Phân lập nấm trichoderma spp từ nấm linh chi và khảo sát khả năng đối kháng với nấm gây bệnh thán thư trên cây ớt

42 2.3.9 Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh Colletotrichum acutatum trên đĩa petri trong điều kiện invitro.. 44 2.3.10 Khảo sát khả năng đối kháng

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả trong Đồ án là trung thực Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Nhi

tốt nghiệp

Em xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Thị Hai đã tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo sát tiến trình thí nghiệm Em đã học được nhiều điều hay ở cô về lòng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong công việc, và

cả tình yêu thương đối với mọi người

Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Th.S Huỳnh Văn Thành đã tận tình giúp đỡ

và hỗ trợ em trong suốt thời gian thí nghiệm tại trường

Em xin cám ơn anh KS Nguyễn Tấn Đức (Trung tâm Công nghệ sinh học

Tp Hồ Chí Minh) đã giúp đỡ em rất nhiều về chuyên môn, giúp em định hướng tốt trong công việc, cũng như cung cấp công cụ làm việc để em có thể hoàn thành tốt bài luận văn này

Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa và đặc biệt là em Phan Ánh Ngân và anh Nguyễn Thái Minh Hiếu đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng em trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện

Đồ án tốt nghiệp

Con xin gởi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến ba mẹ vì đã hỗ trợ rất nhiều về tinh thần cũng như vật chất, giúp con có thể an tâm thực hiện tốt các thí nghiệm trong thời gian vừa qua

Tp Hồ Chí Minh, Ngày 20 tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Huỳnh Nhi

MỤC LỤC

MỤC LỤC I DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc diểm hình thái 3

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 5

1.1.4 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng 6

1.1.5 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động enzyme chitinase của Trichoderma spp 11

1.1.6 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam 12

1.1.7 Ứng dụng của Trichoderma spp trong nông nghiệp 15

1.2 Giới thiệu về nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt 18

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ớt trên thế giới và ở Việt Nam 18

1.2.2 Nghiên cứu về các loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt 20

1.2.3 Tình hình gây bệnh thán trên ớt do nấm Colletotrichum spp gây ra ở Việt Nam 26

1.2.4 Các biện pháp và kết quả đạt được trong phòng trừ bệnh thán thư ớt 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.2 Vật liệu 31

2.2.1 Nguyên liệu 31

2.2.2 Giống vi sinh vật 32

2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 32

2.2.4 Hóa chất 32

2.2.5 Các loại môi trường 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1 Phân lập nấm Trichoderma spp từ tai nấm linh chi được trồng tại Tp Hồ Chí Minh 35

2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm 36

2.3.3 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh thán thư và tái nhiễm theo quy tắc Koch 37

2.3.4 Xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 39

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma trên môi trường thạch 39

2.3.6 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma spp để thu nhận enzyme chitinase 41

2.3.7 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa enzyme chitinase 41

2.3.8 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase 42

2.3.9 Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh Colletotrichum acutatum trên đĩa petri trong điều kiện invitro 44

2.3.10 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh Colletotrichum acutatum trên trái ớt trong điều kiện invivo 46

2.3.11 Khảo sát tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma với chủng nấm bệnh Colletotrichum acutatum trên cây ớt trồng trong chậu 48

2.3.12 Đánh giá ảnh hưởng của một số hoá chất trừ nấm lên sự sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp 49

2.3.13 Phương pháp xử lý số liệu 50

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Phân lập nấm Trichoderma spp từ tai nấm linh chi và xác định tác nhân

gây bệnh trên cây ớt sừng trâu được trồng tại Tp Hồ Chí Minh 51

3.1.1 Phân lập nấm Trichoderma spp từ tai nấm linh chi gây bệnh tại huyện Hóc Môn, Tp Hồ Chí Minh 51

3.1.2 Xác định tác nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt sừng trâu được trồng tại huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh 54

3.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng, sinh enzyme ngoại bào và đối kháng với nấm Colletotrichum acutatum của các chủng Trichoderma spp 58

3.2.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm Trichoderma T1, T2, T3, T4, T5 58

3.2.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma T1, T2, T3, T4, T5……….………60

3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng nấm Trichoderma T1, T2, T3, T4, T5 61

3.2.4 Khảo sát hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm Trichoderma T1, T2, T3, T4, T5 63

3.2.5 Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma T2 và T4 với Colletotrichum acutatum trong điều kiện invitro 64

3.2.6 Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma T2, T4 với Colletotrichum acutatum trên trái ớt trong điều kiện invivo 67

3.2.7 Khảo sát tính đối kháng của chủng nấm Trichoderma T2, T4 với chủng nấm bệnh Colletotrichum acutatum trên cây ớt trồng trong chậu 70

3.3 Đánh giá ảnh hưởng của một số hoá chất trừ nấm lên sự sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp trong điều kiện invitro 73

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

4.1 Kết luận 76

4.2 Kiến nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loài Colletotrichum spp được ghi nhận là tác nhân gây bệnh thán

thư trên ớt tại nhiều nước trên thế giới 25

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng (nghi ngờ là Trichoderma spp.) đã phân lập được……… 51

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái các chủng Trichoderma spp của Nguyễn Thái Minh Hiếu [10] 53

Bảng 3.3 So sánh đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được và nấm Colletotrichum acutatum theo mô tả của Verma (2006) và Mordue (1979) [6] 55

Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái của Colletotrichum acutatum phân lập ban đầu và sau lây bệnh nhân tạo 57

Bảng 3.5 Đường kính tản nấm Trichodema spp (cm) sau các ngày nuôi cấy 58

Bảng 3.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với Colletotrichum acutatum 64

Bảng 3.7 Tỉ lệ bệnh (%) trên các trái ớt thí nghiệm 67

Bảng 3.8 Chỉ số bệnh (%) trên các trái ớt thí nghiệm 68

Bảng 3.9 Tỉ lệ bệnh (%) trên cây ớt sau các ngày theo dõi 70

Bảng 3.10 Chỉ số bệnh (%) trên cây ớt sau các ngày theo dõi 71

Bảng 3.11 Đường kính tản nấm Trichodema spp ở các công thức sau 3 ngày nuôi cấy 73

Bảng 3.12 Tỉ lệ ức chế (%) Trichoderma spp của thuốc hóa học sau 3 ngày nuôi cấy 73

Bảng 3.13 Các chủng nấm Trichoderma spp được nuôi cấy sau 3 ngày trên môi trường PDA có bổ sung thuốc hóa học 75

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum 3

Hình 1.2 Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp 3

Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên sợi nấm gây bệnh Rhizoctonia solani 8

Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ Trichoderma harzianum 10

Hình 1.5 Các trung tâm xuất nhập khẩu ớt lớn trên thế giới 18

Hình 1.6 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum gloeosporioides 20

Hình 1.7 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum nigrum 21

Hình 1.8 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum capsici 21

Hình 1.9 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum acutatum 22

Hình 1.10 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum coccodes 22

Hình 1.11 Bào tử của các loài Colettotrichum spp 23

Hình 1.12 Một số khu vực và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện trên thế giới 24

Hình 1.13 Vết bệnh thán thư trên trái và lá ớt 26

Hình 2.1 Trái ớt sừng trâu bị bệnh thán thư 31

Hình 2.2 Trái ớt sừng trâu sạch bệnh được mua tại vườn ớt ……… 32

Hình 3.1 Hình thái đại thể của chủng nấm gây bệnh thán thư ớt sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 54

Hình 3.2 Hình thái vi thể của chủng nấm bệnh: (a) Sợi nấm, (b) Bào tử 54

Hình 3.3 Trái ớt sừng trâu trước và sau khi lây nhiễm theo quy tắc Koch 56

Hình 3.4 Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma spp sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 59

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cellulase của các chủng Trichoderma (cm) 60

Hình 3.6 Đường kính vòng phân giải cellulase của năm chủng Trichoderma 61

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma (cm) 61

Hình 3.8 Đường kính vòng phân giải chitin của năm chủng Trichoderma 62

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện hoạt độ enzyme chitinase của các chủng Trichoderma T1, T2, T3, T4, T5 63

Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T1, T2, T3, T4, T5 với nấm Colletotrichum acutatum trên đĩa petri ở 7NSC 65

Hình 3.11 Sợi nấm Trichoderma spp tấn công Colletotrichum acutatum dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại X100 66

Hình 3.12 Trái ớt ở thời điểm phun trước tại 7NSC 69

Hình 3.13 Trái ớt ở thời điểm phun đồng thời tại 7NSC 69

Hình 3.14 Trái ớt ở thời điểm phun sau tại 7NSC 70

Hình 3.15 Các công thức thí nghiệm trên cây ớt ở 11NSC 72

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ớt là một loại rau ăn quả và là loại gia vị không thể thiếu trong bữa ăn của người Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Ngoài ra, ớt còn là nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và là một vị thuốc quý trong y học

cổ truyền có thể chữa hữu hiệu một số bệnh Ớt còn là loại nông sản xuất khẩu có giá trị kinh tế cao của Việt Nam Vì vậy, cây ớt được trồng rộng rãi ở nhiều tỉnh thành trong cả nước Tuy nhiên, năng suất ớt còn khá bấp bênh vì sự gây hại của dịch bệnh Một trong những bệnh hại quan trọng ảnh hưởng tới diện tích trồng ớt ở

Việt Nam là bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp gây ra Trong điều kiện

nhiệt đới ẩm của Việt Nam, bệnh thán thư gây hại rộng khắp các vùng trồng ớt Đặc biệt, vào mùa mưa bệnh phát triển và lây lan rất nhanh Những ruộng bị nhiễm nặng

tỉ lệ bệnh có thể lên đến 70% (Nguyễn Cảnh Trí, 2010) Hiện nay việc phòng trị bệnh thán thư trên ớt chủ yếu là biện pháp canh tác và biện pháp hóa học

Theo quan điểm phòng trị bệnh trong thực tế sản xuất ngày nay là biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp, trong đó có sự phối hợp nhiều biện pháp gồm canh tác, biện pháp sinh học và biện pháp hóa học Đối với biện pháp hóa học có ưu điểm giúp ngăn chặn bệnh hiệu quả trong thời gian ngắn Tuy nhiên biện pháp này cũng tồn tại nhiều khuyết điểm như gây ô nhiễm môi trường, phá vỡ cân bằng sinh thái,

dễ tạo điều kiện cho mầm bệnh hình thành nòi kháng thuốc và tồn lưu thuốc hóa học trong nông sản Hiện nay các biện pháp sinh học (sử dụng các vi sinh vật đối kháng như vi khuẩn vùng rễ, nấm) đang được nghiên cứu và phát triển mạnh, đặc

biệt là các chủng nấm Trichoderma spp đang được sử dụng như một tác nhân phòng trừ bệnh hại cây trồng hiệu quả và phổ biến nhất Tuy nhiên, Trichoderma

spp chủ yếu được phân lập từ đất và để phòng trừ nấm gây hại cây trồng có trong

đất (Trần Thị Miên, 2008) Vì vậy, cần phải tìm kiếm các loài nấm Trichoderma có

ổ sinh thái khác với đất để sử dụng trừ nấm Colletotrichum spp gây hại ớt là rất cần

thiết Xuất phát từ yêu cầu trên, sinh viên thực hiện đề tài “Phân lập nấm

Trichoderma spp từ nấm linh chi và khảo sát khả năng đối kháng với nấm gây

bệnh thán thƣ trên cây ớt”

2 Mục đích nghiên cứu

Tìm kiếm các chủng nấm Trichoderma spp có khả năng khống chế nấm

Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt Đồng thời bổ sung các chủng mới cho bộ

sưu tập nấm Trichoderma spp của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường

đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

3 Mục tiêu nghiên cứu

– Thu thập được các chủng nấm Trichoderma spp kí sinh trên nấm linh chi

– Xác định được tác nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt

– Tuyển chọn được chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm

Colletotrichum hại ớt

– Xác định ảnh hưởng của một số loại thuốc hóa học đến nấm Trichoderma để

khuyến cáo cho sản xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp

1.1.1 Phân loại

Các chi Trichoderma được mô tả bởi Christiaan Hendrik Persoon năm 1794,

nhưng các nguyên tắc phân loại vẫn khó xác định Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính Năm 1801, Persoon đã xác định

Trichoderma thuộc phân loại:

Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong

đất, trên vỏ cây mục nát Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng

rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Khi quan sát hạch nấm

hay chồi mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma

(Klein và Eveleigh,1998) Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài

Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau Nhìn chung các loài Trichoderma xuất

hiện ở vùng đất trung tính hoặc kiềm

Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài Bào tử đính ở đỉnh của cành Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W

< 1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm

Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 –

9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998) Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này mất dần đi Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và

mật độ phân bố cơ học của Trichoderma

Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan

đến hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất Độ nhạy của đất kháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acide Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh Thiết lập quần thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau Khi sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh hưởng nhiều bởi thành phần môi

trường đất Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất)

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà

Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất

dinh dưỡng Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống

sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên

Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Nguyễn Hoàng Anh, 2013)

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là

monosaccharide, disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm

Trichoderma dễ sử dụng nhất, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta

thường bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến

khả năng sinh trưởng của Trichoderma (Gary, 2005)

Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 300C, có một vài loài Trichoderma tăng

trưởng được ở 350C Một số ít phát triển tốt ở 400C Trichoderma phát triển tốt ở đất

có độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt ở pH trung tính (Vũ Triệu Mân, 2007)

Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí

hậu ấm áp Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá trình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa Tác động của ánh sáng trên

nấm đã là chủ đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998) Quá trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác

nhau: thiếu dinh dưỡng hoặc ánh sáng Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát

triển trong cảm ứng tối do thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết Mặt khác, việc hình thành bào tử được cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển trong tối, trước khi để chiếu sáng (Gary, 2004)

1.1.4 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng

Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại các loài nấm gây

hại như: Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp.,

Botrytis spp và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở

cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu,

cà rốt, cà chua (Bùi Xuân Đồng, 1982)

Nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác

nhau: ký sinh, tiết kháng sinh để tiêu diệt nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh nơi sống với nấm bệnh (Gary, 2004)

1.1.4.1 Cạnh tranh

Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV

Thiếu dinh dưỡng là được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến Trichoderma

cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores)

Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Botrysis spp

và Sclerotina spp gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử

dụng chúng làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe) Nấm

Trichoderma sử dụng những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng,

bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm

Botrysis spp và Sclerotina spp Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch

tiết của cây với nấm Pythium spp do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào tử Pythium spp không thể nảy mầm

Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm

nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009)

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự

tăng trưởng khác với nấm bệnh T harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis

cinerea (gây bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân

gây bệnh tại những vùng bị nhiễm (Gullino, 1992) Sivan và Chet (1989), đã chứng

minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế chính được T harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F oxysporum

1.1.4.2 Kí sinh (Nguyễn Thái Minh Hiếu, 2014)

Là hiện tượng "giao thoa sợi nấm" Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây

xung quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm Cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng

ngoài của nấm bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh

Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm

gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm Trichoderma xâm

nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ Điều này dẫn đến hiện tượng chất nguyên sinh

ở sợi nấm vật chủ bị phá rối từng phần hoặc hoàn toàn

Hình 1.3 Hệ sợi nấm Trichoderma kí sinh trên sợi nấm gây bệnh Rhizoctonia solani

(Agrios, 2005)

Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải

phóng các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma Một điều quan trọng cho

sự ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bào tử của nấm

Trichoderma sau khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật

chủ và phải hình thành được thể giác bám Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ Tỷ lệ ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự

tiếp xúc trực tiếp của nấm Trichoderma với nấm vật chủ

1.1.4.3 Tiết kháng sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Hoàng Anh, 2013)

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và

ký sinh đã làm cho nấm bệnh chết Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc

của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh Howell (1987), thấy rằng những chủng T virens đột biến mất khả năng ký

sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm

bệnh R solani tương đương với chủng tự nhiên Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh

không là cơ chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể Sự sinh kháng

sinh cũng là một trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma Nó là một

trong những cơ chế chính đối với điều khiển sinh học Những kháng sinh này có thể

ức chế mạnh sự sinh trưởng của những VSV khác

Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau Chúng gồm:

– Gliotoxin: Chất kháng sinh này được R Weindling và O Emerson mô

tả năm 1936 do nấm T lignorum sinh ra Gần đây được xác định lại là do nấm T

virens sinh ra Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều VSV: vi khuẩn, nấm

(Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…)

– Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm

Trichoderma tạo thành trong hoạt động của chúng Chất kháng sinh này được phát

hiện năm 1945 Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật,

có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ, giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm,

được sản xuất từ T virens

– Trichodermin và Dermadin: Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có

trong dịch nuôi cấy loài T koningii và T aureoviride

Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra

có liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones,

butenolides, isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T virens sinh ra

Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một

loạt các hợp chất hóa học Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl - α – pyrone (6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii) peptaibol Chất kháng sinh peptaibols là một chuỗi các oligopeptides của 12-22 aminoacid có chứa nhiều α - aminoisobutyric acid, N-acetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-

terminus do T polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp

enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh, và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh

Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của

Trichoderma từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm

bệnh Ông sử dụng chất kháng sinh được tiết ra từ T harzianum bổ sung vào môi trường nuôi cấy của chủng P ultimum Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) môi trường có chứa kháng sinh 6PP được tiết ra từ chủng T harzianum, ức chế sự phát triển của chủng P ultimum

Hình 1.4 Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được

tiết ra từ Trichoderma harzianum (Lê Thị Huệ, 2010)

1.1.4.4 Tăng khả năng kháng của thực vật

Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn

trong đất, nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất còn có khả năng

kích thích cơ chế tự bảo vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm Trong trường

hợp này, các nấm Trichoderma đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật Nấm Trichoderma còn có tác

dụng tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải chất xơ, chitin,

ligin… trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng (Susanne và ctv, 2007)

Các chủng đặc trưng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mô rễ,

sau đó bắt đầu làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều

này được xem như là phản ứng phòng vệ của cây Khi bón T harzianum vào rễ cây đậu cho thấy rằng giảm được từ 25% - 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra Các nhà khoa học đã sử dụng T harzianum T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua, và thấy rằng chủng

T harzianum T39 ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay ở giai đoạn đầu và

giảm đến 30% tổn thương cho cây (Audenaert và ctv, 1998) Theo Yedidia và ctv

(1999), thì sự kích hoạt hệ thống phòng vệ của cây có liên quan đến rễ cây được xử

lí với T harzianum T-203 Những rễ được bổ sung chủng T-203 cho thấy hoạt tính

chitinase, β-1,3-glucanase, cellulase và perosidase cao hơn so với đối chứng không

xử lí trong 72 giờ Còn những cây dưa leo được xử lí với 2,6 - dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ thống phòng vệ của thực vật, cho thấy cũng có

những phản ứng diễn ra nhưng không giống với khi xử lí bằng T harzianum Theo Khan và ctv (2001) thì T hamatum chủng 382 kích ứng hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây ra (trích dẫn bởi Trần Thị

Thanh Thuần, 2009)

1.1.5 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hoạt động enzyme chitinase của Trichoderma spp

Trichoderma spp có khả năng phân giải vách tế bào nấm Harran (2004) đã

khảo sát cơ chế phân tử của enzyme phân giải liên quan đến hoạt động kiểm soát

sinh học của Trichoderma harzianum Sự thủy phân vách tế bào nấm chủ yếu dựa

vào hoạt tính của enzyme chitinase, glucanase và protease Sau khi bám và quấn quanh nấm bệnh, sợi nấm của nấm kí sinh tạo lỗ hổng trên vách của sợi nấm ký chủ Màu sắc của sợi nấm ký sinh thay đổi và phát huỳnh quang mạnh bởi sự kết hợp của fluorescein isothiocyanat với lectin gắn vào chitotriose hoặc với calcoflour White

Cả phức hợp này được gắn với B – glucan và oligomer N – acetyl – D – glucosamine Hiện tượng này được nhận định do enzyme phân giải được tiết ra tại

vị trí tiếp xúc bởi Trichoderma harzianum khi phân hủy vách của R solani và S

rolfsii Nếu có sự hiện diện của cycloheximid, hiện tượng đối kháng bị ngăn chặn và

hoạt tính của enzyme bị suy giảm Hoạt tính của enzyme chitinase cũng được tìm

thấy khi Trichoderma tấn công R solani và S rolfsii trong môi trường đất

T harzianum có khả năng tấn công lên nấm bệnh thì tiết B – 1,3 – glucanase

và chitinase nhiều hơn những chủng không có khả năng tấn công nấm bệnh, khả

năng đối kháng của R solani khi bị T harzianum tấn công cũng đã được nghiên cứu Sợi nấm T harzianum khi xâm chiếm vào hạch của S rolfsii và tạo lỗ trên bề

mặt của hạch này, cuối cùng làm thay đổi hình dạng và làm biến mất tế bào chất của

nó Các chủng Trichoderma khác nhau tùy thuộc vào hoạt tính enzyme thủy phân

được để tấn công sợi nấm của các loại nấm bệnh (Tô Duy Khương, 2004)

1.1.6 Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp trên thế giới và

ở Việt Nam

1.2.6.1 Trên thế giới

Hiện nay Trichoderma spp đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như

không được đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật Các chế phẩm nấm

Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có

hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây (Nguyễn Kim Vân, 2009)

Trên thế giới có một số sản phẩm nấm Trichoderma được đưa vào ứng dụng tính đối kháng nấm bệnh trên một số cây trồng Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa Trichoderma harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani,

Sclerotium rolfssim, Pythium Sản phẩm Trichopel (New Zealand) chứa nấm Trichoderma harzianum đối kháng với nhiều nấm bệnh Sản phẩm Ecofit (India)

chứa nấm Trichoderma viride trong phòng chống nấm Fusarium, Pythium,

Rhizoctonia, Macrophomia, Phytophthora trên cây bông vải, thuốc lá, cao su,… và

nhiều loại rau Sản phẩm BINAB-T-WP (Thụy Điển) chứa 2 loại nấm Trichoderma

harzianum và Trichoderma polysporum trong phòng chống các bệnh ở rễ cây

Ngoài ra, còn có rất nhiều sản phẩm khác ở nhiều nước trên thế giới được ứng dụng rộng rãi trong phòng chống nhiều loại bệnh do nấm gây ra trên cây trồng (Trần Thị Thanh Thuần, 2009)

Hình 1.5 Một số chế phẩm sinh học từ Trichoderma spp

(http://www.chephamsinhhoc.net/che-pham-bo-sung/che-pham-trichoderma

/trichoderma-bima.html)

Năm 2003, Howell đã thành công trong việc ứng dụng Trichoderma để làm

tác nhân kiểm soát sinh học đối với một số loại bệnh trên cây trồng thương mại

Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy

Năm 2011, Th Kamala và S Indira đã chọn được 21 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum cũng bằng phương pháp đồng nuôi cấy Và ông cũng đã thử nghiệm thành công 4 chủng nấm Trichoderma đối kháng với nấm bệnh Pythium aphanidermatum ở điều kiện nhà lưới

1.1.6.2 Tại Việt Nam

Tuy chỉ mới được nghiên cứu khoảng 20 năm tại Việt Nam nhưng

Trichoderma spp đã có vai trò rất lớn trong lĩnh vực nông nghiệp Các cuộc khảo

sát được tiến hành trên cây lương thực, cây công nghiệp, rau và cây ăn quả ở phía

Bắc và phía Nam của Việt Nam đã chỉ ra rằng: Trichoderma spp là loài phổ biến và

dễ dàng phân lập được từ đất, rễ và các vỏ cây mục nát Trichoderma viride, T

harzianum, T hamatum là những loài chiếm ưu thế ở Việt Nam Một số cuộc khảo

sát với quy mô nhỏ và lớn đã chứng minh các loài nấm Trichoderma có khả năng

ngăn chặn sự phát triển của các loài nấm bệnh và giúp kích thích tăng trưởng cho cây Các cuộc thí nghiệm được tiến hành trên các loại cây như: cây lúa, cây bắp,

đậu phụng, cà phê…với việc sử dụng chế phẩm Trichoderma đã làm giảm đáng kể các nấm gây bệnh như: Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Phytophthora spp., Pythium aphanidermatum và Rhizoctonia bataticola Việc sử dụng chế phẩm

này đạt hiệu quả cao hơn thuốc diệt nấm và duy trì lâu hơn Ngoài ra còn làm giảm rủi ro về sức khỏe, chi phí và thiệt hại về môi trường do tập quán sử dụng thuốc hóa học gây ra Hiện nay, đã có những nỗ lực để mở rộng sản phẩm thương mại

Trichoderma và đã được phát triển bởi các trường đại học, các viện nghiên cứu và

các công ty phân bón (Nguyễn Hoàng Anh, 2013)

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho

thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng

Sông Cửu long và Đông nam Bộ (Xia và ctv, 2001)

Một số đề tài nghiên cứu về nấm Trichoderma ở Việt Nam:

Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “Khảo sát tính đối kháng

của nấm Trichoderma spp đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây

bệnh trên cây lúa và bắp” Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm

Trichoderma spp có khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum

Năm 2010, Hứa Võ Thành Long với đề tài nghiên cứu “Sản xuất bào tử nấm

Trichoderma spp làm thuốc trừ nấm bệnh cây trồng” kết quả thu được là tạo được 2

chế phẩm nấm Trichoderma reesei và Trichoderma harzianum bằng phương pháp

lên men xốp Cả hai chế phẩm này đều có khả năng tiêu diệt được nấm bệnh

Fusarium và Phytophthora

Năm 2010, Trần Nguyên Hà với đề tài “Sử dụng các chủng Trichoderma để

điều khiển sinh học các tác nhân gây bệnh trên cây trồng ở Việt Nam” kết quả là

phân lập được 7 chủng Trichoderma từ một số cây trồng ở Việt Nam có khả năng

kiểm soát tốt các loài nấm bệnh Nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Hòa, Nguyễn Ngọc Anh Thư thuộc viện cây ăn quả miền nam đã phân lập được 3 chủng nấm

Trichoderma cho hiệu quả đối kháng tốt với nấm Phytophthora và Fusarium Hiệu

quả sản phẩm được kiểm tra trên cây ăn quả và cây hoa được kiểm chứng bằng số

khuẩn lạc của nấm Fusarium có trong 1g đất sau khi tưới nấm Trichoderma giảm

rất nhiều so với đối chứng và so với trước khi tưới

1.1.7 Ứng dụng của Trichoderma spp trong nông nghiệp

1.1.7.1 Bảo vệ thực vật

Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp được quan tâm

nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số

nấm gây bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loài Trichoderma spp khác nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau Kết quả là các loài

Trichoderma spp kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau:

Rhizoctonia sp.: gây mục rễ, thân và hạt,…

Sclerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây

Pythium sp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con,…

Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông

Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho

Penicillium diditatum: hỏng trái ở chanh và chuối

Phytophthora sp.: mục rễ, hỏng trái ở ca cao

Chondeostereum purpureum: bạc lá ở đào và mận

Hiện nay các chủng Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế

phẩm sinh học thương mại như: GlioGard – một chế phẩm với thành phần chính là

Trichoderma spp kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh sau: Rhizoctonia sp., Sclerotium rolfsii, Pythium sp., Armillaria mellea, Phytophthora sp., Phomopsis sp., Fusarium sp (Vũ Triệu Mân, 2007)

Ngoài ra, ở New Zealand, người ta còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác

nhau để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch (Esposito, E and Silva, 1998) Ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt

Trong nước, đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm

Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng

hoại mục trước khi bón ruộng 5 - 10 ngày, rồi rải trên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp (Trần Thị Miên, 2008)

1.1.7.2 Cải thiện năng suất cây trồng (Vũ Triệu Mân, 2007)

Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hoá học lâu ngày sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn; các loại giun đất không phát triển được, làm hạn chế độ xốp đồng thời, độ thông khí cần thiết cho rễ cây cũng thiếu hụt Vì vậy, các nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới – thực chất là một sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học, dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón hữu cơ vi sinh này có các tác dụng sau:

Phòng ngừa các nấm gây bệnh thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết cỏ, bệnh nấm sương mai, bệnh đốm nâu… và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục

gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng đục phá thân

Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo

ra hệ rễ cứng cáp hơn Gần đây, khi khảo sát các loài Trichoderma spp ở các lớp đất sâu, người ta còn thấy Trichoderma spp làm tăng số lượng các rễ sâu (các rễ

cách mặt đất khoảng 1m) Điều này góp phần giúp cho các cây lương thực như ngô hay các loài dùng để trang trí như cỏ lát có khả năng chống chịu tốt với hạn hán

Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu ngô có Trichoderma harzianum T-22 kí

sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22

Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nẩy mầm và sự ra hoa Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và

Trichoderma koningii kích thích sự nẩy mầm và tăng trưởng của cây Đối với các

hoa được trồng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng

cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa

Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất; bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng

Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng và kích thích sinh trưởng của cây

Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Trichoderma harzianum còn

có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng Như

vậy, các chủng nấm Trichoderma spp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh

không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong

tự nhiên

1.2 Giới thiệu về nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thƣ trên cây ớt

1.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ ớt trên thế giới và ở Việt Nam (Phạm Đình

Quân, 2009)

Theo tổ chức Nông lương thế giới (FAO, 2003) cây ớt đựợc xem là một trong những cây trồng quan trọng ở các vùng nhiệt đới Diện tích trồng ớt trên thế giới vào khoảng 1.700.000 ha với mục đích lấy quả tươi và khoảng 1.800.000 ha để làm

ớt bột Tổng diện tích 3.729.900 ha cho tổng sản lượng 20.000.000 tấn Các nước nhập khẩu và xuất khẩu ớt quan trọng nhất bao gồm: Trung Quốc, Ấn Độ, Mexico, Thái Lan và Thổ Nhĩ Kì Ấn Độ là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất ớt tiếp theo là Trung Quốc và Pakistan Một số quốc gia có nhu cầu tiêu thụ ớt lớn vì nó tạo thành một phần của các món ăn thuộc các nền văn hóa khác nhau và cũng được sử dụng làm chất tạo màu

Năm 2009, theo thống kê của FAO diện tích trồng ớt trên thế giới khoảng 1.870.000 hecta trong đó châu Á chiếm diện tích cao nhất Ở nước ta, tổng diện tích

Hình 1.5 Các trung tâm xuất nhập khẩu ớt lớn trên thế giới

(http://www.efreshglobal.com/eFresh/Content/Products.aspx?u=chilli_pcer)

trồng ớt khoảng 5.000 hecta cho một vụ trồng tại 18 tỉnh thành từ Bắc vào Nam và

từ vùng cao đến vùng thấp

Việt Nam nằm trong khu vực 80 – 230 vĩ Bắc, chịu ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa, thích hợp cho cây ớt phát triển quanh năm Tuy nhiên, để đảm bảo có năng suất cao, tăng hệ số sử dụng đất, cây ớt thường được gieo trồng vào 2

vụ chính: vụ Đông Xuân (gieo hạt từ tháng 10 đến tháng 2, trồng tháng 1 – 2 và thu hoạch vào tháng 4 – 5, hay tháng 6 – 7) và vụ hè thu (gieo hạt tháng 6 – 7, trồng tháng 8 – 9, thu tháng 7 – 8)

Mặc dù cây ớt nước ta đã được trồng trọt từ lâu đời nhưng chủ yếu tập trung tại các tỉnh miền Trung (Quảng Bình, Quảng Trị), vùng ven đô, khu vực động dân

cư (Hà Nội, Thái Bình, Hải Hưng, Vĩnh Phúc,vv ) Vùng chuyên canh ớt đã được hình thành ở Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Tuy nhiên, diện tích trồng

ớt có thể mở rộng ra đồng bằng Bắc Bộ, đồng bằng sông Cửu Long và miền Tây Nam Bộ Sản phẩm bột ớt hiện đang đứng thứ nhất trong mặt hàng rau – gia vị xuất khẩu

Trong giai đoạn trước năm 1990, nhiều vùng sản xuất ớt lớn được hình thành

để phục vụ cho xuất khẩu ớt Chỉ tính riêng các tỉnh miền Trung, vùng sản xuất hàng hóa có khoảng 3000 ha, có năm lên đến 5.700 ha (1988), đảm bảo mỗi năm sản xuất sang thị trường Liên Xô (cũ) 4.500 tấn ớt bột

Năm 1994 – 1995 Thừa Thiên Huế có diện tích trồng ớt là 600 ha, năng suất trung bình là 10,6 tấn/ha, xuất khẩu khoảng 400 – 500 tấn ớt, ngoài ra còn được xuất theo con đường tiểu ngạch hàng trăm tấn

Hiện nay diện tích trồng ớt của nước ta còn manh mún chưa được huy hoạch Thấy rõ được tiềm năng của thị trường ớt trong tương lai, phục vụ cho chế biến và xuất khẩu, cây ớt là một trong những cây trồng được chú ý phát triển trong giai đoạn tới

1.2.2 Nghiên cứu về các loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư ớt

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Nhiều loài nấm Colletotrichum khác nhau được tìm thấy trên ớt Bốn loài phổ biến là Colletotrichum capsici, C gloeosporioides, C coccodes, C acutatum Hai loài C gloeosporioides, C capsici được tìm thấy tại Thái Lan cũng là hai loài gây hại chính tại Nam Mĩ và châu Á đặc biệt là vùng nhiệt đới của châu Á C

capsici xâm nhiễm trên trái chín còn C gloeosporioides xâm nhiễm trên cả trái

xanh lẫn trái chín (Trần Mỹ Duyên, 2009)

Tại Việt Nam, phổ biến là 2 loài Colletotrichum nigrum và C capsici Cả 2

loài nấm này thường cùng phá hại làm thối trái ớt rất nhanh Về đặc điểm hình thái

và sinh học của 2 loài nấm trên có những khác biệt, song về điều kiện sinh thái, chúng đều sinh trưởng phát triển thích hợp ở nhiệt độ 28 – 300

C và ẩm độ cao Đặc biệt bào tử nấm thán thư có sức sống cao, có khả năng chịu đựng khô hạn, dễ dàng phát tán nhờ gió và côn trùng (Nguyễn Kim Vân, 2009)

Colletotrichum gloeosporioides: Khuẩn lạc trên môi trường PDA có màu

xám Bào tử có dạng thẳng, không màu, hình trụ kích thước 11,2 – 18,5 x 2,7 – 5,0

µm Đĩa áp có kích thước 9,0 x 6,3 µm Khối bào tử có màu hồng cam, đĩa đài có hoặc không có gai cứng, đường kính đĩa đài khoảng 500 µm (Lê Thị Kim Huyên, 2013)

Hình 1.6 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum gloeosporioides

(http://www.forestryimages.org/)

Colletotrichum nigrum: Đĩa cành nấm đường kính từ 120 – 180 µm, có nhiều

lông gai đen nhọn ở đỉnh, kích thước 55 – 190 x 6,5 – 65 µm, bào tử phân sinh hình bầu dục hoặc hình trụ hai đầu tròn, không màu, đơn bào và kích thước là 18 – 25 x

3 µm Cành bào tử phân sinh ngắn hình gậy, kích thước 20 – 50 x 25 µm (Trần Đức Vinh, 2013)

Hình 1.7 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum nigrum

(http://www.mycologia.org/content/105/4/844.full.pdf)

Colletotrichum capsici: Đĩa cành nấm có đường kính 70 – 100 µm có lông

gai đen màu nâu sẫm, đỉnh có màu hơi nhạt có nhiều ngăn ngang và dài tới 150 µm Bào tử phân sinh không màu, đơn bào, hơi cong như hình lưỡi liềm, kích thước 17 –

28 x 3 – 4 µm có giọt dầu bên trong (Trần Đức Vinh, 2013)

Hình 1.8 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum capsici

(http://hotronongdan.org.vn/vn/default.aspx?n=243&c=13513)

Colletotrichum acutatum: Khuẩn lạc có màu hơi cam, sợi nấm mỏng manh

Bào tử hình gậy, không vách ngăn, một đầu cùn, kích thước 8 – 16 x 2,5 – 4 µm, không có gai cứng Đĩa áp có kích thước 6,5 – 11 x 4,5 – 7,5 µm (Lê Thị Kim Huyên, 2013)

Hình 1.9 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum acutatum

(http://hotronongdan.org.vn/vn/default.aspx?n=243&c=13513)

Collectotrichum coccodes: Bào tử hình trụ, nhọn ở 2 đầu, kích thước 16 – 22

x 3 – 4 µm Đĩa áp hình chùy, dài, màu hơi nâu, không đều, kích thước 11 – 16,5 x

6 – 9,5 µm, trong điều kiện tối C coccodes có khả năng hình thành gai cứng trong

môi trường PDA [29]

Hình 1.10 Đặc điểm hình thái nấm Colletotrichum coccodes

(http://www.mycologia.org/content/105/4/844.full.pdf)

Collectotrichum sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên

cuống bào tử trong dạng thể quả được gọi là cụm cuống bào tử Cụm cuống bào tử

có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong và bào tử trong suốt Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh (Lê Thị Kim Huyên, 2013)

Hình 1.11 Bào tử của các loài Colettotrichum spp

(http://www.efreshglobal.com/eFresh/Content/Products.aspx?u=chilli_pcer)

1.2.2.2 Phổ kí chủ

Nấm Colletotrichum spp là loài nấm gây hại phổ biến ở khắp nơi trên toàn

thế giới và tấn công trên nhiều kí chủ như: họ bầu bí dưa, họ cà, hành, đậu, xoài… Bệnh thán thư gây hại chủ yếu trên trái, đặc biệt ở giai đoạn chín (Phạm Đình Quân, 2009)

Độ dày của biểu bì và vỏ quả có mối tương quan nghịch với tỉ lệ bệnh Giống trái to, vỏ dày ít bị nhiễm bệnh, trong khi đó trái ớt có trọng lượng nhỏ, vỏ mỏng thì

bị ảnh hưởng nhiều hơn Trái xanh ít nhiễm bệnh hơn trái chín Hàm lượng sáp trên

bề mặt trái xanh cao hơn trái chín dẫn đến khả năng kháng bệnh thán thư cao hơn trái ớt chín Mầm bệnh có thể lan truyền qua hạt và tồn tại trên xác bã thực vật và

những cây kí chủ khác như cây họ cà, dưa leo Vì vậy mà mầm bệnh sẽ tăng lên nếu trồng liên tục giữa các cây cùng họ như cà chua, khoai tây Ngoài ra, khả năng gây

hại của nấm Colletotrichum spp còn tùy thuộc vào chủng nấm và điều kiện ở địa

phương (Lê Thị Kim Huyên, 2013)

Bệnh do nhiều loài nấm Colletotrichum spp gây ra tại nhiều khu vực trồng ớt

tại nhiều quốc gia trên thế giới

Khu vực và thời điểm xuất hiện bệnh thán

thư ớt trên thế giới

Hình 1.12 Một số khu vực và mùa mà bệnh thán thư xuất hiện trên thế giới (Lê Thị

Kim Huyên, 2013)

Bảng 1.1 Một số loài Colletotrichum spp được ghi nhận là tác nhân gây bệnh thán

thư trên ớt tại nhiều nước trên thế giới (Lê Thị Kim Huyên, 2013)

Quốc gia / khu

1.2.2.4 Triệu chứng nhận biết bệnh thán thư trên ớt do nấm Colletotrichum spp gây

ra (Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về khảo nghiệm trên đồng rượng hiệu lực phòng

trừ bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) hại ớt của các thuốc trừ bệnh, 2014)

Bệnh gây hại trên thân, lá, quả và hạt, nhưng chủ yếu là gây hại trên quả vào giai đoạn chín Biểu hiện ban đầu của bệnh là có đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên bề mặt

vỏ quả, sau 2 – 3 ngày kích thước đường kính mô bệnh có thể đạt đến 1 cm Vết bệnh lúc ấy thường có dạng hình thoi, lõm và phân ranh giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết bệnh

Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm cho quả bị thối, vỏ khô và có màu trắng vàng bẩn Nấm có thể gây hại trên một số chồi non, gây hiện tượng thối ngọn ớt Chồi bị hại có màu nâu đen, bệnh có thể phát triển nặng làm cây bị chết dần hoặc cây có quả nhưng ít và kém chất lượng Trên những trái ớt đã lớn, khi bị nhiễm bệnh, thường có những vết lõm xuống, hình vòng tròn và hơi ướt Khi gặp thời tiết thuận lợi, bệnh lan rất nhanh, vết bệnh có màu nâu nhạt đến đậm, vết bệnh thường có những hạch bào tử màu vàng Ngoài ra bệnh còn xuất hiện trên cây con, gây chết rạp lá ớt và gây lốm đốm

1.2.3 Tình hình gây bệnh thán trên ớt do nấm Colletotrichum spp gây ra ở Việt Nam

Bệnh gây hại nặng ở các vùng trồng ớt ở nước ta, tỉ lệ bệnh có thể lên đến 70%, bệnh gây hại chủ yếu trên trái, đặc biệt vào giai đoạn chín (Triệu Vũ Mân, 2007)

Hình 1.13 Vết bệnh thán thư trên trái và lá ớt

(http://baovethucvatcongdong.info/vi/bvtv/sudungthuoc/khac/)

Tất cả các vùng trồng ớt tập trung thuộc Hà Nội, Bắc Giang, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế đều bị bệnh này phá hủy nặng Đối với bệnh thán thư những nghiên cứu ở nước ta còn chưa nhiều Theo Ngô Bích Hảo (1991) nguyên nhân gây

bệnh thối trái ớt là do 2 loài nấm Colletotrichum nigrum và Colletotrichum capsici

Bệnh thường xuất hiện và gây hại nặng vào giai đoạn đang thu hoạch quả, nhiệt độ trung bình là 28 – 300C, độ ẩm 85 – 90%, mưa nhiều Bệnh hại nặng vào tháng 4, 5, 6 (TLB 80% - Huế), tháng 6, 7, 8 (TLB 20% - Hà Nội) Vào thời điểm nhiệt độ 200C bào tử nấm nảy mầm với tốc độ nhanh

Khả năng nhiễm bệnh của Colletotrichum nigrum trên ớt Chìa vôi Huế là rất

mạnh Các nấm ở các vùng sinh thái khác nhau có khả năng nhiễm bệnh khác nhau

Sự phân bố và mức độ gây hại của hai loài nấm C nigrum và Colletotrichum

capsici có sự khác nhau Ở vùng trồng ớt tỉnh Thừa Thiên Huế và Hà Nội, loài C nigrum là phổ biến, ngược lại ở Hải Dương, Hưng Yên, Hà Bắc loài Colletotrichum capsici phổ biến hơn Tuy nhiên, cả hai loài cùng phá hại mạnh vào cuối giai đoạn

sinh trưởng của ớt ở khắp các vùng trồng, cây ớt đặc biệt mẫn cảm với giai đoạn quả già và chín Quả càng già tỉ lệ nhiễm càng cao Ở quả xanh tỉ lệ nhiễm bệnh là 8,64%, quả ươm là 23,9% và quả chín là 44,47% (Gary, 2004)

Trong vụ xuân hè 2008, tại vùng Hà Nội và phụ cận đã xác định có hai loài

gây bệnh thán thán thư trên ớt đó là Colletotrichum nigrum và Colletotrichum

gloeosporioide xuất hiện và gây hại trên ớt phổ biến hơn loài Colletotrichum capsici (Trần Thị Miên, 2008)

1.2.4 Các biện pháp và kết quả đạt được trong phòng trừ bệnh thán thư ớt

Công tác phòng trừ bệnh thán thư hại ớt tại các vùng trồng chưa thực sự mang lại hiệu quả do những hiểu biết về bệnh thán thư của người trồng ớt còn hạn chế, việc gieo trồng các giống ớt liên tục nhiều năm đã tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh thán thư bùng phát mạnh gây khó khăn cho việc phòng trừ

Một số biện pháp pháp phòng trừ bệnh thán thư ớt:

1.2.4.1 Biện pháp hóa học (Nguyễn Thị Hai, 2014)

Là biện pháp dễ sử dụng và có hiệu quả nhanh Tuy nhiên, biện pháp hóa học lại gây ô nhiễm môi trường, để lại dư lượng hóa chất trong nông sản gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng Vì vậy, giảm sử dụng thuốc hóa học là xu thế hiện nay trong sản xuất nông nghiệp Một số thuốc phòng trừ bệnh thán thư ớt: Score 250ND/EC, Daconil 75 WP, Melody duo 66,75WP, Lilacter 0,3 SL, CocMan

69 WP, Sat 4 SL, Bactecide 0AS, 60WP

1.2.4.2 Biện pháp canh tác (Nguyễn Thị Hai, 2014)

Vệ sinh đồng ruộng chiếm một vị trí quan trọng trong hệ thống phòng trừ tổng hợp, thu gom và tiêu hủy triệt để toàn bộ các bộ phận của cây bị nhiễm bệnh thán thư Tiến hành luân canh với cây trồng khác không thuộc họ cà: làm đảo lộn môi trường sống của dịch hại khiến chúng không thể sinh sống hoặc bị chết

1.2.4.3 Sử dụng giống chống chịu bệnh (Trần Mỹ Duyên, 2009)

Bệnh thán thư hại ớt là một loại bệnh nguy hiểm và khó phòng trừ, do đó hướng chọn tạo giống ớt chống chịu bệnh là một yêu cầu cấp bách hiện nay Nghiên cứu này được triển khai từ đầu năm 1990, 73 giống được thu thập từ những giống gieo trồng trong sản xuất và cả những giống ớt dại Sau khi khảo sát, các tác giả đã chọn được giống Chìa vôi là giống đang sử dụng rộng rãi trong sản xuất ở các tỉnh miền Trung có năng suất cao, phẩm chất ngon; các giống Chỉ thiên Huế (dạng hoang dại) của Việt Nam và Ấn độ có khả năng chống chịu tốt với các loại bệnh, trong đó có bệnh thán thư

của mầm sâu bệnh; ngộ độc thực phẩm; lưu tồn thuốc trong nông sản; ô nhiễm môi trường; và tăng chi phí sản xuất Một trong cách khắc phục trở ngại này là chuyển

từ biện pháp hóa học sang biện pháp khác

Phòng trừ bệnh thán thư trên ớt trong nhiều năm lệ thuộc vào thuốc hóa học cũng phát sinh nhiều vấn đề, cần thay thế bằng biện pháp khác có hiệu quả trên đồng ruộng Phòng trừ bệnh thán thư trên trái ớt bằng các loại thuốc gốc thảo mộc

trích từ củ, thân và lá của cây xương bồ (Acorus calamus L.), dầu cây sả hồng (Cymbopogon martinii), lá cây hương nhu tía (Ocimum sanctum), lá cây sầu đâu (Azadirachia indica) có thể hạn chế phát triển của nấm bệnh thán thư trên ớt

(Jeyalakshmi và Seetharama, 1998; Korpraditskul và CTV., 1999) Phòng trừ sinh học bằng vi sinh vật được cho là gần gũi với thiên nhiên và thân thiện môi trường so

với các thuốc trừ nấm đang sử dụng (Baker and Paulitz, 1996) Trichoderma và các

chế phẩm của nó được nghiên cứu và sử dụng ở nhiều nước để phòng trừ bệnh thán thư hại ớt

Nấm Trichoderma được cho là biện pháp hiệu quả dễ tiếp nhận vì nó phổ

biến, dễ nuôi cấy, nhân nhanh trên nhiều loại môi trường và tiêu diệt được nhiều loại nấm bệnh do nó tác động như là vi ký sinh (mycoparasite), cạnh tranh hữu hiệu nguồn thức ăn và địa bàn phát triển, sản xuất chất kháng sinh và có hệ thống enzyme có khả năng tấn công được nhiều chủng loại nấm bệnh (Islam và

CTV., 2008) Hơn nữa, Trichoderma còn ngăn cản hay phân hủy chất pectinases và

các enzymes khác của nấm bệnh giúp chúng xuyên qua biểu bì lá (Zimand và CTV.,

1996) Tác động mạnh nhất của các dòng Trichoderma là tạo ra lytic enzymes trên

vách tế bào và biến dưỡng thứ cấp chống lại nấm bệnh (Rahma và CTV., 2009) Do

đó có nhiều nghiên cứu về chất ly trích từ thảo mộc và nấm Trichoderma ngăn chặn nảy mầm của bào tử và phát triển ống mầm nấm bệnh thán thư C capsici

Tác động của các dòng nấm Trichoderma với nồng độ 2000 mg/l trên sự nảy mầm của bào tử nấm C capsici có kết quả cao nhất là T harzianum, T virens và T

pseudokoningii Các dòng nấm này ức chế phát triển sợi nấm trong đất, trên thân lá

và trên hạt (Phạm Đình Quân, 2009)

Ngoài Trichoderma, các nhà khoa học còn phân lập được một số dòng xạ khuẩn Streptomyces spp thử nghiệm trên dòng nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư trên trái ớt Thuốc trừ nấm sinh học gốc xạ khuẩn Streptomyces khống chế

bệnh thán thư trên ớt rất hiệu quả trong điều kiện nhà lưới nhưng khi đưa ra ngoài đồng còn biến động do nó phụ thuộc vào điều kiện bảo quản trước khi sử dụng (Kolombet et al., 2008) Những thuốc trừ nấm sinh học khác như Bio-CG, Bio-

CLT và Bio-T được sản xuất từ Chetomium globosum N0802, Ch lucknowense CLT và Trichoderma harzianum PC01, đều kích thích tăng trưởng, làm tăng năng

suất ớt vì có tác động tương tự (Trần Thị Thanh Thuần, 2009)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Các cây ớt được trồng tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM

Hình 2.1 Trái ớt sừng trâu bị bệnh thán thư