Sản xuất nấm paecilomyces sp để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu

1.1.5.2 Nhiệt độ Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng Ayyasamy và Ba

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP GÂY

HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : PHAN ÁNH NGÂN MSSV: 1211100132 Lớp: 12DSH02

Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực

Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tp HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Phan Ánh Ngân

biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường Và đặc biệt, trong học kỳ này Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của trường Đại học Công Nghệ Tp HCM, đặc biệt là TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp

Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới

Em xin chân thành cảm ơn !

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC ĐÍCH 2

NỘI DUNG 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp 3

1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces 5

1.1.4 Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp đối với tuyến trùng 6

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp 7

Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11 1.2.1 Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật 11

1.2.2 Phân loại khoa học 14

Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng 19

Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp trong phòng trừ tuyến trùng hại cây 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.2.2 Thiết bị 24

2.2.3 Các loại môi trường sử dụng 25

Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp 27

2.3.2 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 28

2.3.3 Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 28

2.3.4 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 29 2.3.5 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) 30

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp 30

2.3.7 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp 31

2.3.8 Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm Paecilomyces sp 35

2.3.9 Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp trên cây hồ tiêu 36

2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp 38

Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp 39

41

3.2.3 Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp và Paecilomyces sp 43

Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp (môi trường lỏng) 44

3.3.1 Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp 44

3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp (môi trường rắn) 49

Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces sp 52

3.4.1 Trong điều kiện phòng thí nghiệm 52

3.4.2 Trên đồng ruộng 55

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

Kết luận 58

Kiến nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Tài liệu tiếng việt 59

Tài liệu tiếng anh 59

Tài liệu từ internet 61

PHỤ LỤC 1

NSC: ngày sau cấy

NT: nghiệm thức

PDA: Potato D – Glucose Agar

SDAY1: Sabourand dextrose Yeast

SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng

Bảng 2 3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm 33

Bảng 2 4 Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp và Paecilomyces sp 35

Bảng 2 5 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp 37

Bảng 3 1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp trên 4 loại môi trường trừ nấm 40

Bảng 3 2 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp 40

Bảng 3 3 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp 41

Bảng 3 4 Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế 41

Bảng 3 5 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp 43

Bảng 3 6 Đường kính tản nấm Trichoderma sp khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp 43

Bảng 3 7 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc 44

Bảng 3 8 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp tính theo logarit 46

Bảng 3 9 Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy 51

Bảng 3 10 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp nhân nuôi trên khay ngô mảnh và gạo tấm 52

Bảng 3 11 Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp bị nấm Paecilomyces sp ký sinh 53

Bảng 3 12 Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu 55

Hình 1.3 Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) 6

Hình 1.4 Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật 15

Hình 1.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp 17

Hình 1.6 Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp phòng trừ tuyến trùng 22

Hình 3.1 Nấm Paecilomyces sp trên môi trường PDA 38

Hình 3.2 Tản nấm Paecilomyces sp trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin 20WP; E: đối chứng) 39

Hình 3.3 Nấm Paecilomyces sp trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) 42

Hình 3.4 Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp và Paecilomyces sp 44

Hình 3.5 Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp trên 4 loại môi trường (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3) 45

Hình 3.6 Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng 48

Hình 3.7 Hình nấm Paecilomyces sp được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) 50

Hình 3.8 Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường 51

Hình 3.9 Nấm Paecilomyces sp nhân nuôi trên khay 52 Hình 3.10 Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp bị chết ở các ngày sau khi lây

nhiễm Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11 Nấm Paecilomyces sp tấn công con cái và trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái

tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái

Hình 3.13 Trước khi tưới 57 Hình 3.14 Sau khi tưới 57

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam

Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam Năm 2015, mặc dù chưa có thống

kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo

số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015) Tuy nhiên, cũng như các ngành nông nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất gây nên do dịch hại Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012) Bên cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu Theo kết quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại cao Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ Tuy

có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để

phòng trừ tuyến trùng Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp được xem là một trong

những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H D., 1998; Butt T M

và Copping L., 2000) Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces

vẫn còn hạn chế Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ

thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp và đã chứng

minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng

ruộng Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp để phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu”

MỤC ĐÍCH

Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Paecilomyces sp và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm Paecilomyces sp

NỘI DUNG

❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp

1.1.1 Phân loại khoa học

phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy

Nấm Paecilomyces spp có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces

fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K Arora, P D

Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004)

Nấm Paecilomyces sp có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng,

cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002) Nấm Paecilomyces spp dễ

dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng

- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất

- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng

- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng

chết, rừng cao su, đất trồng tiêu (Crop Protection Compennium, 2002)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Paecilomyces sp là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến

trùng Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài Cũng có loài màu nâu hay vàng

bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và

uốn cong Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc

có gai (Trần Văn Mão, 2002) Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm Có thể

phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể

(Phùng Lê Kim Yến, 2014)

Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces sp được nuôi nấy trên môi trường

PDA

(Nguồn:http://galleryhip.com/scopulariopsis.htm)

Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi Bào tử có thành trơn hoặc hơi nhám, không có bào tử chống chịu

Hình 1.2 Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi

(Nguồn: http://www.wikiwand.com/de/Paecilomyces_variotii)

1.1.3 Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces

Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin) Leucinostatins là một peptide trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 – hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo Mori et al 1982) Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều loại nấm (theo Fukushima et al 1983 a,b) Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

trùng không có sự tham gia của loại độc tố này Tùy từng loài Paecilomyces khác

nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng

Hình 1.3 Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin)

1.1.4 Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp đối với tuyến

trùng

Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và

West, 1991) Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và

Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng

hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996)

Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi

vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin

và một lớp lipoprotein bên trong Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp

vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004)

Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo các phương thức khác nhau Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong

trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009) Khả năng tiết enzyme chitinase và protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài

nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo

thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980) Sau khi xâm nhập vào bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp

Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp khi tấn công

vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm

độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối phó lại với môi trường (Penland, 1982)

1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng

Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp cần nhiều dưỡng chất, nếu

thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002) Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành

bào tử của nấm Paecilomyces sp (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001) Các

nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001) Các tác giả còn cho biết sucrose là

cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm)

Liang, K (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động

vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002)

1.1.5.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng (Ayyasamy và Baskaran, 2005) Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25

0C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999) Gần đây, Stather và

ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát

triển của nấm Paecilomyces sp và xác định nấm Paecilomyces sp thích hợp ở nhiệt

tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì

nấm Paecilomyces sp sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (theo Penland, 1982) Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt

0C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002) Julio

J D và ctv (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C

1.1.5.3 Ẩm độ

Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004) Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm Bào tử phân sinh của nấm

Paecilomyces sp có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi

ẩm độ 75 %

1.1.5.4 pH

pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+

có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng, acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử (Dasrupta, 1994) Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8 Nhưng nấm tuyến trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6 Theo nghiên cứu

của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P

fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P japonica phát triển tối ưu ở pH 7

(Choi et al., 1999), P sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003)

1.1.5.5 Ánh sáng

Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát triển và tạo bào tử Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002) Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình

sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces

spp sẽ không tạo nhiều bào tử

1.1.5.6 Độ thoáng khí

Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt

1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy

Năm 1986, tác giả Jeanne M M I và CS (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy

nấm Paecilomyces sp bằng phương pháp lên men chìm Tác giả đã tiến hành thử

nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn nitơ và cacbon khác nhau Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì (NH4)2SO4 thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp phát triển, tạo bào tử chồi nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp trong điều kiện nuôi cấy lỏng

đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo –

polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica Kết quả cho thấy với thành phần

cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt

độ 27 0C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và 2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012) Nghiên cứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi

trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC

– P Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất và vitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH Các bào tử đã được cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l,

K2HPO4 1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO4 0.50 g / l, FeSO4 0,01 g / l, agar 13,00 g / l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử

(dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl2 3,00 g / l, ZnSO4 · 7H2O 0,01 g / l, agar 13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH 7 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH

6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn Số liệu cung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ là điều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó Môi trường nuôi cấy lỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất

bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus Trong khi tất cả các môi

trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độ bào tử cao (5,8 × 108 bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 g glucose.l-1 và 13,2 g Casamino axit.l-1 (môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng

kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô có chứa nồng độ glucose trong môi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản

xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn Tất cả 23 chủng nấm P fumosoroseus phân lập

trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trong môi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 % của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ

Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản

xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp đã được thực hiện S Prabhu, S.Kumar và S Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus

trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng Thí nghiệm được thực hiện trên 4 loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10 % Molasses

và môi trường Semi chọn lọc Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượng sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường 10 % Molasses (16.85 g) Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.5g) Sinh

Zhang và Yin Wang đã thực hiện nghiên cứu lên men nấm Paecilomyces lilacinus

bằng chất thải thực phẩm kiểm soát sinh học tuyến trùng sần rễ Điều kiện môi

trường nuôi cấy nấm P lilacinus được tối ưu hóa thông qua phương pháp lên men

bề mặt Kết quả chỉ ra rằng thời gian lên men, lượng chất thải thực phẩm, độ pH ban

đầu và nhiệt độ là các yếu tố quna trọng ảnh hưởng đến sản xuất P lilacinus Sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus phát triển ở điều kiện tối ưu cho 109,6±0,3 bào tử /

ml Sau khi lên men, nhu cầu oxy hóa của chất thải thực phẩm giảm một cách hiệu quả với 81,92 % Hoạt tính enzyme protease và khả năng kiểm soát tuyến trùng sần

rễ của P lilacinus nuôi bằng chất thải thực phẩm được đánh giá cao hơn khi nuôi

bằng môi trường PDA lần lượt là 10,8 % và 27 %

Lê Hữu Phước và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhân sinh khối

nấm Paecilomyces spp trên bốn loại môi trường CDB, CMB, SDAY1 và SDAY3

qua các thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng Khả năng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 NSKL Mật số bào tử cao

lượt là 5,0 x 108 bào tử / ml và 4,8 x 108 bào tử / ml, tuy nhiên giữa chúng không có

sự khác biệt về mặt thống kê

Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp gây bệnh bướu rễ trên cây hồ

tiêu

1.2.1 Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật

Tuyến trùng ký sinh thực vậy có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997) Tổn hại về mặt kinh tế từ 40-50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997)

Vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng nên người nông dân thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra Thiệt hại

về cây trồng do tuyến trùng gây ra hậu quả cao đặc biệt vào mùa mưa, trong đó bao

gồm các loại cây thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua bị ảnh hưởng nhiều

nhất Ở Việt Nam, sản lượng tiêu giảm đáng kể do tuyến trùng Meloidogyne spp

gây ra bệnh sần rễ Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi nấm, vi khuẩn có khả năng xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn Khi tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được

Tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu gồm tuyến trùng ngoại ký sinh và nội ký sinh, chích hút dinh dưỡng từ rễ làm suy giảm sức khỏe của cây, gây tổn thương rễ, ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng và nước, gây vàng lá cục bộ hoặc vàng toàn bộ cây, gây héo tạm thời vào mùa khô khi thiếu nướcvà có nhiều u bướu rễ, vết thâm đen tại bướu, hoặc bướu bị mục nát, có rất ít rễ non được hình thành Hội chứng vàng lá cây tiêu có liên quan đến mức độ rễ bị tổn thương do sự ký sinh của tuyến trùng Triệu chứng sưng rễ thường do tuyến trùng nội ký sinh gây ra, hoặc chỉ là vết thâm nâu, nâu đen trên rễ do tuyến trùng ngoại ký sinh tạo ra

Tuyến trùng luôn hiện diện trong vùng rễ hồ tiêu và tập trung nhiều từ độ sâu

5 đến 40 cm, vì rễ là nơi cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng Cây càng tốt, rễ hút dinh dưỡng càng nhiều, tuyến trùng càng phát triển nhanh về số lượng Mật độ tuyến trùng trên một đơn vị khối lượng đất (50g, 100g) hoặc khối lượng rễ (1g, 5g),

số bướu trên đơn vị khối lượng đất hay khối lượng rễ (1g), số tuyến trùng cái trong

1 bướu rễ, là các chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ nhiễm tuyến trùng của đất trồng

và cây ký chủ Vì vây, biện pháp kiểm soát số lượng tuyến trùng cần thực hiện vào thời điểm cây hồ tiêu có tốc độ phát triển cao nhất và lúc tuyến trùng tập trung vào vùng rễ nhiều nhất

Tuyến trùng nhanh chóng tiếp cận và xâm nhiễm vào rễ non sau khi cây được trồng và thiết lập quần thể với nhiều thế hệ cùng tồn tại Tuy nhiên cơ cấu đất, nguồn hữu cơ, vi sinh vật đối kháng hoặc ký sinh có ảnh hưởng đến số lượng tuyến trùng Tuyến trùng rễ cây hồ tiêu ít định cư ở tầng đât sâu hơn 60 cm, vì vậy kỹ

thuật trồng và chăm sóc cho hệ rễ phát triển theo chiều sâu sẽ giúp cây “thoát” sự xâm nhiễm tuyến trùng

Tuyến trùng phát tán theo nước mưa, nước tưới, động vật đi lại trong vườn, cây giống nhiễm tuyến trùng, hoặc do con người đi lại vô tình mang đất nhiễm tuyến trùng Tàn dư rễ có tuyến trùng định cư, cây ký chủ, mảng trứng trong đất là nơi lưu tồn nguồn tuyến trùng trên vườn hồ tiêu hằng năm

Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn:

rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu trắng

dưỡng bị ảnh hưởng Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gây nhiều bệnh khác cho cây

- Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn

Theo Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự (2007), có 29 loài tuyến trùng thuộc các họ khác nhau có mặt trong vùng đất trồng tiêu của Việt Nam, phổ biến nhất là

chi Meloidogyne Chúng hiện diện tương đối nhiều nơi trên thế giới, chúng ký sinh

bắt buộc với rễ của hàng ngàn loài thực vật

Meloidogyne gồm hơn 60 loài, 4 loài gây hại chính là Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne incognita và Meloidogyne halpa Chúng có

mặt ở 23 trong số 43 loài cây chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ đến các loài cây cảnh

Việc kiểm soát tuyến trùng sẽ rất khó khăn nếu chúng tấn công vào các loài cây lâu năm vì các loài cây lâu năm có rễ ăn sâu vào đất

Meloidogyne spp được Neal phát hiện đầu tiên ở cây sắn vào năm 1889 Rễ

bị tuyến trùng xâm hại sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bình thường, làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất cây trồng, từ đó kéo theo sự suy giảm sức đề kháng của cây trồng với sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh như hạn hán, dịch bệnh,

1.2.2 Phân loại khoa học

Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae

Loài: Meloidogyne

1.2.3 Đặc điểm sinh thái

Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne

spp có đặc điểm sau:

Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn tới dạng quả lê, màu trắng, ít vận động Không có giai đoạn u nang Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12–15 μm Lỗ bài tiết nằm trước tới khoang giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chất đặc sệt để bảo quản trứng, đẻ trứng ra ngoài

Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ Có kinh chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18–25 μm Tuyến hầu chủ yếu nằm ở phần bụng đến ruột Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25–33 μm, ống dẫn dài từ 7–11 μm Có tinh hoàn duy nhất

Ấu trùng: trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra trong một bọc gelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ Ấu trùng cảm nhiễm tuổi

2 (J2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm Kim chích và vùng đầu kitin hóa yếu, đuôi hình chóp

Hình 1.4 Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật

(Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com)

1.2.4 Hình thức sinh sản

Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu Tỷ lệ đực, cái phụ thuộc vào nhiều yếu tố Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát triển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giới đực cái

Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ và phát triển trong tế bào trứng Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với các nhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào.Trứng sau khi thụ tinh, một số phát triển trong vỏ trứng, vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyến trùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoại cảnh phù hợp

1.2.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp

Con cái đẻ trứng trong một khối chất đặc sệt chứa chất nền glycoprotein, được tiết bởi bởi sáu tuyến lớn trong ruột thông qua hậu môn (Sharon và Spiegel, 1993) Các khối trứng thường được tìm thấy trên bề mặt của sần rễ, đôi khi các bọc trứng này có thể nằm trong sần rễ Khối trứng ban đầu mềm, dính và trong vắt như pha lê nhưng lúc sau lại cứng và có màu nâu xẫm

Sau quá trình phát triển phôi thai, lần lột xác thứ nhất xảy ra bên trong trứng

và phát triển thành ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (J2) J2 dễ bị tổn thương, do đó chúng cần xâm nhiễm và định cư vào kí chủ càng nhanh càng tốt Ấu trùng J2 có thể xâm nhập vào rễ ngay cạnh nốt sần hoặc có thể xâm nhập vào rễ mới, ở đó chúng tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, tiết các hợp chất (ascorbic acid, gibberellin hay glutamic acid) và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương (Bird và Loveys, 1975)

Sau khi J2 xâm nhập, đỉnh rễ phình ra và sự phát triển của rễ dừng lại trong một thời gian ngắn Tuyến trùng hút dinh dưỡng tại các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng của tuyến trùng (vùng dinh dưỡng này gồm 5–6 tế bào khổng lồ) Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng

ký sinh cũng phình to tạo ra các bướu rễ

Sau khi xâm nhập vào rễ, J2 cũng nhanh chóng thay đổi về hình thái: cơ thể phình ra và các cơ quan cũng dần phát triển Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ J2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành Lần lột xác cuối cùng là

sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong J2 chúng được nở

ra và có dạng hình giun, trong khi con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh

Hình 1.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp

(Nguồn: extension.umn.edu)

1.2.6 Cơ chế xâm nhiễm của tuyến trùng Meloidogyne sp lên rễ cây

Khi chuẩn bị xâm nhập vào rễ, J2 tập trung dọc theo các tế bào non gần hay ngay tại vùng dính rễ J2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các

rễ bên mọc ra tạo nan điểm xâm nhập cho các J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương Khi J2 tiếp xúc với bề mặt rễ, chúng thường dùng kim chích và xâm nhập ngay vào trong rễ Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ

và bắt đầu quá trình hấp thu dinh dưỡng Khi hút dinh dưỡng, tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các vùng dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tại thành trong vùng nhu

mô hoặc vùng mô libe Tế bào khổng lồ phát triển từ một tế bào ban đầu duy nhất Các tế bào khổng lồ thường chứa nhiều nhân (có thể lê đến 80 nhân trong mỗi tế

bào) và các nhân bên trong tế bào khổng lồ thường là đa bội (Huang và Maggenti, 1969; Wiggers và công sự, 1990) Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bào được tạo ra và duy trì do tuyến trùng ký sinh Cùng với sự hình thành tế bào khổng

lồ, các mô rễ xung qunah nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng J2 xâm nhập và loài tuyến trùng ký sinh

Khi tế bào khổng lồ được hình thành, tuyến trùng J2 trở nên ít vận động và lớn dần, hình thành dạng “xúc xích” Dưới những điều kiện thuận lợi, J2 sẽ biến thái thành ấu trùng tuổi 3 (J3) sau 14 ngày, sau đó đến giai đoạn ấu trùng tuổi 4 (J4), và cuối cùng đến giai đoạn trưởng thành Tổng cộng thời gian ấu trùng ở giai đoạn tuổi 3 và 4 là ngắn hơn so với giai đoạn ấu trùng tuổi 2 hoặc tươnrg thành, thường là từ 4-6 ngày J3 và J4 thiếu kiêm chích và do đó không hút thức ăn được Con đực, khi đã được hình thành, giống hình con giun và không có bằng chứng nào cho thấy chúng hút chất dinh dưỡng Các con đực có thể được tìm thấy nhiều trong các loài có khả năng di chuyển không giao hợp khi các điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của con cái, như khi mật độ tuyến trùng quá cao và có sự giới hạn

về nguồn thức ăn (Perry và Starr, 2009)

1.2.7 Một số biện pháp phòng trừ

Ở Việt Nam, việc kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp vật lý (cày ải, luân canh cây trồng, ) hay hóa học Hoạt chất sinh học được nghiên cứu nhiều nhất có thể phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azzadiractin được chiết xuất từ cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996) Có rất ít nghiên cứu sử dụng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực

vật Gần đây, viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ có chứ T harzianum và

bánh dầu neem để phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy sự giảm mật độ tuyến trùng từ 2-4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiếu và cộng sự, 2010)

Từ những năm 1970 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật như các loại thuốc xông

hơi, các loại thuốc không xông hơi Tuy nhiên biện pháp này lại gây hậu quả xấu đến môi trường và sức khỏe cộng đồng, đặc biệt thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc Do đó cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong trường hợp cần thiết và phải sử dụng chúng một cách hợp lý Đưa thuốc vào độ sâu

35 – 40 cm đã cày bừa kỹ, ẩm độ 75 % và nhiệt độ phải phù hợp trong thời điểm cần xử lý với từng loại thuốc Dùng thuốc vào đúng giai đoạn mẫn cảm nhất của tuyến trùng, có thể thực hiện trước khi trồng, sau khi thu hoạch và trong bảo quản

Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp

trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng

Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quan trọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại Vai trò trấn áp những trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trình bày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P Paspelop (1932- 1940), Dusky S.R (1959), Tanada I (1959 -1964), Hall I M (1964)…(dẫn theo Nguyễn Ngọc Tú, 1997) Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâu hại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986) Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đối với các loài tuyến trùng và tuyến trùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 19 Nhiều loài nấm có khả năng nhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng Hầu hết các loài nấm này có cơ chế hoạt động

là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết Các loài nấm ký sinh trứng tuyến

trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium Paecilomyces lilacinus và

Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ,

M javanica và M incognita trên cà chua, cà tím và các loài rau khác (Cayrol et al,

1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami và Mittal, 2004; Van Damme et al, 2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar, 2006) Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq (2016) thực hiện

nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên

cây cà tím Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã

chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có khả năng làm giảm số lượng lớn

tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loài thuốc hóa học phòng trừ tuyến trùng

Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấy các nấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất

mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria Trong đó phải kể đến

các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E (1961), Hall I M (1963- 1964), Camera J W., Mac Bain (1963- 1967), Madelin M F (1965- 1966), Ignoffo C M (1977), H.D Burges và CS (1982), N K Maniania và CS (1984) (theo Nguyễn Ngọc Tú và CS.,1997), Ferron P (1978) Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất

tỷ mỷ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôi cấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụng chúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng

Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002) Alamgir Khan, Kleith L Williams, Helena K.M Nevalainen (2004) thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm

Paecilomyces lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne javanica Một serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được

tách chiết và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces

lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên

cứu hiệu quả của các loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng Quan sát bằng kính hiển vi điện tử chứng minh rằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúc của vỏ trứng khi chúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau Dưới tác động protease lên vỏ trứng, lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn Khi sử dụng chitinase có lớp không bào lớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của

nó Những thay đổi lớn trên lớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme

protease và chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus Lớp chitin bị thủy phân và

lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm

Paecilomyces lilacinus khi sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm

giảm sự nở của con cái tuyến trùng M javanica Nghiên cứu chỉ ra rằng một số

tuyến trùng đã nở khi được tiếp xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của

enzyme chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới

sự hiện diện của protease nội sinh

Mendoza A R., R A Sikora, và S Kiewnick (2007) đã thực hiện nghiên

cứu về sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến

trùng của chủng nấm đã được chứng minh Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng

khô được xem là liều dùng tối ưu của P lilacinus Tác giả chứng minh rằng P

lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R similis và cũng là

nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối

Năm 2006, M Nasr Esfahani và B Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của

nấm Paecilomyces lilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne Javanica và

ảnh hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính Kết

quả chứng minh rằng P lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng

kể số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M Javanica như tác

nhân gây bệnh làm rễ sần to Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùng được nhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau Tuyến trùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên

cơ thể chúng Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm

Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng

trừ tuyến trùng gây sần rễ Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10

bào tử / ml

Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm

từ nấm Paecilomyces spp vào trong thực tiễn đời sống Một số sản phẩm phòng trừ

tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công ty

Greencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm (Bacillus

subtilis, Trichoderma spp và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm

phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia (Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces spp., và các loại vi khuẩn (B spp) và (Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic, protease và

enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng Các sản phẩm này có hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco

Hình 1.6 Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp phòng trừ tuyến

trùng

Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp

trong phòng trừ tuyến trùng hại cây

Ở Việt Nam, kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp vật lý (cày ải, luân canh cây trồng, ) hay hóa học Hoạt chất sinh học được nghiên cứu nhiều nhất để phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azadiractin được chiết xuất từ cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996) Có rất ít nghiên cứu sử dụng vi sinh vậy (vi nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực vật Gần đây, Viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ chứa T harzianum và bánh dầu neem để

phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy có sự giảm mật độ tuyến trùng từ

2 – 4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiểu và cộng sự, 2010)

Trần Thị Tho và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh

dưỡng đến sự phát triển của nấm tím Paecilomyces javanicus; khả năng hình thành bào tử của các chủng nấm P javanicus và ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ nấm

đến sự phát triển của nấm này Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung pepton và

cao nấm men là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm P

javanicus Sau 14 ngày nuôi cấy nấm P javanicus cho mật số bào tử 108 cfu / cm2 Nghiên cứu do nhóm tác giả Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Trịnh Quang Pháp, Nguyễn Thị Phương Anh, Phạm Văn Ty ( Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) thực hiện nghiên cứu khả năng ức chế tuyến

trùng Meloidogyne Incognita trên cà phê của nấm Paecilomyces Javanicus Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch nuôi cây nấm P javannicus với nồng độ 5, 10, 20% có

ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nở trứng và gây chết đối với tuyến trùng M

hiệu lực là cao nhất, có thể ức chế nở trứng đến 96% và khả năng gây chết cao nhất

đối với ấu trùng M incognita là 75% so với đối chứng Do vậy, nguồn nấm P

javannicus có khả năng được phát triển trong phòng trừ sinh học đối với tuyến trùng

M incognita trên đồng ruộng

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ ngày đến ngày tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công nghệ Tp.HCM

Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Chủng nấm Paecilomyces sp được phân lập bởi Phùng lê Kim Yến (2014)

tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM

Chủng nấm Trichoderma sp được phân lập bởi Lê Nhật Đăng (2015) tại

phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp HCM

Mẫu rễ tiêu nghi nhiễm tuyến trùng thu nhận tại vườn tiêu thuộc tỉnh Bình Phước

2.2.3 Các loại môi trường sử dụng

2.2.3.2 Môi trường PDA (Potato D-glucose Agar)

Ống giống (Phòng thí nghiệm trường ĐH Công nghệ Tp HCM)

Thử nghiệm hiệu lực diệt tuyến

2.3.1 Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp

Chuẩn bị môi trường WA có bổ sung 0,1 g / l chloramphenicol, hấp khử trùng rồi phân phối đều ra các đĩa Petri vô trùng Cấy nấm vào giữa đĩa Petri môi trường, dùng kim hút đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cách tâm đĩa 2cm Đặt đĩa Petri trong tủ ủ với nhiệt độ 25 ± 2 0C Theo dõi sự xâm nhiễm của nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 2, 4, 6, 8, 10, 12 ngày cấy nấm (Khan và cộng

sự, 2009)

nhiễm Paecilomyces sp Dùng đũa thủy tinh vô trùng nghiền mẫu với 10 ml nước

cất vô trùng Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6

đĩa trên môi trường PDA

Chuẩn bị đĩa petri có chứa sẵn 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất WA Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy đã khử trùng lấy bào tử từ ổ bào tử (chú ý không lấy quá nhiều bào tử) khoảng 1 - 10 bào tử trên quang trường vật kín x10 Hòa bào tử vào ống nghiệm chứa 10 ml nước cất vô trùng Lắc đều tay để bào

tử hòa loãng đều trong ống nghiệm trong vòng 15 – 20 phút Đổ dịch bào tử vào đĩa petri có chứa 1 lớp mỏng môi trường thạch nước cất và tráng qua toàn bộ đĩa rồi lắc nhẹ cho dịch tràn đều trên toàn bộ bề mặt môi trường trong thời gian từ 30 giây đến

1 phút Trút bỏ toàn bộ dung dịch trong đĩa môi trường Dán đĩa bằng paraffin và

20 giờ Quan sát đĩa môi trường dưới kính lúp để tìm bào tử nẩy mầm Dùng que cấy dẹt, sắt để cắt xung quanh bào tử (cắt toàn bộ môi trường phía dưới của bào tử)

và chuyển miếng thạch có bào tử đó sang đĩa môi trường mới Ủ đĩa trong điều kiện phòng thí nghiệm và quan sát hình thái tản nấm sau 2 ngày

2.3.2 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PDA tiến hành hấp khử trùng

gỗ

Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng Sau đó bảo quản các ống giống này trong điều kiện lạnh (3 – 5 0C)

2.3.3 Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp đổ/trải đĩa đếm khuẩn lạc

trong bể điều nhiệt Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp) Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều Để nguội môi trường và đem ủ

tính ra số khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu)

2.3.3.2 Phương pháp đếm trực tiếp tế bào trong buồng đếm hồng cầu

Phương pháp này thường áp dụng để đếm tế bào nấm men hoặc bào tử nấm mốc

tử (đường kính 9 cm), dùng que cấy vòng cào bào tử trên bề mặt đĩa, chuyển bào tử sang bình định mức 100 ml bằng pipet Pastuer, lặp lại các bước này tối thiểu ba lần bảo đảm chuyển hết bào tử sang bình định mức 100 ml

5-10 tế bào)

❖ Nhẹ nhàng dùng đầu pipet (chứa 1 giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng) Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có cùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt

khoang Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0,1 mm

❖ Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm Chỉnh thật rõ, sau đó chuyển qua vât kính x10 hoặc x40 để đếm

cả tế bào lẫn các đường kẻ Tùy vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện Đếm bào tử trong vùng có chữ W (vùng đếm bạch cầu)

bào nằm trên 2 đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô

• Mật độ bào tử trong mẫu là: Bào tử / 1mm3 = 1𝑚𝑚2𝐵.0,1 𝑚𝑚 =10𝐵

Bào tử / 1ml = B.1000.10 (B là số bào tử trung bình đếm được)

• Số bào tử trong dung dịch gốc:

Bào tử / ml = B.1000.10.F (F là hệ số pha loãng)

• Số bào tử trên 1 đĩa Petri 9 cm = B.104.F

2.3.4 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014)

được ở tỉnh Bình Phước Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để khô tự nhiên, cân khối lượng và đánh giá mức độ nguy hại trước khi tách tuyế trùng Các cấp đô nguy hại của rễ được đánh giá dựa vào sự hiện diện của các nốt sần

khô tự nhiên Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và

bắt con cái, túi trứng trong nốt sần Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 600 - 700 nm, rộng 400 -

500 nm Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái

2.3.5 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp trên các loại môi

trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009)

với 4 loại môi trường CDB, CMB, SDAY1, SDAY3 và 3 lần lặp lại Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 500ml (chứa 250ml môi trường thử nghiệm) Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng autoclave ở 121

số 4,72.106 bào tử / ml Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng / phút ở nhiệt độ phòng, thời gian 12 giờ sáng / 12 giờ tối

điểm: 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày sau khi lắc cho tất cả các thí nghiệm Ở mỗi thời điểm, tiến hành pha loãng dung dịch huyền phù bào tử nấm trong mỗi bình môi trường Đếm mật số bào tử / ml cho từng nghiệm thức

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của

nấm Paecilomyces sp