Khảo sát hoạt tính sinh học của cây nhân trần tía

Đặt vấn đề Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của cơ thể là một tác nhân oxy hóa gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như các bệnh về đường tim mạch, viêm gan, đục thủy tinh thể

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hồng Sinh viên thực hiện: Lê Hoàng Khải

MSSV: 1211100095 Lớp: 12DSH02

Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Tất cả số liệu, kết quả trong đề tài này đều thu được qua nghiên cứu thực nghiệm và hoàn toàn trung thực Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016

Lê Hoàng Khải

chân thành nhất đến quý thầy, cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, những người đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em, cho em được thỏa sức tìm tòi học hỏi những điều mới, dù có đi đâu làm gì, em vẫn luôn tự hào là đứa con của đại gia đình Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường

Con xin cảm ơn cha, mẹ và em trai, những người đã cho con ngày hôm nay Gia đình đã luôn hỗ trợ tài chính, động viên tinh thần con trong suốt thời gian qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Ngọc Hồng, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy cho em những kiến thức tuyệt vời, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cũng như kỹ năng sống Được làm việc trong nhóm nghiên cứu của cô đối với em là một niềm vinh dự và hạnh phúc

Xin cảm ơn các bạn trong thể lớp 12DSH đã luôn giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu và động viên tinh thần mình trong thời gian qua

Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 8 năm 2016

Lê Hoàng Khải

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

3 Mục đích nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Các kết quả đạt được của đề tài 4

7 Kết cấu của ĐATN 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về chi Adenosma sp.và loài Adenosma bracteosum Bonati 5

1.1.1 Tổng quan về chi Adenosma sp 5

1.1.2 Tổng quan về Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 6

1.1.2.1 Tên khoa học 6

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 7

1.1.2.3 Một số thành phần hóa học đã nghiên cứu 8

1.1.2.4 Hoạt tính sinh học 12

1.1.2.5 Một số bài thuốc từ Nhân trần 15

1.2 Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hóa và chất chống oxy hóa 15

1.2.1 Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hóa 15

1.2.2 Chất chống oxy hóa 17

1.2.3 Tác hại của sự stress oxy hóa 18

1.2.3.1 Tác động lên DNA 18

1.2.3.2 Tác động lên protein 19

1.2.3.3 Tác động lên lipid 19

1.3 Hợp chất tự nhiên từ thực vật và hoạt tính sinh học 20

1.3.1 Terpenoid 20

1.3.1.1 Định nghĩa, phân loại 20

1.3.1.2 Nguồn gốc và ứng dụng 20

1.3.2 Steroid 22

1.3.2.1 Định nghĩa, phân loại 22

1.3.2.2 Nguồn gốc và ứng dụng 23

1.3.3 Polyphenol 24

1.3.3.1 Định nghĩa, phân loại 24

1.3.3.2 Nguồn gốc, ứng dụng 25

1.3.3.3 Flavonoid 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 27

2.1.1 Địa điểm 27

2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài 27

2.2 Vật liệu 27

2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 27

2.2.2 Đối tượng thí nghiệm 27

2.2.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Xác định độ ẩm 30

2.3.2 Quá trình chiết và thu nhận cao chiết 31

2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng cao thu được 33

2.3.4 Phương pháp định tính các thành phần hóa học trong Nhân trần tía 33

2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 36

2.3.6 Phương pháp định lượng flavonoid tổng số 36

2.3.7 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên mô hình DPPH 37

2.3.8 Phương pháp xác định năng lực khử 38

2.3.9 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 39

2.3.10 Xác định độc tính cấp diễn 41

2.3.11 Đánh giá hoạt tính cao chiết trên chuột bạch ứng dụng trong mô hình ổn định lượng đường trong máu 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Thử độ ẩm của dược liệu 45

3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết 45

3.3 Định tính các thành phần hóa học có trong dịch chiết Nhân trần tía 47

3.4 Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết 54

3.5 Định lượng flavonoid tổng số 56

3.6 Xác định hoạt tính kháng gốc tự do DPPH 58

3.7 Xác định năng lực khử 60

3.8 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 62

3.8.1 Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao cồn và cao nước 62

3.8.2 Hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao phân đoạn 63

3.9 Kết quả thử độc tính cấp diễn 64

3.10 Ảnh hưởng của dịch chiết Nhân trần tía lên lượng đường trong máu 65

3.10.1 Ảnh hưởng của việc uống glucose liều cao đến nồng độ đường trong máu của chuột 66

3.10.2 Ảnh hưởng của các loại cao chiết đến nồng độ đường trong máu 66

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 Kết luận 69

4.2 Kiến nghị 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AG: Acid Gallic

AQ: aqueous (nước)

BU: n-butanol

CH: chloroform

db: gam dược liệu khô

DMSO: Dimethyl sulfoxyde

IC50: half maximal inhibitory concentration

RE: Rutin equivalent

RNS: Reactive Nitrogen Species

ROS: Reactive Oxygen Species

TFC: Total Flavonoids Content (Hàm lượng flavonoid tổng số) TPC: Total Polyphenols Content (Hàm lượng polyphenol tổng số) TPHH: thành phần hóa học

TSA: tryptone soya agar

TSB: tryptone soya broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thành phần hóa học có trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati 10

Bảng 1.2 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học 16

Bảng 1.3 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA 18

Bảng 1.4 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein 19

Bảng 1.5 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid 20

Bảng 2.1 Nồng độ khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết 41

Bảng 2.2 Bảng tra nồng độ đường huyết 44

Bảng 3.1 Độ ẩm dược liệu 45

Bảng 3.2 Khảo sát hàm lượng cao chiết theo dung môi 45

Bảng 3.3 Khảo sát hàm lượng thu hồi sau khi chiết lỏng-lỏng cao cồn 46

Bảng 3.4 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học 47

Bảng 3.5 Hình ảnh định tính thành phần hóa học 48

Bảng 3.5 Kết quả đường chuẩn acid gallic 54

Bảng 3.6 Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số các cao chiết 55

Bảng 3.7 Bảng kết quả đường chuẩn Rutin 56

Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng Flavonoid tổng số 57

Bảng 3.9 Độ hấp thụ quang ở bước sóng 700 nm tại nồng độ 25 g/ml 61

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của cao tổng cồn và cao tổng cồn tại nồng độ 100 mg/ml 62

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ của các cao phân đoạn 63

Bảng 3.12 Kết quả thử độc tính cấp diễn 65

Bảng 3.13 Kết quả nồng độ lượng đường trong máu chuột 65

Bảng 3.14 Nồng độ đường trong máu của nhóm uống glucose liều cao 66

Bảng 3.15 Khả năng làm giảm đường huyết của dịch chiết Nhân trần tía lên đường huyết của nhóm chuột được uống đường glucose ở liều cao 67

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati 7

Hình 2.1 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 29

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía 31

Hình 2.3 Phản ứng quét gốc tự do DPPH 37

Hình 2.4 Phản ứng xác định năng lực khử 39

Hình 2.5 Chuột bạch dùng cho thí nghiệm 42

Hình 3.1 Dung dịch dựng đường chuẩn acid gallic 54

Hình 3.2 Đường chuẩn acid gallic 54

Hình 3.3 Dung dịch Rutin chuẩn 56

Hình 3.4 Đường chuẩn Rutin 57

Hình 3.6 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các cao chiết trong thí nghiệm quét gốc tự do DPPH 59

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện năng lực khử của các cao chiết 61

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Gốc tự do được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của cơ thể là một tác nhân oxy hóa gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như các bệnh về đường tim mạch, viêm gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, đột biến gen gây ung thư Về mặt hóa học, gốc tự do rất kém bền nên dễ dàng tấn công các đại phân tử sinh học như protein, lipid, carbohydrate, DNA Điều này dẫn đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây ra nhiều loại bệnh tật Do đó, việc tìm ra những hợp chất chống oxy hóa có khả năng ức chế các gốc tự do hoặc các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự do

là điều cần thiết

Chất chống oxy hóa có thể có nguồn gốc từ thiên nhiên hoặc được tổng hợp hóa học Tuy nhiên, những hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có nhiều lợi thế hơn so với những hợp chất tổng hợp do hợp chất tổng hợp gây ra những phản ứng phụ như viêm gan và ung thư Bên cạnh đó, những hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên đôi khi tác dụng dược lý tốt hơn

Ngoài ra vấn đề liên quan đến đường huyết luôn được mọi người quan tâm đến

vì lượng đường trong máu dù tăng hay giảm đi so với mức bình thường thì sẽ tác động không tốt đến sức khỏe Chứng tăng đường huyết ảnh hưởng trực tiếp đến bệnh đái tháo đường, là một trong những căn bệnh trước đây dân gian vẫn thường gọi là “bệnh của người giàu” Tăng đường huyết chỉ biểu hiện ra ngoài bằng các triệu chứng lâm sàng khi vấn đề đường huyết đã nghiêm trọng Các thói quen trong ăn uống không điều

độ, chế độ dinh dưỡng quá nhiều đồ ngọt, đồ béo hoặc uống những loại thức uống có cồn như rượu, bia và ít hoạt động thể chất hay các hoạt động được lựa chọn cũng ảnh hưởng đến lượng đường trong máu và dần dần sẽ hình thành bệnh tiểu đường

Cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati từ lâu trong dân gian được sử

dụng như là một vị thuốc với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da Ngoài ra trong cây có chứa nhiều hợp flavonoid và

tinh dầu, đây là những hợp chất tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học nổi bật Tuy nhiên, cho đến nay Nhân trần tía vẫn chỉ được xem là một vị thuốc Đông y, chưa có công trình nghiên cứu nào chứng minh một cách cụ thể nhất về các hoạt tính sinh học

như kháng oxy hóa, điều trị tiểu đường, kháng khuẩn… Do đó đề tài “Khảo sát hoạt

tính sinh học của cây Nhân trần tía” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các sản

phẩm ứng dụng từ nguồn dược liệu này

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

❖ Những nghiên cứu trong nước:

Nguyễn Viết Tựu và cộng sự (1975) đã phân tích hàm lượng tinh dầu trong cây

Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati

Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự (2006) chứng minh cao toàn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần tía thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol

Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự (2008) đã phân lập được một số hợp chất polyphenol trong Nhân trần tía

Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân (2008) đã xác định khả năng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin bằng sản phẩm kết hợp giữa cao Nhân trần tía

và Tảo Spirulina

❖ Những nghiên cứu ngoài nước:

Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích thành phần tinh dầu của Adenosma

bracteosum Bonati bằng GS và GC/MS

3 Mục đích nghiên cứu

Định tính thành phần hóa học cây Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati

Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và khả năng kháng oxy hóa cao chiết

từ cây Nhân trần tía

Xác định độc tính cấp diễn và hoạt tính làm ổn định đường huyết của cao chiết thô trên chuột bạch

Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của Nhân trần tía

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên

cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo

Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp

xác định, khảo sát, phân tích

Nhiệm vụ 3: Thu nhận cao chiết toàn phần từ cây Nhân trần tía bằng dung môi

nước và dung môi cồn; tách và thu nhận các cao phân đoạn từ cao chiết cồn

Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ các thành phần hóa học

Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các

cao chiết và cao phân đoạn từ cây Nhân trần tía

Nhiệm vụ 6: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa thông qua nồng độ ức chế 50%

gốc tự do DPPH, đánh giá năng lực khử của các cao chiết và cao phân đoạn

Nhiệm vụ 7: Xác định độc tính cấp diễn của cao chiết nước và cao chiết cồn Nhiệm vụ 8: Đánh giá hoạt tính của cao chiết nước và cao chiết cồn trên mô hình động vật ổn định lượng đường trong máu

Nhiệm vụ 9: Đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết và cao phân đoạn

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: các tài liệu về cây Nhân trần tía, sơ

bộ thành phần hóa học của cây Nhân trần tía, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn Phương pháp xác định độc tính cấp diễn, mô hình thử nghiệm hoạt tính hạ đường huyết trên

chuột bạch

Phương pháp làm thí nghiệm: tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các

nhiệm vụ nghiên cứu

Phương pháp xử lý số liệu bằng toán học và phân tích phương sai ANOVA bằng

phần mềm SAS 9.4: các số liệu thu được sẽ được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Thu nhận được cao chiết nước và cao chiết cồn từ cây Nhân trần tía bằng phương pháp ngâm dầm, thu nhận các cao phân đoạn từ cao tổng cồn qua quá trình chiết lỏng – lỏng Xác định được hàm lượng của các cao chiết và cao phân đoạn

Định tính sơ bộ các thành phần hóa học trong cây Nhân trần tía

Định lượng được hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các cao chiết và cao phân đoạn

Tìm ra giá trị IC50 của các cao chiết trên mô hình DPPH, xác định giá trị hấp thu của các cao chiết trên mô hình năng lực khử

Xác định sử dụng cao chiết với liều 3000 mg/kg thể trọng không gây độc cho chuột bạch

Chứng minh khả năng giúp làm ổn định đường huyết trên chuột bạch của cao nước và cao cồn

Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của các cao chiết từ Nhân trần tía

7 Kết cấu của ĐATN

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chi Adenosma sp.và loài Adenosma bracteosum Bonati

1.1.1 Tổng quan về chi Adenosma sp

Chi Adenosma sp (hay còn được gọi là Chi Tuyến hương, Nhân trần) được xếp vào Họ Scrophulariaceae Là loài cỏ mọc hằng năm, có mùi thơm, có khoảng 15 loài

phân bố ở khu vực Bắc Á, Đông Nam Á, Trung Quốc và quần đảo Thái Bình Dương

Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) và Đỗ Tất Lợi (2004), Việt Nam có sự phân bố

của nhiều loài trong chi Adenosma sp bao gồm:

- Adenosma annamensis Yam (Tuyến hương Trung bộ) Cây thân cỏ cao

khoảng 30-40 cm, phiến lá xoăn và có lông thưa, có hoa ở nách lá, mọc chủ yếu ở Quảng Nam và Đà Nẵng

- Adenosma bracteosum Bonati (Tuyến hương lá bắc, Nhân trần tía) Thân và

cành có màu tím đỏ, cụm hoa nằm ở ngọn có những lá bắc lợp lên nhau, dạng màng, trong suốt Mọc nhiều ở miền nam Việt Nam và rãi rác ở Campuchia , Lào

- Adenosma caeruleum R Br (Nhân trần nam, Hoắc hương núi, Tuyến hương

lam) Thân thảo cao tới gần 1 m Lá phía dưới mọc đối, lá phía trên có khi mọc so le, hình trái xoan nhọn Thân màu tía hay lam, chia 2 môi, nhị 4, bầu có vòi nhuỵ hơi dãn

ra ở đỉnh Quả nang dài hình trứng, có mỏ ngắn nở thành 4 van Hạt nhiều, bé, hình trứng Mùa hoa quả tháng 4 – 9 Phân bố nhiều ở miền bắc Việt Nam, Trung Quốc, Lào, Thái Lan

- Adenosma hirsuta (Miq.) Kurz (Tuyến hương phún) Thân thảo cao hơn 1 m,

có nhiều lông, lá hình bầu dục, hai mặt lá nhiều lông Mọc nhiều ở vùng Tây Nguyên, rãi rác ở Đông Nam Bộ

- Adenosma indiana (Lour.) Merr (Nhân trần hoa đầu, Nhân trần bồ bồ, Tuyến hương Ấn) Thân hình trụ, cành non mang nhiều lông về sau nhẵn, lúc đầu thân màu xanh sau chuyển sang màu tím nhạt, chiều cao cây 70 cm đến 100 cm Lá mọc đối, phiến lá hình mác, đầu nhọn, mép lá có răng cưa, gân lá hình lông chim, mặt trên mang

nhiều lông hơn mặt dưới, chiều dài lá 5 cm - 8 cm, rộng lá 2 cm - 4 cm Rễ thuộc loại

rễ chùm, có nhiều lông tơ nhỏ màu trắng, rễ dài 10 - 18 cm Hoa nhỏ, màu tím, mọc tụ tập thành đầu nang, đài có lông với hai môi, môi trên nguyên, môi dưới xẻ bốn Tràng cánh hợp với hai môi, môi trên xẻ bốn, môi dưới nguyên,bốn nhị có hai chiếc dài, hai chiếc ngắn Quả thuộc loại quả nang nằm gọn trong đài hoa Nhiều hạt nhỏ, hình trứng thuôn, có nhiều gai, màu cánh gián Loài Adenosma indiana (Lour.) Merr phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, Myanma, Nam Trung Quốc, Campuchia, Lào, Việt Nam, Thái Lan

- Adenosma javanica (Bl.) Kds (Tuyến hương java) Loài cỏ cứng, bò dưới mặt

đất, nhánh dài 0,2 - 0,4 m Lá có phiến tròn, thon, dài 1 - 5 cm, có lông phún Hoa mọc

ở nách lá Mọc rãi rác một số nơi ở Việt Nam như Quảng Ninh, Kon Tum

Trong đó ba loài Adenosma bracteosum Bonati, Adenosma caeruleum R Br

Adenosma indiana (Lour.) Merr là mọc phổ biến nhất ở Việt Nam Mặc dù cả ba loài

này đã dùng từ lâu trong Y học cổ truyền như một loại dược liệu giúp giải độc, mát gan nhưng lại có rất ít công trình nghiên cứu về chúng Chỉ mới có một số công trình

nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của Adenosma caeruleum (De

Abreu và cộng sự, 2009; Adam và cộng sự, 1992; Nguyễn Hoàng Tuấn, 2000) và thành

phần hóa học loài Adenosma indiana (Dương Hồng Nhung, 2015) Hiện tại loài Adenosma bracteosum chỉ mới dừng lại ở việc khảo sát thành phần tinh dầu (Tsankova

và cộng sự, 1994) và một số hợp chất polyphenol (Nguyễn Đức Hạnh và cộng sự, 2008)

1.1.2 Tổng quan về Nhân trần tía Adenosma Bracteosum Bonati

có hình trụ, mọc ở đầu cành Đài hoa có 5 lá đài hình tim nhọn, kích thước không đều, rời nhau, có lông rậm và có tuyến ở mép Tràng hoa cao 5 mm, màu lam, có lông rải rác ở mặt ngoài, môi trên tròn, môi dưới dài bằng môi trên và chia thành 3 thùy hình

trứng Cây có quả dạng quả nang, hình trứng, đôi khi thuôn dài, cao 3 mm Quả không lông, màu nâu và có nhiều hạt

Nhân trần tía đang được trồng và mọc hoang tại Campuchia, Lào và miền nam Việt Nam Cây thường mọc vào mùa mưa trên đất sét ẩm, các bờ ruộng ở độ cao 300 -

800 m Cây thường mọc thành đám có khi tới hàng chục mét vuông trên những bãi đất bằng dưới chăn đồi, trong thung lũng hay những đám ruộng cao bỏ hoang Ở những nơi đất ít dinh dưỡng thì cây chỉ cao 15 cm đã thấy có hoa và quả Cây mọc tốt trên đất có phèn ở vùng thấp và dọc đường đi một số nơi từ Kontum, Đắk Lắk tới Tây Ninh, Thành phố Hồ Chí Minh (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004)

Nhân trần tía chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa mưa đến đầu mùa khô hằng năm Cây bắt đầu mọc vào tháng 6 và ra hoa vào khoảng tháng 10 - 11, tàn lụi vào tháng 12 Cây ưa táng, ưa ẩm và có thể chịu được khô hạn sau khi đã ra hoa, kết quả

Sau khi quả già, toàn cây tàn lụi So với các loài khác thuộc chi Adenosma sp., thì

Nhân trần tía có vòng đời ngắn hơn, chỉ tồn tại 5 - 6 tháng nên mức độ khai thác và sử dụng ít hơn

1.1.2.3 Một số thành phần hóa học đã nghiên cứu

❖ Thành phần hóa học của một số loài trong chi Adenosma sp

➢ Adenosma caeruleum

Adenosma caeruleum R Br có chứa monoterpenoid peroxyde (Adam, 1992),

betulinic acid, arbutin, aucubin, β-sitosterol, stigmasterol, campesterol, adenosmoside, crenatoside, verbascoside, cistanoside F, campneoside I, campneoside II, apigenin 7-O-

β-D-glucuronopyranoside, apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside (De abreu, 2009)

Năm 1975, Lê Tùng Châu và cộng sự phân tích trong Adenosma caeruleum

R.Br có saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu Cả cây

có 1% tinh dầu, hoa có 1,86% tinh dầu tỷ trọng 0,8042 (25o) nD=1,4705 (20o) (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004)

➢ Adenosma indiana

Năm 1939, F Guichard và J Clemensat phân tích loài Adenosma indiana

(Lour.) Merr dưới định danh Nhân trần và thấy 1,67% kali nitrat, một saponin có chỉ

số bọt 2.600, một glucozit tan trong axeton, trong ete, không tan trong nước, khoảng

0,7% tinh dầu Tinh dầu của loài Adenosma indiana (Lour.) Merr lỏng, màu vàng, mùi

hăng gần giống như mùi long não và bạc hà, vị nóng; tan trong methanol, ethanol, chloroform và các dung môi hữu cơ khác Thành phần chủ yếu của tinh dầu 20% hợp chất oxy tan trong dung dịch reorcin Chỉ số acid 1,4; chỉ số xà phòng hóa 11,5; chỉ số axetyl hóa 38; chỉ số iot 121,4 (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004)

Năm 1950, P.V Nair và cộng sự đã chưng cất được từ loài Adenosma indiana

(Lour.) Merr 1% tinh dầu và đã phân tích thấy có 5L.monoterpen và 2D.secquiterpen trong đó có 38,5% cineol Ngoài ra còn thấy saponin triterpenoid, flavonoid, acid nhân thơm, coumarin và tinh dầu (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004)

Vào năm 2015, Dương Hồng Nhung đã phân lập được từ Adenosma indiana

(Lour.) Merr các hợp chất 2-(4’-hydroxyphenyl)etyl triacontanoat, β-sitosterol glucosid, acid betulinic

❖ Thành phần hóa học của Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati

➢ Tinh dầu:

Nguyễn Viết Tựu và cộng sự phân tích thấy trong Adenosma bracteosum Bonati

có 0,25% tinh dầu, màu vàng sẫm, tỷ trọng 0,890, chỉ số khúc xạ 1,496, sắc ký khí thấy

19 peak trong đó có 5 peak lớn cineol khoảng 18% (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi, 2004)

Tsankova và cộng sự (1994) đã phân tích tinh dầu của Adenosma bracteosum

Bonati bằng GS và GC/MS thấy một số hợp chất chính gồm thymol (25.6%), linalool (13.1%) và (E)-β-farnesene (9.5%) Ngoài ra còn có sự hiện diện của carvacrol, đây là một tinh dầu kháng khuẩn mạnh và có khả năng chống ung thư (Can Baser, 2008; Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004)

1 Bảng 1.1 Các thành phần hóa học có trong tinh dầu Adenosma bracteosum Bonati

11 thymol methyl ether

scutellarein-6-O-Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati của Việt Nam

1.1.2.4 Hoạt tính sinh học

❖ Hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Adenosma sp

Lê Tùng Châu và Nguyễn Viết Tựu (1975) đã có một số nghiên cứu về hoạt tính

sinh học của những loài thuộc chi Adenosma sp ở Việt Nam (trích dẫn bởi Đỗ Tất Lợi,

2004) Bao gồm:

- Tác dụng trên gan mật: các loài thuộc chi Adenosma sp có tác dụng làm tăng

tiết dịch mật, thúc đẩy quá trình bài xuất dịch mật Đồng thời giúp bảo vệ tế bào gan, tăng cường chức năng giải độc của gan, phòng chống tích cực tình trạng gan nhiễm

mỡ Nhân trần bồ bồ có tác dụng sinh học học mạnh hơn Nhân trần nam

- Tác dụng chống viêm: các loài thuộc chi Adenosma sp.có tác dụng giải nhiệt,

giảm đau, chống viêm Tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính mạnh hơn mãn tính Thử nghiệm trên 3 mô hình (mô hình kaolin, mô hình u hạt, mô hình teo tuyến ức), kết quả Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ có tác dụng kháng viêm trên cả 3 mô hình

- Tác dụng kháng khuẩn: dịch chiết từ các loài thuộc chi Adenosma sp có khả

năng ức chế một số vi khuẩn Cao cồn và cao nước của Nhân trần bồ bồ có tác dụng ức

chế sự phát triển của các khuẩn Shigella dyseteriae, Shigella shigae, Staphylococus

aureus 209 P và Streptococcus hemolyticus S84 Khả năng kháng khuẩn của Nhân trần

nam kém hơn Nhân trần bồ bồ, nhất là với trực khuẩn lỵ Nhưng Nhân trần nam ức chế

mạnh hơn với Staphylococus và Streptococcus

- Tác dụng trên tuần hoàn: làm hạ huyết áp, điều chỉnh rối loạn lipit máu, cải thiện lưu lượng tuần hoàn nuôi tim và não

- Ứng dụng trên lâm sàng: các loài thuộc chi Adenosma sp được sử dụng để

điều trị các bệnh viêm gan, truyền nhiễm cấp tính thể vàng da, vàng da tán huyết do thương hàn ở trẻ sơ sinh, giun chui ống mật, rối loạn lipit máu, thiểu năng mạch vành, viêm loét miệng, nấm da

- Độc tính cấp: Nhân trần nam và Nhân trần bồ bồ không gây độc

Guichard và Clemensat (1939) đã nghiên cứu tác dụng của diệt giun của Nhân

trần nam và Nhân trần bồ bồ Tinh dầu và nước cất từ Nhân trần bồ bồ có tác dụng diệt

giun đất, giun đũa và giun móc Giun đất sau khi tiếp xúc với thuốc sẽ quần quại trong

vòng 10 – 15 phút rồi chết, còn giun đũa phải sau 2 – 3 giờ mới chết Thí nghiệm trên

giun đũa của lợn (Ascaris suum) sơ bộ thấy Nhân trần nam có tác dụng tốt (trích dẫn

bởi Đỗ Tất Lợi, 2004)

Nguyen Bich Thu và cộng sự (2010) đã chứng minh Nhân trần nam Adenosma

caeruleum có khả năng các dòng tế bào ung thư phổi A54, ung thư vú MCF-7, ung thư

gan HepG2 và dòng tế bào fibrosarcoma người HT 1080 bằng phương pháp MTT; với chỉ số IC50 từ 2.0 – 3.3 µg/ml

❖ Hoạt tính sinh học của Nhân trần tía

Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati đã được dùng trong y học cổ truyền

để phòng ngừa và chữa trị các bệnh lý về tiêu hóa và gan mật Đây là loại thực vật gây được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế gỉới do khả năng phòng chống viêm gan, chữa viêm gan virus, bảo vệ gan trước các hóa chất hóa độc hại (Nguyễn Đức Hạnh, 2008)

Cây thường được sử dụng trong dân gian với tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, lợi mật, tiêu độc, lợi tiểu, chữa cảm cúm, táo bón, bệnh vàng da Tác dụng tăng tiết mật thí nghiệm trên chuột lang cho thấy dịch chiết Nhân trần tía làm tăng tiết mật 24.7% so với

lô đối chứng Độc tính cấp Cho chuột uống với liều 300 mg/kg thể trọng dịch chiết nước không thấy chuột lang chết Chữa viêm gan virus trên lâm sàng Bệnh viện Chợ Quán thành phố Hồ Chí Minh đã dùng Nhân trần tía chữa trị viêm gan virus cho các bệnh nhân, kết quả số bệnh nhân khỏi hẳn là 24%, số bệnh nhân có chuyển biến khá và tốt là 46.6% (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004)

Protecliv là một sản phẩm thuốc được bào chế từ 50% cao Nhân trần tía và 50%

Tảo Spirulina có tác dụng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của Rifampicin và các

dẫn xuất Rifampicin (INH và RIF) ở các bệnh nhân phải điều trị bệnh lao bằng các loại thuốc này (Vũ Mạnh Hùng và Bùi Thị Bích Vân, 2008)

Cao toàn phần phối hợp giữa lá Đinh lăng và Nhân trần Tây Ninh thể hiện tác động bảo vệ gan trên ba mô hình gây tổn thương gan bằng ethanol, tetraclorua và paracetamol (Dương Thị Mộng Ngọc và cộng sự, 2011)

1.1.2.5 Một số bài thuốc từ Nhân trần

Ở miền nam, dược liệu mang tên Nhân trần chủ yếu là Nhân trần tía Adenosma

bracteosum Bonati Nhưng trong Y học cổ truyền Việt Nam chưa có sự phân biệt rõ

ràng cách sử dụng, do đó cả ba loại Nhân trần nam Adenosma caeruleum R Br., Nhân trần bồ bồ Adenosma indiana (Lour.) Merr., Nhân trần tía Adenosma bracteosum

Bonati thường được dùng như là cùng một loại dược liệu Theo Đỗ Tất Lợi (2004), dược liệu Nhân trần được dùng trong các bài thuốc sau:

- Trong thú y, người ta dùng Nhân trần bồ bồ chữa bệnh trâu bò đi tiêu ra phân trắng Ngày dùng 4 – 6 g, có khi tới 20 g dưới hình thức thuốc sắc, thuốc pha hay thuốc viên

- Chữa sốt vàng da, ra mồ hôi ở đầu mà người không có mồ hôi, miệng khô, tiểu tiện khó khăn, bụng đầy (Nhân trần cao thang) Nhân trần nam hoặc Nhân trần bồ bồ 24

g, Chi tử (Dành dành) 12 g, Đại hoàng 4 g, nước 800 ml, sắc còn 250 ml chia 3 lần uống trong ngày

- Viêm gan vàng da có sốt Bạch hoa xà thiệt thảo 0,5 kg, Nhân trần 150 g, Sinh cam thảo 50 g Mỗi ngày dùng 60 g hỗn hợp này đun với nước cho sôi trong bình kín, sau 15 phút thì lấy ra dùng

- Người miền Bắc hay sử dụng cây Nhân trần và Cam thảo dùng làm nước uống giải nhiệt hằng ngày có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm gan, rối loạn tiêu hóa, phòng chống ung … Dùng 80 g Nhân trần với 40 g Cam thảo dùng với 3000 ml nước, sắc cho

ra nước màu nâu đậm để nguội uống thay nước

1.2 Định nghĩa về gốc tự do, stress oxy hóa và chất chống oxy hóa

1.2.1 Khái niệm về gốc tự do và stress oxy hóa

Gốc tự do là các phân tử hay nguyên tử có lớp ngoài cùng chỉ chứa điện tử độc

thân Vì chỉ có một điện tử đơn lẻ nên gốc tự do luôn ở trạng thái bất ổn và tìm cách chiếm lấy điện tử của các nguyên tử khác Các gốc tự do hoạt động chứa oxy là các dẫn xuất dạng khử của oxy phân tử (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009)

Các “gốc tự do” hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen Species - ROS và Reactive Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các

“gốc tự do” và các dẫn xuất không phải gốc tự do Các “gốc tự do” là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân Các dẫn xuất không phải gốc tự

do như oxy đơn, hydroperoxyde, nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do

2 Bảng 1.2 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Wallace, 1997; Puri, 2014)

❖ Nguồn gốc phát sinh gốc tự do:

Nguồn nội sinh: Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý như quá trình hô hấp ở tế bào, hoặc các quá trình bệnh lý như quá trình viêm nhiễm, hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy hóa (prooxydant enzyme), ion kim loại chuyển

tiếp… trong cơ thể

Nguồn ngoại sinh: Ngoài những yếu tố nội sinh, gốc tự do còn được hình thành trong cơ thể bởi các yếu tố ngoại sinh như sự ô nhiễm môi trường, bức xạ, khói thuốc

lá, sử dụng thuốc giảm đau quá liều, uống nhiều rượu bia …

Khi nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hoà quá trình chết theo chu trình của tế bào (apoptosis), kích hoạt các yếu tố phiên mã cho các gen tham gia vào quá trình miễn dịch, kháng viêm, điều hoà các gen mã hóa cho các enzyme chống oxy hóa Khi nồng độ cao, các gốc tự do gây ra sự phá hủy các đại phân tử sinh học dẫn đến nhiều bệnh nghiêm trọng

Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa gây tác động xấu đến cơ thể sinh vật

là các hợp chất tự nhiên Các chất này có nhiều trong rau và quả Chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản

và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009)

1.2.3 Tác hại của sự stress oxy hóa

1.2.3.1 Tác động lên DNA

Hydroxyl là gốc tự do có khả năng phá hủy DNA mạnh nhất, thường là qua con đường biến đổi các base hay phân cắt chuỗi DNA Sợi đôi DNA bị bẽ gãy sẽ gây ra hiện tượng chết tế bào Bản thân superoxyd không tương tác với DNA nhưng có khả năng khử Fe3+ thành Fe2+ xúc tác phản ứng Fenton, khởi đầu cho sự phá hủy DNA Mặt khác, gốc perhydroxyl có thể lấy đi nguyên tử 5’-hydrogen từ vòng deoxyribose

và cơ chế này có thể chuyên biệt cho phản ứng của HOO● (Dix và cộng sự, 1996)

3 Bảng 1.3 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa DNA (Cooke và cộng sự, 2003)

Gan Nhiễm virus viêm gan C (HCV); Xơ gan mãn tính; Ung thư

tế bào biểu mô thận Phổi Xơ hóa nang; Ung thư tế bào biểu mô; Ung thư phổi

Da Viêm da phân bào; Vẩy nến da; Ung thư da

Dạ dày Ung thư dạ dày

Một số bệnh

khác

Lão hóa; Đái tháo đường; Hội chứng Down; Viêm thấp khớp; Rối loạn tim mạch; Ung thư trực tràng; Ung thư tế bào biểu mô thận

1.2.3.2 Tác động lên protein

Sự oxy hóa protein diễn ra do sự biến đổi các protein gây ra trực tiếp bởi các gốc tự do hoặc gián tiếp do các sản phẩm thứ cấp của stress oxy hóa Có rất nhiều cơ chế gây ra sự oxy hóa protein cũng như toàn bộ chuỗi acid amin đều có thể bị oxy hóa, do đó gây ra một số lượng rất lớn các protein bị biến đổi Hai acid amin dễ bị tác động nhất là cystein và methionin do cả hai chứa nguyên tử sulfur linh hoạt, hầu như tất cả các tác nhân oxy hóa đều có thể oxy hóa hai acid amin này Trong khi ở các acid amin khác, sự oxy hóa cần các điều kiện nghiêm ngặt hơn Cách oxy hóa hiệu quả nhất là tấn công thông qua xúc tác kim loại ở các vị trí chuyên biệt, trong đó các dạng khử của kim loại chuyển vị liên kết với protein sẽ khử H2O2 thành dạng trung gian hoạt động (Shacter, 2000)

4 Bảng 1.4 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa protein Protein bị oxy hóa Bệnh

Carbonyl; Glutamine synthetase Lão hóa; Alzheimer; Thiếu máu cục bộ

Một số protein chưa biết Lão hóa; Parkinson; Xơ vữa động mạch;

5 Bảng 1.5 Các bệnh liên quan đến sự oxy hóa lipid (Adibhatla, 2010)

Thần kinh Azheimer; Parkinson; Teo cơ; Đa xơ cứng; Tâm thần

phân liệt; Tổn thương dây thần kinh cột sống; Thoái hóa

hệ thần kinh; Động kinh

Gan Gan nhiễm mỡ; Xơ gan; Ung thư gan; Kháng insulin

ngoại vi; Nhiễm virus viêm gan C Một số cơ quan khác Viêm; Tiểu đường; Ung thư; Lão hóa

1.3 Hợp chất tự nhiên từ thực vật và hoạt tính sinh học

Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của Nhân trần tía, nhận thấy thành phần chủ yếu của loài này terpenoid, steroid và polyphenol, do đó xin được giới thiệu thông tin sơ bộ về các nhóm họp chất này

1.3.1 Terpenoid

1.3.1.1 Định nghĩa, phân loại

Terpenoid (hay isoprenoid) là một nhóm các hợp chất tự nhiên (HCTN) hình thành do sự kết hợp của các đơn vị isopren mang 5C, chiếm số lượng lớn (>35000 chất) trong các nhóm HCTN và có cấu trúc rất đa dạng Tùy theo số đơn vị isopren có trong phân tử, người chia thành các nhóm hemi- (1 đơn vị isopren và 5C), mono- (2 đơn vị và 10C), sesqui- (13 đơn vị và 15C), di- (4 đơn vị và 20C), sester- (5 đơn vị và 25C), tri- (6 đơn vị và 30C), tetra- (8 đơn vị và 40C) và polyterpenoid (>8 đơn vị isopren và >40C) (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015)

1.3.1.2 Nguồn gốc và ứng dụng

Terpenoid được tìm thấy rộng rãi với số lượng lớn trong thực vật bậc cao, ở tất

cả bộ phận của cây như hoa, lá, hạt, rễ , gỗ và cũng xuất hiện ở rêu, tảo, địa y, đĩa tiễn Một số nguồn gốc từ động vật (đặc biệt là côn trùng) và vi khuẩn

Mono- và sesquiterpenoid là thành phần chính của tinh dầu, dễ bay hơi và có mùi thơm, tìm thấy trong nhựa cây Tuy nhiên các di- và sesquiterpenoid tồn tại ở dạng glycosid hay ester với acid béo thì không bị lôi cuốn theo hơi nước Di- và triterpenoid

có trong nhựa cây và không bị lôi cuốn theo hơi nước Sesterterpenoid hiếm gặp Tetraterpenoid chủ yếu là các sắc số tự nhiên, tiêu biểu nhất là carotenoid

Terpenoid từ lâu đã được dùng trong mỹ phẩm, xà phòng, hương liệu, dược phẩm, chất khử trùng Terpenoid sở hữu khả năng kháng oxy mạnh, nhờ đó chúng có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi sự tác động của stress oxy hóa, nhất là một số căn bệnh như viêm gan, thận, thần kinh, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường, lão hóa Trong phạm vi đề tài xin được giới thiệu một hoạt tính sinh học tiêu biểu của nhóm chất này

- Kháng khuẩn: trong chi Nhân trần có sự hiện diện của p-cymen, carvacrol, thymol là các monoterpenoid một vòng; carvacrol, thymol là 2 chất kháng khuẩn mạnh được dùng làm thuốc sát khuẩn trong nha khoa Một thành phần khác là camphor thuộc dạng monoterpenoid hai vòng, có mùi thơm và thể hiện khả năng kháng khuẩn, được dùng trong nước hoa Cơ chế chính được cho terpenoid đã làm rối loạn thành phần màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến sự thay đổi tính thấm và làm rò rĩ tế bào chất, ngoài ra sau khi xâm nhập vào trong tế bào vi khuẩn, các hợp chất này tiếp tục gây hư hại các cấu trúc sinh học của vi khuẩn (Trombetta, 2005)

- Chất chống oxy hóa: những hợp chất monoterpenoid trong cấu trúc có nhóm methylene như terpinolene, α-terpinene, -terpinene và sabinene có tính kháng oxy hóa mạnh; những monoterpenoid có cấu trúc phenol như thymol và carvacrol cũng thể hiện khả năng kháng oxy hóa Khả năng kháng oxy hóa khả quan nhất là ở nhóm tetraterpenoid, thể hiện mạnh nhất ở các carotenoid (α-carotene, -carotene, lutein, zeaxanthin, -cryptoxanthin, lycopene) (Gonzalez-Burgos và Gomez-Serranillos, 2012)

- Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng hổ trợ điều trị tiểu đường của terpenoid thông qua việc làm giảm stress oxy hóa Nhiều báo cáo thu được kết quả khả

quan trên mô hình động vật mang gen tiểu đường và mô hình chuột gây độc bằng alloxan và streptozotocin Nhiều nghiên cứu dịch tễ học cũng được tiến hành, tập trung vào chế độ ăn giàu carotenoid Ở những monoterpenoid, nổi bật là catapol với khả năng bảo vệ não khỏi bệnh tật trong khi mắc bệnh đái tháo đường, aucubin tác động lên tuyến tụy để điều khiển bệnh, loganin và morroniside làm giảm hoạt động của ROS, logarin bảo vệ gan khỏi tác động của bệnh tiểu đường Những sesquiterpenoid như costunolide, eremanthin thể hiện khả năng chống stress oxy hóa trong mô hình chuột streptozocin thông qua cơ chế làm tăng các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT, GPx và các chất chống oxy hóa phi enzyme như GSH Một số triterpenoid như arjunolic acid và glycyrrhizin, ginsenoside là những hợp chất chống lại bệnh tiểu đường rất mạnh Carotenoid một lần nữa thể hiện khả năng dược lý, một nhóm bệnh nhân tiểu đường type 2 cho cho sử dụng chế độ ăn giàu caraotenoid lycopene đã làm giảm nguy cơ tim mạch cho những bệnh nhân này Trên mô hình chuột tiểu đường type

2, astaxanthin giúp giảm stress oxy hóa gây ra bởi nồng độ đường cao Burgos và Gomez-Serranillos, 2012)

(Gonzalez Chống tế bào ung thư: betulinic acid là một triterpenoid tiêu biểu có trong chi

Adenosma sp., betulinic acid được biết tới như là một chất ức chế u ác tính trên người,

qua thực nghiệm đã chứng minh được betulinic acid có khả năng phá hủy tế bào trong các hệ thống ung thư (Fulda, 2009) Safe và cộng sự (2012) đã đặt ra một số cơ chế chống ung thư của terpenoid như khả năng loại gốc tự do, làm giảm tác nhân gây ung thư và tác động lên thụ thể hạt nhân và cặp thụ thể G-protein tế bào ung thư

1.3.2 Steroid

1.3.2.1 Định nghĩa, phân loại

Steroid là một nhóm HTCN quan trọng, phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vi sinh vật Cholesterol là steroid tiêu biểu nhất Khi biến đổi, đặc biệt trên mạch nhánh, cholestrol tạo thành các hợp chất có hoạt tính quan trọng như acid mật, vitamin

D, kích thích tố Nhiều steroid tự nhiên, một lượng lớn steroid tổng hợp và bán tổng

tổng hợp có hoạt tính sinh học hữu ích nên được sử dụng nhiều trong y học Mặc dù có cùng khung sườn, hoạt tính sinh học của các steroid rất khác nhau, có lẽ một phần là do

sự hiện diện của các nhóm định chức gắn lên sườn steroid và một phần là do hóa học lập thể của các vòng dung hợp

Steroid là các triterpenoid biến đổi, chứa hệ bốn vòng có khung gonan Steroid trong tự nhiên được chia thành các nhóm chính như sau sterol (zoosterol, phytosterol

và mycosterol), acid mật, nội tiết tố giới tính, corticosteroid, vitamin D, glycosid tim, saponin steroid Các sterol từ thực vật được gọi chung là phytosterol, trong đó ergostrol

và stigmasterol là hai sterol thực vật chính (Nguyễn Diệu Liên Hoa và Phạm Đình Hùng, 2015)

β-Các phytosterol có khả năng ngăn chặn nhiều loại ung thư khác nhau, như ung thư phổi (Mendilaharsu và cộng sự, 1998), ung thư dạ dày (De Stefani và cộng sự, 2000), ung thư vú, dạ dày (Awad và Fink, 2000) Cơ chế chính của chúng tác động lên các tế bào ung thư được Woyengo và cộng sự (2009) mô tả như sau:

+ Phytosterol làm giảm sự sản sinh các chất gây ung thư và có khả năng

loại bỏ các gốc tự do, kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, superoxide dismutase và glutathione peroxidase, làm giảm sự hư hại tế bào

+ Kích thích quá trình apoptosis (chương trình tự chết tế bào) bằng cách

kích thích tăng hoạt động của caspase-3 (một loại enzyme pro-apoptosis họ MAPK)

Một cơ chế khác là phytosterol giúp thúc đẩy quá trình apoptosis bằng cách hạ thấp mức cholesterol trong máu Việc giảm mức cholesterol trong máu có thể giúp tăng quá trình apoptosis Cholesterol trong máu cao có sự liên quan đến bệnh ung thư, Oadir và Malik (2008) ghi nhận ở phụ nữ bị ung thư vú có nồng độ tryglyceride, cholesterol và LDL-cholesterol cao hơn so với người bình thường; chúng sẽ tích tụ trên màng tế bào, làm thay đổi tính chất của màng tế bào; ngoài ra cholesterol còn làm giảm quá trình apoptosis của tế bào

+ Ngăn chặn di căn và sự hình thành mạch của tế bào ung thư Sự tạo mạch

của tế bào ung thư nhằm lấy dinh dưỡng để phát triển và di căn là nguyên nhân chính gây tử vong bởi ung thư Campesterol và β-sitosterol được Awad và cộng sự (2001) chứng minh là có khả năng làm giảm quá trình di căn của tế bào ung thư

1.3.3 Polyphenol

1.3.3.1 Định nghĩa, phân loại

Đây là nhóm hợp chất lớn trong các nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật Các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 8000 hợp chất phenol tự nhiên Đặc biệt trong cấu trúc của nhóm này trong phân tử có vòng 6C (vòng benzen) gắn trực tiếp một hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) Vì vậy chúng là những alcol bậc 4 và được đặc trưng bởi tính acid yếu

Dựa vào thành phần chính và cấu trúc phenol, người ta chia chúng thành 3 nhóm

là phenol đơn giản, phenol phức tạp và nhóm polyphenol Phân loại này dựa trên bộ khung carbon của các hợp chất trong đó là C6 là nhóm phenyl, C1 là nhóm methyl, C2

là nhóm acetyl, C3 là nhóm thế có 3 carbon, C4 là nhóm thế có 4 carbon C6 (phenol đơn giản, benzoquinone), C6-C1 (acid phenolic), C6-C2 (acetophenone, phenylacetic acid), C6-C3 (acid hydroxycinnamic, coumarin, phenylpropene, chromone), C6-C4

(naphthoquinone), C6-C1-C6 (xanthone), C6-C2-C6 (stilbene, anthraquinone), C6-C3-C6

(flavonoid, isoflavonoid), (C6-C1)2 (tannin thủy phân), (C6-C3)2 (lignan, neolignan), (C

6-C3-C6)2 (biflavonoid), (C6-C3)n (lignin), (C6)n (catechol melanin), (C6-C3-C6)n (tannin ngưng tụ)

Nhóm hợp chất polyphenol là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc sự trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng

có thể chuyển từ sống dưới nước lên cạn hoàn toàn Các nghiên cứu còn cho thấy trao đổi hợp chất phenol không chỉ bảo vệ chống lại các yếu tố sinh học mà còn tham gia quá trình điều hòa ở cấp độ phân tử giúp cây sinh trưởng và phát triển bình thường Một số hợp chất polyphenol tham gia tạo màu sắc tự nhiên của hoa, quả, hấp dẫn côn trùng thụ phấn cho hoa

1.3.3.3 Flavonoid

Flavonoid là một trong các nhóm polyphenol thường gặp ở thực vật, với hơn

4500 hợp chất, được phân loại thành các nhóm flavanol, flavanone, flavon, isoflavone, catechin, anthocyanin, proanthocyanidin Phần lớn chúng dễ tan trong nước, tạo màu vàng nên được gọi là “flavonoid” (flavus – tiếng Latin, có nghĩa là màu vàng, một sắc

tố xanh đỏ tím hoặc không màu cũng được sắp xếp vào nhóm flavonoid nếu chúng có chung đặc điểm cấu tạo hóa học Flavonoid là sản phẩm của con đường acid shikimic, chúng có khung carbon chung là C6-C3-C6

❖ Tính chất sinh học

Tác dụng sinh học của các flavonoid rất đa dạng và phong phú Các cơ chế hóa học của chúng có nhiều điểm còn chưa sáng tỏ, tuy nhiên cơ chế đóng vai trò quyết định là tác dụng chống oxyl hóa Nhờ đó flavonoid có thể triệt tiêu gốc tự do có hại trong cơ thể, giúp cơ thể động vật và con người phòng chống bệnh tật

- Flavonoid có khả năng kiềm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tọa hóa học của từng chất flavonoid cụ thể Do bản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc ở trong cơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa khử, tồn tại ở dạng hydroxyl, semiquinone Semiquinone hoặc quinone là những gốc tự do bền vững, gọi là gốc phenoxyl, kí hiệu ArO* Chúng có thể nhận điện tử và hydrogen từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinone Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý

và bệnh lý để triệt tiêu chúng

- Sự có mặt của các nhóm hydroxyl nhân thơm của các flavonoid cũng như các polyphenol làm cho chúng có khả năng tương tác với protein Tương tác này có thể làm hoạt hóa hay ức chế hoạt động của enzyme Tác dụng của flavonoid lên các enzyme là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng các chất flavonoid để chữa bệnh

- Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã khẳng định flavonoid có khả năng chống ung thư Các flavonoid có tác dụng kiềm hãm các enzyme oxy hóa, kìm hãm quá trình đường phân, quá trình hô hấp, kìm hãm quá trình giảm phân, hạn chế sự phá

vỡ cân bằng các quá trình trao đổi chất bình thường trong tế bào; ngăn ngừa hoặc trì hoãn một số bệnh mãn tính và thoái hóa như ung thư, bệnh tim mạch, viêm khớp, lão hóa, đục thủy tinh thể, giảm trí nhớ, đột quỵ, bệnh Alzheimer, viêm, nhiễm trùng (Pham-Huy và cộng sự, 2008)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

2.1.1 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường,

Trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện trong 12 tuần, từ ngày 16/06/2016 đến ngày 07/08/2016

2.2 Vật liệu

2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Cây Nhân trần tía thu hái tại núi Bà Đen, tỉnh Tây Ninh vào tháng 12, năm

2015 Mẫu cây được định danh bởi PGS TS Trần Hợp, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

2.2.2 Đối tượng thí nghiệm

Chuột bạch giống swiss albino mice được mua ở Viện Pasteur Thành phố Hồ

Chí Minh

Vi sinh vật chỉ thị (Escherichia coli, Enterotoxigenic Escherichia coli -ETEC,

Listeria monocytogenes, Salmonella typhii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) được cung cấp bởi Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

Dòng tế bào ung thư gan HepG2 cung cấp bởi được cung cấp bởi ATCC (ATCC® HTB-8065™), được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền, khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

2.2.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm

❖ Dụng cụ thí nghiệm:

- Máy sấy; Máy cô quay chân không; Máy lọc chân không

- Máy lắc; Máy quang phổ UV-Vis

- Bể điều nhiệt; Bếp đun cách thủy

- Tủ cấy, que cấy, tủ ấm, nồi hấp, đĩa petri, ống nghiệm

- Máy đo đường huyết Benecheck Plus (Đài Loan)

❖ Hóa chất:

- Thuốc thử Folin-Ciocalteau (Merck – Đức); Acid Gallic (Sigma – Đức)

- Rutin (Ấn Độ); Ciprofloxacin (Flamingo - Ấn Độ)

- Vitamin C; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma – Đức)

- FeCl3, K3Fe(CN)6; CCl3COOH; H3PO4; NaCO3; AlCl3; BaCl2; H2SO4; glucose; Đệm phosphate (pH=6,6)

D Dung môi dùng cho phân tích (AR): Ethanol (Việt Nam); Methanol (Xilong – Trung Quốc); Dimethyl sulfoxyde - DMSO (Xilong - Trung Quốc); Chloroform (Việt Nam); Ethyl acetate (Xilong - Trung Quốc); n-butanol (Xilong - Trung Quốc)

- Môi trường TSA (Himedia - Ấn Độ); Môi trường TSB (Himedia - Ấn Độ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

2 Hình 2.1 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

Nhân trần tía

Sấy ở nhiệt độ 60oC

Trích ly nguyên liệu thu dịch chiết

Cao chiết và Cao phân đoạn

do DPPH

Đánh giá năng lực khử

Đánh giá hoạt tính cao chiết lên đường huyết

Xác định độc tính cấp diễn

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

2.3.1 Xác định độ ẩm

Độ ẩm của dược liệu được thực hiện bằng phương pháp Xác định mất khối

lượng do làm khô Cụ thể là dùng phương pháp: sấy trong tủ sấy ở áp suất thường theo

Dược điển Việt Nam Quyển III, Phụ lục 5.16

W: độ ẩm của dược liệu (%)

mbd: Khối lượng ban đầu (g)

msau: Khối lượng sấy (g)

2.3.2 Quá trình chiết và thu nhận cao chiết

2.3.2.1 Sơ đồ quy trình

3 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết cao chiết Nhân trần tía

Ngấm kiệt với cồn 96%

Cô quay loại dung môi

Bột dược liệu khô

Cao chiết cồn

Hòa vào nước

Chiết lỏng–lỏng với dung môi chloroform (CHCl3)

Cao phân đoạn

CHCl3

Dịch chiết cồn-nước sau lắc CHCl3

Chiết lỏng–lỏng với Ethyl acetate (EA)

Cô quay loại dung môi

Cao phân đoạn

EA

Dịch chiết cồn-nước sau lắc EA

Cao chiết nước

Ngấm kiệt với nước

Cô quay loại dung môi

Cô quay loại dung môi

Chiết lỏng–

lỏng với n-butanol

Cô quay loại dung môi

Cao phân đoạn n-butanol

Cô quay loại dung môi

Cao phân đoạn nước