Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nguồn mẫu lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu cây bá bệnh (eurycoma longifolia jack)

Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS Murashige và Skoog, 1962 [32] đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu tử diệp

Trang 1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu cây Bá bệnh 5

1.1.1 Phân loại học 5

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 6

1.1.3 Đặc tính sinh học 6

1.1.3.1 Đặc điểm phân loại của cây Bá bệnh 6

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái của cây Bá bệnh 6

1.1.4 Thành phần hóa học 7

1.1.5 Ứng dụng 9

1.1.6 Các nghiên cứu về cây Bá bệnh 10

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 10

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 12

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo 12

1.2.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 12

1.2.2 Vai trò của cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng đến sự hình thành mô sẹo 15

1.3 Phương pháp lớp mỏng tế bào (Thin cell layers) 18

1.3.1 Khái niệm 18

1.3.2 Những tính chất đặc trưng của hệ thống TCL 19

1.3.3 Ưu điểm 19

1.4 Mô sẹo 21

1.4.1 Khái niệm 21

1.4.2 Mục đích của nuôi cấy mô sẹo 21

Trang 2

1.4.3 Quá trình tạo mô sẹo 21

1.4.4 Những nghiên cứu về mô sẹo cây dược liệu 22

1.4.4.1 Sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis) 22

1.4.4.2 Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 23

1.4.4.3 Cây Thông đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.) 24

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu 25

2.2.1 Đối tượng thí nghiệm 25

2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 25

2.2.3 Trang thiết bị và dụng cụ 25

2.2.4 Hóa chất và môi trường thí nghiệm 26

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 27

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tử diệp 27

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá non 28

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy cuống lá non 29

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tử diệp 30

2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá non 31

2.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy cuống lá non 32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tử diệp 34

Trang 3

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp

lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá non 40

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy cuống lá non 46

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tử diệp 51

3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá non 55

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

4.1 Kết luận 62

4.2 Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 1

Trang 4

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BAP : N6– benzyllaminopurine

CĐHSTTV : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Ltcl : Long thin cell layer

NAA : α – napthalene acetic acid

SPSS : Statistical Product and Services Solutions

TDZ : N-phenyl-N′-1, 2, 3-thiadiazol-5-ylurea

tTCL : transverse thin cell layer

Trang 5

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy tử diệp cây Bá bệnh 28

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy lá non cây Bá bệnh 29

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy cuống lá non cây Bá bệnh 30

Bảng 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy tử diệp cây Bá bệnh 31

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy lá non cây Bá bệnh 32

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy cuống lá non cây Bá bệnh 33

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh

hình thái của mẫu cấy tử diệp sau 45 ngày nuôi cấy 35

hình thái của mẫu cấy lá non sau 45 ngày nuôi cấy 41

hình thái của mẫu cấy cuống lá non sau 45 ngày nuôi cấy 47

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh

hình thái của mẫu cấy tử diệp sau 45 ngày nuôi cấy 52

hình thái của mẫu cấy lá non sau 45 ngày nuôi cấy 55

hình thái của mẫu cấy cuống lá non sau 45 ngày nuôi cấy 58

Trang 6

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 So sánh tỷ lệ mô sẹo hình thành và khối lượng tươi trung bình của

mô sẹo theo nồng độ NAA riêng lẻ lên mẫu cấy lớp mỏng tử diệp (bảng 3.1) 36

Biểu đồ 3.2 So sánh tỷ lệ mô sẹo hình thành và khối lượng tươi trung bình của

mô sẹo theo nồng độ NAA riêng lẻ lên mẫu cấy lớp mỏng lá non (bảng 3.2) 433

mô sẹo theo nồng độ NAA riêng lẻ lên mẫu cấy lớp mỏng lá non (số liệu bảng 3.3) 499

mô sẹo theo nồng độ TDZ riêng lẻ lên mẫu cấy lớp mỏng tử diệp (số liệu bảng 3.4) 53

mô sẹo theo nồng độ TDZ riêng lẻ lên mẫu cấy lớp mỏng lá non (số liệu bảng 3.5) 56

mô sẹo theo nồng độ TDZ riêng lẻ lên mẫu cấy lớp mỏng cuống lá non (số liệu bảng 3.6) 59

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình cây Bá bệnh 5 Hình 1.2 Các dược phẩm chiết xuất từ Bá bệnh 10 Hình 3.1.a Ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA lên mẫu tử diệp với nồng

Trang 8

Tuy nhiên, việc sử dụng các dược liệu này vẫn rất hạn chế do chỉ có thể chiết xuất trực tiếp một lượng rất ít từ thực vật và việc tổng hợp nhân tạo vẫn còn gặp nhiều khó khăn do con đường tổng hợp nhân tạo vẫn còn gặp nhiều khó khăn

và chưa được làm sáng tỏ Thu nhận hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ thực vật bằng phương pháp nuôi cấy tế bào đơn được xem là giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay để sản xuất, làm giàu hàm lượng và ổn định nguồn cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật

Tầm quan trọng

Với xu hướng dùng thảo dược thiên nhiên để chữa bệnh, cây Bá bệnh đã trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia trong khu vực Đông Nam Á, đặc biệt nó còn được xem như nhân sâm ở Malaysia, vì nó có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu chữa các bệnh sốt, đau bụng, chống sốt rét và tăng cường sức khỏe sinh lý nam giới, …

Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng các sản phẩm được chiết xuất

từ rễ và vỏ của cây Bá bệnh ứng dụng làm dược liệu ngày càng tăng, điều này tạo nên áp lực cho việc duy trì quần thể cây này Mặt khác, việc thu nhận hợp chất

Trang 9

thứ cấp trong nuôi cấy đã được nghiên cứu và cho kết quả tốt như Ginsenoside từ

cây nhân sâm (P ginseng) (Choi và cộng sự, 1994; Franklin và Dixon, 1994); Rosmarinic acid từ cây tía tô (Coleus bluemei) (Ulbrich và cộng sự, 1985); Berberin từ cây liễu sam (C japonica) (Matsubara và cộng sự, 1989)… Chính vì

thế, việc nuôi cấy tế bào thực vật được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn nguyên liệu mà không làm ảnh hưởng đến nguồn cây ngoài tự nhiên [18], [31], [45]

Xuất phát từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và nguồn mẫu lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy

cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)” được tiến hành

Ý nghĩa của đề tài

Thí nghiệm đề ra nhằm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành mô sẹo, với mục đích tăng nhanh số lượng mô sẹo để làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm thu nhận sinh khối có hợp chất thứ cấp nhằm ứng dụng rộng rãi trong y học

Năm 2014, Trần Trọng Tuấn và cộng sự đã nghiên cứu quá trình phát sinh

mô sẹo từ mẫu lá cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) [12]

Trang 10

3 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật (chất ĐHSTTV) đến sự phát sinh mô sẹo khi nuôi cấy mẫu tử diệp, lá non và cuống lá non của cây Bá bệnh

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) [32] đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu tử diệp của cây Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của NAA và BA riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu lá non của cây

Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của NAA và BA riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy cuống lá non của cây Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy tử diệp của cây Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy mẫu lá non của cây Bá bệnh

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp bổ sung vào môi trường MS đến sự phát sinh mô sẹo từ nuôi cấy cuống lá của cây Bá bệnh

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: phương pháp lớp mỏng tế bào

Phương pháp thống kê: sử dụng phần mềm SPSS

6 Kết quả đạt được của đề tài

Xác định được các yếu tố ngoại sinh kích thích sự phát sinh hình thái cây

Bá bệnh nhằm tăng nhanh số lượng lớn mô sẹo

Trang 11

7 Kết cấu của khóa luận tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và đề nghị

Trang 12

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cây Bá bệnh

Cây Bá bệnh là một loài thuộc giới thực vật, tên khoa học của cây bá bệnh

là Eurycoma longifolia, cây có họ Simaroubeacea và chi Eurycoma

Simaroubacea là một họ lớn bao gồm 30 chi và 200 loài, trong đó có 8 chi và 10 loài được tìm thấy ở Malaysia (Hooi và cộng sự, 2002) [21]

Cây có các tên gọi khác như: Bách bệnh, Mật nhân, Lồng bẹt, Nho nan (Tày), Tongkat Ali ở Malaysia, Pasakbumi hoặc Bidara Pahit ở Indonesia, Lan-don ở Thái Lan và tiếng Anh là Longjack

Trang 13

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây Bá bệnh được tìm thấy ở khu rừng tự nhiên các nước trong khu vực Đông Nam Á và phân bố rộng rãi ở rừng nguyên sinh, rừng thứ cấp ở Malaysia đến các nước Việt Nam, Indonesia, Thái Lan và Philippin

Ở Việt Nam, cây mọc phổ biến ở khắp nước, rải rác ở những cánh rừng thưa, vùng núi thấp, trung du, vườn quốc gia Bái Tử Long, một số rừng ở Tây Nguyên và miền Trung nhiều hơn là ở các tỉnh phía Bắc Cây chịu được bóng nên thường gặp dưới tán rừng

1.1.3 Đặc tính sinh học

1.1.3.1 Đặc điểm phân loại của cây Bá bệnh

Cây thuộc họ Thanh Thất là cây gỗ hay cây bụi, vỏ đắng, nhánh phủ lông,

lá lớn, mọc so le, kép lông chim sẻ, có nhiều đôi lá chét mọc đối Cụm hoa mọc thành từng chùy rộng, thường mọc ở gần ngọn, hoa thường đơn tính, có một số lưỡng tính Lá đài rời hoặc dính ở gốc, thường phủ lông tơ, cánh hoa dài hơn lá đài Nhị xem kẽ với cánh hoa, chỉ nhị rời và ở mỗi gốc của nhị thường có phần phụ dạng vảy Bao phấn ngắn, có khi ngã xuống, lắc lư, mở ngang hoặc hướng trong Bộ nhụy bao gồm 4 – 5 lá noãn rời, xếp chồng trên cánh hoa, ở hoa đực không có các noãn hoặc chỉ có rất thô sơ, vòi nhụy dính thành cột, đầu nhụy rời Quả hạch, 3 – 5 quả nang Hạt không có phôi nhũ, có hạt lởm chởm lông ngắn

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái của cây Bá bệnh

Thân: Bá bệnh là loại cây cây thân gỗ nhỏ, cao khoảng 15m, thường mọc dưới tán lá của những cây lớn, có lông ở nhiều bộ phận Cây không phân cành

hoặc ít phân cành, cuống lá có màu nâu đỏ

Lá: dạng kép lông chim sẻ gồm từ 13 – 42 lá nhỏ sánh đôi đối nhau Mặt trên lá màu xanh, mặt dưới có màu trắng xám Cuống lá có mầu nâu đỏ, lá có hình dạng mũi mác hoặc bầu dục, với góc lá thuôn, đầu nhọn

Hoa: cây bá bệnh là loài đơn tính khác gốc nên mỗi cây chỉ trổ hoa đực hoặc hoa cái Hoa màu đỏ nâu mọc thành chùm, nở vào tháng 3 – 4 Mỗi hoa có

5 – 6 cánh rất nhỏ, hoa và bao hoa phủ đầy lông có màu đỏ nâu Hoa mọc thành

Trang 14

chùy ở kẽ lá và tập trung ở ngọn.Đài hoa được chia thành năm thùy hình tam giác, tràng hoa có năm cánh hình thoi, nhị có lông dày và hai vảy ở gốc, bầu có 5 noãn, đầu nhụy rời

Quả: cây kết quả vào tháng 3 – 11 Quả non màu xanh, khi chín đổi sang màu đỏ sẫm Quả hình trứng dày, nhẵn, hơi thuôn dài, đầu tù và cong, có rãnh ở giữa dài từ 1 – 2 cm, ngang 0,5 – 1,0 cm, chứa 1 hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn.Cây thường bắt đầu ra quả sau 2 – 3 năm trồng và cây hoàn toàn trưởng thành sau 25 năm

1.1.4 Thành phần hóa học

Cây Bá bệnh đang được các nhà khoa học chú ý với các đặc tính dược lý và các chất mang hoạt tính của cây Trên các bộ phận của cây, các nhà khoa học đã tìm và chứng minh có các hợp chất sau đây:

Các hợp chất quassinoid: 14,15-β-dyhdroxykalaineanon, eurycomalacton, longylacton, 6α-hydroxyeurymalcton, 5, 6 dehydroeurycomalacton, 11-dehydroklaineanon

Các hợp chất triterpen loại tirucalan: niloticin, dihydroniloticin, piscidinol

A, bourjotinolon A, espisapelin A, melianon, hyspirdon

Các alkaloid loại canthin-6-on: 9,10- dimethoxycanthin-6-on, 9methoxy-canthin-6-on, 9-methoxy-3methyl-canthin-5, 6dion, alkaloid carbolin, 5,9-dimethoxycanthin-6-on và 9-methoxy-3-methyl-canthin-5, 6-dion (Hooi và cộng sự, 2002) [21]

10-hydroxy-Năm 1963, Lê Văn Thới và Nguyễn Ngọc Sương, trường đại học khoa học

Sài Gòn cô lập thành công hợp chất β-sitosterol, campesterol, 2, 6-

dimetoxybenzoquinon, eurycomalaton Ngoài ra, còn cô lập được hợp chất dihydroeurycomalacton [43]

Năm 1970, Thoi va Suong đã cô lập được 2 hợp chất quasinoid tên là eurycomanon và eurycomanol [42]

Năm 1982, Suong và cộng sự đã cô lập được hai hợp chất là laurylacton A

và laurylacton B [40]

Trang 15

Năm 1992, Chan và cộng sự tìm thấy hợp chất mới dihyroeurycomalacton, 5,6-dehyroeurycomalacton, 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalacton, 10-hydroxycantin-6-on, scopoletin [15]

3,4-Năm 1995, Chan và cộng sự đã ly trích cao n-butanol từ rễ và cây cô lập được một quassinoid glycoside có tên là eurycomanol-2-O-β-D-glucopyranosid [16]

Năm 1990, Tada và cộng sự đã phân lập được hợp chất paskbumin A (eurycomanon) và pasakbumin B, pasakbumin C từ cao metanol [15] Đến năm

1993, các tác giả đã cô lập thêm hợp chất 1,

2-seo-1-nor-6-(5-10)-abeo-picrasan-2, 5-olide [41]

Năm 1991, các nhà nghiên cứu thuộc trường đại học Y dược, Tokyo, Nhật trong quá trình nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây Bá bệnh đã phân lập được hai hợp chất mới với khung squallan Đây đồng thời là hai đồng phân lập thể của nhau, một là eurylen, đồng phân kia là teurylen

Năm 1992, tại trường đại học Tokyo, Nhật hợp chất hydroxyeurymalacton và 11-dehydroklaineanon cũng được phân lập từ cây Itokawa và cộng sự còn phát hiện thêm một số hợp chất thuộc nhóm triterpen với khung tirucallan, niloticin, hydroniloticin, piscidinol A, bourjotinolon A, 3-episapelin A,melianon, hispidon, các hợp chất này được công bố có độc tính đối với một số loại tế bào ung thư [28]

6α-Đến năm 1992, các tác giả còn cô lập được bốn hợp chất mới thuộc nhóm chất biphenylneolignan Trong đó có hai đồng phân của nhau: 2,2’-dimetoxy-4-(3-hyroxy-1-propenyl)-4’-(1,2,3-trihydroxypropyl)diphenyleter [28]

Năm 1993, ngoài eurylacton olide), nhóm nghiên cứu tại trường đại học Y dược Tokyo, Nhật còn cô lập thêm một hợp chất mới là 14-deactyl eurylen [28]

Choo và Chan (2002) đã sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để chứng minh trong cây Bá bệnh có nhiều hợp chất quý là các alkaloid như 9-methoxycanthin-6-one, 3-methylcanthin-5,6-dione, canthione; và nhóm

Trang 16

quassinoid như là eurycomalactone, longilactone, eurycolactone, laurycolactone, eurycomanone [17]

Năm 2010, Miyake và cộng sự đã công bố hoạt tính gây độc đối với tế bào

ung thư của các hợp chất quassinoids từ cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)

Có 24 quassinoids cô lập từ cây Bá bệnh được khảo sát là có khả năng gây độc với các tế bào ung thư khác nhau [31]

1.1.5 Ứng dụng

Sử dụng lá Bá bệnh để nấu làm nước tắm nhằm trị tình trạng ghẻ trên da Tùy theo cơ địa và khả năng hấp thu ở mỗi người mà cây có tác dụng bệnh lý cũng không giống nhau

Hoa và trái của cây Bá bệnh được sử dụng như một loại thuốc để điều trị bệnh lỵ

Một số người dân địa phương còn dùng rễ cây này để làm thuốc hạ sốt, làm nhanh lên da non ở những chỗ nhiễm trùng, vết thương, vết loét, giangmai, chảy máu răng

Vỏ của cây được sử dụng để chữa bệnh sốt, loét miệng, và giun trong ruột Trong vỏ, rễ cây Bá bệnh có thành phần chính là các quasinoide, triterpenoid, alkaloide giúp tăng năng lượng hoạt động và sức bền cơ thể Tăng cường sinh lý, tăng cường sức khỏe tình dục, điều hòa và làm ổn định huyết áp, chữa ngộ độc, đau mỏi lưng do thấp khớp, giải say rượu, ăn uống không tiêu, nôn mửa.Cây Bá Bệnh được người dân các nước vùng Đông Nam Á sử dụng từ lâu và được chứng minh qua rất nhiều nghiên cứu trên thế giới trong có tác dụng tăng cường chức năng sinh lý và sức khoẻ tình dục Đặc biệt năm 2006, các nhà khoa học Trường Đại học Hà Nội đã tìm thấy và nghiên cứu cho thấy cây Bá bệnh tại Việt Nam cũng có tác dụng không thua kém các nước trong khu vực (Đỗ Huy Bích và cộng

sự, 2006) [2]

Việt Nam đã cho ra các dòng sản phẩm từ cây Bá bệnh như: khang dược Bá bệnh, linh dược Bá bệnh, cà gai leo, Alipas

Trang 17

c Giải độc gan Tuệ Linh

1.1.6 Các nghiên cứu về cây Bá bệnh

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2005, Hussein và cộng sự nghiên cứu hình thành một lượng lớn chồi trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Bá bệnh Kết quả tỷ lệ chồi của mẫu cấy cao nhất là 90% trên môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/l kinetin.Rễ được cảm ứng hình thành sau 14 ngày nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/l IBA [24]

Trang 18

Năm 2006, Hussein và cộng sự đã nghiên cứu thành công việc tạo chồi bất định từ nuôi cấy rễ và thân của cây Bá bệnh Môi trường tốt nhất được xác định

là môi trường Juglan medium (DKW) có bổ sung 0,1 mg/l kinetin kết hợp với 0,1 mg/l zeatin Với số lá 25,1 ± 1,5; chiều dài thân 3,1 ± 0,5 cm, tỷ lệ 90% tạo chồi, hình thành chồi sớm nhất trong vòng 15 ngày nuôi cấy Môi trường tốt nhất để nuôi cấy thân là DKW được bổ sung 2,0mg/l BAP và 2,0 mg/l zeatin Với số lá 38,9 ± 1,5; chiều dài thân 4,3 ± 0,5 cm, tỷ lệ tạo chồi cao nhất 70% trong thời gian sớm nhất là 16 ngày nuôi cấy Mẫu thân và rễ sử dụng để nuôi cấy được lấy

ở vị trí cách xa gốc 2,0 cm, đó được xác định là vị trí phù hợp nhất để đạt tỷ lệ tối

đa hình thành chồi bất định Rễ con được cảm ứng từ chồi bất định cũng được hình thành sớm nhất và nhiều nhất trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 0,5 mg/l IBA Chồi bất định hình thành từ mẫu rễ, tỷ lệ phần trăm cao nhất của rễ con là 70% và thời gian hình thành rễ con là 19 ngày Chồi bất định hình thành từ mẫu thân, tỷ lệ phần trăm cao nhất của rễ con là 60%, thời gian hình thành rễ con

sau 18 ngày Sau 2 tháng cây con in vitro được chuyển ra đất với điều kiện không

có sự khác biệt về hình thái so với cây mẹ [23]

Năm 2010, Mahmood và cộng sự đã nghiên cứu về việc cảm ứng mô sẹo

từ các cơ quan của cây Bá bệnh Sử dụng lá, cuống lá, cuống, thân, rễ chính, rễ

xơ, lá mầm được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác nhau như 2,4-D, IAA, NAA, picloram, dicamba Tỷ lệ 81,76% mẫu cấy lá hình thành sẹo tốt nhất ở môi trường 2,4-D với nồng độ 0,1 mg/l Tỷ lệ 78,33% mẫu cuống lá hình thành mô sẹo trong môi trường có hai loại auxin là 2,4-D và picloram, cùng nồng độ 0,4 mg/l Mẫu thân kết quả tốt nhất là 88,33% ở 0,2 mg/l 2,4-D Lá mầm thì kết quả là 85% ở 0,4 mg/l 2,4-D Mẫu rễ không tạo mô sẹo với IAA và NAA [30]

Năm 2010, Miyake và cộng sự nghiên cứu hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư của quassinoids Có 24 quassinoids cô lập từ cây Bá bệnh được khảo sát

là có khả năng gây độc với các tế bào ung thư khác nhau [31]

Trang 19

Năm 2012, Hussein và cộng sự công bố ảnh hưởng của auxin, nồng độ đường và nguồn carbohydrate lên khả năng hình thành rễ bất định từ nuôi cấy mẫu lá của cây Bá bệnh Kết quả cho thấy nồng độ auxin tốt nhất để nuôi cấy rễ bất định là 3,0 mg/l NAA với tỷ lệ 28,9% hình thành rễ, thời gian hình thành rễ là

20 ngày sau nuôi cấy Nồng độ đường 50 g/l có hiệu quả kích thích rễ bất định cao hơn so với nồng độ đường 30 g/l [25]

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Năm 2006, các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội đã có những công bố về thành phần hợp chất trong cây có tác dụng dược lý

Năm 2012, Trần Trọng Tuấn và cộng sự đã nghiên cứu thành công đề tài

sử dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong cảm ứng tạo rễ bất định in vitro từ mẫu cấy lá cây Bá bệnh Trong nghiên cứ này, với mẫu cấy là lá trong

môi trường MS có bổ sung 2,5 mg/l 2,4-D tỷ lệ tạo rễ của mẫu đạt 23,80% Đối với môi trường B5 có bổ sung 2,5 mg/l 2,4-D thì tỷ lệ tạo rễ của mẫu cấy đạt 55,00% và trong môi trường WPM có bổ sung 2,5 mg/l NAAtỷ lệ tạo rễ của mẫu cấy cao nhất là 82,40% [12]

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo

1.2.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Auxin là một nhóm chất ĐHSTTV được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong nuôi cấy mô để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin

Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc sự phát sinh hình thái cần nghiên cứu Hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi của cây mẹ, vị trí thu mẫu cấy, thời gian thu mẫu trong năm Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy Sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4]

Trang 20

Auxin thường là nguyên nhân: của sự kích thích sự tăng trưởng, kéo dài tế bào và sự trương của mô; có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào (cảm ứng khởi tạo mô sẹo) và cảm ứng tạo rễ bất định; ức chế sự hình thành của chồi bất định và chồi nách; thường phát sinh phôi trong nuôi cấy huyền phù Với nồng độ thấp auxin sẽ kích thình hình thành mô sẹo và không có khả năng cảm ứng tạo rễ bất định (Pierik, 1998) [36]

Ảnh hưởng của auxin trong nuôi cấy tế bào thực vật

Vai trò của auxin lên sự cảm ứng sự tăng trưởng của mô sẹo: auxin thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu cấy Loại auxin thường được sử dụng cho mục đích này là 2,4-D, nhưng nếu tiếp tục duy trì mô sẹo trong môi trường có 2,4-D này thì tế bào dễ bị đột biến Vì vậy, người

ta có thể cảm ứng sự tạo mô sẹo bằng NAA hay IAA hoặc sau khi cảm ứng mô sẹo bằng 2,4-D thì mẫu cấy sẽ chuyển sang môi trường có NAA hoặc IAA Để cảm ứng mô sẹo từ mẫu cấy của cây lá rộng, người ta thường dùng 2,4-D với nồng độ từ 1,0 – 3,0 mg/l Cần chú ý là để cảm ứng mô sẹo từ cây hai lá mầm, thường kết hợp auxin với cytokinin, nhưng cytokinin thì lại không cần thiết trong

sự tạo mô sẹo từ cây một lá mầm và auxin phải được sử dụng với một nồng độ cao như 2,0 – 10,0 mg/l (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4]

Ngoài ra auxin còn có ảnh hưởng khác như ảnh hưởng lên sự phát sinh hình thái (sự tạo chồi hay rễ), ảnh hưởng lên phát sinh phôi soma Nồng độ của auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng

sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4]

Auxin được phân loại thành 2 nhóm là auxin tự nhiên và auxin nhân tạo Auxin tự nhiên như 3-indol-acetic acid (IAA) đây là auxin được biết đến chủ yếu, có tác động sinh lý nổi bật nhất trong các loại auxin tự nhiên Ngoài

ra còn có các loại khác như: 4-cloroaxetic acid (A4-Cl-IA) và butyric acid (AIB) Auxin nhân tạo đây là loại auxin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như indol-3-butyric acid (IBA), naphthalene

Trang 21

indol-3-acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyacetix acid (2,4-D) Ngoài ra còn có một số auxin khác ít được sử dụng hơn như: (2,4,5-trichlorophenoxy) acetic acid (2,4,5-T); 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA); 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MPCA); 2-naphthyloxyacetic acid (NOA); 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba); 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram)

Tính ổn định trong môi trường nuôi cấy: IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt

độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môi trường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng Nồng độ của IAA có thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ sung thêm Tốc độ phân hủy của auxin ở ngoài sáng nhanh hơn đặc biệt trong môi trường MS Trong môi trường MS lỏng ở nhiệt độ 25C, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, IAA nồng độ 10M (1,75 mg/l) sẽ giảm ít hơn giới hạn được nhận biết

là 0,05 mg/l trong 14 ngày IBA ổn định trong môi trường hơn là IAA, nồng độ IBA giảm đi 25% sau 30 ngày trong tối, 60% sau 30 ngày ngoài sáng Các loại auxin khác như NAA và 2,4-D không bị biến tính trong môi trường nuôi cấy nhưng một khi đã được mô tế bào thực vật hấp thu vào thì tốc độ phân tách xảy

ra nhanh không chỉ do tác nhân vật lý mà còn do tác động của các enzyme (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4]

Các loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Trong thực vật IAA được tổng hợp từ tryptophan và được sản xuất tại mô phân sinh chồi ngọn nhưng thường lại góp phần vào sự hình thành và phát triển của rễ (Sathyanarayana và Varghese, 2007) IAA được sử dụng trong nuôi cấy

mô nhưng nó lại dễ bị biến tính trong môi trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến trong mô Tuy nhiên, những đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA (cùng với cytokinin) sau khi cảm ứng sự hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm lượng của auxin trong mô giảm IAA thường được sử dụng phối hợp với các chất ĐHSTTV khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo

Trang 22

mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4]

1.2.2 Vai trò của cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng đến sự hình thành

mô sẹo

Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo dưới tác động thích hợp nào đó và chỉ có rất ít cơ quan thực vật không thể hiện được khả năng này Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào tình trạng sinh lý, sinh hóa và kiểu gen Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất ĐHSTTV ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Vai trò của loại cơ quan thực vật thường sử dụng để tạo mô sẹo: người ta

có thể tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể và trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4] Trong nuôi cấy mô thì IAA thường được bổ sung vào trong môi trường ở nồng độ từ 0,01 – 10,00 mg/l (Pierik, 1998) [36] Nhưng IAA không được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật do dễ bị phân hủy trong quá trình nuôi mẫu

2,4-D thường sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng sự tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và nó sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4] IBA và NAA là loài auxin được sử dụng phổ biến cho sự hình thành rễ và khi kết hợp thêm với một số cytokinin thì thích hợp cho việc phát sinh chồi trong nuôi cấy, còn 2,4-D và 2,4,5-T thì rất có hiệu quả cho việc cảm ứng tạo mô sẹo (Sathyanarayana và Varghese, 2007) Tương tự như IAA thì các auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D) cũng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy ở nồng độ

từ 0,01 – 10,00 mg/l (Pierik, 1998) [36]

Cytokinin là một nhóm các phenyl urea dẫn xuất của adenine, các cytokinin được xác định đầu tiên vào năm 1913 Cytokinin chủ yếu liên quan tới phân chia tế bào, cảm ứng hình thành chồi (Sathyanarayana và Varghese, 2007)

Trang 23

Chúng thường được hòa tan trong dung dịch HCl hoặc NaOH đã được pha loãng

Tỷ lệ auxin và cytokinin là quan trọng đối với phát sinh hình thái trong hệ thống nuôi cấy mô Đối với cảm ứng tạo phôi, cảm ứng mô sẹo và cảm ứng rễ thì đòi hỏi tỷ lệ của auxin cao hơn cytokinin trong khi ngược lại sẽ phát sinh chồi (Sathyanarayana và Varghese, 2007)

Năm 1998, Pierik [36] cho rằng các loại cytokinin thường được sử dụng phổ biến để kích thích tế bào tăng trưởng và phát triển Chúng thúc đẩy sự phân chia tế bào, đặc biệt nếu thêm vào cùng với một auxin Trong môi trường nuôi cấy cytokininở nồng độ cao (1,0 – 10,0 mg/l) có thể cảm ứng sự hình thành chồi, nhưng lại ức chế việc hình thành rễ Các cytokinin thúc đẩy hình thành chồi nách bằng cách giảm ưu thế chồi ngọn và chúng làm chậm quá trình lão hóa

Cytokinin được phân thành 2 loại là cytokinin tự nhiên và cytokinin tổng hợp Các cytokinin tự nhiên được biết đến trong nuôi cấy mô như: 4-hydroxy-3-methyl—trans-2-butenylaminopurine hoặc 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl)-aminopurine hoặc 2-methyl-4-(1H-purine-6-ylamino)-2-buten-1-ol (zeatin),N6-(2-isopentyl)adenine hoặc N6-(2-isopentenyl)adenosine hoặc 6-(3-methyl-2-butenylamino)purine hoặc 6-(,-dimethylallylamino)purine (2iP hay IPA), 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl)aminopurine (dihydrozeatin) Tuy nhiên chúng ít được sử dụng trong nuôi cấy mô vì giá thành cao.Các cytokinin tổng hợp: 6-furfurylaminopurine hoặc N-(2-furanylmethyl)-1H-purin(e)-6-amine (kinetin), 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine hoặc N-(phenylmethyl)-1H-purin(e)-6-amine (BAP hay BA), 1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl) (TDZ)

Ngày nay, người ta cho rằng kinetin không phải là chất tự nhiên mà nó được tạo thành do sự tái sắp xếp lại cấu trúc của một hợp chất khác, có ít nhất hai loại cytokinin tự nhiên có cấu trúc tương tự như cấu trúc của kinetin đã được xác định, đó là những hợp chất tự do hay những hợp chất có gắn với nhóm glucoside hoặc riboside

Trang 24

Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong hình thành mô sẹo:

Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường tạo bướu ở các mô cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), sự tạo rễ bất định và sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1998) [36]

Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thay đổi khác nhau tùy thuộc vào vật liệu được dùng trong nuôi cấy Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin

mà cần phải có sự phối hợp giữa cytokinin và auxin

Trong tăng trưởng mô sẹo và phát sinh hình thái từ mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại và nồng độ của chất ĐHSTTV hiện diện trong môi tường nuôi cấy Qua thí nghiệm cho thấy nếu môi trường có auxin cao thì mô sẹo tăng nhanh, nếu chuyển sang môi trường không có auxin mà có đầy đủ chất dinh dưỡng thì mô sẹo tăng sinh rất chậm Còn nếu giữ nguyên loại và nồng độ của auxin nhưng thay đổi cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì việc phát sinh hình thái cũng có sự thay đổi Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của BAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có sự hiện diện của kinetin có dạng bở và thường không có khả thực vật Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất ĐHSTTV với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan thực vật đó Các mô và các cơ quan khác nhau của một thực vật có thể được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo như rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành, phôi hợp

tử trưởng thành, tượng tầng libe-mộc…

Vai trò của tuổi cơ quan thực vật trong sự tạo mô sẹo: tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mô sẹo Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo Ngược lại, cây non (còn nguyên vẹn hay cắt

Trang 25

đoạn) hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất ĐHSTTV, đặc biệt là auxin

Vai trò của ánh sáng trong quá trình tạo mô sẹo: tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt là đối với mẫu lá (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006) [4]

1.3 Phương pháp lớp mỏng tế bào (Thin cell layers)

1.3.1 Khái niệm

Phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào đã được Trần Thanh Vân đề xuất (2000) và được ứng dụng rộng rãi trong vài năm trở lại đây Phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng nhân nhanh một số đối tượng như: phong lan (Nguyễn Quang Thạch và Hoàng Thị Nga, 2000), dứa (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004) và các cây trồng khác (Dương Tấn Nhựt, 2011) [8]

Hệ thống TLC chứa những mẫu cấy có kích thước nhỏ được cắt ra từ các

cơ quan thực vật khác nhau (chồi, lá, rễ, cụm hoa, đế hoa hoặc các cơ quan của hoa, lá mầm, trụ trên hay trụ dưới lá mầm, vùng chồi đỉnh hoặc phôi) Chúng được cắt theo chiều dọc – được gọi là lTCL hoặc ngược lại, theo chiều ngang – được gọi là tTCL Dạng l TCL (kích thước 1 mm × 0,5 mm hay 10 mm) chỉ bao gồm một loại tế bào, ví dụ một lớp các tế bào biểu mô có thể tách ra từ một số cơ quan hoặc vài lớp từ các tế bào vỏ; trong khi đó, dạng tTCL (kích thước 0,2/0,5

mm hay vài mm bề dày) bao gồm một số lượng nhỏ các dạng tế bào từ các mô khác nhau (biểu mô, vỏ, vùng thượng tầng, mô mạch, cũng như nhu mô) Một số đặc tính phổ biến lTCL và tTCL là tính mỏng, có nghĩa là mảnh cấy có số lượng

tế bào càng ít càng tốt Đặc tính “mỏng” dóng vai trò cực kỳ quan trọng bởi

những phân tử marker dự tuyển cho sự biệt hóa có thể được xác định in situ trong

những tế bào đích (hay tế bào đáp ứng) Sự xác định vị trí như vậy cho phép giới hạn những tế bào đáp ứng (Dương Tấn Nhựt, 2011) [8]

Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phương

Trang 26

pháp này cho mọi loại thực vật Tuy nhiên điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL còn phụ thuộc vào loài và còn phải thử nghiệm

lại tất cả các điều kiện in vitro gồm chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng,

ánh sáng và nhiệt độ

1.3.2 Những tính chất đặc trưng của hệ thống TCL

Có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi loài thực vật, tuy nhiên, cần điều kiện môi trường lý tưởng để mẫu có thể tồn tại được Quá trình này đòi hỏi cần phải tiến hành nghiên cứu tất cả các yếu tố như chất điều hòa sinh trưởng, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…

Mẫu cấy phải mỏng (ít tế bào) để các phân tử đánh dấu của quá trình biệt

hóa có thể định vị in situ trong các tế bào mục tiêu hay trong tế bào cảm ứng,

điều này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn

Sử dụng vài tế bào trong hệ thống TCL vì chúng thường tiếp xúc với tế bào

bị thương do cắt ra khỏi cơ quan (sinh ra nhiều enzyme hay polysaccharide trong quá trình cắt mẫu), chất dinh dưỡng và yếu tố môi trường cần cho sự cảm ứng sinh trưởng và phát triển của thực vật, kiểm soát sự phát sinh hình thái

Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL mang sự tổ chức không gian/thời gian của cơ thể ban đầu Khác với khi sử dụng một tế bào đơn hay thậm chí tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào với tổ chức không gian/thời gian khác biệt với tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mô hay cơ quan cho (Dương Tấn Nhựt, 2011) [8]

 Mẫu nuôi cấy đồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng

 Tần số phát sinh các cơ quan, việc hình thành phôi thấp

Trang 27

 Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến đổi

 Không xảy ra sự tương tác giữa các cơ quan với toàn bộ cơ thể thực vật

 Nhanh chóng đạt kết quả trong thời gian ngắn

Các tính chất khác mong muốn có được trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào: sự đồng nhất về sinh lý, di truyền và có thể ứng dụng phương pháp lớp mỏng tế bào cho mọi thực vật TCL cho phép tái sinh thành một cơ quan chuyên biệt dưới một số điều kiện như: môi trường được kiểm soát chặt chất điều hòa tăng trưởng ngoại sinh được đưa vào trong môi trường nuôi cấy; bổ sung các chất khác vào môi trường

Hệ thống TCL là một hệ thống đơn giản, một mô hình tốt để nghiên cứu lãnh vực cơ bản hay nghiên cứu vào chuyển gene và tái sinh TCL được sử dụng đển nghiên cứu quá trình cảm ứng tạo phôi, tạo cơ quan ở một số lượng lớn các loài thực vật TCL còn là một phương pháp hiệu quả để nhân giống một số lượng lớn thực vật hoặc cơ quan với những tính trạng mong muốn, quy mô rộng, hiệu

quả kinh tế cao Đây còn là hệ thống có thể làm thay đổi đặc tính khó tái sinh in vitro đối với cây rừng, cây thân gỗ, cây một lá mầm

Các hệ thống nuôi cấy mô thực vật như hệ thống TCL cho phép sự tăng trưởng sạch bệnh của các tế bào đã biệt hóa hoặc không biệt hóa trong các hệ thống sinh học dưới những điều kiện có thể kiểm soát được, trong một khoảng thời gian ngắn hơn trong cơ thể thực vật với những protein lạ có thể thi nhận, tách chiết và tinh sạch từ sinh khối hoặc dịch nuôi cấy, hoặc cả hai Khi xét đến khía cạnh này, khả năng điều khiển việc sản xuất với khối lượng lớn các cơ quan mong muốn có khả năng biểu hiện vượt mức hoặc sản xuất vượt mức một loại protein hoặc một hợp chất không mong muốn có thể đạt được bằng cách sử dụng

hệ thống TCL

Tuy nhiên, điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL phụ thuộc vào loài và đòi hỏi phải thử nghiệm lại tất cả các điều kiện, hệ

thống nuôi cấy in vitro gồm các chất điều hòa sinh trưởng, chất dinh dưỡng, ánh

sáng, sự thẩm thấu, nhiệt độ (Dương Tấn Nhựt, 2011) [8]

Trang 28

1.4 Mô sẹo

1.4.1 Khái niệm

Mô sẹo là một khối tế bào không tổ chức Mô sẹo được hình thành từ các

mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt Các tế bào thuộc các

mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phân hóa trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969) Người ta tạo ra mô sẹo để làm nguyên liệu cho việc tạo ra sản phẩm mong muốn như phôi, chồi, rễ (gián tiếp)

Các tế bào hoặc mô thuộc cơ dung hợp tế bào trần, bảo quản nguồn gen in vitro, nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus Nuôi cấy tế bào thực vật trên môi

trường lỏng trên quy mô lớn để sản xuất hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, streoid… Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn cho phát triển thành cây con Sản xuất dòng cây đồng hợp tử Vi nhân giống cây có giá trị khoa học và thương mại

Các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin để cho ra mô sẹo Ngoài ra, còn do sự phân chia tế bào thượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh khối hay sự tái tạo trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979)

1.4.2 Mục đích của nuôi cấy mô sẹo

 Nhân giống in vitro các loài thực vật mà nhân giống đỉnh sinh trưởng khó

thực hiện

 Phục vụ cho quá trình nghiên cứu sự hình thành cơ quan

 Nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn do chọn lọc dòng

 Nuôi cấy huyền phù tế bào

 Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao

1.4.3 Quá trình tạo mô sẹo

Quá trình phát sinh mô sẹo trải qua ba giai đoạn như sau:

Phát sinh mô sẹo: tạo mô sẹo từ sự phản phân hóa tế bào nhu mô gây biến đổi hình thái và chức năng theo hướng tế bào phân sinh

Trang 29

Phân chia tế bào: là quá trình tạo mô sẹo từ sự phân chia tế bào thượng tầng Ở giai đoạn này, các tế bào thượng tầng của song tử diệp không cần phải qua giai đoạn phản phân hóa trong quá trình tạo mô sẹo khi có sự hiện diện của auxintrong môi trường nuôi cấy (Pierik, 1998) [36] Các tế bào phân hóa của mô sẹo có tần suất phân chia tương đối nhanh Các tế bào thượng tầng ở phần nhiều song tử diệp có thể phân chia trong điều kiện thiếu auxin bổ sung

Biệt hóa: tạo mô sẹo từ các xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi Tốc độ phân chia và sinh trưởng giảm cho tới khi dừng hẳn, xuất hiện sự biệt hóa tế bào

và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp

có hoạt tính sinh học Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin

1.4.4 Những nghiên cứu về mô sẹo cây dược liệu

1.4.4.1 Sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis)

Sâm Ngọc Linh là cây dược liệu quan trọng đặc hữu của Việt Nam, đến

nay đã ghi nhận nhiều nghiên cứu của một số tác giả trong nước về tạo mô sẹo và tái sinh chồi, rễ từ mô sẹo thông qua con đường phát sinh phôi soma và con đường phát sinh chồi, rễ bất định Kết quả cho thấy, nuôi cấy trên môi trường tạo

mô sẹo MS có 2 mg/l 2,4-D, sau khoảng 1 tháng nuôi, nhận thấy mô sẹo hình thành ở mép cắt (vị trí gần cuống lá), có cụm mô hình thành trên bề mặt phiến lá

Mô sẹo hình thành gần như trên toàn bộ bề mặt phiến lá sau khoảng 2,5 tháng nuôi Mô sẹo sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ và cấy chuyển sang môi trường mới để tiếp tục nghiên cứu (Mai Trường và cộng sự, 2013) [11]

Khi được nuôi cấy trên môi trường MS có nồng độ 2,4-D giảm (1 mg/l 2,4-D) và có bổ sung 1 mg/l NAA, 0,2 mg/l kinetin,10% nước dừa và để mô ở điều kiện sáng, mô sẹo lá chuyển sang trạng thái cứng hơn, có sự hình thành diệp lục tố do để ở điều kiện sáng, có khả năng sinh phôi và sau đó có khả năng bước vào giai đoạn hình thành phôi soma dạng cầu Nếu tiếp tục cấy chuyền mô sẹo sang môi trường chỉ có 2,4-D (2 mg/l) trong thời gian dài nhận thấy kết cấu mô

Trang 30

sẹo xốp dần, ghi nhận có trường hợp màu hơi vàng và đôi khi có sự hình thành cụm mô với kết cấu tơi xốp, trắng

1.4.4.2 Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

Hiện nay, cây Trinh nữ hoàng cung đã nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học ở cả trong nước và nước ngoài vì các tính năng dược học của nó Kết quả nghiên cứu tạo mô sẹo từ củ cây Trinh nữ hoàng cung cho thấy hai loại auxin NAA và 2,4-D đều có tác dụng tốt tới khả năng tạo mô sẹo và sự sinh trưởng phát triển của mô sẹo Tuy nhiên, 2,4-D trong môi trường kích thích

sự nhân nhanh và kéo dài tế bào lại ít kích thích sự sản xuất các chất trao đổi thứ cấp bằng IAA và NAA (Vũ Thị Lan và cộng sự, 2011) [3]

Thí nghiệm được bố trí trên nền môi trường cơ bản: MS + 30 g/l sucrose + 7% agar + 2mg/l NAA và bổ sung kết hợp với các chất ĐHST là BAP hoặc kinetin hoặc nước dừa ở các nồng độ khác nhau Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp 2mg/l NAA với BAP (môi trường từ SB1 đến SB4): Mô sẹo sinh trưởng và phát triển rất tốt và đồng đều ở giai đoạn đầu, sau đó tốc độ sinh trưởng của các môI trường mới có sự chênh lệch nhau Sau 120 ngày nuôi cấy, sinh khối mô sẹo đạt cao ở môi trường SB1và SB2, lần lượt đạt 26,57 và 31,66 g/bình, tăng 17,1 và 18,96 so với ban đầu Sinh khối mô sẹo giảm dần ở các môi trường SB3 và SB4 Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp 2mg/l NAA với kinetin (môi trường từ SK5 đến SK8): Mô sẹo sinh trưởng và phát triển tương đối tốt, tuy nhiên giữa các môi trường khác nhau trọng lượng mô sẹo thu được có

sự chênh lệch nhau Sau 120 ngày nuôi cấy, sinh khối mô sẹo đạt cao và tương đương nhau ở môi trường SK6 và SK7, lần lượt đạt 22,58 và 22,48 g/ bình tăng 16,14 và 15,36 lần so với ban đầu Đối với các môi trường MS bổ sung kết hợp 2mg/l NAA với nước dừa (môi trường SN10 –SN12): Mô sẹo đều sinh trưởng tốt

ở giai đoạn đầu, sau đó mới có sự khác biệt giữa các môi trường Môi trường SN9 và SN10, mô sinh trưởng và phát triển khá tốt, trọng lượng mô đạt được sau

120 ngày nuôi cấy lần lượt là: 23,26g và 24,30g

Trang 31

1.4.4.3 Cây Thông đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.)

Thông đỏ Taxus wallichiana là loài cây trong vỏ có chứa nhiều Taxol, được dùng để chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú, phân bố ở các vùng ôn

đới của bắc bán cầu Mô sẹo T wallichiana tăng trưởng tốt trên các môi trường

không có nước dừa, trong đó môi trường C3 trong tối là điều kiện tối ưu, cho các

mô sẹo mềm và màu trắng ngà Trong môi trường có nước dừa, một ít mô sẹo chuyển sang màu nâu rồi chết dần Tỷ lệ mô sẹo hóa nâu là 7.45% dưới điều kiện sáng và 3.88% trong tối Mô sẹo trong tối tăng trưởng tốt hơn mô sẹo dưới điều kiện sáng do tác động ức chế của ánh sáng đối với mô sẹo (Gibson et al., 1993)

Ảnh hưởng của nước dừa đối với sự tăng trưởng và phát triển in vitro của thực

vật đã được nghiên cứu rộng rãi nhưng riêng cho đối với nuôi cấy Taxus và tách chiết Taxol thì vẫn chưa có nhiều công trình Kết quả trong nghiên cứu này cho

thấy nước dừa ở nồng độ 20% là không phù hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo T wallichiana cho dù nước dừa có tác động tốt đến nhiều loài khác (Dương Tấn

Nhựt và cộng sự, 2006) [6]

Huyền phù từ nguồn mô sẹo sinh trưởng trong tối sẽ cho màu đỏ đặc trưng, trong khi mô sẹo dưới ánh sáng sẽ tạo ra huyền phù có màu hơi vàng Huyền phù tăng trưởng chậm hơn khi mật độ tế bào ban đầu thấp hơn do khả năng phân chia thấp (Torres, 1989) Trong nghiên cứu, mô sẹo nuôi cấy trong bong tối bở xốp hơn so với mô sẹo dưới điều kiện sáng, do đó chúng dễ dàng hình thành các tế bào đơn và cụm tế bào hơn nếu được chuyển qua nuôi cấy lỏng lắc

Trang 32

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành trong thời gian 4 tháng, từ ngày 05/04/2015 đến ngày 16/08/2015, tại phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về tế bào thực vật, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP.6, P.Linh Trung, Quận Thủ Đức, TP.HCM

2.2 Vật liệu

2.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Nơi thu mẫu: trái, lá non, cuống lá non của cây Bá bệnh được thu tại vườn ươm của Viện Sinh học Nhiệt đới

Chọn mẫu và thu mẫu:

1 Trái Bá bệnh chín vàng, không xanh, không đỏ, không sâu bệnh, dập nát, chọn quả đẹp

2 Lá Bá bệnh là mẫu lá non, xanh nhạt, không sâu bệnh, dập nát

3 Mẫu được hái ngay trên cây, bọc lại bằng bông gòn, đựng vào hộp nhựa

và nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức cấy 3 mẫu Thời gian theo dõi là 45 ngày sau khi cấy mẫu

2.2.2 Điều kiện nuôi cấy

Độ sáng: 45µmol.m-2

.s-1 ± 2 Nhiệt độ: 24 ± 2ºC

Trang 33

g đến 250 g, tủ lạnh để bảo quản hóa chất, phòng lạnh, kệ đặt mẫu, phòng nuôi mẫu, …

Dụng cụ: dao cấy, kẹp cấy, kéo, đèn cồn, đĩa cấy, bông gòn, ống đong các loại 1000 ml, 100 ml, 50 ml, 10 ml; pipetman 1000 l, erlen, khay đựng mẫu cấy, chai thủy tinh dung tích 500 ml, cốc thủy tinh 50 – 1000 ml, bình định mức 25

2 Chất điều hòa sinh trưởng: NAA, BA, TDZ

3 Cồn 96, cồn70, agar (Công ty cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh), các hóa chất pha môi trường (phụ lục), NaOH, HCl, nước cất vô trùng, các chất ĐHSTTV, …

Môi trường thí nghiệm: Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) [34]

cơ bản được bổ sung 8 g/l agar và chất ĐHSTTV Môi trường được điều chỉnh

pH nằm trong khoảng 5,7 – 5,8 bằng NaOH và HCl trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 121C, 1 atm trong 20 phút Tùy theo các nghiệm thức của từng thí nghiệm mà bổ sung vào môi trường chất ĐHSTTV gồm NAA; TDZ và BA theo nồng độ thích hợp ở dạng riêng lẻ hay kết hợp

2.2.5 Cách pha môi trường

Hút chính xác các Stock của môi trường MS, chất ĐHSTTV, cân chính xác agar Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất rồi định mức chính xác đến thể tích đã định sẵn

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh về pH 5,7 – 5,8 bằng NaOH (1N), hoặc HCl (1N) Môi trường được chuẩn bị và hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 atm, trong vòng 20 phút Môi trường sau khi hấp sẽ được trữ ở phòng lạnh rồi đem cấy

Trang 34

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS và phần mềm MicroSoft Excel® 2007, kiểm định Duncan (Duncan,1955) [19] với mức ý nghĩa 5%

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tử diệp

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các BA, NAA riêng

lẻ hay kết hợp đến sự phát sinh hình thái đối với mẫu cấy tử diệp của cây Bá bệnh

Cách tiến hành: Mẫu hạt sau khi khử trùng sẽ loại bỏ lớp vỏ cứng bên ngoài lấy phần tử diệp, mẫu tử diệp được cắt với kích thước 3 x 2 mm (ngang x dọc), đặt lên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA với nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l kết hợp với NAAvới nồng độ lần

Trang 35

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy tử diệp cây Bá bệnh

2.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá non

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các BA, NAA riêng

Cách tiến hành: Mẫu lá non sau khi khử trùng sẽ loại bỏ phần hư hại bên ngoài do khử trùng, mẫu lá non được cắt với kích thước 4 x 0,5-1,0 mm (ngang x dọc), đặt lên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là

BA với nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l kết hợp với NAA với nồng

Trang 36

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy lá non cây Bá bệnh

2,5

N2B0 N2,5B0

N2B0,5 N2,5B0,5

N2B1 N2,5B1

N2B1,5 N2,5B1,5

N2B2 N2,5B2 3,0 N3B0 N3B0,5 N3B1 N3B1,5 N3B2 3,5 N3,5B0 N3,5B0,5 N3,5B1 N3,5B1,5 N3,5B2 4,0 N4B0 N4B0,5 N4B1 N4B1,5 N4B2

2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy cuống lá non

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các BA, NAA riêng lẻ hay kết hợp đến sự phát sinh hình thái đối với mẫu cấy cuống lá non của cây Bá bệnh

Cách tiến hành: Mẫu cuống lá non sau khi khử trùng sẽ loại bỏ phần hư hại bên ngoài do khử trùng, mẫu cuống lá non được cắt với kích thước 3 x 1 mm (ngang x dọc), đặt lên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA với nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l kết hợp với NAA

với nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 mg/l (Theo bảng 2.3)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại, mỗi lần lập lại gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức chứa 3 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%), trọng lượng tươi (g), đặc điểm hình thái của mô sẹo

Trang 37

riêng lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy cuống lá non cây Bá bệnh

2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tử diệp

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các BA, TDZriêng

Cách tiến hành: Mẫu tử diệp sau khi khử trùng sẽ loại bỏ lớp vỏ cứng bên ngoài lấy phần tử diệp, mẫu tử diệp được cắt với kích thước 3 x 2 mm (ngang x dọc), đặt lên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là

BA với nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l kết hợp với TDZ với nồng

Trang 38

Bảng 2.4 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng

lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy tử diệp cây Bá bệnh

2.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá non

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các BA, TDZ riêng

Cách tiến hành: Mẫu lá non sau khi khử trùng sẽ loại bỏ phần hư hại bên ngoài do khử trùng, mẫu lá non được cắt với kích thước 4 x 1 mm (ngang x dọc), đặt lên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA với nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l kết hợp với TDZ với nồng độ lần

Trang 39

lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy lá non cây Bá bệnh

2.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của BA và TDZ riêng lẻ hay kết hợp lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy cuống lá non

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các BA, TDZ riêng

lẻ hay kết hợp đến sự phát sinh hình thái đối với mẫu cấy cuống lá non của cây

Bá bệnh

Cách tiến hành: Mẫu cuống lá non sau khi khử trùng sẽ loại bỏ phần hư hại bên ngoài do khử trùng, mẫu cuống lá non được cắt với kích thước 3 x 1 mm (ngang x dọc), đặt lên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là BA với nồng độ lần lượt là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l kết hợp với TDZ

với nồng độ lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0mg/l (Theo bảng 2.6)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức chứa 3 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hình thành mô sẹo (%), trọng lượng tươi (g), đặc điểm hình thái của mô sẹo

Trang 40

lẻ hay kết hợp lên mẫu cấy cuống lá non cây Bá bệnh

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	2,14 MB