Tạo hạt nano từ chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật và thửñộc tính trên sâu khoang

Hàm lượng ba hoạt chất chính trong dầu và bánh dầu của cây Neem Một số sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ dầu Neem Một số sản phẩm thương mại dùng trong y học Thành phần các chất trong dự

TRƯỜNG ðẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

LỜI CẢM ƠN

đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ựến quý thầy, cô khoa Công nghệ sinh học Ờ Thực phẩm Ờ Môi trường ựã tận tình chỉ dạy và truyền ựạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập tại trường đại học Công Nghệ TP Hồ Chắ Minh đó là những hành trang quý giá giúp tôi bước vào ựời hòa nhập tốt vào xã hội

Và tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc ựến cô đỗ Thị Tuyến Ờ người ựã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình làm thắ nghiệm và viết ựồ án

đồng thời tôi chân thành cảm ơn ựến ban lãnh ựạo Viện Sinh học Nhiệt ựới ựã tạo mọi ựiều kiện ựể tôi có thể thực hiện tốt ựược ựồ án, sự ủng hộ và ựộng viên của bạn bè

và gia ựình trong quá trình thực hiện ựồ án

TP Hồ Chắ Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2015

Võ Phùng Tuyết Thanh

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong bản này là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kì công trình nào khác

Võ Phùng Tuyết Thanh

MỤC LỤC

Trang Lời cảm ơn

Lời cam ñoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng, sơ ñồ và ñồ thị

Danh mục hình

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tổng quan tài liệu về chitosan và nano chitosan 4

1.2.1 Nguồn nguyên vật liệu 13

1.2.2 Phương pháp tách chiết dầu neem 13

1.2.3 Các nhóm hoạt chất của dầu neem 13

1.2.4 Cơ chế tác ñộng của azadirachtin lên côn trùng 15

1.2.5 Mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc 18

1.2.6 Một số nghiên cứu tạo công thức thuốc BVTV từ hạt neem 18

1.2.7 Một số ứng dụng của neem 21

1.2.8 Tình hình nghiên cứu cây neem ở Việt Nam 23

1.3.Sơ lược về vi nhũ tương 25

1.3.1 Giới thiệu 25

1.3.2 Các loại cấu trúc vi nhũ tương 25

1.4.Sơ lược về sâu khoang 28

1.4.2 đặc ựiểm hình thái Ờ sinh học 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Thời gian và ựịa ựiểm thắ nghiệm 32

2.3.1 Phương pháp tách chiết, tinh sạch và xác ựịnh hàm lượng hoạt chất từ nhân

2.3.2 Tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem (CN) bằng phương pháp vi nhũ

2.3.3 Xác ựịnh tắnh chất hóa lý của chế phẩm 38 2.3.4 đánh giá hoạt lực của chế phẩm 40 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1.Chiết tách, tinh sạch, xác ựịnh hàm lượng của azadiractin 43

3.1.2 Xác ựịnh ựộ tinh sạch trên phổ HPLC 46 3.1.3 Xác ựịnh hàm lượng Azadirachtin tổng có trong dầu Neem 47 3.2.Tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem 51 3.2.1 Tạo nguyên liệu dạng dung dịch giàu azadirachtin 51 3.2.2 Kết quả tạo vi hạt nano chitosan mang dầu neem (CN) 53

3.3.Kết quả xác ựịnh tắnh chất hóa lý của chế phẩm 59 3.3.1 Kết quả ựo tỉ trọng và ựộ nhớt 59 3.3.2 đánh giá ựộ bền nhũ tương 60 3.3.3 Kết quả ựánh giá ựộ tạo bọt 60 3.4.Kết quả ựánh giá hiệu lực của chế phẩm lên sâu khoang 61

AZRL (Azadirachtin related limonoid) Hoạt chất Azadirachtin trong nhóm limonoid

Bt Vi khuẩn Bacillus thuringensis

HPLC (High Performance Liquid Sắc ký lỏng cao áp

Chromatography)

JH (Juvenile hormon) Hóc môn trẻ

MIC (Minimum inhibition concentration) Nồng ñộ ức chế tối thiểu

UV – Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến

Hàm lượng ba hoạt chất chính trong dầu và bánh dầu của cây Neem

Một số sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ dầu Neem

Một số sản phẩm thương mại dùng trong y học

Thành phần các chất trong dựng ñường chuẩn Azadirachtin

Thành phần các chất pha ñể ño mẫu

Khảo sát nồng ñộ Chitosan hòa tan trong acid acetic

Khảo sát thời gian khuấy chế phẩm CN

Khảo sát nồng ñộ dầu Neem

Bố trí thí nghiệm

Hỗn hợp dung môi rửa giải mẫu qua cột

Kết quả ñánh giá ñộ bền nhũ tương

Số lượng sâu chết trung bình qua các ngày

Hiệu lực gây chết sâu khoang của chế phẩm CN

Quy trình tách, tinh sạch hoạt chất Azadirachtin

Quy trình thu nhận dịch chiết cồn giàu Azadirachtin từ nhân hạt

Hình Nội dung Trang 1.1

Công thức phân tử của Chitosan

Các nhóm chức của Chitin, Chitosan và Cellulose

Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp khâu mạch nhũ

tương

Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp giọt tụ/ kết tủa

Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ

tương

Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp tạo gel ion

Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp mixen ñảo

Cấu trúc phân tử Azadirachtin“A”

Cấu trúc phân tử Azadirachtin“D”

Cấu trúc phân tử của Nimbin

Sơ ñồ hình thành nhũ tương ñơn lớp và ña lớp

Phương pháp tạo vi nhũ tương

Sâu khoang (Spodoptera litura )

Vòng ñời sâu khoang

Phương pháp nghiên cứu ñề ra ñể tạo chế phẩm CN

Sâu ñược nuôi ñể làm nguồn tiến hành thử nghiệm

Kén sâu

Ngài sâu

Xác ñịnh ñộ tinh sạch Azadirachtin bằng HPLC

Hệ thống máy UV – Vis Agilent

Phần mềm ño quang phổ UV-Visible

Chitosan 2% khuấy 120’ ở các nồng ñộ dầu Neem ñể yên sau 24h

ðộ tự nhũ của nghiệm thức Neem 15%

ðộ tự nhũ của nghiệm thức Neem 20%

ðộ tự nhũ của nghiệm thức Neem 25%

ðộ tự nhũ của nghiệm thức Neem 30%

ðộ tự nhũ của nghiệm thức Neem 35%

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Chitosan là một polysaccharide có ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường Nó ñược sản xuất từ vỏ các loại giáp xác như tôm cua

Việt Nam là quốc gia không những có diện tích vùng biển rộng mà còn có nhiều

ao hồ sông suối nên các ngành nuôi và chế biến thủy hải sản phát triển mạnh và chiếm tỷ trong cao trong cơ cấu ngành kinh tế Trong ñó giáp xác là nguồn nguyên liệu dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng thủy hải sản Hàng năm các nhà máy chế biến ñã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn lên ñến 70.000 tấn/năm Chính lượng phế thải này gây ra hiện tượng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây ảnh hưởng lớn ñến sức khỏe người dân.Việc sản xuất sản sản phẩm ứng dụng từ Chitosan có nguồn gốc từ vỏ giáp xác giúp giảm bớt lượng chất thải này vào môi trường mà còn tạo ra một sản phẩm mới an toàn cho sức khoẻ con người và thân thiện với môi trường

Ngoài ra, nước ta còn là một nước nông nghiệp với sự phát triển kỹ thuật và quy

mô không ñồng ñều, ña số là quy mô hộ gia ñình Nên việc quản lý sử dụng thuốc bảo vệ thực vật rất khó khăn.Việc sử dụng bừa bãi và thiếu hợp lý thuốc trừ sâu tổng hợp ñã dẫn ñến những hậu quả nặng nề như sự kháng thuốc, bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng ñến sự tồn tại và phát triển của các loài thiên ñịch, cũng như gây ra một tác ñộng không nhỏ ñối với môi trường Vì vậy, các hoạt chất có nguồn gốc thực vật từ lâu ñã ñược nhiều nước khuyến khích sử dụng thay cho các loại thuốc trừ sâu tổng hợp

Từ những nghiên cứu và báo cáo ñã cho thấy cây Neem là một ứng cử viên ñầy tiềm năng với hơn 120 hoạt chất sinh học ñược phát hiện Tiêu biểu nhất là Azadirachtin:

Một trong những chất chính có tác ñộng xua ñuổi sâu bọ ở cây Neem, còn gọi là

xoan Ấn ðộ (Azadirachta indica A Juss), là Azadirachtin Nó có tác ñộng xua

ñuổi và gây ngán ăn ñối với nhiều loại côn trùng gây bệnh cũng như một số loại tuyến trùng Ngoài ra Azadirachtin còn có tác ñộng ức chế côn trùng phát triển và

sinh sản thông qua việc kiểm soát và làm thay ựổi sự biến thái bình thường của côn trùng

Nhiều mô hình nghiên cứu tác ựộng của Azadirachtin ựối với cá thể côn trùng ựã

ựược thực hiện (Aritakula và cộng sự, 2007; Dennis, 1992)

Theo các nhà khoa học, hợp chất azadiractin có tác dụng trừ sâu mạnh vì chúng vừa có ựộc tắnh diệt trừ (S.A Rudwandki, 1980) vừa gây ngán ăn (H.Rembold,

1980, vừa có tác dụng làm bất lực và ức chế sinh trưởng (F.A Masous), 1983) Từ

1980, ựã có 8 hội nghị quốc gia và quốc tế ở CHLB đức, Ấn độ, Philippin, Kenya

và Úc khẳng ựịnh giá trị của cây Neem

Các nghiên cứu về nhóm hoạt chất limonoid từ nguồn nguyên liệu cây Neem cũng

ựã ựược thực hiện ở nước ta (Dương Anh Tuấn và cộng sự, 2001; Nguyễn Tiến Thắng và cộng sự 2003; Trần Kim Qui, 2005), chủ yếu liên quan ựến nghiên cứu thu nhận và sử dụng hoạt chất limonoid trong công tác ựấu tranh sinh học, sau thu họachẦ

Từ sau năm 2000, diện tắch trồng Neem phát triển mạnh ở vài tỉnh phắa Nam, ựặc biệt là ở Ninh Thuận và Bình Thuận, trong ựó hang nghìn ha ựã cho quả.Tạo ựiều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và phát triển sản phẩm chứa hoạt chất

azadiractin quy mô công nghiệp

Vấn ựề cơ bản của hai ngành sản xuất nông nghiệp và chế biến thủy hải sản của Việt Nam suy cho cùng vẫn là gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng sức khỏe con người Chắnh từ ựó nảy sinh ý tưởng sử dụng nguồn nguyên liệu ựược sản xuất từ phế thải của ngành chế biến hải sản kết hợp với một chất có hoạt tắnh sinh học ựể tạo nên thuốc bảo vệ thực vật thân thiện với môi trường đó là bước ựầu tiên trong quá trình tiến hành ựề tài: ỘTạo hạt Nano từ Chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật và thử ựộc tắnh trên sâu khoangỢ

2 Mục tiêu của chuyên ựề tốt nghiệp:

Ớ Chiết tách, tinh sạch Azadirachtin trong nhân hạt cây Neem

Ớ Tạo hạt Nano từ Chitosan, ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật chứa hoạt chất Azadirachtin có trong nhân hạt Neem

3 Nội dung của chuyên ựề tốt nghiệp:

Ớ Chiết tách và tinh sạch Azadirachtin trong nhân hạt Neem

Ớ Nghiên cứu tạo Nano từ Chitosan và ứng dụng vào sản xuất thuốc bảo vệ thực vật chứa hoạt chất Azadirachtin có trong nhân hạt Neem

Ớ đánh giá hiệu quả diệt sâu của chế phẩm trong phòng thắ nghiệm

4 Ý nghĩa thực tiễn của ựề tài:

Xây dựng ựược quy trình sản xuất thuốc bảo vệ thực vật mới, góp phần tạo thêm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thảo mộc, thúc ựẩy sản xuất Chitosan từ phế thải trong chế biến thủy hải sản

5 Kết cấu của chuyên ựề tốt nghiệp: gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan tài liệu về Chitosan và nano Chitosan

Chitosan là một polysacchararide mạch thẳng, là dẫn xuất của chitin thông qua quá trình deacetyl hóa Chitosan ñược tạo ra từ các phân tử D- glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β – 1,4 – glycoside nên còn ñược gọi là poly (1,4) – 2 amino – 2 deoxy –

β – D – glucose hoặc poly β – 1,4 – D –glycosamine

Công thức phân tử [C6H11O4N]n

Phân tử lượng MChitosan= (161,07)n

Hình 1.1 Công thức phân tử của Chitosan (Mahapatro và Singh, 2011)

1.1.1.1 Tính chất vật lý

Chitosan là chất xơ giống như cellolose, tồn tại ở thể rắn, có màu từ trắng ngà ñến vàng nhạt, xốp, nhẹ, hình vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị và có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau Chitosan còn có khả năng tạo màng và có ñầy ñủ các tính chất của cấu trúc quang học

Hình 1.2 Các nhóm chức của Chitin, Chitosan và Cellulose

Chitosan là chất không tan trong nước mà tan trong các acid loãng và các acid hữu

cơ như acid acetic Chitosan khi hòa tan trong acid acetic loăng, (thường sử dụng acid acetic 1 - 3 % (Sunil A Agnihotri, 2004)) sẽ tạo thành dạng keo nhớt trong suốt

1.1.1.5 ðộ nhớt

Chitosan là chất có ñộ nhớt cao phụ thuộc vào nhiều yếu tố như ñộ acetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng dộ dung dịch, pH, nhiệt dộ… Trong dung dịch, Chitosan có khả năng tích ñiện dương, vì thế nó dễ dàng kết hợp với những chất tích ñiện âm như lipid và acid mật … (Trần Thị Luyến, 2000; Nguyễn Thị Huệ và Bùi Thị Huyền, 2005)

Chitosan có khối lượng phân tử cao, Chitosan thương mại thường có khối lượng phân tử khoảng từ 1.000.000 – 1.200.000 Dalton Khối lượng phân tử Chitosan có thể xác ñịnh bằng phương pháp sắc ký, phân tán ánh sáng hoặc ño dộ nhớt (Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm)

Nhờ vào khả năng kháng khuẩn và khả năng tạo phức liên kết với kim loại nặng, Chitosan ñược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực ñặc biệt là trong nông nghiệp, y tế, bảo quản thực phẩm, xử lý môi trường…

Trong nông nghiệp, Chitosan ñược ứng dụng chủ yếu trong việc phòng trừ bệnh gây hại cây trồng Ví dụ như chế phẩm Olicide 9DD chứa 9% Chitosan ñã ñược ñăng kí

sử dụng ở nước ta dùng trong việc phòng trừ nhiều loại bệnh hại cây trồng như bệnh ñạo

ôn trên lúa, bệnh thán thư hại ớt, bệnh rỉ sắt hại chè… Theo danh mục bảo vệ thực vật Việt Nam hiện nay có khoảng 20 sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ Chitosan ñã ñăng kí, bao gồm cả dạng hỗn hợp với dạng chất khác

Trong y học, Chitosan ñược sử dụng nhờ ñặc tính kháng khuẩn của nó ñể ñiều trị các bệnh như viêm loét dạ dày, theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu ðức và Hồ Thị Tú Anh (1999) Chitosan ở dạng dung dịch gel 1,7%, pH = 6 có tác dụng ức chế một số chủng Helicobacter pylori, nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC – Minimum Inhibitory Concentration trong khoảng 0,85 ñến 6,8 mg/ml Trong ñiều trị bỏng, Viện bỏng Quốc gia ñã ñiều chế ñược Chitosan phục vụ trong ñiều trị bỏng và ñã ñược ñưa vào sử dụng rộng rãi Các nhà

khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2011) ñã nghiên cứu

sử dụng Chitosan ñể chế tạo gốm y sinh sử dụng trong phẫu thuật chỉnh hình và bước ñầu

ñã ñạt ñược kết quả khả quan Chitosan còn ñược sử dụng ñể làm chỉ khâu trong phẫu thuật, ñiều chế glusosamine hỗ trợ ñiều trị xương khớp…

Trong bảo quản thực phẩm, Chitosan ñược sử dụng ñể tạo màng kháng khuẩn giúp kéo dài thời gian bảo quản Có nhiều nghiên cứu ñã công bố về vấn ñề này tiêu biểu như nghiên cứu của Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Vệ (2008) ñã sử dụng màng Chitosan 0,25% kết hợp với màng PE giúp thời gian bảo quản trái quýt ñường lên ñến 8 tuần, nghiên cứu của Trần Thị Luyến và Lê Thanh Long (2007) sử dụng Chitosan nồng ñộ 1,5% có bổ sung 0,05% Sodium Benzoat hoặc 1% Sorbitol giúp duy trì chất lượng trứng gà ở hạng A trong 15 – 20 ngày sau khi ñẻ (so với trứng gà tươi không bảo quản chỉ duy trì ñược không quá 5 ngày) Chitosan ñã ñược cho phép làm chất phụ gia thực phẩm ở Nhật từ năm 1983 và Hàn Quốc từ năm 1995 (Viện Sinh học – Thực phẩm)

Trong lĩnh vực xử lý môi trường, các nhà khoa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam (2011) ñã sử dụng Chitosan ñể tổng hợp nanocomposit

Fe3O4/CộNG Sự và Al(OH)3/ Fe3O4/CộNG Sự với dung lượng hấp phụ cao , ứng dụng ñể hấp phụ các ion kim loại nặng trong nước và bước ñầu cho hiệu quả khá tốt, mở ra tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực này

Trong các ngành công nghiệp khác, Chitosan cũng ñược sử dụng rộng rãi và ngày càng khẳng ñịnh vai trò của nó trong mọi lĩnh vực Trong công ngiệp sản xuất nước quả, Chitosan ñược sử dụng như chất làm trong thay cho các chất thường sử dụng như gelatin, bentonite, kali caseinat, tannin… (Viện Sinh học - Thực phẩm) Trong công nghiệp sản xuất giấy, Chitosan ñược sử dụng ñể tạo ra giấy có ñộ bền hơn, dai hơn Trong công nghiệp sản xuất bao bì, Chitosan ñược kết hợp ñể tạo nên túi nilon với ñặc tính kháng khuẩn, dễ phân hủy trong tự nhiên, thân thiện với môi trường

1.1.2 Nano Chitosan

Nano Chitosan là Chitosan ñược ñiều chế có kích thước nano và có tính ưu việt vượt trội hơn hẳn so với Chitosan Nano Chitosan có kích thước siêu nhỏ (từ 10 ñến 1000 nm) nên dễ dàng ñi qua màng tế bào, ngoài ra chúng có diện tích bề mặt cực lớn nên ñược ứng dụng rộng rãi trong việc làm chất mang, dẫn truyền hay hấp phụ (Dương Thị Ánh Tuyết, 2011)

Hiện nay có nhiều phương pháp ñể tạo nano Chitosan với những ưu ñiểm riêng Tùy theo mục ñích sử dụng và ñiều kiện thí nghiệm mà người ta lựa chọn phương pháp chế tạo phù hợp Trong ñó có năm phương pháp chủ yếu ñể tạo hạt nano Chitosan (S.A Agnihotri, 2004)[15] là:

a) Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross-linking)

Dung dịch Chitosan ñược phân tán trong dầu ñể tạo thành dạng nhũ tương nước trong dầu (w/o), sau ñó ñược làm bền bằng chất hoạt ñộng bề mặt, cuối cùng mạch nhũ tương ñược khâu lại nhờ tác nhân tạo nối, phản ứng xảy ra ở nhóm NH2 của phân tử Chitosan

Hình 1.3 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp khâu mạch nhũ tương b) Phương pháp giọt tụ/ kết tủa(coacervation/ precipitation)

Phương pháp này dựa vào tính chất không tan trong kiềm của Chitosan, do ñó sẽ

bị kết tủa Dung dịch Chitosan sẽ ñược phun vào dung dịch kiềm ñể tạo hạt nano bằng một thiết bị nén phun

Hình 1.4 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp giọt tụ/ kết tủa

c) Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion-droplet coalescence)

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của cả hai phương pháp tạo nối ngang và kết tủa Hai hệ nhũ tương bền sẽ ñược tạo ra kết hợp với nhau bằng cách khuấy ở tốc ñộ cao, một hệ chứa dung dịch Chitosan cùng với thuốc, một hệ khác chứa dung dịch gồm Chitosan và các giọt NaOH Khi chúng kết hợp với nhau, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên và kết tủa thành những hạt nhỏ

Hình 1.5 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương d) Phương pháp tạo gel ion (ionic gelation)

Phương pháp này dựa trên sự tương tác tĩnh ñiện giữa Chitosan (polycation) và một poly anion Kỹ thuật này khá ñơn giản, ñầu tiên Chitosan ñược hòa tan trong acid acetic, sau ñó ñược trộn lẫn với polyanion bằng cách khuấy liên tục ở nhiệt ñộ phòng ñể tạo hạt nano Chitosan Tỷ lệ giữa nano Chitosan và polyanion sẽ quyết ñịnh kích thước

và diện tích bề mặt

Hình 1.6 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp tạo gel ion

e) Phương pháp mixen ñảo (reserve micellar)

Trong phương pháp này, dầu tiên người ta tạo ra những hạt mixen ñảo bằng cách hòa tan chất hoạt ñộng bề mặt vào dung môi hữu cơ, sau ñó cho từ từ dung dịch chứa Chitosan và giữ nguyên tốc ñộ khuấy ñể hỗn hợp trở thành pha vi nhũ dạng trong suốt Tác nhân tạo nối ngang dược thêm vào và khuấy qua ñêm, cô quay ñể loại dung môi, phần còn lại phân tán trong nước Thêm dung dịch muối ñể kết tủa chất hoạt ñộng bề mặt, sau ñó ly tâm và chiết phần dung dịch ở trên có chứa nano Chitosan, cho qua màng thẩm tích sau ñó ñông khô thu dạng bột

Hình 1.7 Sơ ñồ tạo hạt nano Chitosan bằng phương pháp mixen ñảo

Trong 5 phương pháp trên thì phương pháp tạo gel ion là phương pháp ñược sử dụng phổ biến nhất với ưu ñiểm là ñơn giản, dễ thực hiện và không cần máy móc thiết bị hiện ñại

Nano Chitosan nhờ có kích thước nhỏ, ổn ñịnh, diện tích bề mặt lớn, phân hủy sinh học tốt, khả năng bám dính cao, không ñộc hại nên ñược ứng dụng nhiều ñể làm chất mang, chất dẫn truyền, chất hấp phụ… dùng trong y học, nông nghiệp và các lĩnh vực khác Chitosan ở dạng nano giữ ñược hoạt lực của Chitosan lâu hơn, nhờ có kích thước nhỏ nên dễ dàng ñi sâu vào tế bào, tác dụng kháng khuẩn trực tiếp thông qua cơ chế liên kết với ion trên màng tế bào vi khuẩn dẫn ñến ức chế hô hấp, khả năng bám dính cao hơn

và khả năng hấp phụ tốt hơn Chitosan ở nước ta cũng ñã có những nghiên cứu bước ñầu

về ứng dụng vật liệu nano Chitosan chủ yếu là trong y học và nông nghiệp

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Hà (2011), nano Chitosan có hiệu suất hấp phụ kháng nguyên cúm A/H1N1 cao từ 93,75% ñến 100% và cho ñáp ứng miễn dịch, hiệu giá kháng thể HI cao hơn so với Chitosan và hydroxide nhôm thông thường Cũng trong nghiên cứu này, tác giả cho rằng nano chiotosan có tính an toàn sinh học khi sử dụng làm tá chất cho vaccine cúm A/H1N1 và tốt hơn các tá chất khác trong thí nghiệm Dương Thị Ánh Nguyệt và các cộng sự (2011) ñã tiến hành nghiên cứu chế tạo nano Chitosan làm chất hấp phụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc với hiệu suất hấp phụ ñạt 96,41%, hiệu suất hấp phụ này khá cao và khả năng ứng dụng trong y học là hoàn toàn có thể

Trong nông nghiệp nano Chitosan ñược sử dụng ñể bảo quản các loại nông sản sau thu hoạch Ở Việt Nam, chế phẩm nano Chitosan của trung tâm nghiên cứu Công nghệ Sinh học Biosun ñã ñược chấp nhận và ñược lưu hành trên thị trường với các công dụng chủ yếu như ñiều trị các bệnh rỉ sắt, thán thư, ñặc trị nấm và vi khuẩn có hại trên cà phê, cao su, thanh long…

1.2 Tổng quan về dầu Neem

Dầu Neem ñược sản xuất từ hạt quả Neem Cây Neem tên khoa học là Azadirachta indica A Juss, thuộc họ xoan (Melieae) ñược trồng phổ biến trên thế giới Ở Việt Nam,

cây Neem còn dược gọi là cây xoan chịu hạn hay cây xoan Ấn ðộ ñã ñược trồng thử nghiệm từ những năm 1980 – 1982 ở Ninh Thuận và Bình Thuận với mục ñích phủ xanh vùng ñất cằn cỗi dọc ven biển và chống sa mạc hóa [4, 5].Theo ñánh giá sơ bộ, hiện nay riêng ở các tỉnh phía Nam, ñã ñược trồng trên 5.000 ha Neem, trong ñó có ñến hơn 700

ha cây Neem ñã cho quả ðiều này chứng tỏ cây Neem thích hợp với vùng sinh thái ở phía Nam nước ta, ñặc biệt là với vùng ñất cát khô hạn ven biển, nên việc gia tăng diện tích trồng Neem là dễ dàng thực hiện Qua ñó cho thấy nguồn nguyên vật liệu sản xuất dầu Neem ñã có sẵn trong nước và khá dồi giàu

Quả Neem chín ñược hái trực tiếp trên cây và xử lý ngay trong ngày Hạt ñược làm sạch phần vỏ và thịt quả, sau ñó sấy khô trong tủ sấy ở 50OC, ñể nguội, tách vỏ thu nhân hạt Ép nhân hạt Neem bằng máy ép dầu chuyên dụng KOMET (ðức) với nhiệt ñộ

ép 40 – 45O ñể thu dầu và bánh dầu

Những năm gần ñây, các chất có hoạt tính sinh học của cây Neem ñã ñược nghiên cứu mạnh mẽ Thế giới ñã tổ chức 7 hội nghị quốc tế về cây Neem, ba hôi nghị ñầu chủ yếu ñề cập ñến việc áp dụng dịch chiết thô từ hạt Neem trong phòng thí nghiệm và tiến hành phòng trừ sâu bệnh trên ñồng ruộng Hơn 100 chất ñã ñược tách ra từ các phần khác nhau của cây Neem Nhóm tetranortriterpenoid ñược nghiên cứu nhiều nhất, sau ñó là diterpenoid, triterpenoid, pentanortriterpenoid và một số ít các chất không thuộc nhóm terpenoid (nonterpenoidal ingredients)

Trong dầu Neem và bánh dầu chứa ba hoạt chất chính thuộc nhóm tetranortriterpenoid là Azadirachtin, nimbin và salannin

− Azadirachtin – hợp chất ñược quan tâm hàng ñầu nhờ tiềm năng sử dụng của nó trong kiểm soát dịch hại Azadirachtin có hoạt tính mạnh tác ñộng lên sự ngán

ăn và làm ngừng sinh trưởng của nhiều loài côn trùng, cản trở sự lột xác ở ấu trùng, gây bất thụ và làm ngừng phát triển của trứng, ấu trùng, nhộng Theo bảng phân nhóm ñộc chất của Hoa Kỳ, Azadirachtin thuộc nhóm IV (rất ít ñộc), có ñộc tính thấp ñối với ñộng vật có vú (ở chuột LC50 = 5.000 mg/kg trọng lượng) Hàm lượng Azadiractin có nhiều trong nhân hạt và cũng rất biến ñộng tuỳ thuộc vào kiểu gen, ñiều kiện sinh trưởng và phát triển, tuổi cây thu hoạch trái cũng như kỹ thuật chiết xuất Trung bình 1

g hạt có chứa 2 - 4 mg Azadirachtin (2.000 – 4.000 ppm), một số mẫu nhân hạt Neem

ở Senegal cho hàm lượng azadiractin lên tới 9 mg/g nhân hạt Azadirachtin có công thức phân tử C35H44O16, nhiệt ñộ nóng chảy 154 - 158OC Từ khi cấu trúc phân tử của Azadirachtin ñược xác ñịnh, một số chất ñược cô lập sau này có cấu trúc tương tự ñược coi là dẫn xuất của Azadirachtin và ñược ñặt tên là Azadirachtin + chữ cái B, C, D, ở phía sau tên Azadirachtin theo thứ tự tìm ra Hiện nay có ít nhất 9 hợp chất tương tự Azadirachtin và ñược ñặt tên là Azadirachtin (B,C,D,E,F,G,H,I,K) ñể phân biệt với Azadirachtin gốc ñược gọi Azadirachtin A

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử Azadirachtin“A” Hình 1.9Cấu trúc phân tử Azadirachtin“D”

− Nimbin: là hoạt chất có khả năng kháng virus mạnh, chúng kháng virus X trên cà chua, virus gây bệnh gia cầm, virus gây bệnh ñậu mùa Hàm lượng nimbin

trong nhân hạt Neem trồng ở Srilanka biến ñộng từ 9 - 619 µg/g nhân hạt Nimbin là chất gây ngán ăn mạnh với côn trùng nhưng không có tác ñộng gây ñộc

Hình 1.10 Cấu trúc phân tử của Nimbin

− Salanin ñược xem là chất gây ngán ăn mạng ở nhiều loài côn trùng nhưng không ảnh hưởng ñến sự lột xác Hàm lượng Salannin có trong nhân hạt Neem Srilanka biến ñộng từ 15 - 1247 µg/g nhân hạt

Bảng 1.1 Hàm lượng ba hoạt chất chính trong dầu và bánh dầu của cây Neem

Azadirachtin ảnh hưởng lên sinh trưởng, phát triển, biến thái, sinh sản của côn trùng Những cơ quan khác nhau của côn trùng ñược xác ñịnh là ñích tác ñộng của Azadirachtin theo cơ chế cảm thụ hóa học Các tác ñộng này có liên quan ñến quá trình

kiểm soát nội tiết tố thần kinh của quá trình lột xác và thay lông Nhưng cơ chế tác ñộng vẫn chưa rõ [27, 34, 38]

Việc chọn các cây chủ của côn trùng ăn tạp phụ thuộc vào các chất ñược tạo ra từ cây chủ, trong ñó có những chất ức chế và kích thích, chúng tác ñộng phụ thuộc lẫn nhau Thức ăn ñược côn trùng lựa chọn phụ thuộc vào hệ thống thụ cảm hóa học Các thí nghiệm ñã chứng minh côn trùng có nhạy cảm ñặc biệt ñối với Azadirachtin so với các chất khác Azadirachtin tác ñộng trực tiếp lên thụ cảm hóa học, thông qua hệ thống thần kinh, gây ức chế tiếp nhận thức ăn và tạo cảm giác gây ngán ăn ở côn trùng Một số thí

nghiệm trên côn trùng cánh vẩy (Spodoptera frugiperda, Sf 9) nuôi cấy một lớp cho thấy

Azadirachtin ức chế miền phân chia tế bào và sự hình thành lớp tế bào, làm giảm sự tổng hợp protein Các kích thích ức chế do Azadirachtin cũng rất có ý nghĩa ñối với những loài côn trùng ăn tạp, ñẻ trứng Dịch chiết nhân hạt Neem và dầu Neem có tác ñộng kiềm hãm

sự ñẻ trứng ở nhiều loại côn trùng

1.2.4.2 Cơ chế nội tiết

Nhiều nghiên cứu cho thấy Azadirachtin tác ñộng trực tiếp lên nơi phóng thích hốc môn ñốt ngực trước (PTTH) từ thể hạch thần kinh, ngăn cản phóng thích hóc môn lột xác

từ vòng hạch thần kinh não, làm giảm vòng tuần hoàn và tác ñộng lên tổng hợp hóc môn PTTH (Sơ ñồ 1.1) Azadirachtin còn tác ñộng lên quá trình dị hóa hóc môn lột xác ở côn trùng, hóc môn lột xác ñược chuyển thành dạng hoạt ñộng hơn là 20 - hydroxyecdysone

do ecdisone - 20 - monoxygenase xúc tác Vì vậy, quá trình này là kiểu tác ñộng nữa của Azadirachtin và ñóng vai trò một phần gây ñộc tổng thể ñối với côn trùng [34] Trên ấu

trùng Galleria mellonella, Azadirachtin tác ñộng kích thích tạo hóc môn trẻ hóa và lột

xác, gây sự lột xác quá mức do giải phóng llatotropin thành thể allata, phá vỡ quá trình tạo vỏ chitin và dẫn ñến thay ñổi vòng sinh trưởng, làm côn trùng không sinh sản ñược và

chết Ở ấu trùng Lucilia cuprin, Azadirachtin có tác ñộng gây thoái hóa nhân, tạo khối dị

nhiễm sắc tố và sự thoái hóa tế bào, ảnh hưởng trực tiếp lên sự gián phân trong các ñĩa

phôi, tế bào biểu bì, tế bào mô ruột giữa, gây chết tế bào trong quá trình phân chia ở giai ñoạn sau trung kỳ [36]

Sơ ñồ 1.1 Tác ñộng kiềm hãm trực tiếp lên hệ nội tiết côn trùng của Azadirachtin (BS Pamar và C.M Ketkar, 1996)

(*): ðiểm xảy ra tác ñộng kiềm hãm trực tiếp của Azadirachtin lên các mô, enzyme và các nội quan khác (PTTH: Hóc môn ñốt ngực trước, JH= hóc môn trẻ, TB máu = tế bào máu, TH Kittin = tổng hợp kittin)

TẾ BÀO THẦN KINH TIẾT

Tuyến nội tiết cạnh tim Tuyến nội tiết cạnh hầu

*PTTH*

Tuyến đốt ngực trước

3- Dehydroxyecdysone

Ecdysone 20- Mo ruột giữa

thần kinh Cơ ruột giữa và ruột sau của côn trùng bị Azadirachtin tác ñộng làm phồng lên, thức ăn ñi qua ruột rất chậm, làm côn trùng rối loạn tiêu hóa, rồi chết Ngoài ra, Azadirachtin còn tác ñộng làm giảm bài tiết các men phân giải protein, gây bệnh hoại tử các tế bào biểu mô ở ruột côn trùng Tác ñộng của Azadirachtin lên các ñáp ứng miễn dịch ñược thấy ở R prolixus, khi xử lý với liều 1µg/ml Azadirachtin làm giảm ñáp ứng miễn dịch trong 6 ngày Có thể do thông qua cơ chế nội tiết, Azadirachtin ñiều hòa hệ thống mô tế bào máu, làm giảm năng lực tổng hợp protein ở côn trùng

Các nghiên cứu có hệ thống về mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc, thí nghiệm thử hoạt tính trên tuyến trùng, vi khuẩn, nấm, nhuyễn thể và các loài khác hiện chưa nhiều Các thí nghiệm hóa dược chủ yếu ñược thử bằng dịch chiết thô [17, 23] Một

số thí nghiệm khác cho thấy, những chất không có cấu trúc tương tự như salanin thì hầu như không gây ngán ăn Gốc ester gắn với C-4 ñược cho là ñóng vai trò quan trọng ñối với hoạt tính gây ngán ăn của Azadirachtin, vì tất cả các dẫn xuất không có gốc ester thì chỉ có hoạt tính ức chế sinh trưởng, không có hoạt tính gây ngán ăn

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy hầu như tất cả các bộ phận của cây Neem ñều chứa chất có hoạt tính sinh học, nhưng nhiều nhất vẫn là ở hạt và lá [21]

Cho ñến nay ñã xác ñịnh ñược trên 200 hoạt chất từ hạt cây Neem Dịch chiết nhân hạt Neem ñược sử dụng phổ biến ñể làm thuốc Bảo vệ thực vật do có hoạt tính gây ngán ăn, xua ñuổi, diệt sâu hại Khả năng kháng thuốc của côn trùng với dịch chiết Neem thấp Song, cũng có một số hạn chế như: hoạt chất dễ bị phân hủy, dễ bị oxy hóa, tác ñộng diệt sâu chưa cao Các nghiên cứu nhằm làm tăng phổ tác ñộng, tăng hiệu lực diệt sâu và làm ổn ñịnh hoạt chất ñể tạo thuốc Bảo vệ thực vật từ cây Neem ñang ñược nhiều nhà khoa học quan tâm [22, 32] Các loại thuốc Bảo vệ thực vật có nguồn gốc thảo mộc

hay ñược dùng là pytheryn (từ hoa cúc, Chrysanthemum cinerariaefolium), rotenone (từ cây thuốc cá Deris spp và lonchocarpus spp), nicotin (từ cây thuốc lá, Nicotinia

tobacum), quassin (từ cây Quassia amara và picrasmaexcelsa), ryania (từ cây ryania speciosa), Azadirachtin (từ cây Neem azadirachta indica) Tỷ lệ dùng thuốc Bảo vệ thực

vật thảo mộc khoảng 1% trên tổng số thuốc Bảo vệ thực vật trên thế giới (tính tơi thời ñiểm năm 1996)và hàng năm tăng trung bình từ 10 – 15% (sơ ñồ 1.2)[1, 6, 7, 8]

pyrethrin, bột xà bông, Bt hay Beauveria basiana với chất mang kaolin [28].Thí nghiệm

tiến hành với nhiều công thức hàm lượng Azadirachtin khác nhau (từ 300 ppm – 60.000 ppm), cho thấy Azadirachtin có tính chất hợp lực với các chất khác Azadirachtin tan trong dung môi phân cực (methanol, acetone, chloroform, ethyl acetate) và ít tan trong

An toàn với người và động vật

Thuốc trừ sâu

nước (1,29 g/lít) Dung dịch chứa Azadirachtin bền khi ñược hòa tan trong dung môi hữu

cơ, nhưng không bền khi pha với nước ở pH 7 Dung dịch chứa hoạt chất Azadirachtin bền nhất khi ñược giữ ở pH 4 – 6 Sự phân rã nhanh cũng là một ñặc ñiểm có lợi của Azadirachtin và các chất triterpenoid khác nhau trong nhân hạt Neem khi ñược sử dụng làm thuốc bảo vệ thực vậv trong nông nghiệp [25]

Một số báo cáo cho rằng Azadirachtin chỉ giữ ñược trong một tuần ở nhiệt ñộ phòng (Sundaram, 1994), một số tác giả khác lại cho thấy Azadirachtin có thể bền trong 3 tháng (Brook, 1996) Azadirachtin trong dung dịch nước, dưới tác ñộng của ánh sáng chỉ giữ ñược 36 – 48 giờ Azadirachtin trong ñất sẽ mất hoạt tính ñi một nữa (50%) ở 25OC sau 20 – 30 ngày (Walter, 1999) Các nhóm tác giả ñang cố gắng tạo ra sản phẩm từ Azadirachtin có ñộ bền hoạt chất cao, giảm tác ñộng của tia cực tím và tự phân hủy hoạt chất

Hiệu quả hợp lực của dịch chiết Neem với một số chất khác ñã ñược thử nghiệm

và công bố bởi Schmutterer (1986) Kết quả thí nghiệm cho thấy các dạng dịch chiết

Neem khi ñược phối trộn với PB ñều có hiệu quả diệt ấu trùng plutella xylostella tuổi 4

tăng lên từ 50 ñến 80% [29]

Dầu mè và lecitin ñược sử dụng làm chất phụ gia, chất mang và chất keo dính DMSO (Dimethyl - sulfoxide) làm tăng khả năng lưu dẫn các chất hóa học vào trong mô cây, glycerol tác ñộng như chất nhũ hóa, MnCl2 và CaCl2 làm chất mang bám trên mặt lá, làm tăng lưu dẫn các chất khác như kháng sinh Sự phối trộn dịch chiết hạt Neem từ cồn với các chất trên theo tỉ lệ khác nhau làm tăng hoạt lực dầu Neem, tùy từng loài sâu [24]

Phối trộn dầu Neem với lecitin làm tăng tỷ lệ diệt nhiều loại rệp cây trồng Hiệu quả diệt sâu của công thức phối trộn dầu Neem với dầu mè cũng ñược cải thiện nhưng yếu hơn Phối trộn dầu Neem với dầu mè và lecitin cho hiệu quả diệt rệp và một số loài sâu hại cây trồng tốt nhất

1.2.7 Một số ứng dụng của Neem

Quả và lá Neem ựược sử dụng ựể tạo nhiều sản phẩm Một cây Neem ựã phát triển ựầy ựủ có thể cho trên 50 kg quả và 350 kg lá mỗi năm Từ quả có thể thu những sản phẩm phụ dưới ựây (Sơ ựồ 1.3)[33]

Sơ ựồ 1.3 Thành phần quả Neem (B.S Parmar và C.M Ketkar, 1996)

Các sản phẩm ựược chế biến từ hạt và lá Neem ựều có hoạt tắnh trừ sâu, nấm gây bệnh, tuyến trùng, gây ngán ăn, ức chế phát triển, ức chế sinh sản, giảm khả năng ựẻ trứng, làm biến thái nhiều loại côn trùng và có ựặc tắnh xua ựuổi Trên 300 loài côn trùng ựược kiểm soát bởi sản phẩm từ Neem đã có một số thuốc Bảo vệ thực vật ựược sản xuất và thương mại dựa trên nền chắnh là dầu Neem và các loại chất chiết từ nhân hạt Neem, lá Neem Riêng ở Ấn độ ựã có tới 100 sản phẩm từ cây Neem, tắnh ựến năm 1996 (Bảng 1.2) [40]

Các chất thô có vị đắng (22,86%)

Vỏ quả (24%) Thịt hạt (47%) Vỏ hạt (19%) Nhân hạt (10%)

25% sau bóc vỏ

QUẢ NEEM

Chiếm (30 - 45%) nhân hạt chiếm 15% hạt

Protein nhân hạt

(15 - 25%, giàu

acid amine)

Bánh dầu chiếm 60 - 65%

nhân hạt

Chất chiết trong cồn

và ether

Dịch chiết Neem (10%)

Chất dễ bay hơi (1,92%)

Lượng chất béo còn lại

Các chất thô không vị đắng (21,66%) Dầu

Bảng 1.2 Một số sản phẩm thuốc bảo vệ thực vật từ dầu Neem Tên sản phẩm Hoạt chất chính Phòng trị Nước sản xuất Neemgold Dịch chiết nhân hạt

Phòng trị nhiều loại côn trùng

Mỹ

Instar Dịch chiết nhân hạt

Neem thái lan, dầu

xả

Diệt côn trùng Thái Lan

NeemAzal T/S Dịch chiết nước ñậm

ñặc

Phòng trị một số loại côn trùng

Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại dùng trong y học Sản phẩm Thành phần chắnh Công dụng Nơi sản xuất

JK-22 Dịch chiết lá đái ựường Ấn độ

GreNeem Dịch chiết lá Lọc máu Ấn độ

Neemcure Dịch chiết lá, dầu

Năm 1981, giáo sư Lâm Công định ựã tiến hành trồng thử nghiệm cây Neem giống Senegal ở tỉnh Ninh Thuận Bước ựầu cho thấy cây Neem phát triển tốt, thắch nghi với vùng ựất khô cằn ở ựây Còn cây Neem giống Ấn độ du nhập vào nước ta những năm sau này [4, 5]

Từ ựầu những năm 1990, việc trồng cây Neem phát triển mạnh ở 2 tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận Ờ là nơi có khắ hậu khô hạn nhất nước ta, với lượng mưa trung bình hàng năm chỉ vào khoảng 500 mm và chỉ tập trung vào 1 - 2 tháng trong năm Ở Ninh Thuận, cây Neem ựã ựược quy hoạch trồng thành rừng dọc theo vùng ựất cát ven biển đến nay, ựã có trên 5.000 ha cây Neem, trong ựó có hơn 700 ha ựã cho quả Theo ựánh giá ban ựầu, cây Neem ựã thắch nghi với vùng ựất khô cằn ở Ninh Thuận Trước mắt, việc

trồng cây Neem phục vụ cho mục ựắch phủ xanh ựất trống, cải tạo môi trường sống và ban ựầu tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc bảo vệ thực vật

Ở các tỉnh phắa Bắc, ựã có một số công trình tách chiết hoạt chất từ hạt Neem ựể làm thuốc trừ sâu (Dương Anh Tuấn, Viện Hóa học, 2003) Theo ựánh giá chung, các tác giả ựều cho thấy: Thuốc trừ sâu thảo mộc từ Neem tuy không mạnh bằng thuốc trừ sâu hóa học nhưng phổ tác ựộng rộng, không gây lờn thuốc, thời gian tác ựộng kéo dài, ựặc trưng cho thuốc trừ sâu sinh học Các nghiên cứu này còn bị hạn chế do nguồn nguyên liệu ắt vì cây Neem tỏ ra không thắch hợp với vùng ựất và khắ hậu ở các tỉnh phắa Bắc (cây ựã ựược trồng nhưng phát triển chậm, không ra hoa, kết trái)

Ở các tỉnh phắa Nam, việc trồng và phát triển cây Neem có thuận lợi hơn, sẵn có nguồn nguyên liệu là hạt Neem ựể nghiên cứu sâu hơn về kĩ thuật trồng và tách chiết hoạt chất từ Neem Năm 2001, Viện Sinh học Nhiệt ựới ựược nhà nước giao thực hiện ựề tài theo nghị ựịnh thư giữa Việt Nam và Ấn độ về ỘNghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu

hạn (Azadirachtin indica), tức cây Neem, trồng tại Việt NamỢ Kết quả, Viện ựã hoàn

thiện ựược qui trình nhân giống cây Neem trên diện rộng ở huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh Thuận Viện Sinh học Nhiệt ựới ựã xác ựịnh ựược quy trình chiết tách thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt Neem, quy trình tách, tinh sạch Azadirachtin, salanin và xác ựịnh hàm lượng Azadirachtin, salanin và nimbin bằng kĩ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết thô nhân hạt Neem lên một số loại nấm gây bệnh và rầy nâu hại lúa Một số tác giả khác của Viện Sinh học Nhiệt ựới như Nguyễn Thị Quỳnh (2000) ựã thử nghiệm chế phẩm dầu Neem ỘPlasmaỢ của Ấn độ phun lên day khoai lang trước khi trồng cho thấy có tác dụng làm giảm tỷ lệ nhiễm hà ở củ khi thu hoạch Nguyễn Thị Phương Thảo (Viện Sinh học Nhiệt ựới, 2000) cũng sử dụng chế phẩm trên ựể bảo quản

củ khoai lang, kết quả thu ựược cho thấy dầu Neem có tác dụng xua ựuổi bọ hà kắ sinh ở liều xử lý 200ppm [10, 11] Những năm sau này, một số nhà nghiên cứu ựã tiến hành thử nghiệm sản xuất thuốc Bảo vệ thực vật từ hạt Neem cho kết quả khả quan như: Võ Văn Kim (Hiệp hội rau quả đà Lạt, 2005) ựã sản xuất ựược 3 dạng chế phẩm từ Neem như Neemcide 3000 EC dạng nhũ dầu, Neemcide SP dạng bột rắc và Neemcide 3000 ES dạng

dung dịch với tổng hàm lượng limonoid (AZRL) 3%, có tác dụng diệt mối, ve, bọ chét, rệp ựen, bọ trĩ hại trà [8] Ngô Văn đát và cộng sự (2005) nghiên cứu trắch ly hoạt chất Azadirachtin từ hạt Neem ựể gia công thành chế phẩm ViNeem 1500 EC, chế phẩm có tác dụng trừ bọ trĩ, rệp sáp hại nho từ 68,9% - 90% sau 5 Ờ 7 ngày phun [3]

1.3 Sơ lược về vi nhũ tương

1.3.1 Giới thiệu

Thuật ngữ vi nhũ tương ựược giới thiệu từ những năm 1940 bởi Hoar và Schulman khi hòa trộn nhũ tương sữa với hexanol Từ ựó ựến nay ựã có nhiều ựịnh nghĩa về vi nhũ tương, theo Danielsson và Lindman (1981) thì vi nhũ tương ựược ựịnh nghĩa là một hệ ựồng nhất của nước, dầu và chất hoạt ựộng bề mặt, có tắnh ựẳng hướng về mặt quang học

và ổn ựịnh về mặt nhiệt ựộng học như một dung dịch lỏng

Có ba loại cấu trúc vi nhũ tương thường gặp, ựó là dạng dầu/ nước (o/w), nước/ dầu (w/o) và dạng hai pha liên tục

−Vi nhũ tương dạng dầu/ nước (oil Ờ in Ờ water o/w): gồm các giọt dầu phân tán trong nước

−Vi nhũ tương dạng nước/ dầu (water Ờ in Ờ oil w/o): gồm các giọt nước phân tán trong dầu

−Vi nhũ tương hai pha liên tục: là vi nhũ tương có cấu trúc khá phức tạp tồn tại ở dạng nước/ dầu/ nước (water Ờ in Ờ oil Ờ in Ờ water w/o/w) gồm những giọt nước phân tán trong những pha dầu lớn và những giọt này lại tiếp tục phân tán trong pha liên tục là nước Ngoài ra còn có dạng dầu/ nước/ dầu (oil Ờ in Ờ water Ờ in Ờ oil o/w/o)

Hình 1.11 Sơ ñồ hình thành nhũ tương ñơn lớp và ña lớp

− Sử dụng lượng lớn chất hoạt ñộng bề mặt và chất ñồng diên hoạt ñể ổn ñịnh các droplet nano (Shaji J và Reddy MS., 2004)

− Khó bền vững ở nhiệt ñộ cao

Thành phần cơ bản của vi nhũ tương bao gồm:

− Pha ñầu: gồm những chất lỏng không phân cực, tan trong dầu và các chất

dễ hòa tan vào chúng

− Pha nước: gồm những chất lỏng phân cực, tan trong nước và các chất dễ hòa tan vào chúng

− Chất hoạt ñộng bề mặt (chất diện hoạt – surfactant): là các chất có khả năng làm giảm sức căng bề mặt, giúp hình thành vi nhũ tương

− Chất ñồng diện hoạt (co- surfactant): là các chất ñược thêm vào ñể hỗ trợ hình thành vi nhũ tương, giúp ổn ñịnh hệ vi nhũ, ñóng vai trò quan trọng trong việc hình thành vi nhũ tương

Phương pháp tạo vi nhũ tương khá ñơng giản (Hình 1.12)

Hình 1.12 Phương pháp tạo vi nhũ tương

Các chất thuộc pha nước và các

chất hòa tan trong nước

Các chất thuộc pha dầu và các chất hòa tan trong dầu

Vi nhũ tương

+ Chất hoạt động bề mặt (khuấy trộn)

Do vi nhũ tương là hệ có khả năng tự nhũ hóa nên thứ tự các chất cho vào không ảnh hưởng ñến hệ mà chỉ ảnh hướng ñến thời gian hình thành vi nhũ tương (Khương Thị Mai Lan, 2008)

Hiện nay vi nhũ tương ñược ứng dụng chủ yếu như một hệ dẫn thuốc, làm tăng hiệu quả sử dụng thuốc và bảo vệ các dược chất dễ bị phân hủy (Khương Thị Mai Lan, 2008) Ngoài ra những hạt này còn ñược ứng dụng trong việc thu hồi dầu, tổng hợp các hạt có kích thước nano …

1.4 Sơ lược về sâu khoang

1.4.1 Giới thiệu

Tên khoa học: Spodoptera litura Fabricius

Họ: Ngài ñêm (Noctuidae)

Bộ: Cánh vảy (Lepidoptera)

Hình 1.13 Sâu khoang (Spodoptera litura )

Sâu khoang là loại ăn tạp, ở nước ta sâu khoang phá hoại chủ yếu trên rau hoa họ thập tự, cà chua, cà bát, ñậu ñũa, ñậu vàng, bầu bí, rau muống, khoai tây, khoai lang, khoai sọ, thuốc lá, bông, thầu dầu, ñiền thanh… (Nguyễn ðức Khiêm, 2006)

Vòng ñời sâu khoang kéo dài trong khoảng từ 25 – 48 ngày tùy thuộc vào thời tiết,

ñộ ẩm, nhiệt ñộ không khí và mùa trong năm, bao gồm khoảng 4 giai ñoạn:

− Giai ñoạn trứng: 3 – 7 ngày

− Giai ñoạn ấu trùng: 12 – 27 ngày

− Giai ñoạn nhộng: 8 – 10 ngày

− Giai ñoạn thành trùng: 2 – 4 ngày

Hình 1.14 Vòng ñời sâu khoang Trứng có hình bán cầu, ñường kính 0,5 mm, xếp với nhau thành ổ, bên trên có lớp lông màu vàng bao phủ Lúc mới ñẻ trứng có màu trắng vàng, sau chuyển thành màu vàng xám, khi sắp nở có màu xám

Ấu trùng sâu khoang có 6 tuổi, tuổi 1 có chiều dài 1 – 2mm, tuổi 6 có chiều dài 38 – 51mm Ấu trùng tuổi 1 – 2 thường tập trung gặm lá ăn một chỗ, chừa lại lớp biểu bì trên và gân lá, nếu bị khua ñộng có thể phân tán hoặc nhả tơ dong mình rơi xuống Từ tuổi 3 trở ñi, sâu tách lẻ tìm thức ăn, ở tuổi này chúng cắn pha mạnh mẽ, ăn thủng lá từng mảng lớn thậm chí trụi lá, ñục khoét trong quả và nụ hoa Tùy thuộc vào ñộ tuổi, thức ăn

và ñiều kiện sống mà sâu khoang có màu từ nâu xám ñến ñen bong, da căng mịn màng, dọc trên lưng có ba vệt kéo dài từ ñầu ñến hậu môn, ở vệt giữa có màu da cam, hai vệt bên có màu vàng nhạt có ñoạn trắng Ở ñốt ngực thứ 3 có một vệt ñen lớn quàng quanh

thân như chiếc khăn, trên “chiếc khăn” này có các ñiểm chấm trắng (Nguyễn Xuân Thành

và Vũ Quang Côn, 2010)

Sâu khoang tuổi nhỏ không nhạy cảm với ánh sáng nhưng ở tuổi lớn (tuổi 4) sâu

có hiện tượng tránh ánh nắng nên ban ngày thường ẩn dưới lớp lá, chui vào chỗ kín hoặc chui xuống ñất, ban ñêm chui ra ñể ăn hại, ăn từ ñêm tới sáng, sâu có thể di chuyển từ cánh ñồng này sang cánh ñồng khác Sâu khoang ưa ñiều kiện nóng ẩm, nhiệt ñộ 29 -

30OC và ñộ ẩm không khí 90% là ñiều kiện tốt nhất cho sâu khoang sinh trưởng và phát dục (Nguyễn ðức Khiêm, 2006) Khi sang tuổi 6, sâu ăn ít, nhả bớt nước trong cơ thể, mình từ từ co lại và chui xuống ñất làm thành một cái kén và hóa nhộng trong ñó

Nhộng sâu khoang hình ống tròn, dài 18 – 20 mm, màu nâu tươi, lúc sắp vũ hóa chuyển sang màu nâu tối Mép trước nốt bụng thứ 4 và vòng quanh các ñốt bụng thứ 5, 6,

7 có nhiều chấm lõm, cuối bụng có một ñôi gai ngắn, trên bụng có lỗ thở

Ngài sâu khoang có chiều dài thân 16 – 21 mm, sải cánh 37 – 42 mm Cánh trước màu nâu vàng, phần giữa từ mép trước ñến mép sau có một vân ngang rộng màu trắng, trên ñường vân này còn có 2 ñường vân nâu màu nâu (ở con ñực không rõ), cánh sau màu trắng loáng phản quang màu tím Trên ñầu ngài có râu cứng

Ban ngày ngài ñậu ở mặt dưới lá và ở những nơi kín trong bụi cây lùm cỏ, bay ra hoạt ñộng từ chập tối ñến nửa ñêm Ngài trưởng thành có sức bay khỏe, có khả năng bay

xa tới 1,5 km và có thể bay cao ñến 6 – 7 m Ngài bị hấp dẫn mạnh bới mùi vị chua ngọt

và với ánh sáng ñèn, ñặc biệt là ñèn có bước sóng ngắn (3650 Angstron) Sau khi vũ hóa

sẽ ñẻ trứng vòa ñêm thứ 2, trứng ñẻ thành từng ổ khoảng vài trăm quả, thường ñẻ ở mặt dưới lá, thời gian ñẻ trứng kéo dài 6 – 8 ngày Trong một dòng ñời con cái giao phối khoảng 3 - 4 lần, trong khi ñó con ñực có thể giao phối 10 lần Trung bình một ngài cái trưởng thành có thể ñẻ 2000 – 2600 trứng Ngài cái có tính chọn lọc kí chủ ñể ñẻ trứng,

số lượng trứng trên các cây ký chủ khác nhau khá rõ rệt, nếu trong khu vực có trồng thầu dầu và ñiền thanh thì ngài sâu khoang ñẻ trứng trên cây này nhiều hơn cây khác