Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men chủng candida bombicola

Những đặc tính ưu việt của SLs so với các chất hoạt động bề mặt hóa học như khả năng phân hủy sinh học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với môi trường.. Trên thị trường chất hoạt động

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

TP Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Người thực hiện đề tài: Huỳnh Thị Diễm Trinh

Sinh viên trường: Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

Khoa: Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi Trường

Ngành: Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Lớp: 11DSH01

MSSV: 1151110044

Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này

là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh học Nhiệt đới, dưới sự hướng dẫn của

TS Nguyễn Hoàng Dũng Các số liệu thu thập được và kết quả phân tích trong bài là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây Một

số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu, thông tin được đăng tải trên các trang web, tác phẩm, bài báo theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ

án

Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo cáo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm - Môi trường, trước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

Ngày ….tháng….năm…

Sinh viên thực hiện

(ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến:

Các thầy cô Bộ môn trong khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường cùng các thầy cô trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, đã trực tiếp giảng dạy

và truyền đạt kiến thức cho tôi khi học ở trường

Thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, một người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn và luôn động viên tôi trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Chị Nguyễn Lương Hiếu Hòa, chị Lê Quỳnh Loan, bạn Trần Lê Việt Hà, bạn Lê Văn Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như những niềm vui nỗi buồn cùng tôi Tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi nhiều điều trong suốt quá nghiên cứu

Tập thể lớp 11DSH01, trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, đã sát cánh bên tôi trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học

Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và các em trong gia đình đã chăm sóc, lo lắng và luôn dõi theo từng bước con đi Sẵn sàng bên cạnh động viên và khích

lệ những lúc con khó khăn nhất, để con có thể vững tin và bước tiếp trên con đường đã chọn

Huỳnh Thị Diễm Trinh

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của đề tài 1

2.Tình hình nghiên cứu 2

3.Mục đích nghiên cứu 2

4.Nhiệm vụ nghiên cứu 2

5.Phương pháp nghiên cứu 3

6.Các kết quả đạt được 3

7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về nấm men 5

1.1.1.Đặc điểm hình thái tế bào nấm men 5

1.1.2.Cấu tạo tế bào nấm men 5

1.1.3.Sinh sản ở nấm men 5

1.1.4.Ứng dụng của nấm men 6

1.1.5.Sơ lược về nấm men Candida bombicola 7

1.2.Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) 8

1.2.1.Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học 8

1.2.2.Khái quát về sophorolipids (SLs) 10

1.2.2.1.Giới thiệu chung về SLs 10

1.2.2.2.Cấu trúc hóa học của SLs 11

1.2.2.3.Sinh tổng hợp SLs 12

1.2.2.4.Hoạt tính của SLs 13

1.2.2.5.Ứng dụng của SLs 15

1.3.Tình hình nghiên cứu về SLs 17

1.3.1.Nước ngoài 17

1.3.2.Trong nước 18

1.4.Thực trạng nguồn dầu thải ở Việt Nam 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 20

2.2.3 Hóa chất 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214 23

2.3.2 Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 23

2.3.3 Định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 25

2.3.4 Xác định thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 26

2.3.5 Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được 27

2.3.5.1 Khả năng nhũ hóa 27

2.3.5.2 Khả năng kháng oxy hóa 28

2.3.5.3 Khả năng kháng khuẩn 29

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải và glucose 32

3.2 Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi lên quá trình thu nhận Sophorolipids 32

3.3 Kết quả định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) 33

3.4 Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 35

3.5 Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu được 37

3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu được 37

3.7 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được 38

3.7.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 38

3.7.2 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình 9

Bảng 1.2 Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ

nước 14

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được 37 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch 39 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương

pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào nấm men C.bombicola 7

Hình 1.2 Cấu trúc của sophorolipid 11

Hình 1.3 Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids 12

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 22

Hình 2.2 Quy trình thu nhận sophorolipids 24

Hình 2.3 Quy trình phân tích mẫu SLs trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 27

Hình 2.4 Cơ chế phản ứng DPPH 28

Hình 3.1 Sophorolipids thu được 32

Hình 3.2 Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác nhau 33

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu SLs thu được 34

Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao 36

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate 36

Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu được 38

Hình 3.7 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch 39

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống hằng ngày của con người Chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm thiết yếu, trong mọi ngành công nghiệp, góp phần phát triển và mang lại lợi nhuận vô cùng to lớn cho ngành công nghiệp hóa chất Chất hoạt động bề mặt là một trong những nhóm hóa chất công nghiệp được sản xuất nhiều nhất hiện nay, với tổng sản lượng trên toàn thế giới vượt quá 15 triệu tấn/năm và đang tăng dần theo thời gian Chất hoạt động bề mặt được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chất tẩy rửa, mỹ phẩm, dược phẩm, thưc phẩm, nông nghiệp, sản xuất giấy, tăng hiệu suất thu hồi dầu thô… Phần lớn chất hoạt động

bề mặt được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóa học và từ dầu mỏ Việc này thường gây ảnh hưởng xấu đến môi trường bởi khả năng phân hủy sinh học của chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) kém Vì vậy, việc tổng hợp và ứng dụng các chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học đang được quan tâm nhiều trong những năm gần đây Trong đó sophorolipids (SLs) – một dạng chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) thuộc nhóm glycolipid - được xem là rất có triển vọng bởi nhiều nguyên nhân:

1 Vi sinh vật sản xuất không phải tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm

2 Những đặc tính ưu việt của SLs so với các chất hoạt động bề mặt hóa học như khả năng phân hủy sinh học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với môi trường

3 SLs có hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khác nhau về nhiệt độ,

liệu rẻ tiền đang được quan tâm hiện nay Vì lý do đó, đề tài nghiên cứu thu nhận

sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola từ nguồn dầu thải đã

được thực hiện

2 Tình hình nghiên cứu

Một số công trình nghiên cứu thu nhận SLs từ quá trình lên men C.bombicola đã

được công bố Kim và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thu nhận SLs bởi chủng

C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải phụ phế phẩm của ngành công nghiệp

chế biến dầu nành (SDO) và đạt sản lượng 90 g/l Tương tự, Daverey và Pakshirajan

(2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs thông qua lêm men C.bombicola

ATCC 22214

Hiện nay tại Việt Nam, một số công trình đề cập đến việc phân lập, nghiên cứu khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố Đa số các chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu Tuy nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất và ứng dụng SLs vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo

3 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men của chủng

C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải

Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Lên men chủng C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường chứa glucose và dầu

thải

- Thu nhận sophorolipids từ dịch lên men

- Định tính và xác định thành phần sophorolipids

- Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng sophorolipids

- Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids như khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa, khả năng nhũ hóa

5 Phương pháp nghiên cứu

lắc 180 vòng/phút

- Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC)

- Phân tích thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC - High Performance Liquid Chromatography)

- Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu

- Khả năng chống oxy hóa của SLs cũng được xác định thông qua khả năng bắt các gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)

- Khả năng nhũ hóa của SLs được xác định bằng phương pháp đo tỷ lệ hệ nhũ tương được tạo thành so với hệ dung dịch ban đầu

6 Các kết quả đạt được

Sản lượng SLs thu được sau quá trình lên men đạt 21,9 g/l Thời gian lên men

thu nhận SLs từ chủng C.bombicola thích hợp nhất là 7 ngày

Trong hỗn hợp SLs thu được có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau Bước đầu xác định được sự hiện diện của 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate

được xác định 4,4531 mg/ml Nồng độ ức chế tối thiểu đối với một số vi khuẩn cũng

được xác định S.aureus (1,25 mg/ml), P.aeruginosa (2,5 mg/ml), B.subtilis (0,6

dầu nành và xăng

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm men

Nấm men thường có hình cầu hoặc hình bầu dục, một số loại hình que và một số hình dạng khác Kích thước trung bình của nấm men là 2,5 – 10 µm x 4,5 – 21 µm Có loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả Khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ

là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài Có loài có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể [1]

Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào thực vật Tế bào nấm men có đầy đủ các thành phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, ribosome, nhân, không bào và các hạt dự trữ

Thành tế bào nấm men dầy khoảng 25 nm, được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90 % là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipid và glucosamine

Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8 nm có cấu tạo tương

tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn

Ty thể nấm men có hình bầu dục, được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hợc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên DNA của ti thể nấm men là một phân tử dạng vòng có khối lượng

[1]

Nấm men sinh sản bằng hai hình thức: vô tính và hữu tính

Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến và điển hình của tế bào nấm men Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa Trên tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo

ra nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài) Mỗi chồi con sẽ

nhận một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ Khi chồi con trưởng thành,

nó sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập Có trường hợp, tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy chồi tạo một tập hợp tế bào nấm men có dạng xương rồng hay còn gọi là khuẩn ty giả Ngoài ra, nấm men còn sinh sản vô tính bằng hình thức phân cắt như ở vi khuẩn, chỉ thấy ở chi nấm men

Schizosaccharomyces và sinh sản bằng bào tử như: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử bắn ở chi Sporobolomyces; bào tử áo ở nấm Candida albicans [1]

Sinh sản hữu tính ở nấm men là do sự tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men với nhau hình thành hợp tử Hợp tử phân chia thành các bào tử túi nằm trong nang (túi), nang chín sẽ vỡ bào tử được phát tán ra bên ngoài, gặp điều thuận lợi phát triển thành một tế bào nấm men mới [1]

Trong nông nghiệp: dịch chiết của nấm men có khả năng giúp thực vật chống lại một số bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra

Trong chăn nuôi: nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men bổ sung vào thức ăn của vật nuôi sẽ tăng cường hệ vi sinh vật đường ruột, giúp vật nuôi kháng lại các bệnh đường ruột Ngoài ra các nghiên cứu cũng nhận thấy sự tăng trọng, tăng sản lượng trứng, sữa… khi bổ sung nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men vào thức ăn của vật nuôi

Bên cạnh đó cao nấm men giàu nitrogen, vitamin, chất khoáng và các hợp chất kích thích tăng trưởng nên được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vât

1.1.5 Sơ lược về nấm men Candida bombicola

Loài: Candida bombicola

Chủng: Candida bombicola ATCC 22214

Nấm men Candida bombicola, trước đây được gọi là Torulopsis bombicola, được phân lập từ mật của loài ong nghệ (bumble-bees) thuộc chi Bombus sp [47] Candida bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida apicola, Candida bororiensis, Wickerhamiella domericqiae và Rhodotorula bogoriensis được biết đến với khả năng sản xuất SLs – một glycolipid ngoại bào

[12][19][20] [23][47] [48]

Hình 1.1 Tế bào nấm men C.bombicola

Nguồn: Kurtzman và Fell, (2001)

Tế bào nấm men Candida bombicola có dạng hình oval đến hình thon dài,

thường tồn tại riêng rẽ hoặc dính thành cặp, với kích thước tế bào là1,5 – 2,5 µm x 3 –

5 µm (Hình 1.1) [28]

men Candida bombicola không xuất hiện khuẩn ty giả hoặc tế bào bao gồm rất nhiều

các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc Phát triển trong điều kiện hiếu khí thì khuẩn lạc có màu kem đến màu xám tro, trơn, bóng, lồi và ria mép khuẩn lạc có dạng răng cưa [28]

Nấm men Candida bombicola có thể lên men glucose, sucrose và có khả năng

đồng hóa glucose, galactose, sucrose, ethanol, glycerol, D – Mannitol, D – Glucitol Chúng có thể phát triền ở nồng độ đường cao 100 g/L hoặc cao hơn [49]

Ngày nay, Candida bombicola thường được gọi là Starmerella bombicola C.A

Rosa & Lachance [14]

1.2 Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH)

Chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất có cấu trúc đa dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật Tất cả CHĐBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo) Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có

xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa hai chất (có thể là chất lỏng - chất lỏng, chất lỏng - chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng - chất lỏng và chất lỏng - chất rắn)[30][33] Không giống như chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHĐBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra Nhìn chung, CHĐBMSH được chia làm các nhóm chính: glycolipid; lipopeptid và lipoprotein; phospholipid và acid béo; CHĐBM trùng hợp và CHĐBM dạng hạt (Bảng 1.1) [6]

Bảng 1.1 Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình

Glycolipids

Rhamnolipids

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas sp

Sophorolipids

Candida bombicola Candida apicola Candida petrophilum

Trehalolipids

Rhodococcus erythropolis Mycobacterium tuberculosis Arthrobacter sp

Lipopeptides và

lipoproteins

Phospholipids,

acid béo và

lipid trung tính

CHĐBMSH

dạng trùng hợp

(polymer)

CHĐBMSH

dạng hạt

Vesicles và fimbriae Acinetobacter calcoaceticus

Nguồn: Desai và Banat, (1997)

Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các chất glycolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic – lipoprotein, hay chính bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có

đặc tính kháng sinh như chất gramicidin S hay polymicin Các CHHBMSH được tạo ra

cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn tan trong nước Nó được tạo ra do phản ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều trên các cơ chất không tan trong nước [6]

Trên thị trường chất hoạt động bề mặt hiện nay, CHĐBMSH được quan tâm nhiều hơn bởi một số đặc tính ưu việc như: độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học cao, thân thiện với môi trường hơn, tính chọn lọc cao và khả năng hoạt động cao trong môi trường có nhiệt độ, pH và nồng độ muối khắc nghiệt [27]

1.2.2.1 Giới thiệu chung về SLs

SLs được xem như là chất hoạt động bề mặt ngoại bào, là sản phẩm được tiết ra

bởi nấm men Candida sp và Wickerhamiella domercqiae SLs là một dạng CHĐBMSH

thuộc nhóm glycolipids có trọng lượng phân tử thấp, đang được quan tâm nhiều hiện nay cho mục đích thương mại [42]

SLs được mô tả lần đầu tiên vào đầu những năm 60 như là một glycolipid

ngoại bào được tổng hợp bởi nấm men Torulopsis magnolia [20] Sau đó vào năm

1968, Tulloch và Spencer đã báo cáo rằng chủng sản xuất SLs thực tế là Torulopsis apicola, hiện nay được gọi là Candida apicola Một nghiên cứu khác của Spencer và cộng sự (1970) cho thấy rằng SLs cũng được sản xuất bởi nấm men Candida bombicola Trong đó, nấm men Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và

nghiên cứu nhiều hơn cả do nó có khả năng sản xuất với sản lượng cao SLs (400 g/l) và

không phải là tác nhân gây bệnh [49] Không những thế C.bombicola ATCC 22214

còn có khả năng sử dụng dầu thải nhà hàng như là nguồn lipid cho quá trình tổng hợp SLs [17]

SLs được xem là một CHĐBMSH có triển vọng bởi vì vi sinh vật sản xuất không phải là tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm, có năng suất và chuyển hóa cơ chất cao [38]

1.2.2.2 Cấu trúc hóa học của SLs

Về cấu trúc hóa học, SLs gồm phần ưa nước là disaccharide sophoroses D-glucopyranosyl-D-glucopyranose) liên kết với gốc hydroxyl của carbon kế cuối hoặc cuối trong chuỗi acid béo C16-C18 (phần kỵ nước) bằng liên kết β-glucosidic ở vị trí C1’ (Hình 1.2) [25]

(2-O-β-Trong phân tử SLs, nhóm carboxyl của chuỗi acid béo hoặc ở trạng thái tự do (cấu trúc SLs dạng mở hay dạng acid) hoặc là phản ứng este hóa nội sinh với nhóm hydroxyl ở vị trí C 4” của phần sophorose (cấu trúc SLs dạng vòng hay dạng lacton) [41] Đây là hai dạng cấu trúc chính trong thành phần cấu tạo của SLs Các cấu trúc này có sự khác biệt về mức độ acetyl hóa (ở vị trí 6’ và 6”) của phần sophorose và thành phần acid béo (chiều dài chuỗi, mức độ bão hòa, vị trí của nhóm hydroxyl) phụ thuộc vào chủng sản xuất, điều kiện sinh trưởng và nguồn carbon kỵ nước [29]

Các phân tử SLs có cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến một vài sự khác nhau trong các đặc tính sinh học và hóa lý của chúng và có thể được ứng dụng chuyên biệt trong các lĩnh vực khác nhau [29] Các sophorolipid lacton có hiệu quả hơn trong việc làm giảm sức căng bề mặt và khả năng kháng khuẩn tốt hơn, trong khi sophorolipid acidic tạo bọt và hòa tan tốt hơn

Hình 1.2 Cấu trúc của sophorolipid

Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011)

1.2.2.3 Sinh tổng hợp SLs

Hình 1.3 Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids

(1) lipase, (2) cytochrome P450 monooxygenase, (3) alcohol-dehydrogenase,(4) aldehyde-dehydrogenase, (5) desaturase, (6) cytochrome P450 monooxygenase, (7) glucosyltransferase I, (8) glucosyltransferase II, (9) lactonesterase, (10)

acetyltransferase

Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011)

Con đường sinh tổng hợp SLs được trình bày ở hình 1.3 Tiền chất lý tưởng cho quá trình tổng hợp SLs là glucose và acid béo Ngoài ra, các dạng methyl, ethyl esters của acid béo hay triglycerides cũng có thể được sử dụng Trong trường hợp này, esterases sẽ thủy phân dần dần những chất này để tạo ra các acid béo Do các chủng

như C.bombicola, C.apicola có thể tăng trưởng trên alkan nên chúng có hệ enzyme cần

thiết cho quá trình oxy hóa các alkan này để tạo nên các acid béo Ở bước đầu tiên, các acid béo được hydroxyl hóa ở vị trí cuối (ω) hay kế cuối (ω -1) bằng enzyme

cytochrome P450 monoxygenase Ở C.bombicola, 5 gen cytochrome P450

monoxygenase khác nhau thuộc nhóm CYP52 đã được xác định Ở bước thứ 2, glucose thứ nhất được gắn vào vị trí C1’ của nhóm hydroxy bằng enzyme glycosyltransferase I

Ở bước thứ 3, glucose thứ hai được gắn vào vị trí C2’ của glucose thứ nhất nhờ enzyme glycosyltransferase II Sản phẩm được tạo thành trong quá trình này chỉ là các SLs dạng acid Tuy nhiên, sau đó chúng thường được biến đổi tiếp thông qua quá trình ester hóa để tạo nên SLs dạng lacton bằng enzyme lactonesterase và acetyl hóa đầu carbohydrate bằng enzyme acetyltransferase để tạo nên các dạng acetyl [50]

1.2.2.4 Hoạt tính của SLs

Sophorolipids là CHĐBMSH thuộc nhóm glycolipids, có chỉ số cân bằng ưa nước – ưa béo (HLB) khá rộng từ 8 – 10 Vì vậy, chúng được ứng dụng rộng trong nhiều lĩnh vực như: mỹ phẩm, dược phẩm, chất tẩy rửa…

Tiêu chuẩn để đánh giá khả năng hoạt động của một CHĐBM là sức căng bề

mặt và nồng độ micelle tới hạn (CMC) SLs sản xuất từ nấm men Candida bombicola

trên môi trường chứa: mật rỉ đường mía, dịch chiết nấm men, ure và dầu đậu nành được báo cáo là có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nước và nồng độ micelle tới hạn (CMC) tương ứng là 34,15 N/m và 59,43 mg/l [14] Trong nghiên cứu sản xuất

SLs bởi nấm men Candida bombicola từ glucose và một số loại dầu như: dầu đậu nành

đen (SDO – phụ phẩm của ngành chế biến dầu nành), dầu bắp, dầu nành như là các nguồn carbon, Kim và cộng sự (2005) đã xác định được giá trị CMC và sức căng bề

mặt tối thiểu trong dung dịch nước của SLs tương ứng là 150 mg/l và 48 mN/m; 82 mg/l và 41 mN/m; 88 mg/l và 40,5 mN/m Tương tự, Otto và cộng sự (1999) cũng đã báo cáo rằng 130 mg/l cho CMC và 39 m.N/m cho sức căng bề mặt tối thiểu của SLs được sản xuất bởi nấm men sử dụng deproteinized whey và dầu hạt cải dầu như là các nguồn carbon

Bên cạnh khả năng làm giảm sức căng bề mặt thì khả năng nhũ hóa của SLs cũng là một hoạt tính quan trọng giúp SLs ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau

SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola là một chất nhũ hóa kém, không thể ổn

định nhũ tương có chứa nước và một trong hai chất hydrocarbon hoặc dầu thực vật [13][36] Tuy nhiên, một nghiên cứu của Daverey và Pakshirajan (2009) chứng minh

được rằng SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola ATCC 22214 sử dụng mật rỉ

đường mía như nguồn carbon, đã thể hiện hoạt tính nhũ hóa tốt hơn và ổn định hơn (Bảng 1.2) Trong một nghiên cứu của Ma và cộng sự (2012) về hoạt tính sinh học và

bề mặt của phân tử SLs được sản xuất bởi Wickerhamiella domercqiae đã cho thấy

rằng SLs có khả năng nhũ hóa mạnh mẽ đối với các cơ chất kỵ nước được chọn cụ thể

là paraffin lỏng, dầu hạt cải dầu và sự nhũ hóa trở nên yếu hơn đối với dầu thô Hơn nữa, các nhũ tương được tạo thành ổn định ngay cả khi để yên trong hơn 1 tuần

Bảng 1.2 Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ

Nguồn: Daverey và Pakshirajan (2009)

SLs cũng được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của một số chủng vi khuẩn Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của SLs của Kim và cộng sự

(2005) cho thấy: nồng độ ức chế (IC) của SLs đối với vi khuẩn Bacillus subtilis và Propionibacterium acne lần lượt là 4,0 mg/l và 0,5 mg/l Điều đó chỉ ra rằng SLs có

thể được sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe như là một tác nhân diệt khuẩn Năm 2013, Joshi-Navare và Prabhune đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của SLs trong sự kết hợp với kháng sinh để tăng cường hiệu quả kháng khuẩn và

thu được kết quả: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tetracycline với Staphylococcus aureus (ATCC-29.737) được xác định là 150 g/ml và SLs là 400 g/ml

Bên cạnh đó, SLs thô và SLs acid còn cho thấy có tác dụng đáng kể trong việc chống lại các gốc tự do hydroxyl (OH) Theo đó, SLs thô và SLs acid ở nồng độ 0,028%, 0,083 % khối lượng khô (w/v) sẽ bắt được các gốc tự do tương ứng lên đến 97

%, 100 % và 98 %, 100 % [22]

Ngoài ra, SLs còn có những hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH và nồng độ muối Kết quả nghiên cứu của Chandran và Das (2011) đã cho thấy SLs hoạt động ổn định trong một phạm vi rộng của pH từ 2 – 10,

1.2.2.5 Ứng dụng của SLs

SLs cho thấy có nhiều khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Hiện nay, việc nghiên cứu phát triển sản phẩm từ SLs đang được nhiều nhóm nghiên cứu tiến hành, đăng ký bằng sáng chế và một số đã được thương mại hóa Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của SLs là làm chất hoạt động bề mặt Công ty Saraya ở Nhật đã tiến hành thương mại hóa sản phẩm sophoron, một loại nước rửa chén chứa SLs [18] SLs cũng có thể được sử dụng trong bột giặt với vai trò là chất tẩy rửa [21]

Vì SLs là một phân tử không mang điện tích nên chúng có thể duy trì được đặc tính có sức căng bề mặt thấp ngay cả trong điều kiện nồng độ muối cao Khả năng tạo nhũ (emulsifying) của SLs cũng được ứng dụng trong các ngành hóa dầu Chúng có thể được sử dụng trong việc thu hồi các sản phẩm dầu thứ cấp, loại bỏ thành phần hydrocarbon trong dầu thô SLs còn được sử dụng để xử lý đất và nước bề mặt bị

nhiễm hydrocarbon; hấp thu các kim loại nặng có trong trầm tích [7][32] Ngoài ra, đặc tính tạo nhũ của SLs cũng được áp dụng trong trong công nghiệp thực phẩm để làm tăng chất lượng của bột mì hay trong các khoang chứa lạnh của máy bay để tránh tạo các tinh thể đá [5][34]

Bên cạnh đó, SLs cũng được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm Công ty Soliance

ở Pháp đã thương mại hóa các sản phẩm chăm sóc da, dưỡng thể chứa SLs Một công

ty của Hàn Quốc cũng đang trong quá trình thương mại hóa các sản phẩm chứa SLs trong mỹ phẩm Ngoài vai trò tạo nhũ, SLs còn đóng vai trò kháng khuẩn trong việc trị mụn, trị gàu và mùi hôi cơ thể [31] SLs còn cho thấy có nhiều tác động hữu hiệu trong việc bảo vệ da và tóc Chúng kích thích sự biến dưỡng của các tế bào fibroblast trong lớp biểu mô và kích thích quá trình tổng hợp collagen, nhân tố làm cho da săn chắc [9] Chúng còn có khả năng ức chế các gốc tự do, ức chế hoạt động của enzyme elastase gây ra lão hóa, thúc đẩy quá trình làm liền da và làm trắng da [22] SLs cũng cho thấy

có khả năng tổng hợp leptin qua đó làm giảm sự tích tụ mỡ thừa ở dưới da [39] SLs còn là nguồn cơ chất cho các acid béo khó tổng hợp ( , -1) ứng dụng trong công nghiệp tạo mùi và nước hoa

Khả năng kháng khuẩn của SLs còn được sử dụng như là một tác nhân sinh học làm sạch trái cây [40] Ngoài khả năng kháng khuẩn, SLs còn có khả năng kháng lại

một số loại nấm như các loài Phytophtora, Phythium và một số loài tảo biển gây hại

[51] Ngoài ra, các nghiên cứu còn cho thấy SLs có nhiều tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm Chúng có khả năng chống lại sự suy giảm miễn dịch do virus gây ra [43] SLs cũng có khả năng ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư bạch cầu (dòng tế bào HL60 leukemia) bằng cách ức chế hoạt tính của protein kinase C [24] Các diacetyl lacton SLs có khả năng tiêu diệt nhiều dòng tế bào khác nhau như dòng tế bào ung thư gan H7402 [12] SLs cũng làm giảm tỷ lệ chết do shock nhiễm khuẩn (septic shock) trên mô hình chuột [8]

1.3 Tình hình nghiên cứu về SLs

Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về SLs cũng như những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau

Kim và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thu nhận SLs bởi C.bombicola ATCC

22214 từ nguồn dầu thải phụ phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến dầu nành

(SDO) Với việc nuôi C.bombicola trong 7 ngày có bổ sung chất dinh dưỡng SDO 15

g/ngày đã thu được sản phẩm SLs 90 g/l Một số hoạt tính của SLs cũng được tìm thấy: khả năng làm giảm sức căng bề mặt và CMC tương ứng 150 mg/l và 48 mN/m Một số hoạt tính khác như: khả năng phân tán của SLs cao hơn chất hoạt động bề mặt hóa học

SDS và Brij 30; hoạt tính kháng khuẩn của SLs đối với Propionibacterium acne và Bacillus subtilis cũng đã được chứng minh

Trong nghiên cứu của Shah và cộng sự (2007), họ sử dụng dầu thải từ nhà hàng

như là nguồn carbon trong sản xuất SLs bởi C.bombicola ATCC 22214 Môi trường

gồm 100 g/l glucose, 10 g/l yeast extract, 1 g/l urea và 40 g/l dầu thải đối với lên men trong bình tam giác, 10% (v/v) đối với lên men trong fermentor 3,3 lít Lên men trong

tam giác và 400 vòng/phút đối với lên men trong fermentor Sản lượng SLs thu được là

30 g/l (lêm men trong bình tam giác) và 34 g/l (lên men trong fermentor)

Daverey và Pakshirajan (2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs

thông qua lêm men C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường sử dụng nguyên liệu rẻ

tiền nhằm giảm chi phí sản xuất, gồm mật rỉ đường mía, yeast extract, urea và dầu đậu nành Bên cạnh đó, nồng độ micelle tới hạn và khả năng làm giảm sức căng bề mặt được xác định tương ứng là 59,43 mg/l và 34,15 mN/m, khả năng nhũ hóa và ổn định

hệ nhũ tương của SLs đối với dầu kerosene, xylene, benzene và hexane cũng được công bố

Shao và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của các SLs có các cấu trúc khác nhau trong việc chống lại các tế bào ung thư thực quản ở người Kết quả cho thấy rằng, sự ức chế của diacetylated lactonic SLs trên hai dòng tế bào ung thư thực

khác nhau về mức độ không bão hòa của chuỗi acid béo hydroxyl trong các phân tử SLs cũng có ảnh hưởng đến khả năng gây độc của chúng với các tế bào ung thư thực quản SLs với một liên kết đôi trong chuỗi acid béo sẽ có tác dụng gây độc mạnh nhất

tính chống lại các tế bào ung thư thực quản

Hiện nay, chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học ở Việt Nam đang được chú trọng nhiều hơn Một số công trình đề cập đến phân lập, nghiên cứu khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố như: “Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt sinh học phân lập từ bãi biển Nha Trang” [2], “Khả năng tạo chất hoạt động

bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn KC31” [4], “Vi khuẩn tạo chất hoạt hóa bề mặt

sinh học Rhodococcus ruber TD2 phân lập từ nước ô nhiễm dầu ven biển Vũng Tàu”

[3] Đa số các chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu Tuy nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất cũng như ứng dụng SLs vẫn chưa được nghiên cứu thấu đáo

1.4 Thực trạng nguồn dầu thải ở Việt Nam

Các nhà hàng trên khắp thế giới sử dụng hàng ngàn lít dầu ăn mỗi tuần Trên khắp Hoa Kỳ ước tính mỗi tuần có khoảng 100 tỷ lít dầu thải ra từ nhà hàng (US EPA Oil Spill, chương trình nội bộ báo cáo năm 1997) [44] Hiện nay, Việt Nam chưa có thống kê nào về lượng dầu thải từ nhà hàng, nhưng lượng dầu thải ra cũng không phải

là con số nhỏ

Dầu ăn sau khi sử dụng ở nước ngoài gần như là bỏ đi thế nhưng ở Việt Nam thì ngược lại, dầu ăn phế thải vẫn được tái sử dụng cho những mục đích kinh doanh khác bất chấp chất lượng không đảm bảo, độc hại, chế biến thực phẩm gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Thông thường với số lượng lớn dầu phế thải như ở TP HCM mà giới báo chí và cảnh sát môi trường từng điều tra cho thấy, chúng vẫn thường được lén lút đem bán lại cho các cơ sở, xưởng sản xuất chế biến thực phẩm độc hại hoặc bán cho tiểu thương chiên xào tiếp, như món hành phi là một thí dụ điển hình Dầu ăn phế thải được dùng

để chiên nhiều đến mức từ vàng sang đen, rồi vón cục Lúc này, chu kỳ “tận dụng” của

nó mới chấm dứt và thường được đổ thẳng xuống cống rãnh, làm thành những mảng đen bám ở đây, gây ô nhiễm môi trường trầm trọng [53]

Vì vậy, hướng nghiên cứu sản xuất SLs từ nguồn dầu thải thông qua lên men

C.bombicola ATCC 22214 hứa hẹn sẽ giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường,

đảm bảo sức khỏe con người và đem lại giá trị kinh tế vô cùng to lớn

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 08 năm 2015 Địa điểm thực hiện: Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới Địa chỉ: (9/621 xa lộ Hà Nội, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Thành Phố Hồ Chí Minh)

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm men C.bombicola ATCC 22214 được cung cấp bởi giáo sư Kim

EK, thuộc Đại học Inha, Hàn Quốc

Hỗn hợp SLs thu được từ quá trình lên men glucose và dầu thải từ hệ thống nhà

hàng KFC (Tp HCM) như là hai nguồn carbon chính bởi nấm men C.bombicola

ATCC 22214

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

Ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, erlen, becher, đèn

cồn, que cấy, pipetteman, đĩa 96 giếng

- Cân phân tích A&D HR – 200 (Japan)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave ES – 315, Tomy (Japan)

- Tủ cấy Sanyo MCV – 710ATS, Sanyo (Japan)

- Tủ lắc có điều chỉnh nhiệt độ Stuart SI500, Stuart (Japan)

- Máy ly tâm Hettich EBA 20, Hettich (Germany)

- Máy khuấy từ Yellowline IKA, Yellowline (Germany)

- Máy votex Disruptor Genie, Scientific Industries (US)

- Máy cô quay LABOROTA 4001 - efficient, Heidolph (Germany)

- Bảng mỏng TLC Silicagel 60 F254 , Merck (Germany)

- Hệ dung môi để tách chiết SLs thô: Ethylacetate, Hexane

- Hệ dung môi chạy sắc ký bảng mỏng (TLC): Chloroform, Methanol, dung dịch

- Dung dịch Glycerol 40 %; DMSO 5 %, 10 %

- Hóa chất trong phản ứng DPPH: dung dịch DPPH, Vitamin C, Ethanol

- Các loại môi trường nuôi cấy và lên men sản xuất SLs (Phụ lục B)

- Môi trường tăng sinh và nuôi cấy vi khuẩn (Phụ lục B)

- Hệ dung môi chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Methanol 99 % (Merck, Germany), nước cất 2 lần

2.3 Phương pháp nghiên cứu

.Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Nấm men C.bombicola ATCC 22214

Tăng sinh, cấy truyền giữ giống Lên men thu nhận sophorolipids từ dầu thải

Dịch lên men

Ly tâm

Chiết hexane và ethyl acetate

Sophorolipids (SLs) thô

Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc

ký TLC và HPLC

Khảo sát một số hoạt tính của SLs

hóa

Khả năng nhũ hóa

2.3.1 Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214

Mục đích: Mục đích của việc tăng sinh nhằm gia tăng nhanh chóng số lượng tế bào nấm men trong môi trường nuôi cấy thích hợp để sử dụng cho các thí nghiệm sau

Quy trình tăng sinh:

- Chuẩn bị môi trường YM lỏng, phân phối vào các ống nghiệm và hấp khử trùng

- Tiến hành cấy nấm men C.bombicola dưới dạng đông khô vào các ống nghiệm

chứa môi trường YM lỏng

- Sau 48 giờ nuôi cấy, sẽ tiến hành cấy truyền dịch nuôi cấy của chủng vào các ống nghiệm chứa môi trường YM lỏng đã được hấp khử trùng, để đảm bảo mật

độ tế bào thích hợp cho các thí nghiệm sau

Mục đích: Bảo quản chủng vi sinh vật là công việc không những để duy trì khả năng sống lâu dài của vi sinh vật, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo được tính ổn định di truyền và các hoạt tính sinh học cao của chủng được giữ Điều này có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với sản xuất các chất có hoạt tính sinh học ở quy mô công nghiệp cũng như nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Quy trình bảo quản:

- Hút 500 µl dịch nuôi cấy của chủng sau khi cấy truyền được 48 giờ và 500 µl glycerol 40 % cho vào eppendorf loại 1,5 ml vô trùng, trộn đều

- Giống được bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ thấp có thể giữ trong 12 tháng

2.3.2 Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214

Nguyên tắc: Nấm men C.bombicola có thể sản xuất SLs khi phát triển trên một

môi trường bao gồm hai nguồn carbon khác nhau (thường là đường và dầu) và một nguồn nitơ (thường là cao nấm men) [25]