môi trường nuôi cấy

Tuy nhiên, Vitamin không phải là nhân tố chính cho sự phát triển của cây Đối với các loại vitamin khác, thật khó để nói tầm quan trọng của chúng Ảnh hưởng của Vitamin trong nuôi cấy mô in vitro khác nhau tùy theo loài hoặc cũng có thể gây hại cho mô

Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp

được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng nên phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B

Pepton

Pepton là tên gọi chung các sản phẩm chuyển hóa chưa hoàn toàn của protein

có nguồn gốc khác nhau như thịt, casein, gelatin được thủy phân bằng protease hoặc bằng các acid sau đó làm khô thành dạng bột Pepton có chứa các chất đạm hữu cơ, đường, muối khoáng và các vitamin Pepton tan trong nước, không tan trong ether,

có màu vàng nhạt

Pepton được sử dụng như là một nguồn nitrogen hữu cơ trong môi trường

nuôi cấy vi sinh vật cho nhiều loại vi khuẩn và nấm Trong nuôi cấy in vitro, nguồn

nitrogen giúp giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân, lá,

rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh Việc bổ sung nguồn nitrogen hữu cơ vào môi

trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây,

đặc biệt là những cây sinh trưởng chậm và khó nhân giống như lan Hồ điệp

Những nghiên cứu trước đây đã cho thấy những ảnh hưởng tích cực của pepton lên sự nảy mầm và phát triển của các loại lan Pepton nâng cao tỷ lệ nảy

mầm và phát triển của PLB ở lan Cattleya (Curtis et al., 1943); Dendrobium (Alberts, 1953); Vanilla (Bouriquet, 1947)

Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007) khi nghiên cứu ảnh hưởng của pepton

lên sự phát sinh phôi và tế bào lan Dendrobium đã đưa ra kết quả khi bổ sung 1g/l

pepton vào môi trường VW thì tỷ lệ phôi soma đạt được là 100% trên các mẫu nuôi cấy

Pepton đã được chứng minh có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành PLB

lan Dendrobium Các nghiên cứu cho thấy rằng khi bổ sung 2g/l pepton thì số

lượng PLB đạt được là cao nhất (Kanjilal và Datta, 2008)

1.1.7 Dịch chiết các hợp chất tự nhiên

Bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro thường được thực hiện với mục đích thúc đẩy quá trình trao đổi chất của một số cây sinh trưởng chậm

Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2004)

Sự bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy in vitro nhằm thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, đặc biệt là những cây sinh trưởng chậm và khó nhân giống

Các nghiên cứu của Pierik và cộng sự (1988), Li và cộng sự (2001), Chyuam

và cộng sự (2010), Songjun và cộng sự (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi của một số loài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này

Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước

dừa, dịch chiết chuối, cà rốt, khoai tây, pepton và triptone, đây là những nhân tố

đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro Ngày

càng nhiều các hợp chất hữu cơ khác nhau được phát hiện và bổ sung vào môi

trường nuôi cấy in vitro như mầm ngô, mầm đậu, dịch chiết cà chua, để nâng cao

hiệu quả nhân giống

Trong nuôi cấy in vitro thực vật từ năm 1941, nước dừa đã được sử dụng để nuôi cấy phôi Datura metel L và năm 1949 nuôi cấy mô Daucus carota Nước dừa

thường chứa các acid amin, acid hữu cơ, đường, ARN, ADN Đặc biệt trong nước

dừa có chứa các hợp chất quan trọng cho nuôi cấy in vitro đó là myo-inositol, các

hợp chất có hoạt tính auxin, các glucose của cytokinin (Pierik, 1987)

Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô lan giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961)

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh 2004) Một lít nước dừa có 40 g carbohydrate, 2-3 g acid amin, 4 g chất khoáng (48 meq potassilum, 2 meq sodium,

45 meq chlorur, 7 meq calcium, 6 meq magnesium…và các yếu tố vi lượng như sắt, manganese, lithium), vitamin, hầu như không có lipid và có rất ít

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa

nước ta Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với các vùng có điều kiện khắc nghiệt Đậu xanh còn là nguồn cung cấp chất

xơ hòa tan

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu xanh

Đậu đen có: glucid 53%, protein 24%, lipid 1,7%, các vitamin A, B1, B2,

PP, C; giàu acid amin: lysin, tryptophan, phenylalanin, threonin, valin, leucin, isoleusin, arginin, histidin; các nguyên tố vô cơ: Ca, P, Fe…

Đậu đen có chứa nhiều sinh tố A, B, C, PP, protein, carbohydrat, lipid, muối khoáng Hàm lượng acid amin cần thiết trong đậu đen rất cao gồm: lysin, methionin, tryptophan, phenylalanin, alanin, valin, leucin,

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của 100 g đậu đen

(Nguồn: Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam)

1.1.8 Carbon và nguồn năng lượng

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp

nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose

Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy Nồng độ sucrose có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy

1.1.9 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ngoài thành phần vô cơ và hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay phytohormone là một thành phần không thể thiếu được cho sự cảm ứng phân chia tế bào, sinh trưởng và phân hóa của mô nuôi cấy

Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà loại và liều lượng sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau

Có 5 nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và ethylene Trong đó, hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng là auxin và cytokinin quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được nuôi cấy in vitro

Nhóm auxin (gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T,…) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ Ở liều lượng cao, auxin thường gây nên các đột biến

Nhóm cytokinin (gồm kinetin, zeatin, BA,…) đẩy nhanh sự phân chia tế bào, nhân chồi và phát triển của chồi

1.1.10 Các thành phần khác

Các chất hấp phụ phenol

Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để giống Phalaenopsis, vấn đề

thường gặp nhất là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol sẽ khuếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu và chết (Morel, 1974; Flemee và Boesman, 1977; Fast, 1979)

Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol, polyvinyl pyrolidone (PVP), than hoạt tính và nhiều loại chất hấp thụ khác Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 – 3 tuần sang môi trường mới Đối với nuôi cấy mô lan trong môi trường lỏng thường bổ sung chất PVP

Trước đây, than hoạt tính thường được sử dụng để phòng độc, lọc không khí

và các chất lỏng Hiện nay, than hoạt tính đã được tinh chế và sản xuất rộng rãi như một chất có tính hấp thụ cao và được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô nhờ có tác động lên sự phát sinh hình thái và phát sinh cơ quan của thực vật

Vai trò của than hoạt tính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật như các phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ mẫu môi trường nuôi cấy Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất cótrong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường

Từ khi than hoạt tính được ứng dụng trong nuôi cấy mô, các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu và công bố về ảnh hưởng của nó trong việc cải tiến môi trường nuôi cấy, tăng cường khả năng tái sinh cây, phát sinh phôi, tăng sinh tế bào trần, ngăn cản sự phát triển bất thường của cây con, kích thích quá trình hình thành và phát triển chồi, thúc đẩy hay ức chế sự tăng trưởng và hình thành rễ Ngoài

ra, than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiện tượng thủy tinh thể ở một số loài

thực vật Trong khi đó, các nghiên cứu về khả năng định hướng rễ in vitro dưới tác

động của than hoạt tính lại rất hạn chế và hầu như chưa có công bố nào về vấn đề này

Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thương mại Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định vào môi trường nuôi cấy

Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh

trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park et al., 2000)

Agar

Agar là một sản phẩm tự nhiên được ly trích từ các loại tảo đỏ như Rhodophycean, Gelidium, Gracillaria và Pterocladia Agar là một polisaccharide gồm 2 phân đoạn: agarose và agaropectin Agarose là một polymer trung tính, tạo nên tính đông của agar Agaropectin là một polymer tích điện âm, làm cho agar có tính nhầy Phân đoạn agarose trong agar chiếm 50 – 90% (Adrian và Assoumani,

1983) Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel, tan ra ở nhiệt độ 60 –

100oC và đặc lại khi nhiệt độ xuống dưới 45oC Từ đây, chúng ta có thể lý giải: pH

trạng thái gel)

Agar là chất trơ nên không phản ứng với các chất trong môi trường, ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật

đặc lại ở nhiệt độ phòng Agar đóng vai trò là chất làm bán rắn hay làm đông môi trường, đóng vai trò làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cây đứng vững trong môi trường nuôi cấy

1.1.11 Sự phát sinh hình thái thực vật

Sự phát sinh chồi bất định

Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, nghiên cứu sự tạo chồi nhằm nhân

nhanh để tạo một số lượng chồi lớn với những đặc tính đồng nhất và giống với cây

mẹ Sự tạo chồi in vitro có thể từ nuôi cấy cơ quan, mô hay tế bào trên môi trường

có hàm lượng cytokinin kết hợp với auxin Tỷ lệ về hàm lượng của hai loại phytohormone này là rất quan trọng Nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì mẫu có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại, nếu nồng độ auxin cao hơn cytokinin thì mẫu có khuynh hướng tạo rễ

Trong sự tạo chồi, hoặc là chồi được tạo trực tiếp hoặc thông qua mô sẹo Các tế bào của mô cấy được cảm ứng bởi môi trường để phản biệt hóa trở về trạng thái sinh mô Những tế bào sinh mô được cảm ứng để có khả năng biệt hóa trở lại tạo một cơ quan chồi mới được gọi là chồi bất định

Chồi thường được cảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi (vùng nhu mô vỏ) nên thường được xem là có nguồn gốc ngoại sinh

Sự phát sinh rễ bất định

Sự tạo rễ trên nhánh cây hoặc chồi in vitro gọi là sự tạo rễ bất định, gồm ít

nhất là hai giai đoạn có thể phân biệt được dưới kính hiển vi (Mai Trần Ngọc Tiếng

và cộng sự, 1980):

 Giai đoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc hoặc chu luân, giai đoạn này ñược khởi phát bởi auxin ở nồng độ cao Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng, đồng thời giúp sự phân hóa của các mô dẫn

 Giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ được kích thích bởi auxin ở nồng độ thấp

Điều quan trọng là nồng độ của auxin kích thích giai đoạn tạo sơ khởi rễ nhưng có thể ức chế giai đoạn kéo dài rễ và ngược lại

1.2 Giới thiệu sơ lược về Bạc hà

1.2.1 Tình hình nghiên cứu Bạc hà trên thế giới và ở Việt Nam

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ thời xa xưa, người Hy Lạp và La Mã biết cho Bạc hà vào sữa để bảo quản sữa khỏi chua và dùng lá Bạc hà để trợ giúp tiêu hóa Người Do Thái rắc lá Bạc hà trong các hội đường để tạo hương thơm dịu mát khi bước trên lá

Theo nghiên cứu thực vật học thì Bạc hà lục có trước, sau đó là Bạc hà cay

do được lai tạo tự nhiên (Bạc hà cay được chính thức ghi nhận là một giống mới vào năm 1696 và được ghi nhân vào Dược Điển Anh năm 1721)

Năm 1771 tinh dầu Bạc hà bắt đầu được nghiên cứu và sản xuất ở phương

Tây bởi Gaubius

Vài năm sau tiến sĩ Muhiy cho biết: tinh dầu Bạc hà không màu hoặc màu

vàng xanh, có mùi hương đặc trưng và vị hơi đắng Bạc hà chứa nhiều hợp chất như acetate, mentyl, menthone và lượng nhỏ α-pinen, β-phellandrene, terpinene, cineole, ester, limoninecarfon,…

Bạc hà được người Pilgrims đưa sang Mỹ vào thế kỷ XVII Từ năm 1816, Bạc hà được trồng trong vùng Rochester, New York Năm 1840, Bạc hà đã phát triển ở Ohio, Michigan và sau đó là khắp miền Bắc Hoa Kỳ Ngày nay, Bạc hà được trồng tại California, Oregon, Washington và nhiều tiểu bang khác nữa

Năm 1990, Erk và Kitto tiến hành nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh Bạc hà

Nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo của Mentha piperita và mentha spicata

đã được báo cáo nhằm cho phép sản xuất và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp (Lin và Staba, 1961; Wang và Staba, 1963) Huyền phù tế bào đã được báo cáo

sau đó để biến đổi tiền chất vào monoterpene (Aviv và Gulan, 1978; Aviv và etal,

1983)

Triterpene được sản xuất bởi các mô sẹo của Mentha arvensis (Karasawa và

Shimzu, 1980)

Năm 1986, Rech và Pires nghiên cứu nhân chồi từ chồi nách của mentha spp

bởi các kỹ thuật nuôi cấy mô

Năm 1986, Repcakoa và cộng sự nghiên cứu vi nhân giống Mentha piperita

L thông qua nuôi cấy mô Herba hungarica

Năm 2000, Shanany và cộng sự nghiên cứu sự tương quan của tinh dầu Bạc

hà nuôi cấy in vitro và trong tự nhiên

Năm 2013, Maity nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro Mentha arvensis L

thông qua nuôi cấy mô sẹo

của tinh dầu Mentha piperita L và so sánh nó với tinh dầu bạc hà tổng hợp trên Aspergillus niger

Năm 2014, Dar và cộng sự tiến hành sàng lọc hóa thực vật và khả năng

chống oxy hóa của rễ cây Mentha arvensis L từ khu vực Kashmir

Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Cây Bạc hà đã được trồng nhiều ở tỉnh để khai thác tinh dầu như ngoại thành

Hà Nội, Nam Hà, Quảng Nam, Đà Nẵng, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Long An Năm 1977, nước ta đã tự sản xuất được 50 tấn tinh dầu và 10 tấn menthol chiết xuất

từ tinh dầu Bạc hà mỗi năm

Nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gene và tạo dòng các tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng đang được phát triển (Phan Huy Báo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và cộng sự, 1995; Bùi Ba Đồng, 1995)

Năm 1998, Trần Việt Hưng cho rằng: Bạc hà là vị thuốc cảm thông dụng nhất thế giới trong cuốn “Thuốc Nam trên đất Mỹ”

Năm 2008, Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ đã nghiên cứu khảo sát

hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone ở Mentha arvensis L bằng phương pháp

cây Bạc hà Mentha arvensis L

Năm 2011, Bùi Thị Hồng Gấm và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của bức xạ

gamma lên mô sẹo của cây Bạc hà Mentha arvensis L

1.2.2 Giới thiệu sơ lược về giống Bạc Hà Á Mentha arvensis L

Trên thế giới có 2 loại Bạc hà chính cho 2 loại tinh dầu khác nhau Đã được trồng cách đây khoảng 2000 năm tại nhiều quốc gia khác nhau:

- Bạc hà Châu Á (hay Bạc hà Nam) mọc nhiều ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn

Độ, Brazil Ở Việt Nam, Bạc hà Châu Á mọc hoang nhiều ở Việt Bắc (Lào Cai, Sơn

La, Lai Châu) được di thực về đồng bằng để trồng trọt nhưng không phát triển Do vậy, đã di thực nhiều chủng có năng suất cao hơn như: Bạc hà 974, 975, 976 và Bạc

hà Đài Loan Riêng chủng loài 974 được trồng nhiều ở cả 2 miền Nam Bắc vì chủng này có ưu điểm: chịu hạn, chịu rét, chịu sâu bệnh

- Bạc hà Châu Âu: trồng nhiều ở Anh (vùng Mitsam), Pháp điển hình là giống bạc hà có nguồn gốc Mitsam (Anh) đây là giống lai như vẫn giữ nguyên được tính chất từ thế kỷ XIX đến nay

Vào những năm cuối thế kỷ XIX (1840) và những năm đầu của thế kỷ XX các nước Pháp, Italia, Đức, Bungari, Nam Tư và Liên Xô cũ đã trồng Bạc hà trên diện rộng để lấy tinh dầu và thị trường quốc tế đã có nhiều nước xuất khẩu tinh dầu Bạc hà Trong thời gian này các nước Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên, cũng đã có mặt hàng này xuất khẩu, vào năm 1986 Nhật Bản đã có sản lượng tinh dầu xuất khẩu lớn, chiếm 50% sản lượng tinh dầu toàn thế giới

+ Giống Bạc hà Á phổ biến ở Việt Nam có 2 nguồn gốc:

Bạc hà bản địa: mọc hoang ở các tỉnh Sơn La, Lào Cai, Lai Châu Cây có thể cao đến 1,50 m Thân màu xanh, xanh lục hoặc tím Loại này đưa về đồng bằng trồng cho năng suất cây xanh cao, nhưng hiệu suất tinh dầu và hàm lượng methol trong tinh dầu thấp nên không có giá trị kinh tế Ngoài ra, còn phát hiện các chủng mọc hoang khác ở một số vùng khác nhau, phổ biến nhất là chủng giàu piperiton oxyd và pulegon

Hiện nay ở vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên) có trồng một loại Bạc hà hoa màu trắng hồng, mọc vòng quanh kẽ lá Thành phần menthol trong tinh dầu loài Bạc hà này rất thấp (3,6 – 8,2%), trong khi đó tỷ lệ pulegon lại khá cao (33,0 – 56,5%) Loại này được bán trong vùng để sử dụng làm thuốc

Bạc hà di thực có nhiều chủng loại: Bạc hà 974 là giống Bạc hà 974 được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và các tỉnh phía Nam, Bạc hà 976, Bạc hà Đài Loan, Một số giống đang nghiên cứu TN8 và TN26, Bạc Hà Nhật

Đặc điểm thực vật học

 Rễ:

Rễ Bạc hà thuộc loại rễ chùm Rễ mọc từ các đốt thân ngầm dưới mặt đất và phân bố ở tầng đất có độ sâu 20 – 30 cm Thân ngầm phát triển đến đâu thì bộ rễ lan rộng tới đó Do bộ rễ phân bố nông nên khả năng hút dinh dưỡng và nước yếu cho nên trong trồng trọt phải chú ý đến biện pháp kỹ thuật làm đất trước khi trồng đảm bảo cho đất tơi xốp thông thoáng, việc lên luống tạo tầng đất mặt dày, tơi xốp; tưới nước đủ và trồng mật độ thích hợp là rất cần thiết để cây Bạc hà đạt sinh khối lớn

Rễ cây Bạc hà thích hợp với ẩm độ đất khá cao khoảng 70 – 80 % Tuy nhiên chúng không chịu được ngập úng, kể cả vùng đất úng ngập cục bộ Khi bị úng ngập thường ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cả bộ rễ và các thân ngầm, trong điều kiện ẩm độ đất quá lớn cả thân ngầm và bộ rễ đều có thể bị nấm gây bệnh thối thân, thối rễ

 Thân và cành:

Thân bạc hà là loại cây thân thảo, chiều cao của cây, chiều dài của cành gồm

có nhiều đốt, các đốt ở thân, cành đều có khả năng phát sinh rễ và phát sinh các mầm cành thứ cấp tại các mắt đốt Chiều cao của cây biến động trung bình từ 0,6– 1,2 m và là cây trồng một năm Các mầm cành phát sinh và trở thành đoạn thân trên mặt đất (thân khí sinh) Ở phần thân này mỗi mắt đốt mang một đôi lá, mỗi nách có hai mầm cành (mọc đối nhau từng đôi một, bên dưới mỗi mầm cành có nhiều mầm

rễ và có khả năng phát triển thành các rễ ở một vài đốt gần mặt đất Thân, cành Bạc

hà có góc cạnh khá rõ, màu sắc tuỳ thuộc vào giống (xanh đậm, xanh nhạt hoặc tím) Màu sắc của thân cành cũng tương ứng với màu sắc của lá và hoa

Tuy phát sinh trong đất nhưng các thân ngầm này vẫn tiếp tục phân các nhánh thân ngầm cấp 2 Đốt thân ngầm càng nhiều thì khả năng ra rễ cũng như các nhánh thân càng nhiều Khi phần thân trên mặt đất ở giai đoạn ra hoa thì phần thân ngầm và rễ đã phát triển mạnh đan xen nhau nhiều trong tầng đất mặt từ 0 – 20 cm

 Lá:

Lá là bộ phận chính chứa tinh dầu nên đây là bộ phận kinh tế của cây Bạc hà

Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất, không chỉ thực hiện các chức năng quang hợp, thoát hơi nước mà còn chứa các túi tinh dầu Lá là bộ phận thu hoạch để chưng cất tinh dầu, chiếm 50 % tổng khối lượng phần sinh khí trên mặt đất Tỷ lệ tinh dầu trong lá phụ thuộc vào bản chất di truyền của giống và thường dao động 2 – 6 % so với khối lượng khô

Lá Bạc hà là lá đơn, mọc đối trên thân, có màu xanh hoặc đỏ tím, chiều dài lá

4 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm, phía trên và phía dưới của bề mặt lá đều có các túi tinh dầu, thường thì số lượng túi tinh dầu ở phía trên nhiều hơn Túi tinh dầu ở dạng lông tiết (loại lông ngắn chủ yếu chứa tinh dầu), loại lông tiết dài chủ yếu làm nhiệm vụ che chở cho cây Trên bề mặt phiến lá số lượng túi tinh dầu tăng từ mũi lá đến gốc lá, từ hai bên mép vào giữa phiến lá Trên cây, lá từ đốt thứ 8 từ dưới lên phát triển nhất và chứa nhiều tinh dầu nhất trong cây

 Hoa:

Hoa Bạc hà là loại hoa chùm, hoa lưỡng tính nên có các bộ phận như đài, cánh hoa, nhị và nhuỵ Đài có 5 cánh đối xứng hai bên, màu sắc của cánh hoa có màu tím, hồng nhạt hay trắng Hoa có 4 nhị nhưng chỉ có 2 nhị là phát triển và có hai bao phấn, 2 nhị kia thoái hoá phát triển kém trở thành nhị lép cho nên khả năng thụ phấn thụ tinh thấp Trong điều kiện Việt nam không thể kết hạt được, do đó phương pháp nhân giống Bạc hà chủ yếu là nhân giống vô tính Các loài bạc hà

châu Âu (M piperita L.) là loại ra hoa hữu hạn, các hoa sắp xếp thành cụm trên đầu cành nở hoa trước Bạc hà châu Á (M avensis L.) hoa ra theo hình xim ở hai nách lá

tạo thành vòng và ra hoa vô hạn (các đốt dưới của thân cành ra hoa trước)

Khi Bạc hà bắt đầu có hoa là lúc cho thân lá cao nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg thân lá/ha) và hàm lượng tinh dầu trong lá cao Đây là thời điểm thu hoạch tốt nhất, nếu để trên cây đã có 100% số hoa nở thì năng suất chất xanh giảm

do lá bị rụng ở các đốt ra hoa sớm

Thành phần hóa học

Tinh dầu Bạc hà tinh dầu được chưng cất từ cây Bạc hà Nó là một hỗn hợp

có hàng chục các hợp chất có nguồn gốc khác nhau; trong đó có Menthol và Menthola là thành phần chính

Tinh dầu tập trung chủ yếu trong lá của cây Bạc hà và khối lượng lá thường chiếm khoảng 40 – 50 % tổng lượng phần cây trên mặt đất (thân, cành, lá, hoa, quả)

Hàm lượng tinh dầu trong cây Bạc hà đạt từ 0,50% – 5,6% Sự biến động này phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh Giống Bạc hà châu Âu có hàm lượng tinh dầu cao hơn Bạc hà Châu Á Tuy nhiên do lai tạo hiện nay một số giống Bạc hà Châu Á cũng có lượng tinh dầu cao

Tinh dầu Bạc hà là một chất lỏng linh động trong suốt hoặc có màu vàng

trưng và vị mát lạnh

+ Hoạt chất Menthol và Menthola

tinh dầu chiết xuất thì hai hoạt chất này là một chất rắn dạng tinh thể màu trắng, còn

ở trong tinh dầu chưng ở dạng tự do hay kết hợp Hàm lượng các hoạt chất này trong tinh dầu biến động từ > 80 – 90%

Menthola trong tinh dầu chủ yếu ở trạng thái tự do, phần còn lại kết hợp với acid acetic Loài bạc hà nào có lượng menthola tự do cao sẽ cho chất lượng tinh dầu cao Vì vậy Menthola là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dầu

Điều kiện sinh thái

• Nhiệt độ

Cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 – 27oC, trong thời kỳ ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là 25 – 27oC Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt độ >10oC cây vẫn có thể sinh trưởng được Trong thời kỳ tiềm sinh, bạc hà có thể chịu được nhiệt độ rất thấp dưới -1oC

• Độ ẩm

Cây Bạc hà không yêu cầu ẩm độ một cách nghiêm ngặt, tuy nhiên trồng để đạt năng suất cao về chất xanh và tỷ lệ tinh dầu nên chú ý và coi trọng vấn đề tưới tiêu nước, do rễ cây Bạc hà phát triển ở trên tầng đất mặt nên sức hút nước và dinh dưỡng kém hơn so với các loại cây trồng khác Tưới tiêu, giữ ẩm là cơ sở cho việc tạo năng suất cao của cây Bạc hà quá trình sinh trưởng phát triển của cây cần đảm bảo đủ độ ẩm đất, ẩm độ biến động lớn sẽ gây rụng lá và tích lũy tinh dầu kém

Ẩm độ đất thích hợp là 70 – 75 %, ẩm độ không khí từ 75 – 80 %

• Ánh sáng

Cây Bạc hà rất mẫn cảm với thời gian chiếu sáng (ngày dài, ngày ngắn) và cường độ chiếu sáng mạnh, đầy đủ Để cây sinh trưởng và phát triển bình thường thì yêu cầu độ chiếu sáng trong ngày ≤ 12h Độ dài ngày chiếu sáng 8 – 10 h, cây sẽ sinh trưởng yếu và không nở hoa, hầu hết các dạng thân ngầm không chuyển sang dạng thân khí sinh, số cây trên đơn vị diện tích sẽ làm giảm năng suất chất xanh và lượng tinh dầu Cây Bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng trực xạ Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ, không trồng xen để đảm bảo ánh sáng hợp lý cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt Ở nước ta thời vụ trồng thích hợp nhất là vụ xuân hàng năm

• Đất đai:

Cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước và thoát nước tốt Các loại đất phù sa ven sông suối, các loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho bạc hà Các loại đất có thành phần cơ giới nặng như đất sét, đất không có cấu tượng như đất cát không

thích hợp với bạc hà

Độ pH thích hợp cho bạc hà là 6 – 7,5, trên các loại đất trồng liên tục từ 2 – 3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để giảm tỷ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất

• Dinh dưỡng:

Trong từng giai đoạn sinh trưởng Bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau Chú ý bón phân vào các thời kỳ: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh Nguyên tố potassium cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành)

để không ảnh hưởng tới tích lũy tinh dầu

Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Bạc Hà Á Mentha arvensis L

a) Giá trị kinh tế:

Tinh dầu Bạc hà là nguyên liệu cho công nghiệp dược, chủ yếu trong sản xuất các loại thuốc kháng vi khuẩn (như thuốc đánh răng, thuốc chữa viêm xoang mũi, trán), các loại thuốc làm tan vết bầm dập trên cơ thể, đau xương khớp và thuốc chống cảm lạnh, thuốc chữa loét dạ dày Tinh dầu Bạc hà còn là nguồn nguyên liệu, nguyên liệu phụ cho công nghiệp thực phẩm (như làm rượu, bia, bánh kẹo) và công nghệ chế biến mỹ phẩm Bã dầu khi chưng cất có khối lượng lớn, người ta để thật hoai mục làm phân bón cho cây lúa nước

Diện tích trồng Bạc hà chỉ có một số nước trên thế giới, nhưng nhu cầu để duy trì thì hầu hết có ở các nước nên tinh dầu và dạng hoạt chất của tinh dầu luôn có giá trị nên thị trường ổn định ít mất giá

b) Tình hình sản xuất

 Trên thế giới:

Trên thế giới có nhiều nước trồng Bạc hà để thoả mãn nhu cầu trong nước và xuất khẩu Châu Mỹ trồng nhiều bạc hà nhất, Brazil có diện tích lớn Tỷ trọng xuất khẩu của châu lục này chiếm 70 – 90% của thế giới, sản lượng tinh dầu Bạc hà trên thế giới ước đạt 3000 tấn/năm Châu Á ít trồng chỉ có Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam trồng bạc hà và có mặt hàng xuất khẩu,

 Ở Việt Nam:

Cây Bạc hà Châu Á mọc hoang ở nước ta rất nhiều nhưng tập trung nhiều ở các vùng như: Hoàng Liên Sơn, Tam Đảo, Ba Vì Cây Bạc hà Châu Á được trồng thành vùng ở đồng bằng Bắc Bộ như Hưng Yên, Nam Định, Hà Nam, các vùng ở ngoại thành Hà Nội, Các chủng loại được nhập và trồng phổ biến ở nước ta mang

mã số 701, 974, 976, Các chủng này có thể đạt 60 – 100 lít tinh dầu/ha/năm Điều kiện nước ta rất thích hợp cho trồng Bạc hà, đầu ra của sản phẩm có triển vọng nhưng chính sách và các nghiên cứu về Bạc hà chưa được chú trọng

 Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do hiện tượng bay hơi)

 Thuốc bôi chữa đau răng (có tên là thuốc lỏng Bonain) gồm có một phần Menthol, một phần phenol và một phần cocain

 Nhu cầu hàng năm trong nước khoảng 50 tấn tinh dầu

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

Địa điểm: Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Khoa CNSH – TP – MT, trường Đại Học Công nghệ Tp.HCM

Thời gian tiến hành Đề tài từ tháng 11 / 2015 đến tháng 8 / 2016

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Nguồn mẫu được sử dụng trong đề tài được tạo từ các đoạn thân in vitro, của giống Bạc hà Á Mentha arvensis L in vitro ở phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học

thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh

2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Các thí nghiệm sử dụng môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung thêm đường sucrose, agar, than hoạt tính và bột từ các loại ngũ cốc, nước dừa tuỳ theo từng thí nghiệm

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm