Nghiên cứu ảnh hưởng của LP20 lên hệ miễn dịch tự nhiên và sức đề kháng của cá tra kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi edwardsiella ictaluri

Sự lạm dụng hóa chất và thuốc kháng sinh trong điều trị đã dẫn đến kết quả tất yếu là tăng các chủng vi khuẩn kháng thuốc và kháng sinh; tồn dư của các thuốc kháng sinh trong các sản phẩ

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là bài nghiên cứu của tôi Những kết quả và các số liệu trích dẫn trong luận văn tốt nghiệp là trung thực, không sao chép bất kỳ nguồn nào khác Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Bích Thưởng

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn Thạc sĩ

Võ Minh Sơn, cảm ơn giáo viên giới thiệu Th.s Phạm Minh Nhựt đã nhiệt tình hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban giám đốc cùng các anh chị làm việc tại Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng Thủy sản II đã chỉ dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt các quá trình thực nghiệm của đồ án Xin cảm ơn Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng Thủy sản II đã hỗ trợ toàn bộ kinh phí và máy móc, trang thiết bị

để tôi có thể thực hiện đề tài nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, cùng quý thầy cô của Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tâm chỉ bảo, giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường để có thể áp dụng và hoàn thành tốt

đồ án này

Tôi xin cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến gia đình tôi đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và phấn đấu trong bốn năm qua Cảm ơn bạn lớp 11DSH02, 11DSH01 và các bạn đã làm việc, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng Thủy sản II

Sau cùng, tôi xin gửi tới thầy cô Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

và cùng toàn thể anh chị trong Viện Nghiên cứu và Nuôi trồng Thủy sản II lời cảm

ơn chân thành nhất

Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cá tra 3

1.1.1 Giới thiệu về cá tra 3

1.1.1.1 Phân loại 3

1.1.1.2 Phân bố 3

1.1.1.3 Hình thái, sinh lý của cá tra 4

1.1.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng và sinh sản 4

1.1.2 Tình hình nuôi trồng và xuất khẩu cá tra Việt Nam 5

1.1.2.1 Tình hình nuôi trồng cá tra 5

1.1.2.2 Tình hình xuất khẩu cá tra 6

1.1.3 Tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra 6

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7

1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn E ictaluri 7

1.2.2 Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn E ictaluri 8

1.2.3 Dấu hiệu bệnh lý ở cá tra do E ictaluri gây ra 9

1.3 Tổng quan về miễn dịch 11

1.3.1 Giới thiệu về miễn dịch 11

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2 Hệ miễn dịch tự nhiên 12

1.3.2.1 Miễn dịch thực bào 12

1.3.2.2 Miễn dịch dịch thể 16

1.3.3 Chất tăng cường miễn dịch 17

1.4 Chế phẩm LP20 22

1.4.1 Sản phẩm HK L-137 22

1.4.2 Thức ăn LP20 23

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu thí nghiệm 25

2.2.1 Mẫu thí nghiệm 25

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 25

2.2.3 Môi trường và hóa chất 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Chuẩn bị thức ăn 27

2.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh 28

2.3.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm và miễn dịch 28

2.3.3.1 Thí nghiệm cảm nhiễm 30

2.3.3.2 Thí nghiệm miễn dịch 32

2.4 Xử lí số liệu 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 39

3.1 Kết quả thí nghiệm 39

3.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm 39

Đồ án tốt nghiệp

3.1.1.1 Xác định liều gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn E ictaluri trên cá 39

3.1.1.2 Khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ sau 60 ngày nuôi 40

3.1.2.2 Khả năng bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ sau 75 ngày nuôi 41

3.1.2.3 Kết quả kiểm tra vi khuẩn E ictaluri 42

3.1.2 Các thông số miễn dịch tự nhiên 45

3.1.2.1 Hoạt tính lysozyme 45

3.1.2.2 Hoạt động thực bào 47

3.2 Thảo luận chung 49

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

E Ictaluri: Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

LD50: Liều lượng vi khuẩn E ictaluri gây chết 50%

LP20 : Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 20%

L-15: Môi trường leibovitiz – 15

NT: Nghiệm thức

RPS: Tỷ lệ sống tương đối

TLS: Tỷ lệ sống

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của chất tăng cường miễn dịch trên cá (Sakai, 1998) 18

Bảng 1.2 Sự khác nhau của HK L – 137 và vi khuẩn sống 22

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thực nghiệm 28

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát LD50 bằng phương pháp tiêm 39

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh hóa của E.ictaluri Gly09M 44

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cá tra 3

Hình 1.2 Vi khuẩn E ictaluri 7

Hình 1.3 Cá tra khỏe mạnh và nội tạng bình thường (A); Cá tra bệnh với triệu chứng nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B) 8

Hình 1.4 Thực bào và quá trình giết các vi sinh vật bên trong tế bào 15

Hình 1.5 Mẫu bao gói và nhãn của thức ăn LP20 23

Hình 2.1 Thức ăn bổ sung LP20 27

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm trong bể kính 150 lít 29

Hình 2.3 Tiêm 0,2 ml vi khuẩn E.ictaluri vào cá tra ăn thức ăn chứa LP20 31

Hình 2.4 Sơ đồ thu huyết thanh cá tra từ mẫu máu 32

Hình 2.5 Lấy máu ở động mạch chủ đuôi của cá bằng ống tiêm vô trùng 33

Hình 2.6 Máu cá tra sau khi ly tâm (A); Huyết thanh thu được từ máu cá tra (B) 33 Hình 2.7 Lấy thận trước cá tra (A); Thận trước cá tra sau khi vô trùng bằng L-15 (B); Nghiền thận trong cối xứ vô trùng với môi trường L-15 (C) 35

Hình 2.8 Dịch bạch cầu sau ly tâm nằm giữa percol 37/51% (A); Dịch bạch cầu thu được sau quá trình xử lí từ thận trước (B) 35

Hình 2.9 Sơ đồ thu nhận dịch bạch cầu từ thận trước cá tra 36

Hình 2.10 Dịch bạch cầu được có định trên lame ở tất cả các nghiệm thức (A); Dịch bạch cầu được rửa bằng PBS sau khi nhuộm màu với propidium (B) 37

Hình 2.11 Sơ đồ về quá trình xác định hoạt động thực bào 38

Hình 3.1 Tỷ lệ sống của cá tra sau khi cảm nhiễm với E Ictaluri Gly09M sau 60

ngày sử dụng LP20 40

Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.3 Kết quả kiểm tra hình thái bên ngoài của cá tra sau khi gây bệnh với vi

khuẩn E ictaluri Gly09M 43

Hình 3.4 E ictaluri Gly 09M được nuôi cấy trên môi trường Blood agar bổ sung

5% máu cừu 43

Hình 3.5 Đồ thị phương trình đường chuẩn lysozyme từ lòng trắng trứng gà với

Microccoccus luteus ATCC 9341 45

Hình 3.6 Hoạt tính lysozyme huyết thanh của cá tra sau khi cho ăn thức ăn trộn với

LP20 Số liệu biểu thị giá trị trng bình và độ lệch chuẩn (n = 3) 46

Hình 3.7 Tỷ lệ thực bào của tế bào bạch cầu cá tra sau khi cho ăn thức ăn trộn

LP20 Số liệu biểu thị số trung bình và sai số chuẩn (n = 3) Các chữ cái (thuờng) khác nhau ở cùng thời điểm thu mẫu biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với p < 0,05 47

Hình 3.8 Chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu cá tra sau khi cho ăn thức ăn trộn

LP20 Số liệu biểu thị số trung bình và sai số chuẩn (n = 3) Các chữ cái (thuờng) khác nhau ở cùng thời điểm thu mẫu biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với p < 0,05 48

Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là một trong những loài thủy sản nước

ngọt xuất khẩu chiến lược của Việt Nam trong những năm gần đây Sản lượng cá tra

tăng rất nhanh từ 52.248 tấn trong năm 2000 đến hơn 1 triệu tấn trong năm 2011

Năm 2014, tổng số tiền thu được từ cá tra đạt 1,8 tỷ USD Bên cạnh sự gia tăng về sản lượng cá tra luôn kèm theo sự gia tăng về các bệnh trên cá trong suốt quá trình nuôi trồng, gây thiệt hại kinh tế lớn cho người nuôi trồng thủy sản Có nhiều loại

bệnh xuất hiện trên cá như bệnh do nấm Achlya.sp, bệnh nhiễm trùng máu (MAS)

do vi khuẩn Aeromonas hydrophyla và bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri Trong đó, bệnh gan thận mủ gây ra bởi E ictaluri xảy ra thường xuyên và gây tổn

thất cho người nuôi trồng nghiêm trọng nhất (Crumlish et al., 2002; Ferguson et al., 2001)

Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ được phát hiện đầu tiên vào năm 1998 trên cá tra, thỉnh thoảng trên cá basa Bệnh xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá tra (Từ Thanh Dung và ctv, 2005) Đầu năm 2006, các tỉnh An Giang và Đồng Tháp

có cá chết do bệnh gan thận mủ lên đến 60% Bệnh gan thận mủ vẫn là căn bệnh gây thiệt hại về số lượng lẫn chất lượng ở cá tra nhiều nhất

Hiện nay, phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống về các bệnh của cá tra

đã không còn hiệu lực vì tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn quá nhiều nên làm gia tăng những chủng vi khuẩn gây bệnh kháng kháng

sinh, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ (E ictaluri) trên cá tra (Dung et al.,

2008; Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007) Sự lạm dụng hóa chất và thuốc kháng sinh trong điều trị đã dẫn đến kết quả tất yếu là tăng các chủng vi khuẩn kháng thuốc và kháng sinh; tồn dư của các thuốc kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản (Cabello, 2006), chuyển các gen kháng thuốc cho các vi khuẩn và vi sinh vật gây bệnh cho người và động vật trên cạn và làm thay đổi hệ vi sinh vật trong nước và nền đáy (Verschuere et al., 2000)

Đồ án tốt nghiệp

Nhằm giảm bớt việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất, có các liệu pháp sinh học như vaccine, probiotic và chất tăng cường hệ miễn dịch đã được áp dụng khá phổ biến trong thời gian gần đây Với mục đích tăng cường khả năng kháng bệnh và phòng ngừa dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản (Bricknell và Dalmo, 2005; Vine, 2006) Trong đó, nghiên cứu sử dụng các chất tăng cường miễn dịch là cách tiếp cận tiềm năng, có thể áp dụng cho cả giai đoạn cá bột và cá nuôi nhằm tăng cường khả năng kháng bệnh thông qua kích thích hệ miễn dịch tự nhiên (Sakai, 1999; Vadstein, 1997)

Để đáp ứng yêu cầu của thực tiễn hiện nay và góp phần vào việc tăng cường

sự cạnh tranh về chất lượng cá tra trên thị trường với các nước trên thế giới, nhóm

thực hiện đề tài đã tiến hành “Nghiên cứu ảnh hưởng của LP20 lên hệ miễn dịch

tự nhiên và sức đề kháng của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) kháng bệnh gan thận mủ gây ra bởi Edwardsiella ictaluri”.

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sự ảnh hưởng của thức ăn LP20 có khả năng nâng cao hệ miễn

dịch tự nhiên của cá tra nuôi chống lại bệnh gan thận mủ do E ictaluri gây ra

3 Nội dung nghiên cứu

Xác định liều gây chết của vi khuẩn E.ictaluri gây bệnh lên cá tra

Khảo sát ảnh hưởng của LP20 lên hệ miễn dịch tự nhiên cá tra qua các chỉ tiêu:

1 Tỷ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh

2 Hoạt tính lysozyme của huyết thanh cá

3 Hoạt động thực bào thận trước của cá

Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn, sống ở môi trường

nước ngọt, có giá trị kinh tế cao, phân bố chủ yếu ở lưu vực sông Mê kông và được nuôi ở một số quốc gia như Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái lan Ở Việt Nam những năm trước đây, khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống tra được vớt trên sông Tiền và sông Hậu Cá trưởng thành thường chỉ thấy trong ao nuôi, rất

ít gặp trong tự nhiên trên địa phận Việt Nam, nguyên nhân là do cá tra có tập tính di

cư ngược dòng sông Mê kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên Hiện nay,

cá tra được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang (Đồng Thanh Hà và Đỗ Thị Hòa, 2008 – 2009)

Hình 1.1 Cá tra

Đồ án tốt nghiệp

1.1.1.3 Hình thái, sinh lý của cá tra

Cá tra là một loài cá da trơn, thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai đôi râu dài Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7 – 10%) Cá tra có thể chịu đựng được nước phèn với pH > 5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15oC, nhưng chịu nóng tới 39oC Cá tra có

số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác Cá có cơ quan hô hấp phụ

và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan (Phạm Văn Khánh, 2001)

1.1.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng và sinh sản

Cá tra thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau khi còn nhỏ Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục, là đặc điểm của cá thiên về ăn thịt

Cá lớn thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn Dựa vào đặc tính ăn tạp và chuyển đổi thức ăn mà vẫn tăng trọng nhanh, người nuôi có thể phối hợp một số thành phần nguyên liệu như cám, rau và động vật đáy, xay nhuyễn, trộn đều và nấu chín cho cá ăn

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, cá còn nhỏ tăng nhanh về chiều dài Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài từ 10 – 12 cm (trọng lượng 14 –

15 g) Cá khi lớn đạt khoảng 2,5 kg trở lên, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm

Tuổi thành thục của cá đực là 2 tuổi và cá cái 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục

từ 2,5 – 3 kg Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ, nên nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt được cá tra đực hay cá tra cái Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch Cá có tập tính di cư đẻ tự nhiên trên những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp Sức sinh sản tuyệt đối của cá tra từ 200 ngàn đến vài triệu trứng Sức sinh sản tương đối có thể tới 135 ngàn trứng/kg cá cái

2013, số lượng hộ nuôi cá tra giảm đột ngột do giá thành cá tra giảm, người nuôi bị

lỗ vốn Nguyên nhân của sự giảm giá thành cá tra là do thị trường tiêu thụ gặp nhiều khó khăn, các nước EU, châu Á, Đông Âu và đặc biệt thị trường Nga vẫn chưa mở rộng cửa đón nhận sản phẩm của nước ta Thêm vào đó là rào cản kỹ thuật ngày càng khắt khe, sự kiểm tra gắt gao của hai quan nước ngoài (đặc biệt là nước Mỹ) khi xuất khẩu cá tra số lượng lớn, bên cạnh đó có một số doanh nghiệp nước ngoài cạnh tranh không lành mạnh bán phá giá sản phẩm, rồi trở lại hạ giá thu mua cá nguyên liệu nhằm đảm bảo lợi nhuận

Diện tích nuôi cá tra của các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long trong năm 2014, ước đạt hơn 5.500 ha với sản lượng cá tra lên đến 1.116 nghìn tấn Đầu năm 2014, giá mua bán cá tra bắt đầu có diễn biến khả quan Sản lượng nuôi trồng thuỷ sản tháng 3/2014 ước đạt 176 nghìn tấn, tăng 0,3% so với cùng kỳ năm 2013 Theo báo cáo của các sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thuộc đồng bằng sông Cửu Long, diện tích nuôi cá tra của các tỉnh trong khu vực 3 tháng đầu năm ước đạt 5.400 ha với sản lượng 382 nghìn tấn

Sau một thời gian giá cá tra tăng ổn định, nhiều hộ nuôi tiếp tục thả nuôi vụ mới, diện tích nuôi tăng mạnh kể từ tháng 10 đến nay và dần hồi phục gần bằng cùng kỳ năm ngoái cả về diện tích lẫn sản lượng cá tra Hai tỉnh Đồng Tháp và An Giang có sản lượng cá tra lớn nhất vùng nhưng sản lượng giảm nhẹ so với cùng kỳ năm ngoái với Đồng Tháp (-2%), An Giang (-8%) Chỉ riêng tỉnh Hậu Giang, diện tích giảm 12% nhưng sản lượng lại tăng đáng kể, đạt 70.905 tấn, tăng 102% so với cùng kỳ

Đồ án tốt nghiệp

1.1.2.2 Tình hình xuất khẩu cá tra

Năm 2013, cá tra Việt Nam đã có mặt ở 149 quốc gia, vùng lãnh thổ trên thế giới, tăng thêm 9 quốc gia so với cùng kỳ năm 2012 Giá trị kinh tế trong năm 2013 tăng cao, xuất khẩu cá tra sang ASEAN đạt giá trị 124,8 triệu USD, tăng 13,1% so với năm 2012 Hiện nay, các thị trường nhập khẩu cá tra Việt Nam đang hồi phục mạnh mẽ, đặc biệt là các nước châu Âu Trong năm 2014, Mỹ là thị trường lớn nhất chiếm 24,6% tổng giá trị nhập khẩu nhóm hàng này khi đạt 38,5 triệu USD (tăng 44,6% so với cùng kỳ năm 2012) Tiếp đến là EU với 20,5% tỷ trọng và 32,1 triệu USD (giảm 13,6% so với cùng kỳ năm trước) Cuối cùng là các nước Brazil, ASEAN, Mexico, Trung Quốc và Hồng Kông chiếm thị phần nhập khẩu cá tra lần lượt là 9,3%; 6,1%; 5,2% và 4,2%

1.1.3 Tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra

Bệnh dịch đã xuất hiện trên cá tra ở các tỉnh Nam Bộ từ những ngày đầu nuôi trồng, trong đó dịch bệnh trên cá tra có ba loại chủ yếu bao gồm bệnh gan thận mủ chiếm 48%, bệnh xuất huyết chiếm 32% và bện ký sinh trùng chiếm 4% Theo báo cáo của Tổng Cục Thủy Sản tháng 10 năm 2013, thiệt hại từ các bệnh đem lại là

732 ha, trong đó tỉnh Đồng Tháp bị thiệt hại nhiều nhất và chiếm 639 ha, còn Vĩnh Long là 70 ha

Bệnh gan thận mủ là bệnh xảy ra nhiều nhất trên cá tra và gây nhiều thiệt hại cho người nuôi Bệnh có thể xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỷ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002), tỷ lệ hao hụt ở cá tra giống từ

10 - 90%, nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất là ở giai đoạn cá có trọng lượng từ

300 – 500 g (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Kết quả điều tra của Từ Thanh Dung (2005), bệnh gan thận mủ thường bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại Đặc biệt bệnh gan thận mủ xuất hiện cao nhất vào thời gian lũ đạt tỷ lệ 85,4% số hộ nuôi cá

ở An Giang bị nhiễm bệnh

Đồ án tốt nghiệp

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn E ictaluri

Loài: Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri được tìm thấy ở các loài cá da trơn như cá trê sông, cá tra

và gây bệnh xuất huyết đường ruột ở cá da trơn Ở Việt Nam, E ictaluri phân lập

từ cá tra giống và cá tra thịt

Vi khuẩn E ictaluri là vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, có kích thước

khoảng 0,75 × 1,5 – 2,5 µm, di động ở nhiệt độ dao động từ 25 – 30oC, nhưng di động yếu hoặc không di động khi nhiệt độ cao hơn 30oC (Hawke et al., 1981) Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose và galactose, sinh hơi yếu hoặc không

sinh hơi, không lên men các đường khác Trong test API 20E vi khuẩn E ictaluri

phản ứng dương tính với methyl red, nitrate, lysine, ornithine và catalase và phản ứng âm tính với citrate, voges-proskauer, arginine, oxidase và ure (Waltman et al., 1985)

Vi khuẩn E ictaluri có khả năng lên men và sinh sản phẩm NO3- từ NO2- Khuẩn lạc phát triển tốt trên môi trường thạch máu, BHI agar, sau 36 – 48 giờ, nhiệt

độ thích hợp ở 28 – 30oC, pH từ 6 – 7 (Plumb et al., 1989) Trên môi trường EIM

giúp tăng cường sự phân lập và định danh E ictaluri (Shotts et al., 1986)

Hình 1.2 Vi khuẩn E ictaluri

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2 Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn E ictaluri

Theo Shotts et al (1986), E ictaluri xâm nhiễm vào cơ thể cá qua hai con

đường:

1 Bằng đường nước: vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ quan khứu giác, thông qua mũi cá rồi chúng di chuyển vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não Sự truyền nhiễm lan rộng từ màng não đến sọ và da cá, vì thế tạo nên những lỗ thủng trên đầu cá (thường được gọi là bệnh “hole-in-the-headˮ )

2 Bằng đường tiêu hóa: E ictaluri có thể đi vào trong máu xuyên qua ruột, dẫn đến bệnh nhiễm trùng máu Bằng con đường này vi khuẩn xâm chiếm mạnh đến

các mao mạch quản bên trong da, đây là nguyên nhân dẫn đến hoại tử và làm mất sắc tố của da cá

Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn (Shotts et al., 1986)

Hình 1.3 Cá tra khỏe mạnh và nội tạng bình thường (A); Cá tra bệnh với

triệu chứng nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B)

B

Đồ án tốt nghiệp

1.2.3 Dấu hiệu bệnh lý ở cá tra do E ictaluri gây ra

Cá bệnh gan thận mủ không có những biểu hiện bệnh lý bất thường bên ngoài

Ở giai đoạn mới chớm bệnh, cá vẫn bắt mồi nhưng giảm ăn Một số trường hợp, cá

có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết bên da và hậu môn Dấu hiệu đặc thù nhất là bên trong nội tạng, các cơ quan như gan, thận, tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng, đường kính từ 1 – 3 mm, các cơ quan này sưng to và có

biểu hiện nhũn ở thận (Ferguson et al., 2001) Trên các tra, E.ictaluri tấn công vào

các cơ quan như thận, gan và tỳ tạng Trong đó, vi khuẩn tấn công vào thận và tỳ tạng đầu tiên

❖ Đặc điểm nội tạng của cá tra bị bệnh gan thận mủ

1 Gan

Quan sát tiêu bản gan có đốm trắng dưới kính hiển vi cho thấy đây là vùng hoại tử Các tế bào gan không còn sát nhau như ở mô thường mà tách rời ra tường tế bào hoặc thoái hóa thành một vùng không còn nhận ra được cấu trúc Giai đoạn đầu

bị sung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, đặc biệt là hệ thống xoang mao mạch giữa các dãy tế bào gan làm cho toàn bộ tổ chức gan bị sưng to Sau đó, do quá trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzyme (protease, lipase…) làm các tế bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử Quan sát thấy những tế bào tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu hủy

Khi cá bệnh nặng những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng khử độc và lọc máu, làm chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm cá chết Ngoài ra, do tổ chức gan thận bị hư hại làm mất khả năng tiết mật ở gan Một số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan Điều này có thể khi gan bị hoại tử đồng thời cũng hoại tử ống dẫn mật và túi mật là túi mật bị vỡ, dịch mật thoát ra ngoài

Đồ án tốt nghiệp

1 Thận

Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy

ra ở toàn bộ tổ chức Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được, do hệ thống tiểu cầu thận và ống thận bị hư hại Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và mất chức năng các đơn vị cấu tạo nên thận Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế bào kẻ và tế bào nội tiết của thận cũng bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút Khi thận bị hoại tử, chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ Trong đó quá trình trao đổi chất lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, hai loại hormone tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý của cá

3 Tỳ tạng

Tỳ tạng cũng là cơ quan bị hủy hoại nặng khi cá bị bệnh mủ gan Đối với cá bệnh nặng, nhiều vùng hoại tử dạng hạt lan rộng Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái hóa Quá trình hoại tử ở tỳ tạng bắt đầu từ quá trình thoái hoái và hoại tử các tiểu thể tỳ tạng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo vệ cơ thể, chống các tác nhân gây bệnh và làm tỳ tạng mất chức năng cung cấp máu cho cơ thể

4 Mang, tim và cơ

Mang xuất hiện các vùng có các sợi mang bị sưng, kết dính lại với nhau Sự dính lại của các sợi mang làm giảm khả năng hô hấp của mang do giảm diện tích tiếp xúc với nước và do mất chức năng ở các vùng sợi mang bị dính lại hay hoại tử

Do đó, cá bệnh sẽ có biểu hiện do thiếu oxi và thường tập trung ở mặt nước

Tim và cơ ít bị ảnh hưởng so với các cơ quan trên

Đồ án tốt nghiệp

1.3 Tổng quan về miễn dịch

1.3.1 Giới thiệu về miễn dịch

Miễn dịch (MD) là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, độc tố vi sinh vật, các phân tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể Miễn dịch gồm miễn dịch tự nhiên (MD không đặc hiệu) và miễn dịch thu được (MD đặc hiệu) (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2012)

Miễn dịch tự nhiên hay bẩm sinh chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu có sẵn

từ khi sinh ra và mang tính di truyền trong các cơ thể cùng loài (Nguyễn Lân Dũng

và ctv, 2012) Nói cách khác đó là khả năng tự bảo vệ do những cơ chế không đặc hiệu cho nên không đòi hỏi có sự tiếp xúc trước của cơ thể với vật lạ Cơ chế này hoạt động ngay dù là kháng nguyên xâm nhập lần đầu hay lần sau Do đó, miễn dịch

tự nhiên giữ một vai trò rất quan trọng, nếu không có miễn dịch tự nhiên thì sinh vật khó tồn tại trước sự tấn công của sinh vật khác có sức sống mãnh liệt hơn (Vũ Triệu

An, 2001)

Cơ thể luôn luôn có miễn dịch tự nhiên, đó chính là khả năng thích ứng phòng ngự tự nhiên của cơ thể chống lại bất kỳ tác nhân có hại nào, bất kỳ ở đâu và bất kỳ lúc nào Cơ thể tạo nên một sự thích ứng bảo vệ tự nhiên bằng hàng rào da, niêm mạc, dịch tiết tạo nên một sức đề kháng tự nhiên, đặc biệt nhất là dựa vào hoạt động thực bào của một số tế bào có khả năng thực bào Miễn dịch không đặc hiệu là loại miễn dịch có tính chất sinh lý, đại diện là loại hình miễn dịch thực bào (Nguyễn Quang Tuyên, 2003)

Miễn dịch thu được là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể đã tiếp xúc với kháng nguyên và có phản ứng sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại chúng Miễn dịch thu được có hai đặc điểm chính khác cơ bản so với miễn dịch tự nhiên đó là khả năng nhận dạng và trí nhớ đặc hiệu về kháng nguyên (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2012)

Đồ án tốt nghiệp

1.3.2 Hệ miễn dịch tự nhiên

Hệ miễn dịch tự nhiên bao gồm hệ miễn dịch thông qua các tế bào (bạch cầu trung tính, đại thực bào) và dịch thể (lysozyme, hệ bổ thể, lectin, cytokine, interferon ) Chúng có chức năng là bảo vệ vật chủ từ sự xâm nhập của vi khuẩn,

vi sinh vật, nấm và ký sinh trùng (Secombes, 1996; Whyte, 2007)

1.3.2.1 Miễn dịch thực bào

Thực bào là hiện tượng các tế bào bạch cầu đa nhân (trung tính, toan tính, kiềm tính) nuốt và tiêu hoá các tế bào vi sinh vật, các tế bào của cơ thể, các chất lạ khi chúng xâm nhập vào cơ thể, gồm tiểu thực bào và đại thực bào (Nguyễn Quang Tuyên, 2003)

Tiểu thực bào hay bạch cầu đa nhân trung tính là quan trọng nhất trong hoạt động thực bào, lan tràn nhanh chóng đến ổ viêm sau khi đã xuyên mạch được gọi là thực bào lưu động, vì nó là loại tế bào xuất hiện tại ổ viêm đầu tiên Khi vi sinh vật vừa xâm nhập vào một vị trí nào đó của cơ thể, ngay tại nơi tiếp xúc sẽ có hiện tượng viêm, do các bạch cầu đa nhân trung tính được tăng nhanh chóng, ồ ạt kéo đến nơi vi sinh vật xâm nhập, giam chân mầm bệnh tại chỗ, các tế bào thực bào lưu động sẽ len vào các tổ chức gây viêm, xuyên qua thành mạch để vây bắt và nuốt kháng nguyên vào trong

Đại thực bào là loại tế bào thực bào thứ hai, có nguồn gốc từ các bạch cầu đơn nhân, hoạt động của đại thực bào diễn ra chậm hơn so với bạch cầu đa nhân trung tính (tiểu thực bào) nhưng toàn diện hơn Khi mầm bệnh đã được khu trú tại các ổ viêm thì các đại thực bào lưu động cũng theo hệ mạch máu ngoại vi kéo đến ổ viêm

để phối hợp vây bắt và nuốt kháng nguyên Những mầm bệnh nào vượt qua được ổ viêm, tiếp tục xâm nhập vào các tổ chức của cơ thể, thì trên đường đi, dọc theo hệ bạch huyết, chúng sẽ bị các đại thực bào cố định tiếp tục vây bắt và nuốt Sau đó, các đại thực bào tiết ra các enzyme phân giải để làm tan kháng nguyên hoặc làm bất hoạt kháng nguyên, khiến cho chúng mất độc tính gây bệnh (Nguyễn Quang Tuyên, 2003)

Đồ án tốt nghiệp

Thực bào đóng vai trò rất quan trọng và là bức tường đầu tiên chống sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh thông qua các cơ chế thực bào và các sản phẩm oxide hóa cao có khả năng tiêu diệt các mầm bệnh (Ellis, 2001)

Theo Dalmo et al (1997), thực bào nhận biết vi sinh vật gây bệnh thông qua thụ thể hiện diện trên bề mặt tế bào bạch cầu Chúng có khả năng nhận biết phân tử liên kết trên thành tế bào vi khuẩn như polysaccharides, lipopolysaccharide (LPS)

từ vi khuẩn gram âm, peptidoglycan từ vi khuẩn gram dương, β-1,3-glucan từ nấm, DNA vi khuẩn và vi sinh vật RNA mạch đôi

Giai đoạn 2: Tế bào thực bào gắn với vi khuẩn

Ở nơi viêm tế bào thực bào tiến tới gần vi khuẩn Sự bám dính tế bào thực bào với vi sinh vật nhờ các thụ thể (recepter) có mặt trên tế bào vi sinh vật như

mannose, Lipopolysaccharide (LPS)… Chúng sẽ hấp dẫn các tế bào bạch cầu áp tới,

hoạt hóa enzyme kinase nhằm tạo ra những giả túc Khi tế bào thực bào đến sát thì

có hiện tượng dính màng tế bào nhờ vào protein liên kết Sau đó, các tế bào thực bào sẽ thay đổi các hoạt động như thò giả túc, hình thành lysosome, tăng cường hoạt động men…

Đồ án tốt nghiệp

Giai đoạn 3: Tế bào thực bào nuốt và làm tiêu tan vi khuẩn

Đầu tiên, màng tế bào bị lõm vào, chất nguyên sinh sẽ tạo ra các chân giả bao lấy vi sinh vật, rồi đóng kín lại tạo thành hốc thực bào (phagosome) chứa các vi sinh vật Như vậy, vi sinh vật đang ở bên ngoài đã được chuyển vào bên trong Tiếp theo

là bắt đầu giai đoạn làm tiêu tan vi khuẩn, các hạt lysosome tiến đến các hốc thực bào, xảy ra hiện tượng hòa tan màng của hai tiểu thể để hình thành màng chung là phagolysosome Tại đây, các vi sinh vật sẽ bị tiêu hủy do hai quá trình một cần có oxy, một là do men:

1 Cơ chế không phụ thuộc oxy: các men tiêu protein, lysozyme, lactoferin làm vi khuẩn vỡ ra từng mảng, hiện tượng đó có thể cụ thể hoá như sau: vi khuẩn sưng to lên, đút nát ra từng đoạn, rồi làm rã hoàn toàn

2 Cơ chế phụ thuộc oxy: oxy được sử dụng một cách mạnh mẽ để chuyển thành các anion superoxyde và oxy nitơ (NO), tạo nên một hệ thống halogen

có thể tiêu diệt vi khuẩn lẫn vi rút

Một trong số các enzyme tham gia hai cơ chế này là oxidase của tế bào, làm nhiệm vụ thực bào và có tác dụng chuyển phân tử oxy thành anion superoxide và các gốc tự do Các chất này được gọi là các chất trung gian oxy phản ứng (ROI) có tác dụng độc đối với các vi sinh vật đã bị tế bào làm nhiệm vụ thực bào nuốt vào Enzyme thứ hai là enzyme iNOS xúc tác quá trình chuyển đổi arginine thành nitric oxide Đây cũng là một chất có tác dụng diệt vi sinh vật Nhóm các enzyme thứ ba

là các protease của lysosome có tác dụng phân cắt các protein của vi sinh vật Tất cả các chất kháng vi sinh vật này được tạo ra chủ yếu ở trong các lysosome và các phagolysosome Chúng tác động lên các vi sinh vật đã được nuốt vào ở bên trong các bọng nên không hề gây tổn thương gì cho các tế bào thực bào Trong những trường hợp phản ứng quá mạnh thì các enzyme kể trên có thể được giải phóng ra khoang gian bào và có thể gây tổn thương cho các mô của cơ thể (Nguyễn Quang Tuyên, 2003)

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4 Thực bào và quá trình giết các vi sinh vật bên trong tế bào

bổ thể thì lysozyme sẽ cùng hiệp lực tấn công màng vi khuẩn (Nguyễn Quang Tuyên, 2003)

Interferon (IFN): là một nhóm các polypeptide được sản xuất ra ở tế bào khi bị nhiễm virus (IFN- α và IFN-β) hay từ lympho bào T khi tiếp nhận kháng nguyên đặc hiệu (IFNγ) Các IFN có nhiều hoạt tính sinh học như làm cản trở sự xâm nhập

và nhân lên của virus, kìm hãm sự tăng sinh của một số tế bào u, có khả năng hoạt hóa các đơn nhân thực bào, các tế bào NK (natural killer) và làm tăng biểu lộ kháng nguyên của các tổ chức hòa hợp mô chủ yếu

Bổ thể (complement) là một hệ thống gồm nhiều thành phần do nhiều loại tế bào sản xuất nhưng lại tương tác với nhau và hoạt hóa theo một chương trình nhất định Trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên thì bổ thể được hoạt hóa theo con đường không đặc hiệu bởi các chất như carbon hydrate, lipopolysaccharide… của vi khuẩn, nhờ đó mà chọc thủng và làm dung giải vi khuẩn Một số thành phần của bổ thể như C3a, C5a có tác dụng hóa ứng động bạch cầu, gây dãn mạch, giải phóng các hóa chất trung gian từ các hạt của bạch cầu ái kiềm Một số thành phần khác nhau như C3b sẽ dính vào vi khuẩn giúp cho các tế bào thực bào dễ tiếp cận và tiêu diệt

vi khuẩn (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007)

Opsonin là yếu tố miễn dịch dịch thể không đặc hiệu có vai trò rất lớn trong hoạt động thực bào, opsonin có trong huyết tương bình thường của các loài động vật, đặc biệt có hàm lượng tăng cao trong huyết tương của những cơ thể đã có miễn dịch Opsonin có tác dụng hỗ trợ các tế bào thực bào bằng cách vô hiệu hoá khả năng chống lại sự thực bào của một số vi khuẩn có giáp mô, do đó các vi khuẩn này

dễ dàng bị các tế bào thực bào vây bắt và tiêu diệt (Nguyễn Quang Tuyên, 2003)

Đồ án tốt nghiệp

1.3.3 Chất tăng cường miễn dịch

Theo Anderson (1992), chất tăng cường miễn dịch (immunostimulant) là các hợp chất hóa học hay sinh học, hoặc thuốc có khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên và có thể làm cho các động vật tăng khả năng kháng bệnh với vi khuẩn, vi sinh vật, nấm và ký sinh trùng gây bệnh

Theo Bricknell và Dalmo (2005), chất tăng cường miễn dịch là hợp chất từ tự nhiên có khả năng điều chỉnh hệ miễn dịch bằng cách gia tăng sức đề kháng của vật chủ chống lại bệnh mà hầu hết các trường hợp gây ra bởi mầm bệnh

Sakai (1999) đã chia chất kích thích hệ miễn dịch thành các nhóm khác nhau thùy thuộc vào nguồn gốc:

1 Nhóm hóa chất tổng hợp: Levamisole, FK-565, Muramyl dipeptide, CpG oligodeoxynucleotides

2 Nhóm hoạt chất sinh học: từ thành tế bào nấm, vi khuẩn gram âm và dương (FCA, β-glucan, Peptidoglycan (Brevibacterium lactofermentum; Vibrio sp.) lipopolysaccharide (LPS) ; dịch chết từ động – thực vật (ete, hde, glycyrrhizin, firefly squid, quillaja saponin (soap tree)…); Vitamin (vitamin C

và E); hormone và cytokine (lactoferrin, interferon, growth hormone ); polysaccharide (chitin, lentinan, chitosan, oligosaccharide )

Dựa vào cơ chế tác dụng của chất tăng cường miễn dịch trên hệ miễn dịch tự nhiên của cá, các nhà nghiên cứu đã sử dụng thành công nhiều hoạt chất sinh học trên các đối tượng thủy sản, kết quả là tăng tỷ lệ sống, tăng khả năng kháng bệnh vi khuẩn, vi sinh vật và vi rút (Bricknell và Dalmo, 2005; Sakai, 1999)

Đồ án tốt nghiệp

Tác nhân Tác giả Loại cá Phương pháp Kết quả Kháng vi sinh vật

Siwicki et al (1990) Trout In vitro Phagocytosis , NBT Kajita et al (1990) Trout Ip Phagocytosis , CL V.anguillarum

Complement Jeney and Anderson (1993) Trout Im A.salmonicida

Baba et al (1993) Carp Im Phagocytosis , CL A.hydrophila

FK-565 Kitao and Yoshida (1986) Trout Ip Phagocytosis A.salmonicida

Kitao et al (1987) Trout In vitro Antibody MDP Kodama et al (1993) Trout Ip Phagocytosis , CL V.anguillarum

LPS Clem et al (1985) Catfish In vitro IL-1

MacArthur et al (1985) Plaice Ip Macrophage migration Salati et al (1987) Red sea bream Ip Phagocytosis

Neumann et al (1995) Goldfish In vitro MAF Solem et al (1995) Salmon In vitro Phagocytosis , NBT Dalmo and Seljelid (1995) Salmon In vitro Phagocytosis , NBT

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của chất tăng cường miễn dịch trên cá (Sakai, 1998)

Đồ án tốt nghiệp

Tác nhân Tác giả Loại cá Phương pháp Kết quả Kháng vi sinh vật

Bacteria Sakai et al (1995) Trout Im Enterococcus seriolicida

C.butyricum Sakai et al (1995) Trout Oral Phagocytosis , NBT V anguillarum

A.stenohalis Kawahara et al (1994) Char Ip CL , complement A salmonicida

Chitin Sakai et al (1992) Trout Ip Phagocytosis ,lysozyme V anguillarum

Chitosan Siwicki et al (1994) Trout Oral NBT , phagocytosis A salmonicida

EF203 Yoshida et al (1993) Trout Oral Phagocytosis , CL Streptococcus sp

Sakai et al (1995) Trout Oral Phagocytosis , NBT R salmoninarum

Protein-bound

Polysaccharide

Oligosaccharide Yoshida et al (1995) Catfish Oral NBT

Spiralina Duncan and Klesius (1996) Catfish Oral CL , antibody E ictaluri

Vitamin C Verlhac et al (1996) Trout Oral Complement , lysozyme

Peptidoglucan Matsuo and Miyazano (1993) Trout Oral V.anguillarum

Itami et al (1996) Yellowtail Oral Phagocytosis E.seriolocida

Schizophyllan

Schizophylla Matsuyama et al (1992) Yellowtail Ip Complement E.seriolocida

Lysozyme Polyglucose Sveinbjornsson and Salmon In vitro NBT , pinocytosis

Đồ án tốt nghiệp

❖ Chú thích:

Kí hiệu tăng:

Kí hiệu không thay đối:

Trout (rainbow trout): cá hồi cầu vồng

Salmon (Atlantic salmon): cá hồi Đại Tây Dương

Carp: cá chép

Catfish: cá trê

Plaice: cá bơn sao

Red sea bream: cá tráp đỏ

Goldfish: cá vàng

Char: cá hồi chấm hồng

Tilapia: cá rô phi

Yellowtail: cá đuôi vàng

Ip (intraperitoneal injection): phương pháp tiêm xoang bụng

Im (immersion): phương pháp ngâm Oral: phương pháp cho ăn

In vitro: nuôi cấy trong ống nghiệm Phagocytosis: sự thực bào

NBT: phản ứng của nitroblue tetrazolium

CL (chemiluminescent response): đáp ứng hóa phát quang IL-1: sản xuất interleukin 1

Complement: bổ thểMAF (macrophage activating factor): hoạt hóa đại thực bào

Antibody: kháng thể Killing: tế bào giết tự nhiên Pinocytosis: âm bào

Macrophage migration:sự di chuyển của đại thực bào

Đồ án tốt nghiệp

1.4 Chế phẩm LP20

1.4.1 Sản phẩm HK L-137

HK L – 137 (Heat Kill Lactobacillus – 137), là Lactobacillus plantarum dòng

137 đã xử lý nhiệt được phân lập từ thực phẩm lên men ở châu Á L plantarum –

137 là vi khuẩn gram dương, hình que, không di động và có khả năng sản sinh ra

acide lac tic Tính chất đặc trưng duy nhất của L plantarum là khả năng dị hóa arginine và sinh ra oxide nitric L plantarum không có khả năng phân giải amino

acid nào ngoại trừ tyrosine và arginine, có 6 con đường khác nhau chuyển hóa arginine thành oxide nitric Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh

Bảng 1.2 Sự khác nhau của HK L – 137 và vi khuẩn sống

- Dự trữ nơi mát

- Ảnh hưởng đến dịch tiêu hóa

- Nâng cao khả năng bảo vệ cơ thể

- Duy trì hoạt tính khi xử

lí nhiệt

- Không ảnh hưởng đến dịc tiêu hóa

=> Rất ổn định

Đồ án tốt nghiệp

HK L-137 có hai đặc điểm chính:

1 Hoạt động tăng cường miễn dịch cao: khi HK L – 137 xâm nhập vào cơ thể và thúc đẩy sản sinh IL – 12 và IFN – β, hỗ trợ cho thủy sản, vật nuôi khỏe mạnh và tác động trực tiếp lên hệ miễn dịch tế bào Có khả năng kích thích tế bào miễn dịch, nâng cao tính miễn dịch và có tác dụng hiệp lực với các nguyên liệu thức

Hình 1.5 Mẫu bao gói và nhãn của thức ăn LP20

Đồ án tốt nghiệp

LP20 được công nhận là sản phẩm an toàn (GRAS) dựa trên quy trình sản xuất khoa học Hàm lượng protein trung bình trong LP20 được xác định là 3,8%, tương ứng với hàm lượng của protein HK – L137 khoảng 20% và hàm lượng axit nucleic trung bình trong LP20 được xác định là 2,4%, tương ứng với axit nucleic HK – L137 là 12%

Hirose et al (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần LP20 đến các thông số miễn dịch, đó là làm tăng các tế bào đơn nhân, tăng IL – 12 (hoạt hóa

tế bào giết tự nhiên) tạo interferon-gamma (IFN – γ) trong tế bào T Khi tế bào T được hoạt hóa sẽ giải phóng IL – 2 và sau đó phân tử này lại tác dụng ngược lại dưới hình thức tự tiết vào tế bào để tạo cầu nối với các quá trình tín hiệu trước đó

do thụ thể của tế bào T gây ra IL – 2 giúp tế bào T tăng sinh, tham gia đến dự phát triển của tế bào B, đồng thời tăng sinh và hoạt hóa tế bào giết tự nhiên, tăng cường hoạt động của các tế bào bạch cầu có nguồn gốc từ tủy xương (monocyte) hay các đại thực bào (macrophage)

Công ty House Wellness Foods Corporation, Nhật Bản, đã thử nghiệm thành công thức ăn LP20 tại Việt Nam trong việc thúc đẩy hệ thống miễn dịch của vật nuôi và thủy sản góp phần nâng cao tỷ lệ sống, tỷ lệ chuyển hóa thức ăn và tăng trọng trong các giai đoạn nuôi, đồng thời không gây ảnh hưởng môi trường Liều dùng đối với thủy sản từ 50 – 100 ppm cho các giai đoạn nuôi

Năm 2014, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II thực hiện thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của PL20 đến tăng trưởng, đáp ứng miễn dịch của tôm sú và tôm thẻ Khi cho tôm ăn thức ăn bổ sung LP20 với các hàm lượng 100 ppm và 500 ppm thì tốc độ tăng trưởng bình quân và FCR (hệ số chuyển đổi thức ăn) khác biệt

có ý nghĩa so với thức ăn không bổ sung LP20 và thức ăn thương mại Sau khi tiêm

vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, tỷ lệ thực bào của tế bào máu tôm sú và tôm thẻ

sau khi cho ăn thức ăn trộn với LP20 với liều 100 ppm và 500 ppm tăng cao khác biệt so với đối chứng

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: 25/05/2015 – 16/08/2015

Địa điểm: phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Ngiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II và tiến hành thử nghiệm ở viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản ở số 139/1552

Lê Đức Thọ, Phường 13, Quận Gò Vấp

2.2 Vật liệu thí nghiệm

2.2.1 Mẫu thí nghiệm

LP20 là sản phẩm chứa 20% chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum L-137

đuợc làm chết bằng nhiệt với mật độ 3,3 x 1011 cfu/g Sản phẩm được sản xuất bởi Công Ty House Wellness Foods Corp, Nhật Bản

Chủng vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ Edwardsiella ictaluri Gly09M được

cung cấp từ Trung Tâm Quan Trắc, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

Cá tra giống có trọng lượng 20 g/con được mua từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Tủ cấy vô trùng (Microflow)

- Máy li tâm lạnh, máy lắc

Đồ án tốt nghiệp

- Ống đong 100 ml, 1000 ml

- Đĩa petri, lame, bút sáp màu

- Cối, chày sứ, giấy lọc

- Kính hiển vi huỳnh quang

- Microrray 96 giếng

- Kim tiêm 1 ml; 5 ml

- Bộ lọc nước, hệ thống cung cấp oxy liên tục

- Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy thủy tinh

2.2.3 Môi trường và hóa chất

a Môi trường:

- Blood agar (BA)

- Brain Heart Infusion Broth (BHI)

ăn đối chứng (ĐC +) được trộn với skim milk với lượng 100 ppm thức ăn Thức ăn thí nghiệm được bảo quản trong tủ mát 4oC

Hình 2.1 Thức ăn bổ sung LP20

Đồ án tốt nghiệp

2.3.2 Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh

Chuẩn bị dịch khuẩn cho phương pháp tiêm xoang bụng (ip): Vi khuẩn gây

bệnh E ictaluri Gly 09M (giữ trong -80oC) được nuôi trên môi trường Blood agar (bổ sung 5% máu cừu), ủ 28oC trong 36 giờ Dùng tâm bông gạt khuẩn lạc và huyền phù trong dung dịch đệm PBS (10mM sodium phosphate, 150mM sodium chloride, pH 7.2)

Sau đó dựa vào đường chuẩn (Y = 8 x 108 X – 6 x 106, R2 = 0,99) để xác định mật độ vi khuẩn trong dung dịch gốc

2.3.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm và miễn dịch

Cá được thuần dưỡng trong bể composite 20 m3 từ 2 – 4 tuần, tại phòng thí nghiệm ướt của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2 và cho ăn bằng thức ăn Green Feed trước khi tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm

Green Feed

GF + Pzpro

GF + LP20

GF + LP20

GF + LP20

Hàm lượng sử

Đồ án tốt nghiệp

Trước khi tiến hành thí nghiệm, bắt ngẫu nhiên 10 con cá để kiểm tra có mắc bệnh lạ không bằng cách mổ và cấy trên môi trường thạch máu kiểm tra vi khuẩn

Cá sạch bệnh là cá không bị nhiễm E ictaluri và các triệu chứng lạ trước khi thí

nghiệm Sau thời gian thuần trong bể composite, cá được chuyển vào bể kính 150 lít (thể tích nước 100 lít/bể) ít nhất 1 tuần trước khi bố trí thí nghiệm Mỗi bể chứa 15 con, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần

Hệ thống nuôi bán tuần hoàn sử dụng máy lọc khí và có sục khí liên tục để cung cấp khí oxy thường xuyên cho cá Cá được cho ăn bằng thức ăn tổng hợp dạng viên nổi Cá ở các nghiệm thức được cho ăn theo tỷ lệ 3% trọng lượng thân, cho ăn

2 lần/ngày Sục khí liên tục, nước tuần hoàn và thay nước 2/3 bể mỗi ngày

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm trong bể kính 150 lít

26 – 28oC, pH dao động từ 6 – 7 Theo dõi cá chết hàng ngày cho đến khi cá ngừng chết trong 3 ngày liên tục Từ đó, xác định liều gây chết gấp 10xLD50 (Newaj-Fyzul

et al., 2007)

Khoảng cách tỷ lệ, proportionate distance (PD) giữa hai nồng độ có tỷ lệ chết lớn hơn 50% và nhỏ hơn 50% được tính theo công thức sau:

Vậy LD50 của vi khuẩn này đối với cá là: LD 50 = 10n-PD cfu/ml, trong đó n: số

mũ thấp nhất của vi khuẩn gây chết trên 50%

b Thí nghiệm cảm nhiễm

Phương pháp tiêm xoang bụng: gây mê cá thí nghiệm bằng EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether) với nồng độ 0,2 ppt trong 2 – 3 phút Sử dụng kim tiêm 24G, chiều dài mũi kim tiêm 4 mm để đảm bảo an toàn cho cá khi thử nghiệm Mũi kim tiêm đi vào xoang bụng cá, ở vị trí giữa hai vây bụng cá tra và chếch một góc

45o Thể tích tiêm của mỗi con cá là 0,2 ml

Tỷ lệ chết > 50% - 50%

Tỷ lệ chết > 50% - Tỷ lệ chết < 50%

PD =