Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm

Các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh azogin ở 15 tỉnh miền Bắc, Trung và miền Nam trên điện tích hàng chục ngàn hecta cho thấy, trong cùng điều kiện sản xuất, ru

i

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS Huỳnh Quang Phước, Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả có được của đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn không sao chép kết quả của người khác dưới bất cứ hình thức nào Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án tốt nghiệp của mình

Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện đề tài

Phạm Ngọc Yến Trinh

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm nay

Qua bốn năm học tập tại Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh em đã được các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô, nhờ các thầy cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS Huỳnh Quang Phước, thầy đã tận tình quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em để em có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Em cũng xin cảm ơn các thầy cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đồ án tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2015 Sinh viên thực hiện đề tài

Phạm Ngọc Yến Trinh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 1

4 Tình hình nghiên cứu 1

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 1

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 3

5 Phương pháp nghiên cứu 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Sự chuyển hóa nitơ 7

1.1.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật 7

1.1.2 Sự hấp thụ đạm ở thực vật 9

1.1.2.1 Sự dùng đạm khoáng bởi thực vật có vài đặc tính đáng chú ý 9

1.1.2.2 Sự khử nitrate 10

1.1.2.3 Sự tổng hợp amino acid 10

1.1.2.4 Sinh tổng hợp protein 12

1.1.2.5 Liên hệ giữ khử nitrate với hô hấp và quang hợp 12

1.1.3 Chu trình nitơ tự nhiên 12

1.1.3.1 Quá trình amon hóa 15

1.1.3.2 Quá trình nitrate hóa 16

1.1.3.3 Quá trình phản nitrite hóa 17

1.1.3.4 Quá trình cố định nitơ phân tử 17

1.1.3.5 Các vi sinh vật cố định nitơ phân tử 19

iv

1.2 Vi khuẩn Paenibacillus 21

1.2.1 Phân loại 21

1.2.2 Đặc điểm hình thái 21

1.2.3 Sự phân bố của Paenibacillus 23

1.2.4 Một số đặc tính khác của Paenibacillus 23

1.3 Phân bón vi sinh cố định đạm 23

1.3.1 Định nghĩa 23

1.3.2 Phân loại 24

1.3.3 Nguyên liệu sản xuất phân bón 25

1.3.3.1 Mật rỉ đường 25

1.3.3.2 Than bùn 27

1.3.4 Quy trình sản xuất 28

1.3.4.1 Quy trình sản xuất tổng quát 28

1.3.4.2 Thuyết minh 29

1.3.5 Các yêu cầu về phân bón vi sinh cố định đạm 30

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu, thiết bị 31

2.1.1 Vật liệu 31

2.1.1.1 Mật rỉ 31

2.1.1.2 Than bùn 31

2.1.1.3 Nguồn phân lập vi sinh vật 31

2.1.2 Thiết bị 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu của mật rỉ 31

2.2.1.1 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS 31

2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường tổng 32

2.2.1.3 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng phương pháp đo độ khúc xạ 32

2.2.2 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu của than bùn 32

v

2.2.2.1 Xác định carbon hữu cơ tổng số bằng phương pháp Walkley – Black

(TCVN 9294-2012) 32

2.2.2.2 Xác định acid humic và acid fulvic (TCVN 8561-2010) 33

2.2.2.3 Xác định N tổng số (TCVN 8557-2010) 33

2.2.2.4 Xác định N hữu hiệu (TCVN 9295-2012) 33

2.2.2.5 Xác định P2O5 tổng số (TCVN 8563 – 2010) 34

2.2.2.6 Xác định P2O5 hữu hiệu (TCVN 8559-2010) 34

2.2.2.7 Xác định K2O tổng số (TCVN 8660-2011) 35

2.2.2.8 Xác định K2O hữu hiệu (TCVN 8662-2011) 35

2.2.2.9 Xác định pH (TCVN 5979-2007) 35

2.2.2.10 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến độ ẩm không đổi 36

2.2.3 Phương pháp phân tích vi sinh 36

2.2.3.1 Phương pháp phân lập 36

2.2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 36

2.2.3.3 Phương pháp nhuộm bào tử 36

2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính của vi sinh vật 37

2.2.4.1 Định tính nitơ trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler 37

2.2.4.2 Định lượng nitơ trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp Kjeldahl 37

2.2.4.3 Xác định khả năng tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) của vi khuẩn bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) 38

2.2.5 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 39

2.2.5.1 Đếm khuẩn lạc 39

2.2.5.2 Xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang 39

2.2.6 Định danh vi sinh vật 39

2.3 Bố trí thí nghiệm 41

2.3.1 Xác một số chỉ tiêu của mật rỉ 42

2.3.2 Xác định một số chỉ tiêu của than bùn 42

2.3.3 Phân lập vi sinh vật 43

vi

2.3.4 Xác định hoạt tính của vi sinh vật 43

2.3.5 Khảo sát điều kiện lên men 43

2.3.5.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng 44

2.3.5.2 Xác định hàm lượng mật rỉ bổ sung 45

2.3.5.3 Xác định hàm lượng khoáng bổ sung 45

2.3.6 Khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn 46

2.3.7 Phương pháp kiểm tra chất lượng chế phẩm 47

2.3.7.1 Kiểm tra mật độ vi sinh vật 47

2.3.7.2 Kiểm tra các chỉ tiêu than bùn 47

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 49

3.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu của nguyên liệu 49

3.1.1 Mật rỉ 49

3.1.2 Than bùn 49

3.2 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái, sinh hóa 50

3.2.1 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50

3.2.2 Tuyển chọn các chủng cố định nitơ mạnh 53

3.2.3 Khả năng tổng hợp acid indole-3-acetic (IAA) của vi sinh vật 54

3.2.4 Định danh bằng sinh học phân tử chủng P2 55

3.3 Khảo sát thời gian và môi trường tối ưu để lên men thu sinh khối 55

3.3.1 Khảo sát thời gian lên men 55

3.3.2 Khảo sát tỉ lệ mật rỉ bổ sung 56

3.3.3 Khảo sát hàm lượng khoáng bổ sung 58

3.4 Kết quả khảo sát điều kiện phối trộn với than bùn 59

3.5 Kết quả kiểm tra chế phẩm phân bón sau khi phối trộn với than bùn 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC A: CÁC CÁCH TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1

PHỤ LỤC B: THỐNG KÊ CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 35

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tóm tắt các quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 20

Bảng 1.2 Phân loại vi khuẩn Paenibacillus 21

Bảng 1.3 Ưu và nhược điểm của chất mang khử trùng và không khử trùng 25

Bảng 1.4 Thành phần dinh dưỡng của rỉ mật mía 26

Bảng 1.5 Thành phần hóa học của rỉ đường mía 27

Bảng 1.6 Thành phần hóa học của than bùn ở các vùng khác nhau 28

Bảng 2.1 Tên các loại thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 32

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu của mật rỉ 42

Bảng 2.3 Các chỉ tiêu của than bùn 42

Bảng 2.4 Xác định hoạt tính của vi sinh vật 43

Bảng 2.5 Xây dựng đường cong tăng trưởng của vi sinh vật 44

Bảng 2.6 Mật độ của vi sinh vật trên môi trường bổ sung mật rỉ qua các mốc thời gian 45

Bảng 2.7 Mật độ của vi sinh vậttrên môi trường bổ sung khoáng qua các mốc thời gian 46

Bảng 2.8 Mật độ tế bào thay đổi theo độ ẩm 47

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của mật rỉ 49

Bảng 3.2 Các chỉ tiêu của than bùn trước khi ủ với vi sinh vật 50

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của 4 chủng vi sinh vật 51

Bảng 3.4 Kết quả nhuộm Gram và nhuộm bào tử 52

Bảng 3.5 Hàm lượng nitơ trong dịch nuôi cấy của các chủng vi sinh vật 54

Bảng 3.6 Khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật 54

Bảng 3.7 Mật độ của vi sinh vật ở các mốc thời gian khác nhau trên môi trường bổ sung mật rỉ 57

Bảng 3.8 Mật độ của các vi sinh vật ở các mốc thời gian khác nhau trên môi trường bổ sung khoáng 58

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của vi sinh vật 60

Bảng 3.10 Các chỉ tiêu của phân bón 61

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Con đường glutamin (sự gia nhập của NH3 và glutamin) 11

Hình 1.2 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên 14

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử trong quá trình khử và oxy hóa nitơ 19

Hình 1.4 Liên kết giữa các bào tử P stellifer trưởng thành với nhau 22

Hình 1.5 Quy trình sản xuất phân bón vi sinh 29

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành 41

Hình 3.1 Phản ứng màu với thuốc thử Nessler 53

Hình 3.2 Khả năng tăng trưởng của chủng P2 trên môi trường NB 56

Hình 3.3 Biến đổi mật độ tế bào của chủng P2 trong các môi trường qua các mốc thời gian trên môi trường bổ sung mật rỉ 57

Hình 3.4 Biến đổi mật độ tế bào của chủng P2 trong các môi trường bổ sung khoáng qua các mốc thời gian 59

1

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong nền kinh tế của nước ta hiện nay, nông nghiệp chiếm vị trí quan trọng Một trong những biện pháp hàng đầu để đẩy mạnh sản xuất nông nghiệp là sử dụng phân bón Do nhu cầu xã hội ngày càng phát triển cao đòi hỏi con người sử dụng nhiều biện pháp khác nhau để tăng năng suất sản lượng sản phẩm

Tuy nhiên, đa số nông dân cung cấp nitơ cho cây trồng đều ở dạng phân bón hóa học với hiệu suất thấp, vì thế dư lượng các chất hóa học trong các loại phân này gây ô nhiễm môi trường đất làm đất bị thoái hóa, chua hóa, làm cho môi trường nước mặt cũng như nước ngầm tích lũy nhiều NO3-, NO2-, gây ra hiện tượng phì hóa nước,…Ngoài ra, bón nhiều phân đạm vào thời kỳ thu hoạch đã làm tăng đáng kể lượng nitơ có trong sản phẩm mà con người sử dụng hàng ngày cũng rất có hại cho sức khỏe Đồng thời, nồng độ nitrate trong nước cao làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người, đặc biệt đối với trẻ em dưới 4 tháng tuổi Trong đường ruột, các nitrate

bị khử thành nitrite, các nitrite tạo ra được hấp thụ vào máu kết hợp với hemoglobin làm khả năng chuyên chở oxy của máu bị giảm Nitrite còn là nguyên nhân gây ung thư tiềm tàng

Vì vậy, việc tìm ra nguồn phân bón hữu cơ vi sinh để giảm sử dụng phân bón hóa học là vấn đề cấp thiết hiện nay Đó cũng là lý do để sinh viên thực hiện đề tài

“Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn cố định đạm

Nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm trên nền chất mang than bùn

4 Tình hình nghiên cứu

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

2

Năm 1896 phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức được

đặt tên là Nitragin Nitragin là loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizolium do

Beijerink phân lập năm 1888 và được Fred đặt tên vào năm 1889 dùng để bón cho các loại cây thích hợp họ đậu Ở Mỹ sản xuất chế phẩm Nitroculture, ở Anh sản xuất loại phân Nitrbacterin Tới nay hầu hết các nước đều sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây bộ đậu đặc biệt là cây đậu tương

Khả năng cố định đạm của vi khuẩn đạm cố định hội sinh Azospirillum được

phát hiện từ 1922, nhưng vai trò của nó trong hoạt động cố định đạm vùng rễ của cây hòa thảo chỉ được biết đến vào những năm thập kỷ 70 nhờ việc tìm ra nơi trú ngụ của chúng

Năm 1976 đã phát hiện Azospirillum bên trong và bên bề mặt của mô rễ, tạo ra

mối quan hệ cộng sinh với cây, chúng có thể tồn tại trong đất vùng rễ, trên bề mặt

rễ Đây là loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm lớn, chúng nhận các chất hữu cơ như pectin, acid hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng để phát triển và cố định đạm, đồng thời cung cấp các hợp chất nitơ cho cây chủ

Nghiên cứu của Puneet (1998) cho thấy nếu phối hợp Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphate như Aspergillus niger sẽ làm tăng năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9% Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải phosphate như Bacillus sp.,

Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa, bông vải lên 10 – 20%

Năm 2008, Anelise Beneduzi và cộng sự đã phân lập được một số chủng

Bacillus và Paenibacillus từ cánh đồng lúa ở miền nam Brazil Việc phân lập vi

khuẩn này từ đất ôn đới và cận nhiệt đới, kết hợp khả năng cố định đạm với việc sản xuất các chất có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật, cũng có thể làm tăng đáng kể năng suất của cây trồng ngũ cốc ở Brazil

Năm 2013, chế phẩm sinh học Nano-Gro được sản xuất bởi công ty Custom Biologicals, Inc Hoa Kỳ và được độc quyền phân phối tại Việt Nam bởi công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn MBT Chế phẩm này có chứa nhiều loại vi sinh vật có tác dụng tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất và có lợi cho cây, ức chế và cô lập

3

các vi sinh vật gây hại như Trichoderma viride, Bacillus subtilis, đặc biệt loài vi khuẩn cố định đạm Paenibacillus polymyxa có mật số tối thiểu lên đến 5.109CFU/gram

Hình 1 Chế phẩm sinh học Nano-Gro

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, phân vi sinh vật cố định đạm cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện Năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và một số vi sinh vật phân giải lân

Phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh được nghiên cứu và phát triển từ những năm 90 của thế kỷ XX trong khuôn khổ của đề tài khoa học cấp Nhà nước KC.08.01 Sản phẩm được gọi dưới tên azogin, Rhizolua Các thử nghiệm sử dụng phân vi sinh vật cố định nitơ hội sinh (azogin) ở 15 tỉnh miền Bắc, Trung và miền Nam trên điện tích hàng chục ngàn hecta cho thấy, trong cùng điều kiện sản xuất, ruộng lúa được bón phân azogin đều tốt hơn so với đối chứng, biểu hiện qua bộ lá phát triển tốt hơn, tỷ lệ nhánh hữu hiệu và số bông/khóm nhiều hơn đối chứng Năng suất hạt tăng 4 - 25%, đặc biệt nhiều nơi bón azogin và giảm 20% phân khoáng vẫn cho năng suất lúa cao hơn so với đối chứng

Bón phân vi sinh vật cố định nitơ cho cây trồng có thể thay thế một phần phân đạm khoáng Kết quả nghiên cứu của các đề tài cấp Nhà nước KC.08.01 (1991 - 1995) và KHCN.02.06 (1996 - 2000) cho biết, có thể tiết kiệm được lượng phân

Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm được 20% phân bón

vô cơ NPK nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với đối chứng 15 – 50%, cà chua tăng 12 – 34%, lạc tăng 30% và làm giảm đáng kể bệnh héo xanh

Nguyễn Thúy Hương, Nguyễn Thùy Quý Tú (2013) đã nghiên cứu thực hiện

được chế phẩm biopolyter – Azotobacter để sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh

cố định đạm Phương pháp lên men bán rắn trên giá thể hạt polyter thu sinh khối

Azotobacter, tạo chế phẩm biopolyter – Azotobacter có nhiều ưu thế hơn so với

phương pháp lên men truyền thống lên men chìm vì đơn giản, hiệu suất thu sinh

khối tăng hơn từ 3,2 đến 4,3 lần Mật độ Azotobacter của chế phẩm đạt 3,80.109CFU/g

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đã có những phân bón vi sinh có tác dụng tốt cho cây trồng, giúp cây trồng phát triển cân đối, tăng năng suất cây trồng, tăng

độ phì nhiêu cho đất, làm cho đất trở nên tơi xốp và bảo vệ môi trường như:

Phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh là nguồn phân được sản xuất theo quy trình công nghiệp mang phần lớn chất hữu cơ và một số thành phần quan trọng cho cây

trồng và đặc biệt là nguồn vi sinh vật có ích cho đất bao gồm Aspergillus,

Azotobacter, Bacillus đều đạt mật độ trên 106 CFU/g

5

Hình 2 Phân hữu cơ vi sinh Sông Gianh

Phân hữu cơ vi sinh đa chức năng số 05 – KC 04 – 04: đây là sản phẩm của đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số KC 04 – 04 Phân này có nguồn gốc

từ rác thải trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội nên rất giàu carbon Các chủng vi sinh vật bao gồm Azotobacter, Bacillus, Enterobacter để có mật độ trên 109 CFU/g, tạp khuẩn <1%

Các nghiên cứu ở Việt Nam và nước ngoài cho thấy, phân bón hữu cơ vi sinh

có tác dụng tốt đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng, giảm giá thành, nâng cao hiệu quả trồng trọt và cải tạo môi trường đất canh tác

5 Phương pháp nghiên cứu

− Phương pháp phân lập

− Phương pháp đếm khuẩn lạc

− Phương pháp nhuộm Gram

− Phương pháp nhuộm bào tử

− Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

− Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler

− Phương pháp xác định hàm lượng IAA

− Phương pháp định lượng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl

6

− Phương pháp so màu trắc quang

− Phương pháp DNS xác định đường khử

− Phương pháp xác định các chỉ tiêu than bùn

− Sử dụng phần mềm Statgraphic xử lý số liệu thô, tính giá trị trung bình và so sánh sự khác biệt của các nghiệm thức

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sự chuyển hóa nitơ

1.1.1 Vai trò của nitơ đối với thực vật

Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất Nitơ có mặt trong rất nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng lượng, đến hoạt động sinh lý của cây

Nitơ là nguyên tố đặc thù của protein mà protein lại có vai trò cực kỳ quan trọng đối với cây Protein là thành phần chủ yếu tham gia cấu trúc nên hệ thống chất nguyên sinh trong tế bào, cấu tạo nên hệ thống màng sinh học, các bào quan trong tế bào

Nitơ có trong thành phần của acid nucleic (DNA và RNA) Ngoài chức năng duy trì và truyền thông tin di truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào…

Nitơ là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trên trái đất

Nitơ là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin Đây là những chất quan trọng trong quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào và của cây

Nitơ tham gia vào thành phần của ADP, ATP, có vai trò quan trọng trong trao đổi năng lượng của cây

Nitơ tham gia vào thành phần của phytochrome có nhiệm vụ điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển của cây có liên quan đến ánh sáng như phản ứng quang chu kỳ, sự nảy mầm, tính hướng quang

Hàm lượng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật thường dao động từ 1 – 3% Tuy hàm lượng trong cây thấp, nhưng nitơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất đối với đời sống thực vật cũng như toàn bộ thế giới hữu cơ

Trong môi trường sống của thực vật, nitơ tồn tại dưới 2 dạng:

Thường các nguồn nitơ vô cơ (NO3-, NH4+) được cây đồng hóa tốt hơn các nguồn nitơ hữu cơ (ngoại trừ urea, asparagin, glutamine dễ phân giải thành NH3)

Do đó, trong điều kiện tự nhiên đối với sự dinh dưỡng đạm của thực vật, các vi sinh vật đất có ý nghĩa rất to lớn, chúng khoáng hóa nitơ hữu cơ và cuối cùng chuyển hóa thành NH3

Tất cả các nitrate trong đất, hay trong các nguồn nước như ao, hồ, ruộng đều được tạo thành do hoạt động sống của vi khuẩn nitrit hóa và vi khuẩn nitrate hóa Còn các vi khuẩn amon (ammonium) hóa cũng phát triển mạnh, chúng phân giải protein của các xác bã động, thực vật và vi sinh vật, bổ sung lượng dự trữ amon cho đất

Riêng nguồn nitơ phân tử của khí quyển (N2) rất trơ về mặt hóa học không được cây xanh đồng hóa Chỉ có nhóm vi sinh vật đất mới có khả năng đồng hóa

nguồn nitơ này Quan trọng nhất là các vi khuẩn thuộc giống Azotobacter,

Clostridium, vi khuẩn lam (Cyanobacteria) sống tự do và các vi sinh vật cộng sinh

trong nốt sần của rễ một số loại cây bộ đậu, phi lao hoặc trong một số loại cây khác

Vì cây rất nhạy cảm với nitơ Nitơ có tác dụng hai mặt đến năng suất cây trồng, nếu cây trồng thừa hay thiếu nitơ đều có hại

Thừa nitơ: khác với các nguyên tố khác, việc thừa nitơ có ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất ở cây trồng Cây sinh trưởng quá mạnh, thân lá tăng nhanh mà mô cơ giới kém hình thành nên cây rất yếu, giảm năng suất nghiêm trọng và có trường hợp không có thu hoạch

Thiếu nitơ: thiếu nitơ cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy, giảm năng suất Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít Trong trường hợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh trưởng và phát triển bình thường

1.1.2 Sự hấp thụ đạm ở thực vật

1.1.2.1 Sự dùng đạm khoáng bởi thực vật có vài đặc tính đáng chú ý

Cây non thích NH4+ (cà chua, bắp, lúa; ngoại lệ: mía, bông vải)

NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ hay Mg2+ Do đó, việc dùng NH4+ quá liều sẽ gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ (lúa mì) Sự bổ sung Ca2+ làm giảm tính độc của NH4+ Ngược lại, NO3- giúp sự thấm cation, nhất là K+ NH4+ cản trở NO3-, nhưng giúp các ion phosphor vào tế bào

Sự hạ thấp pH kích thích sự hấp thu và đồng hóa nitrate, trong khi sự tăng pH kích thích sự hấp thu và đồng hóa amonium Tuy nhiên, khi pH bên ngoài cao, amonia (base yếu) khuếch tán nhanh vào tế bào chất (acid hơn) Do đó, amonia,

thiết yếu ở pH trung tính, trở thành độc trong môi trường kiềm Spirulina platensis

là trường hợp đặc biệt, có thể dùng amonia ở nồng độ cao, như nguồn nitrogen duy

10

nhất, ngay cả ở pH 10 hay cao hơn, do khả năng duy trì pH cao trong tế bào, cản trở amonia vào tế bào Sự thừa NH4+ thường rất độc so với NO3-, vì gây nhiều xáo trộn trong tính thấm của tế bào

Hàm lượng đường của rễ có vai trò quan trọng trong sự dinh dưỡng đạm, vì các acid cetonic được tổng hợp từ đường giúp sự gia nhập nitơ vào amino acid Do

đó, tính độc của NH4+ sẽ rất mạnh nếu quang hợp yếu, khi ấy sự dùng NH4+ hạ thấp hàm lượng tinh bột

1.1.2.2 Sự khử nitrate

Giai đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm khoáng là sự khử nitrate, nói chung xảy ra ở rễ, trong tối Tuy nhiên, ở nhiều loài, nhất là ở các cây dạng cỏ, sự khử được thực hiện đồng thời trong lá, dưới ánh sáng (phân nửa trong rễ, phân nửa trong

lá lúa mì; gần như hoàn toàn trong lá cà chua)

Sự khử nitrate xảy ra theo hai giai đoạn: khử nitrate (NO3-) thành nitrite (NO2-), và khử nitrite thành amonia:

NO3- + 2H+ + 2e-  NO2- + H2O

NO2- + 6H+ + 6e-  NH3 + H2O + OHNitrate được khử trong cytosol nhờ nitrate reductase, sau đó nitrite vào diệp

-lạp của lá hay tiền -lạp của rễ để được tiếp tục khử nhờ nitrite reductaz NH3 có thể ở dạng R-NH2 hay dạng ion hóa NH4+ khi nhận 1 H+

1.1.2.3 Sự tổng hợp amino acid

Các amino acid được tổng hợp từ sự cố định nhóm NH3 (được hấp thu dưới dạng NH4+ hay từ sự khử nitrate) trên các acid -cetonic, theo ba quá trình căn bản sau:

 Sự amin hóa khử

Phản ứng amin hóa khử được thực hiện trong ti thể từ các acid cetonic của chu trình Krebs, và hầu như chỉ xảy ra ở các nấm, ít phổ biến ở thực vật (như hai quá trình còn lại)

Ví dụ, glutamate được tổng hợp từ -cetoglutarate, nhờ glutamate dehydrogenase (GDH)

11

Glutamate: HOOC-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH

-cetoglutarate: HOOC-CH2-CH2-CO-COOH

 Con đường glutamin

Glutamin (amid của acid glutamic) là dạng đạm dự trữ của hạt và củ Sự tổng

hợp glutamin từ glutamate cần NH3, ATP và glutamin sythetase (GS):

NH3 + HCOO-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH

CO(NH2)-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH + H2O ATP ADP + Pi

Hình 1.1 Con đường glutamin (sự gia nhập của NH3 và glutamin)

Glu: glutamat; Gln: glutamin; -GC: -cetoglutarat; GS: glutamin synthetaz;

GOGAT: glutamin synthaz hay glutamin --cetoglutarat aminotransferaz

GDH là enzyme ti thể, GOGAT chỉ có trong các lạp, GS nửa trong cytosol

(nơi khử nitrate) và nửa trong các lạp (diệp lạp ở lá hay tiền lạp không sắc tố ở rễ)

Diệp lạp là bào quan rất thích hợp cho hoạt động của hệ thống GS + GOGAT vì

chứa nhiều chất khử và ATP cần cho hệ thống hoạt động Hơn nữa, không chỉ giàu

nitrite NH3 từ sự khử nitrite, các diệp lạp còn tham gia tái đồng hóa NH3 sinh ra từ

sự quang phosphoryl hóa

 Sự chuyển amin

Phản ứng này rất phổ biến và cũng nhờ một acid cetonic nhưng nhóm amin

(-NH2) có nguồn gốc từ một amino acid thay vì NH3:

R1-CH(NH2)-COOH + R2-CO-COOH  R1-CO-COOH + R2-CH(NH2)-COOH

-CG

Glu

-Amid của aspartate là asparagine, dạng đạm vận chuyển và dự trữ thông thường nhất (khoai tây chứa 1,4 mg asparagine/g mô tươi)

Ngoài ba quá trình căn bản, các phản ứng khác cũng tạo amino acid: sự amin hóa một acid không bão hòa, sự khử carboxyl hóa của một diacid amin, sự hóa vòng glutamate

Tóm lại, sự tổng hợp amino acid được thực hiện một phần ở các nơi khử nitrate (rễ hay lá) Sau đó, sự biến đổi tiếp tục, qua sự chuyển amin, trong mọi loại

mô thực vật, đặc biệt trong ti thể và diệp lạp, các bào quan sẵn sàng cung cấp các acid cetonic, các chất khử (NADH và NADPH) và ATP

1.1.2.4 Sinh tổng hợp protein

Sinh tổng hợp protein trong tế bào được thực hiện trên các ribosome của tế bào chất, ti thể và diệp lạp Trình tự amino acid trong protein được xác định nhờ thông tin di truyền được giữ trong các phân tử DNA của nhân, ti thể và diệp lạp

1.1.2.5 Liên hệ giữ khử nitrate với hô hấp và quang hợp

Chất cho e- trong sự khử nitrate thành nitrite là NADH được cung cấp trực tiếp trong tối nhờ hô hấp và gián tiếp dưới ánh sáng nhờ quang hợp (NADPH diệp lạp chuyển thành NADH tế bào chất)

Do đó, có sự cạnh tranh giữa nitrate với O2 và CO2: O2 của không khí nhận e

-từ NADH, nên khi có nitrate hệ số hô hấp CO2/O2 của rễ gia tăng; CO2 của không khí nhận e- từ NADPH, do đó khi có nitrate sự đồng hóa CO2 (quang hợp) giảm ở

lá (Bùi Trang Việt, 2002)

1.1.3 Chu trình nitơ tự nhiên

Mặc dù nitơ trong khí quyển Trái Đất là một nguồn phong phú, nhưng cây trồng không hấp thụ trực tiếp được mà phải nhờ các vi sinh vật Quá trình amon hóa

13

là cần thiết để chuyển đổi khí nitơ thành các dạng mà sinh vật có thể sử dụng được

ở dạng dễ tiêu ammonia, quá trình này làm cho nitơ trở thành một thành phần quan trọng trong quá trình tạo ra nguồn dinh dưỡng cho cây trồng

Hợp chất nitơ vô cơ đơn giản và đầu tiên là nitơ tự do trong không khí Nitơ vô

cơ này chuyển hóa thành nitơ hữu cơ nhờ quá trình cố định nitơ của vi sinh vật, thực vật Khi cơ thể sinh vật chết đi thì lượng nitơ này tồn tại trong đất Dưới tác dụng của nhóm vi sinh vật hoại sinh thực hiện quá trình amon hóa phân giải thành các amino acid Các amino acid này lại được một nhóm vi sinh vật phân giải thành ammonia Ammonia tiếp tục được chuyển hóa thành các hợp chất của nitrate, nitrite nhờ nhóm vi sinh vật nitrite hóa Dạng nitrate được chuyển hóa thành nitơ phân tử nhờ quá trình phản nitrate hóa, trả lại nitơ cho khí quyển Bên cạnh đó, dưới tác động của sấm sét một lượng nitơ trong không khí bị oxy hóa ở nhiệt độ cao và áp suất mạnh tạo thành NO3-

Như vậy, vòng tuần hoàn nitơ được khép kín Trong hầu hết các giai đoạn chuyển hóa của vòng tuần hoàn đều có mặt của các vi sinh vật khác nhau Nếu sự hoạt động của nhóm nào đó bị ngừng lại thì toàn bộ sự chuyển hóa của vòng tuần hoàn bị ảnh hưởng rất nghiêm trọng

Chu trình nitơ là cơ chế duy trì sự cân bằng nitơ trên Trái Đất Lượng nitơ sinh học được tích lũy trong đất nhờ các vi sinh vật cố định đạm có ý nghĩa to lớn đối với nông nghiệp, đã tạo ra 1 biện pháp làm giàu nguồn đạm cho đất và giảm nguy

cơ ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiều phân bón hóa học

14

Hình 1.2 Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên

15

1.1.3.1 Quá trình amon hóa

Là quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ dưới tác dụng của các loài vi sinh vật thành ammonia cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng

 Amon hóa urea

Urea là hợp chất hữu cơ đơn giản chứa 46,6% nitơ, được sản xuất trong các nhà máy phân bón bằng cách tổng hợp

Urea có trong nước tiểu người và động vật, chiếm khoảng 22% nước tiểu Vì thế đó là nguồn cung cấp đạm tốt cho cây trồng

Mặc dù lượng chất hữu cơ được vùi vào trong đất rất lớn, hàm lượng dinh dưỡng của các chất này nằm trong đất khá nhiều nhưng cây trồng không thể hấp thụ được trực tiếp mà phải thông qua quá trình phân hủy và chuyển hóa của các loài vi sinh vật để thành các chất dinh dưỡng dễ tiêu thì cây trồng mới có thể hấp thụ được

Vì thế, các vi sinh vật tham gia vào quá trình amon hóa có vai trò hết sức quan trọng

Quá trình amon hóa urea chia thành 2 giai đoạn:

Đầu tiên dưới tác dụng của enzyme urease được tạo bởi các vi sinh vật, urea sẽ

bị phân hủy tạo thành muối carbonat amonium

CO(NH2)2 + 2H2O  (NH4)2CO3Sau đó, carbonat amonium được chuyển hóa thành NH3, CO2, H2O bằng phản ứng hóa học thông thường

(NH4)2CO3  3NH3 + CO2 + H2O

 Amon hóa protein

Protein là thành phần quan trọng của tế bào sinh vật, hàng năm lượng protein được đưa vào đất với số lượng rất lớn (xác hữu cơ, phân chuồng, phân xanh, phân rác,…) Trong protein chứa khoảng 15 – 17% nitơ nhưng cây trồng không hấp thụ trực tiếp protein mà phải trải qua quá trình amon hóa

16

Quá trình này có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí nhờ nhóm vi sinh vật phân hủy protein có khả năng tiết enzyme protease bao gồm proteinase và peptidase

Dưới tác dụng của enzyme protease, phân tử protein sẽ được phân giải thành các polypeptide và oligopeptide Các chất này tiếp tục được phân hủy thành các amino acid nhờ enzyme peptidase ngoại bào hoặc được tế bào vi khuẩn hấp thụ rồi sau đó phân hủy tiếp thành amino acid trong tế bào Các amino acid này sẽ được sử dụng một phần vào quá trình sinh tổng hợp protein của vi sinh vật, một phần khác đi theo các con đường phân giải khác nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác

Quá trình khử amin sẽ xảy ra theo một trong những phản ứng sau:

H2S và các sản phẩm bốc mùi khó chịu như indol, scatol

1.1.3.2 Quá trình nitrate hóa

Dưới tác dụng của một số vi sinh vật thì NH4+ được hình thành từ quá trình amon hóa sẽ được tiếp tục chuyển hóa thành NO2- (nitrite) rồi thành NO3- (nitrate) Giai đoạn nitrite hóa: là quá trình oxy hóa NH4+ tạo thành NO2- được tiến hành bởi vi khuẩn nitrite hóa thuộc nhóm tự dưỡng hóa năng, có khả năng oxy hóa NH4+bằng oxy không khí và tạo ra năng lượng

NH4+ + 3

2 O2  NO2- + H2O + 2H + năng lượng

17

Giai đoạn nitrate hóa: Sau quá trình nitrite hóa thì các vi khuẩn thuộc nhóm nitrate hóa sẽ thực hiện giai đoạn tiếp theo, chuyển hoá NO2- thành NO3- (là sản phẩm cuối của quá trình nitrate hóa) Các vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa cũng là vi khuẩn hóa vô cơ tự dưỡng

NO2- + 1

2 O2  NO3- + năng lượng

1.1.3.3 Quá trình phản nitrite hóa

Các hợp chất đạm dạng nitrate ở đất rất dễ bị khử thành nitơ phân tử, quá trình này được gọi là quá trình phản nitrate hóa được thực hiện trong điều kiện kỵ khí nhờ các vi sinh vật phản nitrate hóa Khi đó, NO3- là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp kỵ khí và năng lượng tạo thành dùng để tổng hợp ATP cho tế bào

1.1.3.4 Quá trình cố định nitơ phân tử

Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử vẫn là một

bí ẩn của tự nhiên Liên kết NN có năng lượng liên kết rất lớn (9,4.105J/mol) nên muốn phá vỡ liên kết này thì phải sử dụng những kỹ thuật rất cao và tốn kém Trong khi đó, nhóm vi sinh vật cố định nitơ lại có thể đồng hóa khí nitơ thành hợp chất đạm ngay trong các điều kiện bình thường về áp suất và nhiệt độ

Quá trình cố định nitơ là quá trình khử N2 thành NH3 nhờ enzyme nitrogenase với sự có mặt của ATP, chính enzyme này đã xúc tác làm cho nitơ của khí quyển liên kết với hydro sinh ra trong quá trình trao đổi chất nội bào Đây là một ưu điểm của sản xuất phân vi sinh

N2 + AH2 + ATP  NH3 + A + ADP + P (AH2 là chất cho electron)

Bằng phương pháp sắc ký trên ICC “120” BIP (Pháp) với cột sắc ký poropak,

ta nhận được và xác định được cường độ cố định nitơ phân tử theo hoạt tính của nitrogenase

Sau một thời gian nghiên cứu các nhà khoa học dần hoàn thiện cơ chế cố định nitơ phân tử Theo cơ chế mới nhất (1992) thì quá trình cố định nitơ phân tử được chia theo hai hướng cơ bản: con đường khử và con đường oxy hóa

18

Nitrogenase là một phức hợp gồm hai protein chủ yếu: một protein MoFe (nitrogenase, MW 220000) liên kết với 1-2 protein Fe (nitrogenase reductase, MW 640000)

Fe và Mo của protein Mo-Fe được chứa bên trong cột cofactor gọi là FeMo-co

và sự khử N2 diễn ra cofactor này

 Quá trình khử:

N2  HN=NH  H2N-NH2  NH3  NH4OH

N2 + 8e- + 16Mg.ATP + 8H+ + 16O 2NH3 + 16Mg.ADP + 16P + H2O Trước hết protein Fe được khử bởi ferredoxin sau đó liên kết với ATP làm thay đổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này (từ 100mV – 400mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe ATP bị thủy phân khi diễn

ra sự chuyển đổi electron này Cuối cùng protein MoFe khử chuyển các electron tới nitrogen nguyên tử

Electron của các chất khử (feredoxin, ditionit) đi vào trung tâm có chứa Fe của thành phần II (protein – Fe) và tiếp tục chuyển cho thành phần enzyme (protein – Fe – Mo)

Electron đã hoạt hóa sẽ đi theo mạch nguyên tử Fe để đến Mo, ở bên trong

“hạt”, I Mo sẽ bị khử, nhờ đó có khả năng phản ứng nhanh chóng với N2 Phân tử

N2 đi qua khe có kích thước khoảng 4 – 5Ao, tức là tương đương với chiều dài của phân tử N2 vào bên trong men và được hoạt hóa ở đây

Kết quả của quá trình nitrogenase hoạt hóa và hấp thụ hóa học nitơ sẽ làm đứt hai dây nối trong số dây nối cực phân tử N2 Năng luợng tiêu phí là 7,8 x 105J/mol Dây nối thứ 3 sẽ bị cắt đứt khi tiếp xúc với hydro đã được hoạt hóa nhờ các enzyme dihydrogenase và hệ thống hydrogenase

Sau đó NH3 hoặc sản phẩm khử được sinh ra sẽ liên kết với các ketoacid để tạo thành amino acid NH3 tạo thành trong quá trình cố định nitơ được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các amino acid, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác

Nitrogenase

19

 Con đường oxy hóa:

N2  N2O  (HNO)2  NH4OH Qua hai hướng đó người ta thu được kết quả sau:

Nếu nồng độ nitơ nhiều sẽ ức chế quá trình tạo nitơ phân tử

Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn vi sinh vật hiếu khí

Qua đó ta thấy con đường khử có nhiều khả năng hơn

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển điện tử trong quá trình khử và oxy hóa nitơ

1.1.3.5 Các vi sinh vật cố định nitơ phân tử

Vi sinh vật cố định nitơ là loại sinh vật có vai trò quan trọng trong chu trình nitơ và cung cấp lượng nitơ đáng kể cho cây trồng, có khả năng chuyển hóa nitơ trong không khí và trong đất từ dạng khó hấp thu sang dạng NH4+ cung cấp cho cây

Vi khuẩn cố định nitơ gồm 2 nhóm chính:

(1) Nhóm vi sinh vật sống tự do và hội sinh có 1 số loại điển hình sau:

Azotobacter, Beijerinskii, Clostridium

(2) Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh có một số loại điển hình sau: Rhizobium,

Azospirillum

20

(3) Một số nhóm vi sinh vật cố định đạm khác

Ngoài những giống vi sinh vật cố định nitơ phân tử nêu trên, còn vô số những giống khác đều có khả năng cố định nitơ phân tử, chúng có nhiều ý nghĩa trong sản xuất nông, lâm, ngư nghiệp

− Vi khuẩn: Azotomonas insosolita, Azotonomas fluorescens, Pseudomonas

azotogenis, Klebsiella pneumonia, Paenibacillus spp…

− Xạ khuẩn: một số loài thuộc giống Actinomyces, Frankia, Nocardia,…

− Tảo – vi khuẩn lam: Anabaena azolla, Anabaena cylindrica, Calothrix elenkii,…

Bảng 1.1 Tóm tắt các quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên

Quá trình Cơ chất Sản phẩm Vi sinh vật tham gia

Amon hóa Hợp chất nitơ

-Nitrosomonas; Nitrosolobus; Nitrocystis; Nitrosospira Nitrobacter; Nitrospira;

Nitrococcus…

Achromobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Proteus, Pseudomonas…

Azotobacter, Beijerinskii, Clostridium, Rhizobium, Azospirillum,

thành chi riêng vào năm 1993, được đề xuất bởi Ash và cộng sự Sự khác biệt này

đã được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích so sánh trình tự gen 16S rRNA của

ba trực khuẩn khác nhau cho thấy khoảng cách đủ xa phát sinh loài từ Bacillus

subtilis để đảm bảo một chi mới Paenibacillus (Paeni + Bacillus) có nghĩa là hầu

như Bacillus trong tiếng Latin Và đề xuất Paenibacillus polymyxa (trước đây là

Bacillus polymyxa) như một loài điển hình

Paenibacillus spp Có một số loài đặc trưng sau:

Paenibacillus là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi Có kích thước 0,5-1 x 2-6 μm, là

trực khuẩn Gram dương, các nội bào tử của chúng thường tạo thành nang Chúng có thể sử dụng nitơ trong không khí tạo ra đạm dễ tiêu để cây trồng hấp thụ dễ dàng

Đặc điểm hình thái một số loài Paenibacilus:

22

P polymyxa là một loại vi khuẩn hình thành nội bào tử, trực khuẩn Gram

dương, có khả năng di chuyển nhờ các tiên mao Kích thước 0,6 x 3,0 μm, các nội

bào tử của P polymyxa có thể nảy mầm khi gặp điều kiện thích hợp Tuy nhiên, sự

nảy mầm này có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm nhiệt và các chất dinh dưỡng như fructose cộng với L-alanine Acid hữu cơ cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng chịu nhiệt của bào tử

P stellifer là trực khuẩn Gram dương, kích thước 0,6–0,86 x 2,5–5,0 μm, di

chuyển nhờ các tiên mao Các nội bào tử elip hình thành trong bào tử nang ở vùng đầu cuối của các tế bào, khi bào tử trưởng thành sẽ hình thành liên kết để kết nối các cực của các bào tử lại với nhau (Irmgard Suominen và cộng sự, 2003)

Hình 1.4 Liên kết giữa các bào tử P stellifer trưởng thành với nhau

Ngay từ năm 1908, các chủng P polymyxa khả năng cố định nitơ đã được tìm thấy, cho đến cuối năm 2009, các chi Paenibacillus bao gồm hơn 100 loài, trong đó

có 16 chủng loại đã được báo cáo là có hoạt động nitrogenase bao gồm P

polymyxa, P macerans, P peoriae, P graminis, P odorifer, P brasilensis, P azotofixans, P borealis, P wynnii, P.massiliensis, P sabinae, P zanthoxyli, P donghaensis, P forsythiae, P riograndensis và P Sonchi

Năm 2011, JIN Haojie và cộng sự đã phân lập được 24 mẫu vi sinh vật thuộc

nhóm Paenibacillus có khả năng cố định đạm thông qua việc tìm ra gene nifH, điển hình nhất là vi khuẩn P stellifer và P jamilae

23

1.2.3 Sự phân bố của Paenibacillus

Đất là môi trường thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của các loài vi sinh vật Trong thành phần sinh vật đất, vi sinh vật chiếm tới 90% Trong thành phần carbon hữu cơ của đất, vi sinh vật chiếm khoảng 2% Số lượng vi sinh vật trong mỗi gram đất có tới hàng triệu, hàng tỉ và tới vài chục tỉ tế bào

Vi khuẩn thuộc chi Paenibacillus đã được phân lập trong nhiều môi trường

khác nhau như: đất đai, nước, vùng rễ, thực phẩm, thức ăn gia súc,…(Daane và cộng sự, 2002)

Nhiều vi khuẩn thuộc chi Paenibacillus đã được phân lập từ đất vùng rễ với số

lượng từ 103 đến 106 CFU/gram trọng lượng tươi (Brian B McSpadden Gardener, 2004)

1.2.4 Một số đặc tính khác của Paenibacillus

Paenibacillus ngoài khả năng cố định nitơ tốt, tổng hợp chất kích thích tăng

trưởng thực vật và các enzyme thủy phân P polymyxa còn có hoạt tính đối kháng chống lại loài vi khuẩn Vibrio và nhiều vi sinh vật gây bệnh cho người và vật khác

Do đó, đã được sử dụng trong sản xuất kháng sinh Polymyxin B là một trong

những loại thuốc kháng sinh được sản xuất bởi P polymyxa, và là một trong những

hợp chất được tìm thấy trong các loại kem bôi kháng khuẩn Vi khuẩn này cũng có

thể giúp cây trồng hấp thụ phospho và tăng độ xốp của đất P polymyxa là một vi

khuẩn tiềm năng trong việc phát triền nền nông nghiệp bền vững Ngoài ra, năm

2013 theo Karim Naghmouchi và cộng sự, P polymyxa còn có khả năng ức chế sự sinh trưởng của Escherichia coli ATCC chủng 25.922 và nó còn có các đặc điểm để

sản xuất probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Irmgard Suominen và cộng sự (2003) đã xác định được P stellifer có khả năng

sản xuất cyclodextrin được ứng dụng trong thực phẩm

1.3 Phân bón vi sinh cố định đạm

1.3.1 Định nghĩa

Phân vi sinh cố định đạm là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành Thông qua các hoạt

24

động sống của chúng sau quá trình bón vào đất tạo ra chất dinh dưỡng mà cây trồng

sử dụng được (NH3) hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và

chất lượng nông phẩm Phân vi sinh cố định đạm đảm bảo không gây ảnh hưởng

xấu đến sức khỏe con người, hệ sinh thái và chất lượng nông phẩm

1.3.2 Phân loại

Theo công nghệ sản xuất có thể chia phân vi sinh thành hai loại như sau:

Phân vi sinh trên nền chất mang khử trùng có mật độ vi sinh hữu ích

> 109 CFU/g(ml) và mật độ vi sinh vật tạp nhiễm thấp hơn 1/1000 so với vi sinh vật

hữu ích Phân bón dạng này tạo thành trên cơ sở chủng sinh khối vi sinh vật sống đã

qua tuyển chọn vào cơ chất đã được xử lý vô trùng bằng các phương pháp khác

nhau Phân bón vi sinh vật trên nền chất mang khử trùng được sử dụng dưới dạng

chủng hạt, hồ rễ hoặc tưới phủ với liều lượng 1 - 1,5 Kg hoặc lít/ha canh tác

Phân vi sinh trên nền chất mang không khử trùng được sản xuất bằng cách tẩm

nhiễm trực tiếp sinh khối vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn vào cơ chất không

thông qua công đoạn khử trùng Phân bón dạng này có mật độ vi sinh vật hữu ích >

106 CFU/g(ml) và được sử dụng với số lượng từ vài trăm đến hàng ngàn Kg (lít)/ha

Đối với phân bón vi sinh vật trên nền chất mang không khử trùng, tùy theo

thành phần các chất chứa trong chất mang mà phân bón vi sinh vật dạng này được

phân biệt thành phân hữu cơ vi sinh vật (phân hữu cơ có chứa các vi sinh vật sống)

hoặc phân hữu cơ khoáng vi sinh vật (một dạng của phân hữu cơ vi sinh vật có chứa

một lượng nhất định các dinh dưỡng khoáng)

25

Bảng 1.3 Ưu và nhược điểm của chất mang khử trùng và không khử trùng

Dễ dàng kiểm tra chất lượng

Thuận lời cho việc sử dụng

Cần đầu tư lớn ban đầu và đòi hỏi đặc biệt cho điều kiện khử trùng

Cần có kỹ thuật và cán bộ có kinh nghiệm

Không khử

trùng

Kỹ thuật phối trộn đơn giản

Có thể sử dụng vật liệu tại địa phương

Đầu tư ít, không cần kỹ thuật đặc biệt

Cần lượng sinh khối vi sinh vật lớn

Chất lượng không ổn định Khó đánh giá và kiểm tra chất lượng

Không bảo quản được lâu (Phạm Văn Toản, 2002)

Phân loại theo trạng thái vật lý: căn cứ vào trạng thái phân bón có thể phân chia thành các loại như sau:

− Dạng bột là loại phân bón vi sinh mà trong đó sinh khối của vi sinh vật được tuyển chọn trong đó chất mang ở dạng bột

− Dạng viên được tạo thành khi sinh khối của vi sinh vật được phối trộn và xử lý chất mang để tạo thành dạng phân bón có chứa vi sinh vật sống đã qua tuyển chọn

− Dạng lỏng là loại phân bón vi sinh trong đó sinh khối của vi sinh vật tuyển chọn được chế biến thành dung dịch có chứa các tế bào sống của chúng

1.3.3 Nguyên liệu sản xuất phân bón

Thành phần rỉ đường dao động như sau: nước chiếm 15 – 20 %; chất khô chiếm 80 – 85 % Trong chất khô có 60 % là đường (40 % là đường saccharose và

20 % là fructose và glucose) và 40 % chất khô còn lại là chất không phải là đường (phi đường) Trong thành phần phi đường có khoảng 30 – 32 % hợp chất hữu cơ và

6 – 10 % hợp chất vô cơ Trong hợp chất vô cơ, theo Mac-Dinit, gồm có K2O: 3,5

%; Fe2O3: 0,2 %; MgO: 0,1 %; sulfat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; SiO2: 0,5 %; P2O5: 0,5 %; Clorit: 0,4 %

Bảng 1.4 Thành phần dinh dưỡng của rỉ mật mía

Than bùn được tạo thành từ xác các loài thực vật khác nhau Xác thực vật được tích tụ lại, được đất vùi lấp và chịu tác động của điều kiện ngập nước trong nhiều năm Với điều kiện phân huỷ yếm khí các xác thực vật được chuyển thành than bùn

28

Trong than bùn có hàm lượng chất vô cơ là 18 – 24%, phần còn lại là các chất hữu cơ Theo số liệu điều tra của các nhà khoa học, trên thế giới trữ lượng than bùn

có khoảng 300 tỷ tấn, chiếm 1,5% diện tích bề mặt quả đất

Than bùn được sử dụng trong nhiều ngành kinh tế khác nhau Trong nông nghiệp than bùn được sử dụng để làm phân bón và tăng chất hữu cơ cho đất Than bùn cho phản ứng chua Hàm lượng các chất dinh dưỡng trong than bùn thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần các loài thực vật và quá trình phân huỷ các chất hữu cơ

Bảng 1.6 Thành phần hóa học của than bùn ở các vùng khác nhau

Tên mỏ

Thành phần hoá học (%)

N P2O5 K2O Acid humic Đông Hà, Lào Cai

0,24-0,31 0,03

- 0,06 0,04

0,93-1,27 0,27 0,37 0,37 0,23

5-7 5-6 6-7 6-8 24-26 (Ngô Văn Nhượng và cộng sự, 1999)

Tuy nhiên, than bùn có hợp chất bitumic rất khó phân giải Nếu bón trực tiếp cho cây không những không có tác dụng tốt mà còn làm giảm năng suất cây trồng

Vì vậy, than bùn muốn dùng làm phân bón phải khử hết bitumic

Trong than bùn có acid humic, có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây Hàm lượng đạm tổng số trong than bùn cao hơn trong phân chuồng gấp 2 – 7 lần, nhưng chủ yếu ở dưới dạng hữu cơ Để có thể dùng than bùn làm chất mang, cần phải khử hết bitumic và đưa pH về pH tối thích cho cả vi sinh vật mong muốn và đất cần bón

1.3.4 Quy trình sản xuất

1.3.4.1 Quy trình sản xuất tổng quát

Nguyên liệu để sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm là mật rỉ và than bùn Nguyên liệu sau khi mua về được bảo quản nơi sạch sẽ, thoáng mát Quy trình sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm được thể hiện ở sơ đồ hình 1.5

29

Hình 1.5 Quy trình sản xuất phân bón vi sinh

1.3.4.2 Thuyết minh

 Giống gốc

Giống gốc Paenibacillus sp sau khi phân lập, làm thuần và có khả năng cố

định nitơ tốt được chọn làm giống gốc

Để sản xuất phân đạm vi sinh người ta cố gắng tuyển chọn các chủng vi sinh vật vừa có hoạt tính cố định đạm mạnh, sức cạnh tranh lớn, thích ứng ở pH rộng, phát huy được ở nhiều vùng sinh thái khác nhau và đặc biệt không gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng và môi trường sinh thái, tốt hơn nếu chủng vi sinh vật đó sinh tổng hợp các hợp chất có lợi cho cây trồng

 Nhân sinh khối vi sinh vật

Từ các chủng giống vi sinh được lựa chọn (chủng gốc) người ta tiến hành nhân sinh khối Theo Wang JinLing và cộng sự (2013), để xác định môi trường nuôi cấy tốt nhất cần thiết phải tiến hành thí nghiệm bề mặt phản ứng tối ưu hóa

Chế phẩm dạng rắn

Chế phẩm dạng lỏng

Theo Yuanyuan Hong và cộng sự (2012), P sabinae phát triển tốt khi được

nuôi cấy trong môi trường peptone đậu nành, trong đó chứa: peptone đậu nành 5g/L, cao thịt bò 3g/L, NaCl 5g/L và pH 7,0 Môi trường giới hạn để đo khả năng

cố định đạm của vi sinh vật có chứa: Na2HPO4.12H2O 26,3g/L, KH2PO4 3,4g/L, biotine 10μg/L, CaCl2.2H2O 0,26g/L, MgSO4 0,3g/L, MnSO4.H2O 0,033g/L, ferri citrate 0,36g/L, Na2MoO4.2H2O 0,76g/L, p-aminobenzoic acid 10μg/L, glucose 4 g; acid glutamic 1g/L

Theo Wang JinLing và cộng sự (2013) môi trường có lactose 6g/L, pepton 7,5g/L, NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl2 1,22g/L, K2SO4 0,0087g/L số lượng tế bào sống của Bacillus megaterium trong dịch lên men có thể đạt 2,0.109CFU/ml Có thể cung cấp mật độ cao vi khuẩn cho sản xuất công nghiệp

 Tạo chế phẩm

Tiến hành phối trộn sinh khối vi sinh vật với các chất mang như than bùn, cát,

đá, phụ phế phẩm nông nghiệp Chất mang là cơ chất để vi sinh vật trú ngụ và duy trì mật độ trong thời gian từ khi sản xuất đến khi sử dụng ở đây vi sinh vật được cấy tồn tại và (hoặc) phát triển, tạo điều kiện thuận lợi cho vận chuyển, bảo quản và sử dụng phân vi sinh

1.3.5 Các yêu cầu về phân bón vi sinh cố định đạm

Theo TCVN 6169-1996, phân đạm vi sinh được coi là có chất lượng khi có chứa một hay nhiều loại vi sinh vật có hoạt tính cố định đạm cao và có ảnh hưởng tốt đối với cây trồng với mật độ 108 hay 109 CFU/g (hoặc CFU/ml) đối với loại phân bón trên nền chất mang khử trùng và 106 CFU/g (hoặc CFU/ml) đối với phân bón trên nền chất mang không khử trùng

Mật rỉ đường được mua từ công ty hóa chất và phụ gia Kim Minh và được xử

lý trong phòng thí nghiệm trước khi lên men Rỉ đường được pha loãng với tỉ lệ rỉ đường và nước là 2:1 Kg/Kg, tiến hành xử lý nhiệt ở 85 – 90oC trong thời gian 45 –

60 phút để loại bỏ các tạp khuẩn có trong mật rỉ Sau khi xử lý nhiệt , tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút trong vòng 15 phút thu dịch trong, mục đích tách các hợp chất không tan và chất keo ra khỏi mật rỉ Sau cùng mật rỉ được bảo quản ở 4oC

2.1.1.2 Than bùn

Than bùn được mua từ cửa hàng bán lẻ tại chợ Phú Xuân, Nhà Bè, Tp Hồ Chí Minh Sau khi được đưa về phòng thí nghiệm thì được phơi khô hoặc hun nóng ở

70oC trong 3 ngày để loại bỏ acid bitumic và nghiền nhỏ qua rây 0,2mm

Vì than bùn có độ pH rất thấp nên cần phải chế biến trước khi ủ với vi sinh vật bằng CaO, điều chỉnh pH của than bùn về 7 Sau đó bảo quản trong lọ kín

2.1.1.3 Nguồn phân lập vi sinh vật

Vi sinh vật được phân lập từ chế phẩm dạng lỏng phân bón vi sinh Đại Lợi

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.1 Tên các loại thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

1 Autoclave Analog KT-30SDP

4 Cân phân tích AGB 120 – 4

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu của mật rỉ

2.2.1.1 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS

32

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường

khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định So màu tiến hành ở bước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Cách thực hiện: Mẫu mật rỉ sau khi xử lý (mục 2.1.1.1) được pha loãng 300

lần trước khi tiến hành xác định đường khử được phân tích theo mục 3.1 phần phụ lục A)

2.2.1.2 Xác định hàm lượng đường tổng

Nguyên tắc: Đường saccharose trong mật rỉ sẽ được thủy phân thành glucose

và fructose nhờ acid Do đó, có thể đo được hàm lượng đường tổng bằng phương

pháp DNS

Mẫu mật rỉ sau khi xử lý được pha loãng 400 lần trước khi tiến hành xác định đường tổng

Cách thực hiện: Mẫu mật rỉ sau khi xử lý (mục 2.1.1.1) được pha loãng 400

lần trước khi tiến hành xác định đường tổng được phân tích theo mục 3.2 phần phụ lục A)

2.2.1.3 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng phương pháp đo độ khúc xạ Nguyên tắc: Khi đi từ một môi trường (không khí) vào một môi trường khác

(chất lỏng) tia sáng sẽ bị lệch đi (khúc xạ) Nếu chất lỏng là một dung dịch chất hòa tan (dung dịch đường, muối,…) dựa trên độ lệch của tia sáng, ta có thể tính được nồng độ của chất hòa tan và từ đó tính ra phần trăm nước

Cách thực hiện: (xem mục 3.3 phần phụ lục A)

2.2.2 Phương pháp xác định một số chỉ tiêu của than bùn

2.2.2.1 Xác định carbon hữu cơ tổng số bằng phương pháp Walkley – Black (TCVN 9294-2012)

Nguyên tắc: Tiêu chuẩn này dựa theo phương pháp Walkley – Black – Oxy

hóa carbon hữu cơ bằng dung dịch kali dicromat dư trong môi trường acid sunfuric,

sử dụng nhiệt do quá trình hòa tan acid sunfuric đậm đặc vào dung dịch dicromat,