Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nƣớc thải chế biến thủy sản

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn phân lập được .... Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của các c

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của mình

TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Huỳnh Mai Nhi

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời tri ân chân thành đến Cô Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương và hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy Huỳnh Văn Thành đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện

Đồng thời, em cũng gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian dài học tập Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp

em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này

Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc, tạo điều kiện cho em đến trường theo đuổi ước mơ và là chỗ dựa vững chắc không chỉ về tinh thần mà cả vật chất cho em trong suốt những năm qua

Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm – những người luôn động viên, luôn sát cánh và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, em xin cám ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này Em xin gửi đến quý Thầy Cô lời chúc sức khỏe

TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Huỳnh Mai Nhi

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 2

1 Tính cấp thiết của đề tài 2

2 Tình hình nghiên cứu enzyme protease 3

2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước 3

2.2 Tình hình sản xuất enzyme protease trên thế giới 3

3 Mục đích nghiên cứu 3

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 4

6 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 5

7 Ý nghĩa đề tài 5

8 Các kết quả đạt được của đề tài 5

9 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Tổng quan về ngành sản xuất thủy sản 7

1.2 Tổng quan về nước thải chế biến thủy sản 10

1.2.1 Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản 10

1.2.2 Đặc tính của nước thải chế biến thủy sản 14

1.2.3 Ảnh hưởng của nước thải thủy sản đến môi trường nước 15

1.2.4 Hệ thống xử lý nước thải cho các nhà máy sản xuất thủy sản 17

1.3 Tổng quan về vi sinh vật trong nước thải công nghiệp 18

1.3.1 Nguồn gốc vi sinh vật trong nước thải công nghiệp 18

1.3.2 Thành phần vi sinh vật trong nước thải công nghiệp 19

1.3.3 Chuyển hóa vật chất của vi sinh vật trong nước thải công nghiệp 19

1.4 Tổng quan về quá trình phân giải các chất giàu protein nhờ vi sinh vật21

1.4.1 Quá trình amon hóa protein 22

1.4.2 Vi sinh vật tham gia quá trình phân hủy protein 23

1.4.2.1 Bacillus subtillis 24

1.4.2.2 Bacillus cereus 25

1.4.2.3 Bacillus mensentericus 25

1.4.3 Enzyme protease của vi sinh vật 26

1.4.3.1 Protease ngoại bào của vi sinh vật: 26

1.4.3.2 Protease nội bào của vi sinh vật: 27

1.4.3.3 Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzyme 28

1.5 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải 28

1.5.1 Các phương pháp xử lý nước thải cơ bản 29

1.5.1.1 Phương pháp cơ học 29

1.5.1.2 Phương pháp hóa lý 29

1.5.1.3 Phương pháp hóa học 30

1.5.2 Phương pháp sinh học xử lý nước thải 31

1.5.2.1 Nguyên tắc 31

1.5.2.2 Các quá trình sinh học chủ yếu xảy ra trong nước thải 31

1.5.2.3 Các hình thức xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học 33

1.5.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học 35

1.6 Tổng quan về chế phẩm sinh học 37

1.6.1 Định nghĩa chế phẩm sinh học 37

1.6.2 Mục đích của việc sử dụng chế phẩm sinh học trong thủy sản 37

1.6.3 Các chế phẩm sinh học xử lý nước thải chứa nito trên thị trường 38

1.6.3.1 Men vi sinh JUMBO 38

1.6.3.2 Chế phẩm sinh học EMIC 39

1.6.3.3 Chế phẩm AQUAPOND 39

1.6.3.4 Chế phẩm sinh học EM 40

1.6.3.5 Chế phẩm vườn sinh thái cho thủy sản 40

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 42

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 42

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 42

2.2 Vật liệu nghiên cứu 42

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn 42

2.2.2 Hóa chất và môi trường 42

2.2.2.1 Hóa chất 42

2.2.2.2 Môi trường 42

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ 53

2.2.3.1 Thiết bị 53

2.2.3.2 Dụng cụ 53

2.3 Bố trí thí nghiệm 54

2.4 Bố trí thí nghiệm chi tiết 54

2.4.1 Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn amon hóa 54

2.4.1.1 Phân lập vi khuẩn amon hóa 54

2.4.1.2 Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được 57

2.4.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng phân lập được 58

2.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường thu enzyme đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 60

2.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme trên môi trường lỗ thạch casein 61

2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối môi trường thu enzyme đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 63

2.4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng chế độ cung cấp oxi đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 64

2.4.2.5 Khảo sát động học tổng hợp enzyme protease của các chủng vi khuẩn 66

2.4.3 Thí nghiệm ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải CBTS 67

2.5 Phương pháp nghiên cứu 68

2.5.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu 68

2.5.2 Phương pháp tăng sinh 69

2.5.3 Phương pháp pha loãng mẫu 69

2.5.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein 69

2.5.4.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết 69

2.5.4.2 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 71

2.5.5 Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập được 71

2.5.6 Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 72

2.5.6.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 72

2.5.6.2 Soi khuẩn lạc 72

2.5.6.3 Phương pháp nhuộm gram 72

2.5.6.4 Phương pháp nhuộm bào tử 72

2.5.7 Các thử nghiệm sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phân lập 73

2.5.7.1 Thử nghiệm catalase 73

2.5.7.2 Thử nghiệm khả năng di động 73

2.5.7.3 Thử nghiệm Indol 73

2.5.7.4 Thử nghiệm VP 73

2.5.7.5 Thử nghiệm urease 73

2.5.7.6 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) 73

2.5.7.7 Thử nghiệm MR (Methyl Red) 74

2.5.7.8 Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate 74

2.5.7.9 Thử nghiệm khả năng lên men (F) và oxy hóa (O) glucose 75

2.5.7.10.Thử nghiệm TSI 75

2.5.7.11.Thử nghiệm citrate 75

2.5.7.12.Thử nghiệm khả năng chịu mặn 75

2.5.7.13.Thử nghiệm Tyrosine 75

2.5.7.14.API KIT 20E 76

2.5.8 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quan (OD600nm) 76

2.5.9 Phương pháp đục lỗ thạch 76

2.5.10.Phương pháp nghiên cứu khả năng phân hủy tinh bột, protein, lipase, cellulose 77

2.5.11.Các phương pháp định lượng các chỉ số trong nước thải 79

2.5.11.1.Phương pháp xác định Clorua 79

2.5.11.2.Phương pháp xác định nhu cầu oxi hóa học (COD) 79

2.5.11.3.Phương pháp định lượng N-NH4+ 79

2.6 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 79

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 80

3.1 Kết quả phân lập và lựa chọn các chủng có khả năng phân hủy protein

80

3.2 Kết quả định danh sơ bộ 80

3.2.1 Kết quả thử nghiệm sinh hóa 80

3.2.2 Quan sát hình thái, sinh lý 82

3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập được 88

3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn phân lập được 90

3.4.1 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn phân lập được 90

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme trên môi trường lỗ thạch casein 92

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tăng trưởng và sinh enzyme protease của các chủng phân lập được 98

3.4.3.1 Khả năng tăng sinh khối của các chủng ở các nồng độ muối khác nhau 99

3.4.3.2 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh enzyme của các chủng phân lập được 102

3.4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của oxi đến khả năng sinh enzyme protease

của các chủng phân lập được 106

3.4.5 Khảo sát động học tổng hợp protease trong môi trường nhân tạo 108

3.4.6 Ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải 110

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54

1 Kết luận 54

2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 120

A Tài liệu Tiếng Việt 120

B Tài liệu Tiếng Anh 121

C Tài liệu Internet 123

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CBTS: Chế biến thủy sản

CFU: Colony forming unit

ĐKVPG: Đường kính vòng phân giải

DO: Oxy hòa tan (Dissolved Oxygen)

ĐKVPG: Đường kính vòng phân giải

FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và

Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

TSB: Tripticase Soya Broth

TSI: Triple Sugar Iron Agar

TSS: Total suspended solids (tổng vật chất lơ lửng)

VP – MR: Voges – Proskauer – Methyl Red

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 theo giá so sánh 2010 8

Bảng 1.2 Khối lượng sản phẩm thủy sản xuất khẩu từ năm 2002 – 2005 9

Bảng 1.3 Năng lực sản xuất của các cơ sở chế biến thủy sản đông lạnh 10

Bảng 1.4 Lượng phế thải trung bình cho một tấn sản phẩm thủy sản 12

Bảng 1.5 Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản 13

Bảng 1.6 Giá trị các thông số ô nhiễm làm cơ sở tính toán giá trị tối đa cho phép 13 Bảng 1.7 Một số vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein 24

Bảng 2.1 Kết quả thử nghiệm khử nitrate thành nitrite 74

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập 80

Bảng 3.2 Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được từ nước thải thủy sản 80

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập được. 88

Bảng 3.4 pH môi trường nuôi cấy tối ưu để tổng hợp enzyme protease của các chủng phân lập được 92

Bảng 3.5 pH hoạt động tối ưu của enzyme protease của các chủng phân lập 97

Bảng 3.6 pH môi trường nuôi cấy tối ưu và pH hoạt động tối ưu của enzyme protease tổng hợp từ các chủng vi khuẩn 98

Bảng 3.7 Nồng độ muối tối ưu cho khả năng tăng trưởng của các chủng phân lập 102

Bảng 3.8 Nồng độ muối tối ưu cho khả năng sinh enzyme protease của chủng phân lập 106

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện oxi đến khả năng sinh enzyme của các chủng 108

Bảng 3.10 Thời gian nuôi cấy tối ưu của các chủng phân lập được 110

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm (nghìn tấn) 9

Hình 1.2 Sơ đồ quy trình công nghệ chế biến thủy sản đông lạnh dạng tươi 11

Hình 1.3 Dây chuyền công nghệ xử lý nước thải thủy sản điển hình 17

Hình 1.4 Đường cong sinh trưởng kép của vi sinh vật trong nước thải 20

Hình 1.5 Chuyển hóa các hợp chất nitơ trong xử lý sinh học 22

Hình 1.6 Quá trình amon hóa protein 23

Hình 1.7 Quá trình phân giải protein ngoại bào 27

Hình 1.8 Quá trình hoạt động protease nội bào 27

Hình 1.9 Men vi sinh JUMBO 38

Hình 1.10 Chế phẩm sinh học EMIC 39

Hình 1.11 Chế phẩm AQUAPOND 39

Hình 1.12 Chế phẩm EM gốc 40

Hình 1.13 Chế phẩm sinh học vườn sinh thái 41

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí các bước thí nghiệm 54

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein từ nước thải chế biến thủy sản 55

Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy protein 56

Hình 2.4 Quy trình định danh sơ bộ các chủng phân lập được 58

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tổng hợp enzyme 59

Hình 2.6 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường thu enzyme đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 60

Hình 2.7 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme trên môi trường lỗ thạch casein 61

Hình 2.8 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối môi trường thu enzyme đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 63

Hình 2.9 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của oxi đến quá trình sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 64

Hình 2.10 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy thu enzyme đến

khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn 66

Hình 2.11 Quy trình ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải CBTS 67

Hình 3.1 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT1.3 83

Hình 3.2 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT1.4 84

Hình 3.3 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT2.3 85

Hình 3.4 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT3.3 86

Hình 3.5 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT4.3 87

Hình 3.6 Kết quả sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập được 89 Hình 3.7 pH môi trường thử hoạt tính enzyme lipase 90

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng 91

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT1.3 trên môi trường casein 93

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT1.4 trên môi trường casein 94

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT2.3 trên môi trường casein 95

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT3.3 trên môi trường casein 95

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT1.3 trên môi trường casein 96

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tăng trưởng của các chủng phân lập 100

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng NT1.3 103

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease của chủng NT1.4 103

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease

không cấy VSV 111

Hình 3.23 Hoạt tính enzyme tăng thêm khi bổ sung chủng chọn lọc vào nước thải.

112

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Công nghiệp chế biến thủy sản (CBTS) là một trong những ngành phát triển khá mạnh mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước Bên cạnh những lợi ích to lớn đạt được về kinh tế - xã hội, ngành công nghiệp CBTS cũng phát sinh nhiều vấn đề về môi trường cần phải giải quyết Trong đó, ô nhiễm môi trường do nước thải là một trong những mối quan tâm hàng đầu Nhìn chung, nước thải CBTS thường có các thành phần ô nhiễm vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần Trong khi đó, lưu lượng nước thải tính trên một đơn vị sản phẩm cũng khá lớn, thường từ 30 – 80 m3

nước thải cho một tấn thành phẩm (Lâm Minh Tấn và ctv., 2004) Mặc khác, xây dựng hệ thống xử lý nước thải hoàn chỉnh cho bất cứ cơ sở sản xuất hay nhà máy nào cũng không phải đơn giản, đòi hỏi kinh phí thực hiện cũng như diện tích đất xây dựng khá lớn Thực tế vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất và khu công nghiệp chưa đầu tư và vận hành hệ thống xử lý nước thải

Nước thải CBTS có thành phần đặc trưng gây ô nhiễm là các hợp chất hữu cơ giàu Nitơ Nguồn gốc gây ô nhiễm chủ yếu phát sinh trong các công đoạn sơ chế và làm sạch nguyên liệu (tôm, cá, mực, ) Bên cạnh đó, nó còn làm ô nhiễm các nguồn nước mặt, nước ngầm, huỷ hoại hệ thuỷ sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Do đó, cần phải có phương pháp phù hợp để xử lý và khắc phục tình trạng ô nhiễm trong các nhà máy chế biến thủy sản Công nghệ xử lý nước thải CBTS ngày càng đi sâu vào áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp sinh học

có hiệu quả xử lý triệt để, hơn hẳn những biện pháp xử lý hóa lý khác

Một số vi sinh vật trong nước có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa

thành phần chủ yếu của nước thải thủy sản, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Các chủng vi sinh vật này đã có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong lĩnh vực xử lý nước thải chứa nhiều protein như nước thải chế biến thủy sản Trong điều kiện tự nhiên của nước thải, các vi sinh vật này tự phát triển về số lượng và khối lượng nhưng đòi hỏi thời gian dài Nếu các vi sinh vật này được tách riêng và

tăng sinh trước trong môi trường giàu protein sau đó bổ sung vào nước thải ở giai đoạn vi sinh vật sinh trưởng mạnh nhất thì vừa có thể nâng cao hiệu quả xử lý nước thải, vừa rút ngắn được thời gian thích nghi của vi sinh vật trong bể xử lý Dựa trên

cơ sở đó, đề tài “Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản” được thực hiện nhằm tìm ra

chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein trong điều kiện có nồng độ NaCl ở mức 3% để sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào hệ thống xử lý nước thải chế biến thủy sản, nâng cao hiệu quả xử lý trước khi thải ra ngoài môi trường tự nhiên

2 Tình hình nghiên cứu enzyme protease

2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước

Trương Thị Mỹ Khanh và Vũ Thị Hương Lan (2010) đã phân lập từ mẫu nước thải nhà máy thủy sản được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein và ứng dụng vào xử lý nước thải chế biến thủy sản

2.2 Tình hình sản xuất enzyme protease trên thế giới

Theo nghiên cứu của Graslund et al (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan sử dụng vi sinh vật hữu ích để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao

nuôi Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus spp đóng vai

trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2 Do vậy, Bacillus spp làm

giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chi Bacillus có khả năng chịu mặn và tổng hợp

protease khi nồng độ NaCl lên đến 3 %

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Phân lập và chọn lọc vi khuẩn Bacillus spp amon hóa chịu mặn

 Định danh sơ bộ

 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu

 Khảo sát pH hoạt động tối ưu của enzyme sinh ra từ các chủng nghiên cứu

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu

 Khảo sát điều kiện cung cấp oxy thích hợp cho việc thu enzyme protease của các chủng nghiên cứu

 Khảo sát động học tổng hợp enzyme của các chủng phân lập

5 Phương pháp nghiên cứu

 Phương pháp tổng hợp tài liệu:

 Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài

 Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề tài

 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng amon hóa, không gây bệnh

và có hoạt tính mạnh nhất từ nước thải nhà máy CBTS

 Thực hiện một số khảo sát hình thái, thử nghiệm sinh lý sinh hóa từ

đó tuyển chọn chủng VK mong muốn, loại VSV có nguy cơ gây bệnh

 Thực hiện bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme protease phân hủy protein của chủng VK đã được tuyển chọn phụ thuộc nồng

độ muối và oxy

 Khảo sát khả năng sinh enzyme của chủng chọn lọc trong môi trường nước thải chế biến thủy sản

 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

 Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm

 Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm Statgraphics

6 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

khuẩn lạc của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện, yếu tố

môi trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu enzyme protease của vi khuẩn

 Ý nghĩa thực tiễn: dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease có hoạt tính cao ứng dụng tạo ra chế phẩm sinh học ứng dụng trong xử lý nước thải thủy sản, bảo vệ môi trường

8 Các kết quả đạt đƣợc của đề tài

 Phân lập được 5 chủng có khả năng sinh enzyme protease phân hủy protein

từ nước thải chế biến thủy sản Từ kết quả phân lập và định danh sơ bộ cho

thấy 5 chủng vi khuẩn đều mang đặc điểm của vi khuẩn Bacillus spp

 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease được của các chủng

vi khuẩn trên môi trường nhân tạo giàu protein làm cơ sở để sản xuất chế phẩm sinh học amon hóa cho nước thải giàu protein

 Bước đầu ứng dụng vi khuẩn chọn lọc vào nước thải chế biến thủy sản cho

thấy hiệu quả xử lý cao

9 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

 Phần Mở đầu

 Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu

 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án

 Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả

mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được

 Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt

được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về ngành sản xuất thủy sản

Ngành chế biến thủy sản hiện nay phát triển thành một ngành kinh tế mũi nhọn, ngành sản xuất hàng hóa lớn, đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế Với sự tăng trưởng nhanh và hiệu quả thủy sản đã đóng góp tích cực trong chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp, nông thôn, đóng góp hiệu quả cho công cuộc xóa đói, giảm nghèo, giải quyết việc làm cho trên 4 triệu lao động, nâng cao đời sống cho cộng đồng dân cư khắp các vùng nông thôn, ven biển, đồng bằng, trung du, miền núi…, đồng thời góp phần quan trọng trong bảo vệ an ninh quốc phòng trên vùng biển đảo của Tổ quốc

Chiều 12/6, tại hội chợ VIETFISH 2008 Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam (VASEP) đã ký bản thoả thuận hợp tác với Hiệp hội các nhà kinh doanh và Chế biến Thuỷ sản Liên Bang Nga dựa trên nhu cầu phát triển các mối quan hệ kinh tế, quan hệ đối tác kinh doanh giữa các tổ chức Nhà nước và các Công

ty tư nhân thuỷ sản của 2 quốc gia (Vasep,13/6/2008).[34]

Việt Nam là một trong 10 nước xuất khẩu thủy sản hàng đầu trên thế giới, ngành thủy sản hiện tại chiếm 4% GDP, 8% xuất khẩu và 9% lực lượng lao động (khoảng 3,4 triệu người) của cả nước Nhóm hàng chủ đạo trong xuất khẩu thủy sản của Việt Nam là cá tra, cá basa, tôm và các động vật thân mềm như mực, bạch tuộc, nghêu, sò,… Trong vòng 20 năm qua ngành thủy sản luôn duy trì tốc độ tăng trưởng

ấn tượng từ 10-20% Năm 2014 sản lượng chế biến xuất khẩu đạt trên 1,4 triệu tấn với giá trị kim ngạch đạt 7,83 tỷ USD Ngoài ra còn có hàng nghìn cơ sở chế biến nhỏ lẻ, hộ gia đình, với các loại hình chế biến phong phú như: nước mắm, mắm tôm, thủy sản khô, ăn liền, sứa ướp muối phèn, [24]

Trình độ công nghệ chế biến và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm thuỷ sản Việt Nam được nâng cao Hệ thống nhà máy chế biến thủy sản phần lớn đã được đầu tư và nâng cấp nên có dây chuyền thiết bị hiện đại, áp dụng hệ thống quản lý chất lượng tiên tiến của thế giới như ISO, HACCP, Trên 620 số cơ sở chế biến thủy sản đạt điều kiện đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Tỷ trọng sản phẩm có giá trị gia tăng ngày một cải thiện, chủng loại sản phẩm ngày một phong phú Sản phẩm sơ chế chiếm 51%, sản phẩm làm sẵn chiếm 36%, sản phẩm ăn liền chiếm 13% Như vậy, tỷ trọng các sản phẩm chế biến sâu đạt gần 50% [1]

Theo Tổng cục Thống kê, qua bảng 1.1 ước tính giá trị sản xuất thủy sản năm

2014 (tính theo giá so sánh 2010) ước đạt gần 188 nghìn tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kỳ năm ngoái Trong đó, giá trị nuôi trồng thủy sản ước đạt hơn 115 nghìn tỷ đồng và giá trị khai thác thủy sản ước đạt hơn 73 nghìn tỷ đồng

Bảng 1.1 Giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 theo giá so sánh 2010

so với cùng kỳ

Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77 %/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự nhiên và trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng thủy sản từ hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình quân 6,42 %/năm.[40]

(Nguồn: Vasep.com.vn)

Hình 1.1 Sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm (nghìn tấn)

Cùng với ngành nuôi trồng và khai thác thủy sản thì ngành chế biến thủy sản cũng góp phần gia tăng sản lượng chung của ngành thủy sản Việt Nam với hàng trăm cơ sở chế biến thủy sản trong cả nước Trong những năm gần đây, khoảng 35% đầu ra của sản phẩm thủy sản được sản xuất để xuất khẩu và phần còn lại được bán ra trên thị trường nội địa hoặc ở dạng tươi sống (34,5%), hoặc đã qua chế biến (45,7%) dưới dạng bột cá, nước mắm, cá khô Bắt đầu từ năm 1995, nghề đánh cá

xa bờ được đầu tư mạnh nên sản lượng đã tăng lên 1.230.000 tấn Một số sản phẩm thủy sản truyền thống của Việt Nam và khối lượng xuất khẩu các sản phẩm đó theo thời gian được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Khối lượng sản phẩm thủy sản xuất khẩu từ năm 2002 – 2005

Tôm đông lạnh Tấn 114579.98 124779.69 141122.03 149871.8 Philê cá đông lạnh Tấn 112034.52 132270.71 165596.33 208071.1 Sản phẩm cá khô Tấn 17181.76 7222.04 14755.54 21675.6 Giáp xác và động

vật thân mềm đông

lạnh

Tấn 115160.11 141798.66 108802.32 148611.5

Tổng sản phẩm Tấn 270693.66 285461.13 293125.24 310254.4

Kim ngạch xuất

khẩu

Triệu

(Nguồn: Bộ Thủy Sản ở Việt Nam FICen,2005)

Trong giai đoạn 2001 – 2013, xuất khẩu thủy sản Việt Nam tăng nhanh về cả giá trị và sản lượng Đến năm 2013, giá trị xuất khẩu đạt trên 6,7 tỷ USD, sản phẩm thủy sản được xuất khẩu sang 165 nước và vùng lãnh thổ 3 thị trường chính là EU,

Tổng CS thiết bị cấp đông (tấn/ ngày) 3.150 4.262 7.870

Số thiết bị cấp đông (chiếc) 836 1.318 1.378

(Nguồn: Cục chế biến NLTS và NM)

1.2 Tổng quan về nước thải chế biến thủy sản

1.2.1 Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản

Hầu hết các loại hình công nghệ CBTS đều có nhu cầu sử dụng nước khá lớn cho nhiều công đoạn: chế biến, bảo quản nguyên liệu và sản phẩm Do vậy đã tạo ra một lượng lớn nước thải trong quá trình sản xuất

Nước thải ở các khâu chế biến chiếm 85% - 90% tổng lượng nước thải, 10 % - 15% còn lại là nước thải sinh hoạt của công nhân trong nhà máy Nguồn gây ô nhiễm ở khâu chế biến cơ bản :

- Sơ chế nguyên liệu: rửa, phân loại, mổ, rã đông

- Các quá trình chế biến: ngâm, tách xương, cắt khúc, phile, làm sạch, luộc

Các bước sản xuất trong một nhà máy chế biến thủy sản điển hình và các công đoạn phát sinh nước thải được thể hiện trên hình 1.2

Hình 1.2 Sơ đồ quy trình công nghệ chế biến thủy sản đông lạnh dạng tươi

(Lê Minh Nguyệt, 2003) Lượng phế thải thủy sản phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính nguyên liệu như: chủng loại, kích cỡ, độ tươi, hình dáng cấu tạo,… cũng như trình độ về thiết bị công

Tiếp nhận nguyên liệu

(kiểm tra chất lượng, rửa sơ bộ, bảo quản nguyên liệu)

Xử lý, rửa sạch nguyên liệu

(chặt, cắt, mổ, bóc, tách, đánh vẩy…)

Phân loại, rửa sạch

(phân hạng, phân cỡ, cân đo)

Xếp khuôn, cấp đông

(Dạng Block, IQF)

Tách khuôn, bao gói

(Vào túi PE, đóng hộp cacton)

nghệ sản xuất Khối lượng phế thải trung bình trên 1 đơn vị sản phẩm chủ yếu của các loại hình công nghệ sản xuất điển hình được nêu trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Lượng phế thải trung bình cho một tấn sản phẩm thủy sản

STT Công nghệ chế biến Loại sản phẩm

Lƣợng phế thải (tấn/tấn sản phẩm)

(Nguồn: Báo cáo cơ sở khoa học của Viện xây dựng quy chế bảo vệ môi trường

trong nghiệp chế biến thủy sản, Bô Thủy sản, 2000)

Lượng chất thải lỏng trong chế biến thuỷ sản được coi là quan trọng nhất, các nhà máy chế biến đông lạnh thường có lượng chất thải lớn hơn so với các cơ sở chế biến hàng khô, nước mắm, đồ hộp, bình quân khoảng 50.000 m3/ngày Mức ô nhiễm của nước thải từ các nhà máy chế biến tuỳ thuộc vào loại mặt hàng chủ yếu

mà nhà máy đó sản xuất Một số rất ít chất thải từ chế biến surimi có các chỉ số BOD5 lên tới 3.120mg/l, COD tới 4.890mg/l nước thải từ chế biến Agar có chứa các hoá chất như NaOH, H2SO4, Javen, Borax nhưng liều lượng không cao và tải lượng cũng không nhiều, tuy nhiên nếu loại nước thải này không được pha đủ loãng mà

trực tiếp thải ra môi trường có thể gây hại cho môi trường Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản thể hiện qua bảng 1.5

Bảng 1.5 Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản

2 Nước trong công đoạn xử lý nguyên liệu 35 – 45

3 Nước trong công đoạn vệ sinh thiết bị nhà xưởng 20 – 30

4 Nước kỹ thuật, làm mát thiết bị 1 – 5

(Nguồn: Báo cáo hiện trạng Môi trường, Cục Thủy Sản, 2007)

Thành phần và tính chất đặc trưng nước thải sản xuất thủy sản được thống kê theo bảng 1.6 Đầu ra nước thải sản xuất thủy sản được so sánh với QCVN 11:2008/BTMNT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp chế biến thủy sản

Bảng 1.6 Giá trị các thông số ô nhiễm làm cơ sở tính toán giá trị tối đa cho phép

Cột A quy định giá trị C của các thông số ô nhiễm làm cơ sở tính toán giá trị tối đa cho phép trong nước thải công nghiệp CBTS khi thải vào các nguồn nước được dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt (có lượng nước tương đương cột A1 và A2 của quy chuẩn về chất lượng nước mặt)

Cột B quy định giá trị C của các thông số làm cơ sở tính toán giá trị tối đa cho phép trong nước thải CBTS khi thải vào các nguồn nước không dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt (có chất lượng nước tương đương cột B1 và B2 của Quy chuẩn

kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt hoặc vùng nước biển ven bờ)[4]

Tính chất nước thải thường thay đổi theo các mặt hàng sản xuất của từng nhà máy Nhìn chung nước thải của ngành chế biến thuỷ hải sản vượt quá nhiều lần so với qui định cho phép xả vào nguồn (từ 5 - 10 lần về chỉ tiêu COD, gấp 2 - 4 lần về chỉ tiêu nitơ hữu cơ ) Ngoài ra chỉ số về lượng nước thải trên một đơn vị sản phẩm của nhà máy cũng rất lớn (từ 70 - 120 m3/tấn sản phẩm) Vì vậy, cần có biện pháp

xử lý nước thải phù hợp trước khi xả vào nguồn tiếp nhận.[18]

1.2.2 Đặc tính của nước thải chế biến thủy sản

Nước thải là một trong những vấn đề môi trường lớn nhất của ngành CBTS, nước thải CBTS đặc trưng bởi các thông số ô nhiễm như: màu, mùi, chất rắn không hòa tan, chất rắn lơ lửng, các vi khuẩn, chỉ số BOD, COD, pH,…

Nước thải CBTS thường chứa nhiều các thành phần hữu cơ tồn tại chủ yếu ở dạng keo, phân tán mịn, tạp chất lơ lửng tạo nên độ màu, độ đục cho dòng thải Nước thải thường có mùi khó chịu, độc hại do quá trình phân hủy sinh học Thành phần không tan và dễ lắng chủ yếu là các mảnh vụn xương thịt, vây, vẩy… và còn

có các tạp chất vô cơ như cát, sạn… Ngoài ra đối với phần lớn các nhóm sản phẩm thủy sản, trong nước thải thường chứa các loại hóa chất khử trùng, chất tẩy rửa từ

vệ sinh nhà xưởng, thiết bị

Nhìn chung, hầu hết nước thải của các nhà máy CBTS đều có chung đặc điểm sau:

 Có hàm lượng các chất hữu cơ dạng dễ phân huỷ sinh học cao Giá trị BOD5 thường lớn, dao động trong khoảng 300 – 2000 mg/l, giá trị COD nằm trong khoảng 500 –3000 mg/l

 Hàm lượng lớn các protein và chất dinh dưỡng, thể hiện ở 2 thông số tổng Nitơ (50 –200 mg/l) và tổng Photpho (10 –100 mg/l)

 Hàm lượng chất rắn lơ lửng cao từ 200 –1000 mg/l

 pH thường nằm trong giới hạn từ 6,5 –7,5 do có quá trình phân huỷ đạm và thải amoniac

 Thường có mùi hôi do có sự phân hủy các acid béo không no, nên tạo mùi rất khó chịu và đặc trưng, gây ô nhiễm về mặt cảm quan và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ công nhân làm việc

1.2.3 Ảnh hưởng của nước thải thủy sản đến môi trường nước

Nước thải CBTS có hàm lượng các chất ô nhiễm cao, nếu không được xử lý sẽ gây ô nhiễm nghiêm trọng nguồn nước mặt và nước ngầm xung quanh

Đối với nguồn nước ngầm tầng nông, nước thải CBTS có thể thấm xuống đất và gây ô nhiễm mạch nước ngầm Các chất hữu cơ và VSV gây bệnh có trong nguồn nước ngầm nhiễm gây cản trở cho việc xử lý thành nước sạch cung cấp cho sinh hoạt

Đối với các nguồn nước mặt, các chất ô nhiễm có trong nước thải CBTS sẽ làm suy thoái chất lượng nước, tác động xấu đến môi trường và thủy sinh vật Trong nước thải CBTS chứa các chất như cacbonhydrat, protein, chất béo là các chất hữu

cơ dễ bị phân hủy, nên khi xả vào nguồn nước tự nhiên sẽ làm giảm nồng độ oxy hòa tan vốn có, do VSV sử dụng để phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải Nồng độ oxy hòa tan dưới 50% bão hòa gây ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của các loài thủy sinh và làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho sinh hoạt và công nghiệp Ngoài ra, các chất lơ lững trong nước thải CBTS làm cho nước đục hoặc có màu ngăn cản ánh sáng chiếu sâu vào lòng thủy vực, ảnh hưởng tới quá trình quang hợp của tảo, rong rêu gây tác động tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh, đồng thời gây mất mỹ quan cho dòng nước và

gây bồi lắng lòng sông, cản trở sự lưu thông trên lưu vực.Về mặt vi sinh, nước thải CBTS chứa nhiều vi khuẩn gây bệnh và trứng giun sán là những tác nhân gây nên dịch bệnh ở người như: bệnh lỵ, thương hàn, bại liệt, nhiễm khuẩn đường tiết niệu

và tiêu chảy cấp tính…

Trên hết là tác động của các hợp chất N và P như gây hiện tượng phì dưỡng trong hệ sinh thái nước, làm cạn kiệt oxy trong nước, gây độc với hệ sinh vật nước, làm nước ngầm ô nhiễm nitrate, ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng

Hiện tượng phì dưỡng trong nước là do dư thừa chất dinh dưỡng dẫn tới sự phát triển bùng nổ của các loài tảo và VSV, còn gọi là hiện tượng tảo nở hoa Khi đó mật

độ thuỷ sinh vật trong hồ rất dày đặc làm cho nước có độ màu và độ đục cao Ngoài

ra khi một lượng lớn tảo chết đi sẽ cần lượng oxy lớn tương ứng để phân huỷ dẫn đến hàm lượng oxy hòa tan trong nước bị cạn kiệt, làm chết các sinh vật sống trong nước

Theo tài liệu “Hướng dẫn về chất lượng nước uống” của Tổ chức Y tế thế giới cũng như Tiêu chuẩn 1329/2002 (Bộ Y tế) không xem amoni là chất gây hại cho sức khỏe con người mà xếp amoni vào nhóm các chất gây tác động xấu về mặt cảm quan (mùi, vị) trong nước Bên cạnh đó, amoni còn là yếu tố cản trở trong công nghệ xử lý nước cấp Thứ nhất: nó làm giảm tác dụng của clo là tác nhân sát trùng chủ yếu áp dụng ở các nhà máy nước Việt Nam, do phản ứng với clo tạo thành monocloamin là chất sát trùng thứ cấp hiệu quả kém clo hơn 100 lần Thứ hai: amoni cùng với một số vi lượng trong nước (hữu cơ, phospho, sắt, mangan…) là

“thức ăn” để vi khuẩn phát triển, gây hiện tượng “không ổn định sinh học” của chất lượng nước sau xử lý Nước có thể bị đục, đóng cặn trong hệ thống dẫn, chứa nước Nước bị xuống cấp về các yếu tố cảm quan

Khi nồng độ amoni trong nước cao sẽ rất dễ dàng tạo ra nitrite Trong cơ thể động vật, nitrite và nitrate có thể biến thành N-nitroso – là tiền chất có tiềm năng gây ung thư Mặc dù bằng chứng dịch tễ học chưa đầy đủ về tác hại đối với con người Ủy ban châu Âu quy định mức tối đa của nitrate trong nước uống là 50 mg/l,

Mỹ là 45 mg/l, Tổ chức sức khoẻ thế giới: 100 mg/l, tiêu chuẩn 1329/2002 (Bộ Y

tế) đã đề ra mức giới hạn 3 và 50mg/l đối với nitrite và nitrate tương ứng nhằm ngăn ngừa bệnh mất sắc tố máu (methaemoglobinaemia) đối với trẻ sơ sinh dưới 3 tháng tuổi và ung thư tiềm tàng [28]

1.2.4 Hệ thống xử lý nước thải cho các nhà máy sản xuất thủy sản

Tại Việt Nam, quy trình xử lý nước thải thủy sản được lựa chọn theo phương

án xử lý 3 bậc nhằm hạn chế tối đa hàm lượng chất thải

Sơ bộ: Tách rác, lắng cát, cân bằng, tách dầu

 Thu gom, cân bằng nước thải và tách dầu mỡ

 Xử lý bậc 1 bằng phương pháp sinh học yếm khí trong bể UASB

 Xử lý bậc 2 bằng phương pháp sinh học hiếu khí trong bể AEROTEN

 Xử lý bậc 3 bằng phương pháp hóa lý: keo tụ, lắng lọc và khử trùng

Bùn lắng được gom vào ngăn chứa bùn, bể phân hủy bùn và cuối cùng được thải vào bãi rác hoặc dùng để bón cây Dây chuyền công nghệ xử lý nước thải thủy sản điển hình ở Việt Nam hiện nay được trình bài ở hình 1.3

(Nguồn: Tổng Cục Môi Trường, 2011)

Bùn thải

Tuần hoàn

Xử lý rác

Bể thu khí Sục khí

Hình 1.3 Dây chuyền công nghệ xử lý nước thải thủy sản điển hình

Diễn giải công nghệ:

Nước thải trước khi đi vào bể gom được tách các chất rắn thô bằng lưới chắn rác Từ bể gom, nước thải được gom qua thiết bị tuyển nổi rồi chảy vào bể điều hòa (thường áp dụng phương pháp tuyển nổi với sự tách không khí từ dung dịch: tạo dung dịch quá bảo hòa không khí và khi giảm áp suất thì các bọt không khí sẽ tách

ra khỏi dung dịch, làm nổi chất bẩn Do đó, trang bị máy nén khí và bồn chứa váng mở)

Bể điều hòa có tác dụng điều hòa lưu lượng và nồng độ Từ bể điều hòa nước thải được bơm liên tục vào bể sinh học kỵ khí có vật liệu tiếp xúc Sau đó, nước thải chảy thủy lực vào bể bùn hoạt tính Tại đây các chất hữu cơ có trong nước thải phân hủy bằng các vi khuẩn hiếu khí tồn tại ở dạng lơ lửng với mật độ cao (bùn hoạt tính) trong điều kiện sục khí Tiếp đến, nước thải được dẫn qua bể lắng trước khi xả vào ngăn khử trùng Nước thải được khử trùng bằng Chlorine rồi được lọc áp lực trước khi thải ra môi trường

Bùn tại bể lắng được dẫn vào bể chứa bùn Tại đây một phần bùn được tuần hoàn lại bể bùn hoạt tính Phần bùn dư được hút định kỳ

Để xử lý nước thải thủy sản, nhất là cá tra có nhiều máu, nhiều mỡ với nồng

độ chất gây ô nhiễm cao phải đồng thời áp dụng nhiều phương pháp như trên: phương pháp hóa lý (tách rác, tách mỡ bằng tuyển nổi, lắng tụ, khử trùng, lọc áp lực), phương pháp hóa sinh (nguyên tắc kỵ khí: thiết bị lọc sinh học có vật liệu đệm, nguyên tắc hiếu khí: bể aerotank sục khí với bùn hoạt tính có cấy men vi sinh).[38]

1.3 Tổng quan về vi sinh vật trong nước thải công nghiệp

1.3.1 Nguồn gốc vi sinh vật trong nước thải công nghiệp

Vi sinh vật có trong nước thải công nghiệp chủ yếu đặc trưng cho từng nhà máy, từng loại hình sản xuất Nước thải nhà máy rượu, nhà máy bia giàu thành phần các loại nấm men; nước thải nhà máy thủy sản, thịt giàu thành phần vi sinh vật phân hủy protein; nước thải nhà máy gỗ giàu thành phần vi sinh vật phân hủy cellulose; nước thải nhà máy tinh bột giàu thành phần vi sinh vật phân hủy tinh bột

Bên cạnh đó, vi sinh vật có trong nước thải công nghiệp từ các quá trình sản xuất như rửa nguyên liệu, vệ sinh nhà xưởng, máy móc thiết bị, từ nước thải sinh hoạt của công nhân nếu nhà máy không có hệ thống thu gom, vận chuyển tách hai

hệ thống nước thải công nghiệp và nước thải sinh hoạt riêng Ngoài ra, vi sinh vật

có trong nước thải còn từ thiên nhiên, từ nước mưa, nước chảy tràn hòa chung vào

hệ thống nước thải của nhà máy

1.3.2 Thành phần vi sinh vật trong nước thải công nghiệp

Nước thải các ngành công nghiệp khác nhau sẽ khác nhau về tính chất vật lý, hóa học và tính chất sinh học, phụ thuộc vào quá trình hoạt động đặc trưng cho từng nhà máy, từng loại hình sản xuất Điều này quyết định sự phát triển của vi sinh vật

và khả năng chuyển hóa vật chất của vi sinh vật Trong nước thải công nghiệp, vi khuẩn thường chiếm một số lượng lớn, ngoài ra còn chứa nhiều nấm men, virut, tảo đơn bào và nguyên sinh động vật Trong đó, vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có mặt trong hầu hết các loại nước thải

Đối với nước thải có hàm lượng chất hữu cơ cao như nước thải từ các nhà máy chế biến thịt, thủy sản, thực phẩm thành phần và số lượng các loài vi khuẩn là phong phú và đa dạng nhất Vi khuẩn tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa, từ các hợp chất hữu cơ đến vô cơ, từ các chất dễ phân hủy đến các chất độc hại Các quá trình này nhờ hệ enzyme phong phú và chuyên biệt của mỗi nhóm, mỗi loài vi khuẩn So với động vật và thực vật thì vi khuẩn có tính thích nghi cao hơn, nhiều loài có khả năng tự điều chỉnh quá trình trao đổi chất trong những điều kiện sống không thuận lợi Bên cạnh đó, vi khuẩn có tốc độ trao đổi chất nhanh Trong một ngày đêm chúng có thể chuyển hóa một khối lượng vật chất gấp hàng ngàn lần khối lượng của chúng Chính vì thế, vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có nhiều tiềm năng nhất trong công nghệ xử lý nước thải.[8]

1.3.3 Chuyển hóa vật chất của vi sinh vật trong nước thải công nghiệp

Khi nước thải mới ra khỏi nhà máy, hàm lượng vi sinh vật thường không nhiều Sau một thời gian, những nhóm vi sinh vật thích nghi được với đặc trưng của nước thải sẽ phát triển mạnh, số lượng và số loài dần phong phú hơn

Quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật trong nước thải gồm hai quá trình cơ bản

là quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa Quá trình đồng hóa xảy ra bên trong tế bào vi sinh vật, là quá trình cần năng lượng để tổng hợp những sản phẩm cấu thành sinh khối tế bào Năng lượng cho quá trình đồng hóa được lấy từ các phân tử cao năng như ATP, ADP , từ quá trình dị hóa hoặc từ các chất dự trữ khác trong tế bào Quá trình dị hóa có thể xảy ra bên trong và bên ngoài tế bào vi sinh vật, là quá trình phân hủy các chất nhằm cung cấp năng lượng, nguyên vật liệu cho quá trình đồng hóa

Mặt khác, tế bào vi sinh vật thường không chứa nhiều hợp chất hóa học giàu năng lượng Do đó, vi sinh vật cần phải nhận thêm các nguồn năng lượng từ bên ngoài như năng lượng của ánh sáng mặt trời ở nhóm vi sinh vật tự dưỡng quang năng, năng lượng sinh ra từ quá trình oxy hóa các chất ở nhóm vi sinh vật tự dưỡng hóa năng Đối với các nhóm vi sinh vật dị dưỡng carbon, chúng sử dụng năng lượng

từ quá trình chuyển hóa các hợp chất carbon hữu cơ trong điều kiện hiếu khí hoặc

kỵ khí

Trong quá trình chuyển hóa vật chất, vi sinh vật luôn luôn ưu tiên sử dụng các vật chất dễ chuyển hóa trước, sau đó mới sử dụng đến các vật chất khó chuyển hóa hơn Do đó, đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong nước thải là đường cong sinh trưởng kép, xem hình 1.4.[8]

Hình 1.4 Đường cong sinh trưởng kép của vi sinh vật trong nước thải

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng (2003), Công nghệ xử lý nước thải)

Ghi chú:

A: Đường cong sinh trưởng kép B: Đường con sinh trưởng đơn

1: giai đoạn thích nghi ban đầu 2: giai đoạn tăng trưởng ban đầu

1’: giai đoạn thích nghi với saccharose 2’: giai đoạn tăng trưởng khi sử dụng

saccharose 1”: giai đoạn thích nghi với tinh bột 2”: giai đoạn tăng trưởng khi sử dụng

tinh bột 3: giai đoạn cân bằng 4: giai đoạn suy vong

1.4 Tổng quan về quá trình phân giải các chất giàu protein nhờ vi sinh vật

NH4+ được tạo thành trong quá trình amon hóa nhờ rất nhiều loài vi sinh vật, được các loài vi khuẩn sử dụng làm nguồn N dinh dưỡng, đồng hóa để xây dựng tế bào mới, tảo và các thực vật nổi khác cũng dùng nguồn nitơ này cùng với CO2 và P

để tiến hành quang hợp Ngoài ra, NH4+ nhờ vi khuẩn nitrat hóa chuyển hóa thành

NO2, NO3 hoặc bị vi khuẩn phản nitrat hóa chuyển hóa thành nitơ phân tử bay vào không khí Quy trình chuyển hóa các hợp chất nitơ trong xử lý sinh học được trình bày trong hình 1.5 [5]

Hình 1.5 Chuyển hóa các hợp chất nitơ trong xử lý sinh học (Công nghệ xử lý

nước thải bằng biện pháp sinh học, Lương Đức Phẩm)

1.4.1 Quá trình amon hóa protein

Quá trình amon hóa protein là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa nitơ, giải phóng NH3 do vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí gây ra như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Nhiệt độ tối ưu cho sự amon hóa là từ 25 – 300C Quá trình ammon hóa protein giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển nitơ từ dạng khó hấp thu (hữu cơ) sang dạng muối amon dễ được thực vật sử dụng và giúp làm sạch các thủy vực Nhờ quá trình này mà NH3 luôn luôn được phục hồi, cung cấp dinh dưỡng cho thực vật thủy sinh Ngoài protein và urê, nhiều loài vi sinh vật có khả năng amon hoá kitin là một hợp chất carbon có chứa gốc amin Kitin là thành phần của

vỏ ngoài các loài giáp xác và côn trùng sống trong nước Hàng năm, kitin được tích luỹ lại trong thuỷ vực với một lượng đáng kể Nhóm vi sinh vật phân hủy kitin có

Oxi hóa nội sinh Nitrosomonas

O2Nitrat (NO3)

Nitrat

hóa

Nitơ trong thành phần tế bào vi khuẩn

Đồng hóa

Tế bào vi khuẩn chết

khả năng tiết ra enzyme kitinase và kitobiase phân hủy phân tử kitin thành các gốc đơn phân tử Sau đó, gốc amin sẽ được amon hoá thành NH3.[6]

Cơ chế quá trình phân hủy protein, xem hình 1.6

Nhóm vi sinh vật phân hủy protein có khả năng tiết ra enzyme protease Enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)ntrong phân tử protein, polypeptide tạo sản phẩm là axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Dưới tác dụng của enzyme protease phân tử protein sẽ được phân giải thành các polypeptide và oligopeptide Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ enzyme peptidase ngoại bào hoặc được tế bào vi khuẩn hấp thụ rồi sau đó được phân hủy tiếp thành các axit amin trong tế bào Một phần các axit amin được

tế bào vi khuẩn sử dụng để tổng hợp protein tạo sinh khối Một phần các axit amin theo các con đường phân giải khác nhau để sinh NH3, CO2 và các sản phẩm trung

gian khác Với các protein có chứa S nhờ enzyme desulfurase của nhóm vi khuẩn

lưu huỳnh và các nhóm dị dưỡng hiếu khí khác, sẽ bị phân hủy tạo H2S, scatol, indol hay mercaptan.[5]

Hình 1.6 Quá trình amon hóa protein

1.4.2 Vi sinh vật tham gia quá trình phân hủy protein

Vi sinh vật đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong các quá trình phân hủy chất hữu cơ và một số hợp chất vô cơ có trong nước thải Đặc biệt là nước thải thủy sản với hàm lượng chất hữu cơ rất là cao so với các ngành khác

Vi sinh vật tham gia quá trình phân giải protein rất đa dạng Chúng thuộc các

vi sinh vật hiếu khí, yếm khí và hiếu khí tùy nghi Bảng 1.7 trình bày một số vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein [5]

Bảng 1.7 Một số vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein

Nhóm vi

sinh vật

Dạng phân hủy

Kiểu gây thối

Bacillus putrificus Bacillus histilytics Bacillus coligenes

Bacillus pyocyaneum Bacillus mensentericus

Phân hủy peptide

Bacillus ventriculosus Bacillus sporogenes

Phân hủy acid amin

Bacillus faccalis Algaligenes Proteus zenkirii

Bacillus perfrigenes Bacillus sporogenes

Streptococus Straphylococus Proteus vulgaris

Phân hủy peptide

Bacillus bifidus Bacillus acidophilus Bacillus butyricus

Phân hủy acid amin

Bacillus latic aerogen Bacillus aminophilus Bacillus coligenes

1.4.2.1 Bacillus subtillis

Bacillus subtilis là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 - 5) x

0,6 µm Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thế màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch

Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa khoảng 600C Là

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 µm - 0,9 µm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 - 300 năm

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc

tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin Ngoài ra, nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà

B.subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) Đặc biệt, B.subtilis được sử dụng trong lên men Natto của Nhật - một thực

phấm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe.[46]

1.4.2.2 Bacillus cereus

Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,

Bacillus thuringiensis Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí

Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phấm hư hỏng Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) x (3 - 5) µm, có khi dài hơn,

chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 - l,5)

µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào Khuẩn lạc của

Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm.[46]

1.4.2.3 Bacillus mensentericus

Bacillus mensentericus là trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis, mảnh dài

hoặc ngắn (3- 10) x ( 0,5 - 0,6 ) µm, có thế đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài Bào tử hình bầu dục và kéo dài 0,5 - 0,9 µm, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào

Bacillus mensentericus không bị phình to khi mang bào tử

Khuẩn lạc bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng,

nhăn nheo, xám nhạt - trắng, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger (đen), Bacillus mensentericus ruber (hồng)

Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát triến tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C tối đa 50 – 550C pH = 4,5 - 5 thì nó ngừng phát triển

Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn.[46]

1.4.3 Enzyme protease của vi sinh vật

Ưu điểm lớn nhất của protease từ vi sinh vật là phong phú về chủng loại, có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng Tuy nhiên, hệ protease vi sinh vật lại phức tạp, bao gồm nhiều enzyme giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất Đối với sinh lý của vi sinh vật, protease đóng vai trò rất quan trọng Có 2 loại protease là protease ngoại bào và protease nội bào với các chức năng như sau:

1.4.3.1 Protease ngoại bào của vi sinh vật:

Protease ngoại bào của vi sinh vật tham gia các quá trình phân giải ngoại bào các protein để tạo ra các acid amin

Các acid amin này sẽ được đưa vào trong tế bào tham gia tổng hợp sinh khối hoặc cũng có thể bị phân giải để giải phóng năng lượng và sản phẩm bậc 2

Sự phân giải protein còn có ý nghĩa loại trừ tác động độc hại của protein, vì trong tự nhiên tồn tại một số protein khá độc đối với vi sinh vật hoặc tham gia quá trình kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật.[9]

Quá trình phân giải protein ngoại bào của vi sinh vật được thể hiện củ thể qua hình 1.7

Hình 1.7 Quá trình phân giải protein ngoại bào

1.4.3.2 Protease nội bào của vi sinh vật:

Protease nội bào của vi sinh vật tham gia quá trình cải biến protein, enzyme, tạo ra các quá trình cung cấp năng lượng, vật liệu xây dựng, và sự tạo thành bào tử của vi sinh vật

Protease nội bào có thể tham gia vào việc hoàn thiện các chuỗi polypeptide đã được tổng hợp như: tách gốc, tách một số gốc axit amin khỏi đầu N của chuỗi polypeptide đã được tổng hợp Protease nội bào tham gia phân hủy các protein nội bào không còn tác dụng trong quá trình sinh lý của vi sinh vật Ngoài ra chúng còn

có thể tham gia vào một số quá trình tạo vỏ tế bào của vi sinh vật.[9]

Hình 1.8 Quá trình hoạt động protease nội bào

Sản phẩm tổng hợp

Protease ngoại bào

Acid amin

Protein

Sản phẩm trao đổi chất

Protein nội bào

Cải biến protein, enzyme

Hoàn thiện các polypeptide

Phân hủy các protein thừa

Sản phẩm trao đổi chất

bậc 2

1.4.3.3 Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzyme (Barrett-1984)

Theo Barrett, protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm này gồm tên của các acid amin quan trọng nhấtcó vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme

 Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động Các protein serine này thường hoạt động ở vùng

pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng

 Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH) của acid amin cystein ở trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động của enzyme, vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hoá học

 Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (- COOH) trong trung tâm hoạt động Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH là acid, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các acid amin có vòng thơm hoặc acid amin kỵ nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân

 Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung tâm hoạt động của chúng có những ion kim loại Nhóm này thường hoạt động mạnh

ở vùng pH trung tính

Như vậy, tùy theo vùng hoạt động pH của enzyme protease mà các protease tồn tại ở dạng protease acid, protease trung tính, protease kiềm

1.5 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải

Để đảm bảo phát triển bền vững, đi đôi với các biện pháp quản lý môi trường như tiết kiệm nguyên liệu, cải tiến công nghệ - thiết bị, áp dụng công nghệ hiện đại, công nghệ thân thiện với môi trường…việc xử lý nước thải trong quá trình sản xuất

là rất cần thiết Nếu không giải quyết tốt việc thoát nước và xử lý nước thải của nhà máy, xí nghiệp công nghiệp sẽ gây ô nhiễm đối với các nguồn nước dẫn đến hậu quả xấu, gây tổn thất cho mọi ngành kinh tế