Đặt vấn đề Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời sống con người như:
Trang 1ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ
VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP TRONG
THỨC ĂN CHĂN NUÔI THỦY SẢN
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NHỚ MSSV: 1151110243 Lớp: 11DSH03
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của cô CN Đỗ Thị Tuyến Tôi cam đoan các kết quả nghiên cứu đưa ra trong luận án này dựa trên các kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề tài, hoàn toàn trung thực không sao chép bất kì kết quả nghiên cứu nào của tác giả khác Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ các nguồn sách hay công trình nghiên cứu khác đều được đều được trích dẫn rõ ràng và liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Nhớ
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường
đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập tại trường cũng như đã tạo điều kiện cho tôi thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho công việc sau này
Để hoàn thành tốt khóa luận này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô
CN Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài
Bên cạnh sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi cũng thầm biết ơn sự ủng hộ, quan tâm và động viên của gia đình, bạn bè – những người thân yêu luôn là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh Học Nhiệt Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc
Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Trần Thị Nhớ
Trang 4MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục các hình vi
Danh mục các bảng vii
Danh mục các sơ đồ viii
Danh mục các đồ thị viii
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 2
1.4 Phương pháp nghiên cứu 2
1.5 Kết cấu của đồ án 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp 3
2.1.1 Phân loại 3
2.1.2 Đặc điểm chung của chi Bacillus 4
2.1.3 Khả năng tạo bào tử 4
2.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi trồng thủy sản 6
2.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp 7
2.2 Enzyme protease 8
2.2.1 Giới thiệu chung về protease 8
2.2.2 Phân loại protease 10
2.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật 12
2.2.4 Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease 13
2.2.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease 15
2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật 16
2.3 Trùn quế 17
2.3.1 Phân loại và đặc điểm của trùn quế 17
Trang 52.3.3 Đặc tính sinh lý của trùn quế 19
2.3.4 Sự sinh sản và phát triển 20
2.3.5 Tác dụng của trùn quế 20
2.3.6 Bổ sung Trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi 22
2.4 Chế phẩm probiotics 24
2.4.1 Định nghĩa về Probiotics 24
2.4.2.Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản 24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26
3.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 26
3.2.1 Vật liệu 26
3.2.2 Hóa chất 27
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 28
3.3 Môi trường phân lập, định danh và giữ giống 28
3.4 Phương pháp nghiên cứu 29
3.4.1 Sơ đồ tổng quan thí nghiệm 29
3.4.2 Phương pháp phân lập Bacillus sp 30
3.4.2.1 Hoạt hóa giống Bacillus sp 30
3.4.2.2 Phân lập các chủng Bacillus sp 30
3.4.2.3 Cấy giữ gống Bacillus sp 30
3.4.2.4 Tăng sinh chủng Bacillus sp 30
3.4.2.5 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 31
3.4.3 Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa 31
3.4.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 31
3.4.3.2 Test khả năng di động 33
3.4.3.3 Test catalase 33
3.4.3.4 Thử nghiệm khả năng sinh Indol 34
3.4.3.5 Thử nghiệm Methyl Red (MR) 35
Trang 63.4.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 36
3.4.4.1 Khả năng kháng khuẩn 36
3.4.4.2 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease 37
3.4.4.3 Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease 37
3.4.4.4 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease 38
3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế 38
3.4.5.1 Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu 38
3.4.5.2 Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế 39
3.4.5.3 Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng Nitơ tổng số) 40
3.4.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến 41
3.4.5.5 Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin 44
3.4.6 Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease 45
3.4.6.1 Xác định nhiệt độ tối ưu 45
3.4.6.2 Xác định pH tối ưu 45
3.4.7 Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế 46
3.4.7.1 Khảo sát nồng độ cơ chất 46
3.4.7.2 Khảo sát nồng độ enzyme 47
3.4.7.3 Khảo sát thời gian thủy phân 47
3.4.8 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm 48
3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu 49
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50
4.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp 50
4.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp từ các chế phẩm Probiotic 50
4.1.2 Nhuộm Gram 52
4.1.3 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa 52
4.1.3.1 Khả năng di động 52
4.1.3.2 Khả năng sinh catalase 53
Trang 74.1.3.3 Khả năng sinh indol 54
4.1.3.4 Thử nghiệm methyl red 54
4.1.3.5 Khả năng lên men các loại đường 55
4.2 Đánh giá các hoạt tính sinh học 58
4.2.1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn 59
4.2.2 Định tính khả năng sinh enzyme protease 59
4.3 Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế 60
4.4 Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế phẩm 61
4.4.1 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease 61
4.4.2 Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease 62
4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân 63
4.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy phân 65
4.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân 67
4.8 Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn 70
4.9 Quy hoạch thực nghiệm 71
4.10 Đánh giá hiệu quả sản phẩm 77
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78
5.1 Kết luận 78
5.2 Kiến nghị 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 80
Trang 8DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
OD Optical density
UI Unit International
MR Methyl red CFU Colonies Form Unit TCA Trichloroacetic acid EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit
NL Nguyên liệu CPE Chế phẩm enzyme
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Bacillus sp 3
Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử 5
Hình 2.3 Cấu trúc 3D của protease 8
Hình 2.4 Trùn quế 18
Hình 2.5 Trùn quế trong chăn nuôi 22
Hình 3.1 Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập 26
Hình 3.2 Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP HCM 27
Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu 50
Hình 4.2 Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6 52
Hình 4.3 Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6 53
Hình 4.4 Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6 53
Hình 4.5 Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6 54
Hình 4.6 kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6 54
Hình 4.7 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1 55
Hình 4.8 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5 56
Hình 4.9 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6 57
Trang 10DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease 13
Bảng 2.2 Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá 22
Bảng 3.1 Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin 42
Bảng 3.2 Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu 42
Bảng 3.3 Lập đường chuẩn Albumin 44
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v) 46
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%) 47
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 48
Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ các chế phẩm 51
Bảng 4.2 Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát 58
Bảng 4.3 Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng 59
Bảng 4.4 Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ 3 chủng sau 48 giờ 59
Bảng 4.5 Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân 60
Bảng 4.6 Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme thương phẩm và enzyme chế phẩm 70
Bảng 4.7 Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân
70
Bảng 4.8 Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng 71
Bảng 4.9 Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố 71
Bảng 4.10 Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 72
Bảng 4.11 Kết quả bj và bij 73
Bảng 4.12 Xử lý số liệu tại tâm 73
Bảng 4.13 Bảng kiểm định Student 74
Bảng 4.14 Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn 77
Trang 11DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phân loại protease 10
Sơ đồ 3.1 Quá trình tiến hành thí nghiệm 29
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm 61
Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm 63
Đồ thị 4.3 Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ cơ chất khác nhau 64
Đồ thị 4.4 Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ enzyme khác nhau 66
Đồ thị 4.5 Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các
mức thời gian khác nhau 68
Trang 12Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế, và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát triển của ngành chế biến thức ăn thủy sản Trong những năm gần đây thủy sản đã trở thành nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng thuốc hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm môi trường và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản Với mục đích bảo
vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không
bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, mà thay vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh, tăng khả năng hấp thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi trường nước bằng cách bổ sung thêm những vi sinh vật có lợi Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo
sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme
vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa trong quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh
Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu
cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính nhận được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi Với hàm lượng protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, là thức ăn lý tưởng
để nuôi thủy sản Trùn còn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết cho gia súc, gia cầm và thủy sản Đặc biệt, thịt trùn còn có các loại kích thích tố sinh
Trang 13có mùi tanh và khét của cá và dầu cá, hấp dẫn với vật nuôi, lại bảo quản được lâu hơn thức ăn có dùng bột cá Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó tiêu hóa nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại, cắt đứt các liên kết peptid tạo các amino acid đơn giản giúp quá trình tiêu hóa, hấp thụ tốt hơn
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và
ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp trong thức ăn chăn
nuôi thủy sản”
1.2 Mục đích nghiên cứu
Chọn lọc được chủng Bacillus sp có khả năng sinh enzyme protease cao
Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng
enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp
1.3 Nội dung nghiên cứu
Phân lập chủng Bacillus sp từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản
Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân
So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme
protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp
Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế
1.4 Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics
1.5 Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Mở đầu
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 4: Kết quả và thảo luận
Trang 14Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp
2.1.1 Phân loại
Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất lợi,
nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau:
Giới: Bacteria Ngành: Fimicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae Với một số loài thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus
mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus Brevis, Bacillus simplex,
Hình 2.1 Bacillus sp
(http://nuoitomsu.blogspot.com/2013/03/vai-tro-cua-vi-khuan-bacillus-sp-trong.html)
Trang 152.1.2 Đặc điểm chung của chi Bacillus (Nguyễn Thị Yến Thu, 2011)
Vi khuẩn Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que hay trực khuẩn, Gram
(+), đường kính khoảng 0,2 – 2 µm, dài 2 – 8 µm, thường ở dạng đơn hoặc chuỗi dài, chiều dài của chúng phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong suốt quá trình phát
triển Phần lớn các chủng vi khuẩn Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức trung bình,
với nhiệt độ tối ưu vào khoảng 35 – 45oC, cũng có một số chủng có nhiệt độ tối ưu khá cao khoảng 65oC
Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, bất động hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài như một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 – 11 nên đa số chúng rất phổ biến trong tự nhiên và có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất, nước, thức ăn,…
Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi trong tự nhiên, phần lớn chúng
cư trú trong đất Vi khuẩn Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản
như đường, amino acid, các acid hữu cơ và có thể chuyển hóa các nguồn carbon như methanol, cellulose hay lên men các hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol và butanediol
Các chủng Bacillus được nghiên cứu nhiều do có khả năng tổng hợp được nhiều
loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase, tùy thuộc vào nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là cellulose thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase, Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ thuộc da, công nghệ dệt và trong xử lý chất thải
2.1.3 Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt động
Trang 16dinh dưỡng,…thì nội bào tử mới được hình thành Bào tử có hình oval và có khuynh hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào tử được cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào, tồn tại lâu dài trong điều kiện khắc nghiệt
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:
và bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát
Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử
www.biol.lu.se/cellorgbiol/membprot/pop sv.html
Trang 17triển thành tế bào mới Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004)
2.1.4 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi trồng thủy sản
Sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus trong môi trường với một số lượng lớn sẽ
xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976)
Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc
biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn
Bacillus như: B subtilis, B aterrimus B niger, B pumilis, B panis, B vulgarus, B nigrificans, B natto, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B megaterium, B mesentericus…đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò:
Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp và hỗ trợ tiêu hóa
Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như phân hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở đáy
ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi
Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và môi trường sống
Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát
triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường luôn
ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này
Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có
hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực Verschuere (2000) đã
nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải
thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong quá trình chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2 Do vậy, Bacillus sp làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các
chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007) Một số loài của nhóm vi
Trang 18sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (protease, amylase, cellulase, kitinase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng
thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính, Đinh Thị Kim, 2006) Bacillus còn có khả
năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá
mức như Vibrio, Aeromnas,…(Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012)
2.1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp
Vijayabaska et al (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể
là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhằm hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A Hyrophila gây ra Sugama, Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY
– 9 bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/ml Kết quả cho
thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveji và tỉ lệ
sống của tôm ở giai đoạn OL 10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so với đối chứng (10,6%) Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao
nuôi được cải thiện, đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng Graslund et al., cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã
sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012)
Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu
cơ trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung
3 loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/ml
và 1 đối chứng (không bổ sung vi khuẩn) Kết quả cho ta thấy tỉ lệ sống ở nghiệm thức B37 cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p < 0,05) Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài và trọng lượng của tôm cao nhất ở B37 lần lượt là 1,659 ± 0,034 mm/ngày và 0,45 ± 0,02 g/ngày, trong khi đó ở nghiệm thức đối chứng là thấp nhất với các chỉ số tương ứng là 0,677 ± 0,017 mm/ngày và 0,14 ± 0,01 g/ngày Như vậy hiệu quả xử lí môi trường của các chủng vi khuẩn bổ
Trang 19sung được khẳng định, trong đó hiệu quả xử lý tốt nhất ở nghiệm thức dòng B37 (Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010)
Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus:
Trong chăn nuôi: viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất
thuận tiện cho người sử dụng Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một
số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, Probiotic
Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae Ngoài ra còn ứng dụng
nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch Nghiên cứu sản xuất thử chế
phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá
chất, Bộ Nông Nghiệp tại TP HCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế
phẩm Subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp
2.2 Enzyme protease
2.2.1 Giới thiệu chung về protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Hình 2.3 Cấu trúc 3D của protease
Trang 20
(http://www.hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien-Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide CONH của phân tử protein và cắt liên kết peptide giữa các
L acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ưu điểm nhất như
vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc đã được gia tăng sử dụng như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện được đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn Đặc biệt vi khuẩn là nguồn sản xuất protease tương đối lí tưởng vì những ưu điểm như: có hoạt tính mạnh như chỉ với một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng
cơ chất lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh chóng, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng lớn enzyme Hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng
Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học Các
loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus,
Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các amino acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các acid amin đơn giản, dễ hấp thu Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương…
Trang 212.2.2 Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)
Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất có thể chia protease thành hai nhóm:
Endopeptidase: protease thủy phân peptide ở giữa mạch
Exopeptidase: protease phân cắt các liên kết peptide ở đầu mạch
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:
Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide
Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
Carboxypeptidase Aminopeptidase
Exopeptidase
(E.C 3.4.11-17)
Peptidase (Protease) (E.C.3.4)
Serine proteinase
Metallo proteinase Aspartic proteinase Cystein proteinase
Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phân loại protease
Trang 22 Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các Serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng
Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các Cysteine proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng
Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính
Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các Metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
Protease acid: pH = 2 – 4 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp
bánh kẹo
Protease trung tính: pH = 7 – 8 chúng thường được sản xuất từ các loài vi khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus
Protease kiềm: pH = 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của các enzyme
protease này có serin
Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất Vì cùng một protease của cùng một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein, hemoglobin hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau
Trang 23 Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
Protease động vật: có trong tụy tạng (đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất) và dạ dày bê
Protease thực vật: có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu từ quả, chồi
và vỏ dứa), Papain (có trong nhựa của lá, thân, quả đu đủ) và Ficin (thu được
từ nhựa cây cọ)
Protease vi sinh vật: phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces
và một số và một số loại nấm men
2.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Protease có thể ở 2 dạng chính là protease nội bào (hiện diện trong tế bào) và protease ngoại bào (được tiết vào môi trường nuôi cấy) và có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật Protease ngoại bào thường phân giải protein
và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp
để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ Cho đến nay, các loại protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào
Vi sinh vật tiết ra enzyme ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptide) Các chất này tiếp tục phân hủy thành các acid amin nhờ Peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào
tế bào rồi mới chuyển hóa thành acid amin Một phần các acid amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được phân giải tạo thành
NH3 và các sản phẩm khác
Quá trình này được gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa Đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3) (trích Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012)
Acid amin Polypeptid
Protease
Trang 24Protease nội bào thì cho đến nay còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết
rõ vai trò của chúng trong tế bào Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể
có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng như phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào để hình thành các acid amin và để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969) Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích dẫn bởi Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005)
Bảng 2.1 Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease
Str fradiae Str feacatis Str rectus var proteolyticus
Aspergillus oryzae Asp niger
Asp owamori Asp candidus Asp favus Mucor pusilus Rhizopus niveus
(Nguyễn Đức Lượng, 2002)
2.2.4 Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất
Trang 25đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng phong toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác
Về phương pháp nuôi cấy hiện nay người ta thường dùng hai phương pháp sau:
Nuôi cấy bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường Sử dụng môi trường nuôi dạng rắn hoặc bán rắn hay trên bề mặt dạng lỏng
Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Ở môi trường bán rắn để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường
và sinh tổng hợp enzyme nội bào và ngoại bào Độ ẩm thích hợp của môi trường đặc
là 55 65%
Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý Nhưng nhược điểm
là tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa và tự động hóa
Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm)
Phương pháp này sử dụng môi trường dạng lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men Trong thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng Trong đó hệ thống diều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi
Trang 26bào vi sinh vật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh sản và phát triển, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật
Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích và dễ cơ giới hóa nhưng nhược điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát
2.2.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease
(Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009)
Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, thời gian hoạt động, thành phần môi trường
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp và có khác nhau trong khoảng từ 40oC – 60oC,
đa số hoạt độ của protease cao nhất ở 50oC Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ, bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp và chịu ảnh hưởng của cơ chất, pH môi trường và thời gian tác dụng…Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ hoạt động thích hợp thì hoạt động của protease giảm vì nhiệt độ cao làm biến đổi hay hư hỏng cấu trúc của enzyme Nhiệt độ mà protease mất hoàn toàn hoạt độ gọi là nhiệt độ tới hạn Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0oC
đa số protease vi khuẩn bị giảm hoạt tính nhưng không bị mất hoạt độ, do đó hoạt động của protease có thể tăng khi nhiệt độ tăng Tuy nhiên cũng có một số protease
bị mất hoạt tính trong quá trình đông khô
Ảnh hưởng của pH môi trường: khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường Vì pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của protease, phức chất protease – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của protease Đa số protease vi khuẩn đều bền ở pH trung tính từ 6,2 – 7,4, pH thích hợp cho nhiều protease gần bằng 7
Trang 27Ảnh hưởng của độ thông khí: có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp protease và khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật Trong một số trường hợp thiếu oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease, tuy nhiên sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp protease và lượng oxi thích hợp cho sự tổng hợp protease khác nhau ở các loại vi sinh vật
Ảnh hưởng của độ ẩm: thông thường các loài vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hơn nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60 – 70%
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh tổng hợp enzyme cực đại là khoảng 36 – 48 giờ Tuy nhiên để phân giải protein đạt hiệu suất cao nhất, đòi hỏi thời gian lâu hơn, để enzyme phân giải đối với cơ chất tự nhiên
Ảnh hưởng thành phần môi trường: thành phần môi trường như nguồn carbon, nitơ, khoáng chất và các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme Nếu trong môi trường có chứa các yếu tố gây biến tính protease như acid hoặc kiềm đặc hay muối kim loại nặng ở nồng độ cao thì protease sẽ bị mất hoạt tính
2.2.6 Ứng dụng protease vi sinh vật (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như: ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, thuộc da, dệt, phim ảnh, dùng làm trong bia và nước quả hay trong sản xuất rượu…
Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt…có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi Các loại xà phòng chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như vết máu ở quần áo, drap ở bênh viện…
Trong công nghệ thực phẩm: protease ứng dụng trong công nghệ chế biến sữa
và các sản phẩm từ sữa Sữa là loại thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đối nhất Các sản phẩm từ sữa là rất đa dạng và phổ biến Từ nguyên liệu sữa, người ta đã cho ra vô vàn các sản phẩm có cấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau
Trang 28cảm vị đặc trưng, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường Trong đó, mảng sản phẩm lên men truyền thống từ sữa vô cùng phong phú như là bơ, fomat, kefir, yoghurt,…
Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do
dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật Sản xuất các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng
Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn cho gia cầm và thủy sản
Trong công nghiệp da: thành phần quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác dụng của protease các chất nhờn được tách ra, một số sợi liên kết collagen bị phá hủy Kết quả là da có độ mềm nhất định giúp tách lông thú ra khỏi da dễ dàng mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng của da
2.3 Trùn quế
2.3.1 Phân loại và đặc điểm của trùn quế
Trùn quế có tên khoa học là Perionyx excavates, có vị trí phân loại:
Ngành: Annelides (ngành giun đốt)
Phân ngành: Clitellata (phân ngành có đai) Lớp: Olygochaeta (lớp giun ít tơ)
Họ: Megascocidae (họ cự dẫn) Chi: Pheretima
Loài: Perionyx excavatus (trùn quế)
Trùn quế là động vật không xương sống, cơ thể phân đốt, phần đầu thoái hóa,
có mang đai sinh dục, các hệ bên trong cơ thể như hệ tuần hoàn, hệ thần kinh, hệ bài tiết…cũng sắp xếp theo đốt Mỗi đốt mang một đôi hạch thần kinh giúp cho trùn ghi
Trang 29nhận cảm giác và phản ứng đáp trả của cơ thể đối với môi trường ngoài rất nhạy bén Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy, trong tự nhiên ít tồn tại với phần thể lớn và không có khả năng cải tạo đất trực tiếp như một số loài trùn địa phương sống trong đất
Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ Đây là loại trùn mắn đẻ, xuất hiện rải
rác ở vùng nhiệt đới, dễ bắt bằng tay, vì vậy rất dễ thu hoạch
2.3.2 Đặc tính sinh học của trùn quế
Kích thước trùn quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, bề ngang của con trưởng thành
có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, thân hơi dẹt, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ (Bùi Minh Tuấn, 2012)
Trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải CO2 trong môi trường nước, điều này giúp cho chúng có khả năng sống trong nước nhiều tuần, thậm chí trong nhiều tháng
Hệ thống bài tiết bao gồm một cặp thận ở mỗi đốt, các cơ quan này bảo đảm cho việc bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac và urea Trùn quế nuốt thức ăn bằng môi ở lỗ miệng, lượng thức ăn mỗi ngày được nhiều nhà khoa học ghi nhận là tương đương với trọng lượng cơ thể của nó Sau khi qua hệ thống tiêu hóa với nhiều vi sinh vật cộng sinh, chúng thải qua phân ra bên ngoài và rất giàu dinh
Hình 2.4 Trùn Quế
Trang 30khỏi cơ thể trùn nhưng vẫn còn có thể hoạt động ở “màng dinh dưỡng” trong một thời gian dài Đây là một trong những nguyên nhân làm cho phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao và có hiệu quả cải tạo đất tốt hơn dạng phân hữu cơ phân hủy bình thường trong tự nhiên (Nguyễn Thị Xuân Thanh, 2009)
2.3.3 Đặc tính sinh lý của trùn quế (Bùi Minh Tuấn, 2012)
Trùn quế rất nhạy cảm, thường sống trên mặt đất, thích sống nơi môi trường ẩm ướt, tối, có nhiều chất hữu cơ đang phân hủy và độ pH ổn định Chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn.Tế bào da của trùn quế rất mỏng, thường xuyên tiết ra chất nhờn để bảo vệ cơ thể và thích ứng với điều kiện chui rúc trong môi trường tối và ẩm
Những điều kiện môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của trùn quế:
pH: trùn quế chịu được phổ pH khá rộng từ 4 9 thích hợp nhất là 6,8 7,5; nếu pH quá thấp chúng sẽ bỏ đi
Nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp nhất với trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 35oC,
ở nhiệt độ khoảng 30oC và độ ẩm thích hợp, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh Ở nhiệt độ quá thấp, chúng sẽ ngừng hoạt động và có thể chết, hoặc khi nhiệt độ của luống nuôi lên quá cao cũng bỏ đi hoặc chết Chúng có thể chết khi điều kiện khô và nhiều ánh sáng nhưng chúng lại có thể tồn tại trong môi trường nước có thổi oxy
Độ ẩm: nước là thành phần quan trọng chiếm 75 – 90% khối lượng cơ thể trùn quế, độ ẩm thích hợp nhất cho trùn quế sinh trưởng và sinh sản là 60 – 70%
Không khí: trùn quế hô hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải
CO2, do đó môi trường sống của chúng đòi hỏi phải thoáng khí, lưu ý loại bỏ các chất khí có hại cho trùn như: Clo (Cl2), amoniac (NH3), H2S, SO2, SO3,
CH4,…
Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên như rác đang phân hủy, phân gia súc, gia
Trang 31cầm…Tuy nhiên, những thức ăn có hàm lượng dinh dưỡng cao sẽ hấp dẫn chúng hơn, giúp cho chúng sinh trưởng và sinh sản tốt hơn
Trong tự nhiên, trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, gần cống rảnh, hoặc nơi có nhiều chất hữu có dễ phân hủy và thối rữa như trong phân động vật, rác hoai mục Chúng rất ít hiện diện trên các đồng ruộng canh tác dù nơi đây có nhiều rác thải hữu
cơ, có lẽ vì tỷ lệ C/N của những chất thải này thường cao, không hấp dẫn và không đảm bảo độ ẩm môi trường thường xuyên
2.3.4 Sự sinh sản và phát triển (Tiêu Thị Ngọc Thảo, 2008)
Trùn quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định
và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam Theo nhiều tài liệu, từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 – 1.500 cá thể trong một năm Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng Kén có hình dạng thon dài, hai đầu túm nhọn lại gần giống như hạt bông cỏ, ban đầu có màu trắng đục, sau chuyển sanh xanh nhạt rồi vàng nhạt, mỗi kén có thể nở từ 2 – 10 con
Khi mới nở, con nhỏ như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3 mm, sau 5 –
7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ thẫm trên lưng Khoảng từ 15 – 30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục, từ lúc này chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản Con trưởng thành khỏe mạnh có màu mận chín và có sắc ánh kim trên cơ thể
2.3.5 Tác dụng của trùn quế
Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy: hiếm có loài động vật nào có giá trị hấp dẫn như trùn quế Trùn quế được sử dụng trực tiếp hoặc phối trộn làm thức ăn cao cấp nuôi gia súc, gia cầm, thủy sản; thậm chí làm thực phẩm cho con người; dùng sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm; trùn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường; phân trùn thải ra là một trong những loại phân hữu cơ thiên nhiên giàu dinh dưỡng nhất mà con người từng biết
Trang 32Ứng dụng trong chăn nuôi: trùn quế là loại thức ăn giàu đạm, chất lượng cao để tăng hàm lượng dinh dưỡng trong thức ăn cho gia súc, gia cầm và nhất là đối với các loài thủy sản đồng thời còn có thể giảm chi phí cho thức ăn chăn nuôi
Với hàm lượng protein cao của trùn quế tương đương với trong bột cá thường dùng làm thức ăn chăn nuôi, thêm vào đó là thịt trùn quế có chứa các acid amin, lipit, vitamin, khoáng chất, hay các loại kích thích tố sinh trưởng cao hơn trong bột cá (A.F.Md Hasanuzzaman, Sk.Z Hossian, M Das, 2010) Bột thức ăn chứa thịt trùn quế không có mùi tanh hay mùi khét như bột cá nên có thể hấp dẫn được vật nuôi tốt hơn và dễ bảo quản trong thời gian dài
Trùn quế nhất là trùn tươi rất tốt làm thức ăn cho gà, lợn, thỏ và như một nguồn
bổ sung dinh dưỡng cho các loài thủy sản Thêm vào đó trong thịt trùn quế còn chứa một lượng thấp acid glutamic nên khi dùng làm thức ăn chăn nuôi hàng ngày sẽ giúp tăng tốc độ sinh trưởng, tăng năng suất trứng, tăng khả năng sinh sản và sức kháng bệnh của tôm, cá Trùn quế rất dễ nuôi và sinh sản nhanh nên có thể sản xuất một lượng lớn trùn trong thời gian ngắn giúp giảm giá thành thức ăn, có tiềm năng thay thế cho nguồn protein động vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, đóng vai trò quan trọng trong nuôi trồng và sản xuất thủy sản hiện nay
Theo W.T.Mason (Đại học Phlorida – Mỹ): trùn, nhất là trùn tươi, là thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản, nhất là sản xuất con giống ba ba, rùa, lươn, tôm, cá chình, đặc biệt là nuôi cá tầm – một loài cá quý để ăn và sản xuất món trứng cá muối đắt tiền Nếu cho chúng ăn trùn tươi hằng ngày bằng 10 – 15% trọng lượng cơ thể sẽ tốt hơn bất cứ loại thức ăn nào khác, tốc độ sinh trưởng sẽ tăng từ 15 – 40%, năng suất trứng tăng lên 10% Nếu trộn 2 – 3% bột trùn dùng để nuôi, năng suất sẽ tăng trên 30%, giá thành thức ăn giảm 40 – 60%, đồng thời tăng sức sinh sản và khả năng kháng bệnh của tôm, cá Điều này rất có ý nghĩa khi thức ăn chăn nuôi đắt đỏ như hiện nay
Hiệp hội nuôi gà của Mỹ cho rằng: trùn là phương án hàng đầu cung cấp protein chất lượng cao, rẻ nhất, dễ nhất cho vật nuôi, đặc biệt là gà, thì năng suất trứng tăng
17 – 25%, tốc độ sinh trưởng tăng 56 - 100% Đặc biệt nếu nuôi gà bằng thức ăn có
Trang 33trùn tươi thì hầu như gà không bị bệnh; trong khi nếu nuôi gà không có trùn thì tỷ lệ mắc bệnh cúm gà 16 – 40% Trùn quế còn chứa trên 8% axit glutamic, nên khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi thì vật nuôi khỏe, chóng lớn, đẻ khỏe, ít bệnh tật và sẽ cho thịt thơm ngon hơn hẳn so với vật nuôi thông thường Vì vậy ngày càng có nhiều hãng sản xuất thức ăn công nghiệp quan tâm đưa bột trùn vào thức ăn chăn nuôi để tạo sự khác biệt so với thức ăn thông thường, nâng cao khả năng cạnh tranh sản phẩm trên thị trường
Bảng 2.2 Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá
(A.F.Md Hasanuzzaman, Sk.Z Hossian, M Das, 2010)
2.3.6 Bổ sung trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi
Hình 2.5 Trùn quế trong chăn nuôi
(http://trunque.blogspot.com)
Trang 34Nguyễn Minh Triết (2008) thử nghiệm trùn quế và chế phẩm vi sinh lên sinh trưởng và phát triển của vịt xiêm Khảo sát mức độ trùn quế 5%, chế phẩm vi sinh 5‰ và 10‰ vào khẩu phần thức ăn cho vịt xiêm trong giai đoạn từ 1 – 84 ngày Kết quả cho thấy trọng lượng bình quân của các nghiệm thức thí nghiệm (1886,9; 1723,1; 1891,9) cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (1400,6) và hệ số chuyển hóa thức ăn của nghiệm thức thí nghiệm (3,7765; 3,8601; 3,4928) cũng thấp hơn hẳn so với nghiệm thức đối chứng (5,54)
Trong nghiên cứu của Sakthika.T, Ronald J, Siva Kumar.V, Felicitta J (2014) khảo sát sự ảnh hưởng trong bữa ăn của cá cho ăn thức ăn viên (NT1) và cá cho ăn 2 bữa ăn khác nhau từ trùn quế được nuôi bằng cây lục bình nước (NT2), kiểm tra các thông số tăng trọng của cá sau 60 ngày cho thấy: cá được nuôi ở NT2 cho tỉ lệ tăng trọng lên 51,87%, tốc độ tăng trưởng tăng 22,22%, giảm 51,43% tỷ lệ chuyển đổi thực phẩm và tăng hiệu quả protein lên 55,29% so với NT1 Điều này có ý nghĩa về mặt sinh thái và giá trị kinh tế trong ngành thủy sản
Theo tác giả C.O Monebi và A Ugwumba (2013) khảo sát sự ảnh hưởng của
tỷ lệ thức ăn bột trùn thay cho bột cá đến trọng lượng và tốc độ tăng trưởng của cá giống từ 0, 5, 25, 50, 75, 100% bột trùn (NT1, NT2, NT3, NT4, NT5) Kết quả cho thấy trọng lượng cơ thể cá giống tăng 5% mỗi ngày trong vòng 9 tuần và giảm dần từ tuần thứ 10 trừ cá nuôi ở NT5, tốc độ tăng trưởng cao nhất trong cá nuôi ở NT3 là 1,5% còn thấp nhất đối với cá nuôi ở NT1 là 1,2% Tỷ lệ cá sống cao từ 72 – 73,3%
ở NT3, NT4, NT5 và thấp nhất ở NT1 và NT6 Tỷ lệ hiệu quả protein cao nhất ở NT3 (1,0) và thấp nhất ở NT6 (0,5), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn cao nhất ở NT6 (3,1) và thấp nhất ở NT4 (1,6) Sự khác biệt giữa NT1 và NT6 là không đáng kể nhưng khác nhau đáng kể so với NT3, NT4, NT5 Vậy việc thay thế bột cá sang bột trùn từ 50 – 75% phù hợp với hiệu suất tăng trưởng và khả năng sử dụng chất dinh dưỡng của cá giống
Trang 352.4 Chế phẩm probiotics
2.4.1 Định nghĩa về Probiotics
Có rất nhiều định nghĩa về probiotics như probiotics là những vi khuẩn hoặc nấm men có ích hỗ trợ khôi phục lại sự cân bằng trong đường ruột Chúng còn được gọi là “vi khuẩn thân thiện” hay “lợi khuẩn”, những vi khuẩn này được bổ sung vào chế độ ăn nhằm cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột để cải thiện sức khỏe
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001): “Probiotics là các vi sinh vật sống khi
đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật chủ”
Định nghĩa của Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO): “Probiotics là những vi
sinh vật sống khi được sử dụng với một lượng tương thích sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật chủ”
Định nghĩa khác: “Probiotics là vi sinh vật sống bổ sung trong thức ăn vật nuôi,
gây tác động có lợi cho vật chủ bởi sự cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” (Isolauri et al., 2004)
2.4.2 Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản (Nguyễn Thị Ngọc
Huyền, 2012)
Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007) probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức
ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống Probiotics là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải các chất hữu cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn làm tăng năng suất gấp hai lần so với đối chứng
Trang 36Ngày nay việc đưa những sản phẩm probiotics vào nuôi trồng thủy sản đang được quan tâm và ứng dụng nhiều với những lợi ích như:
Cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh hay tạo ra những hoạt chất ức chế kìm hãm
Trang 37Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian tiến hành từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015 tại phòng thí nghiệm trường đại học Công Nghệ TP HCM
3.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
Nguồn vi sinh vật: phân lập các chủng Bacillus sp từ những chế phẩm đang
được lưu hành tại các đại lý buôn bán thức ăn thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long
Trang 383.2.2 Hóa chất
Hóa chất dùng pha môi trường: Agar, pepton, giá đậu, cao nấm men, NaCl Hóa chất khảo sát đặc tính sinh hóa: MgSO4, K2HPO4, NH4H2PO4, phenol red, bromothymol blue
Thuốc thử: H2O2, methyl red, phenol red, Kovacs’
Thuốc nhuộm Gram: Gentian violet, Lugol, Fucshin
Hóa chất chuẩn pH: NaOH (0,1 N), HCl (0,1 N)
Dung dịch Tyrosine chuẩn
Dung dịch casein 1%
Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 5%
Dung dịch albumin: 0,1%
Thuốc thử Folin đã được pha sẵn
Dung dịch thuốc thử Lowry gồm:
Dung dịch A: cân 2 g Na2CO3 hòa tan trong NaOH 0,1 N thành 100 ml
Dung dịch B: cân 0,5 g CuSO4.5H2O hòa tan trong dung dịch citrate natri 1% tạo thành 100 ml
Hình 3.2 Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp.,
Staphylococcus aureus– Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP HCM
Trang 39 Dung dịch C: là hỗn hợp của dung dịch A và B theo tỷ lệ 49 : 1 (sử dụng trong ngày)
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Các máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu được sử dụng trong phòng thí nghiệm của trường đại học Công Nghệ TP HCM
- Cân điện tử - Tủ sấy, tủ ấm
- Kính hiển vi quang học - Bể ủ nhiệt
- Nồi hấp thanh trùng - Tủ cấy vô trùng
- Bình tam giác - Máy lắc
- Tủ lạnh, tủ lạnh sâu - Máy đo pH
- Máy đo OD - Máy khuấy từ
- Máy Kjeldahl - Máy li tâm
Các dụng cụ khác như: Ống nghiệm, đĩa petri, đầu tuýp, đũa thủy tinh, lam kính, cốc thủy tinh, que trang, que cấy, pipetman, pipet, ống đong, nồi đun, bếp điện, giấy lọc, bông thấm
3.3 Môi trường phân lập, định danh và giữ giống
Môi trường phân lập và giữ giống (MT1): môi trường nước chiết giá đậu pepton cao nấm men agar (Phụ lục 1.1)
Môi trường nhân giống: môi trường nước chiết giá đậu pepton cao nấm men (MT2) (Phụ lục 1.2)
Môi trường khảo sát đặc điểm sinh học: môi trường Clark cluck, môi trường lên men các loại đường (Phụ lục 1.6; 1.7)
Trang 403.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Sơ đồ tổng quan thí nghiệm
Định tính khả năng sinh enzyme protease
Xác định hoạt tính
kháng khuẩn
Xác định hoạt tính sinh học
Định danh bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa
Phân lập chủng
Bacillus sp
Mẫu chế phẩm Probiotic
Hoạt hóa giống
Pha loãng mẫu
Cấy giống Thuần khiết giống
Xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease
Xác định hàm lượng acid amin bằng phương pháp Lowry
Tối ưu hóa quá trình Thủy phân trùn quế
Khảo sát thời gian thủy phân: Từ 0
20 giờ
Sơ đồ 3.1 Quá trình tiến hành thí nghiệm