ỨNG DỤNG RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

Kết quả điện di sản phẩm RAPDXác định hệ số di truyền tương đồng Sij: - Sij: hệ số giống nhau giữa hai cá thể i và j - a: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i,j - b: Số phân đoạn DNA xuất hiện

ỨNG DỤNG RAPD TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GENE KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA (-)

4 Các chỉ thị sinh học phân tử:

‐ RFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

=> Phức tạp , cồng kềnh, khó tự động hóa, tốn kém, nguy hiểm

-AFLP: (Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại)

Tạo nên các đoạn cắt khác nhau được phân biệt bằng phương pháp điện di

=> Giới hạn về kích thước đoạn DNA, phức tạp và tốn kém

- RAPD: Đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên

=> Rẻ tiền, nhanh, dễ thực hiện, giúp xác định tính đa dạng sinh học

II Ứng dụng RAPD trong nghiên cứu sự liên kết với gen kháng bệnh bạc lá ở lúa

1 Phương pháp RAPD

- Dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng hay giữa các

cá thể, phục vụ lai tạo giống và phân loại

- Nguồn gen: Ngân hàng gene, các giống lúa địa phương

2 Đối tượng nghiên cứu

36 giống lúa có nguồn gốc, tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá do Bộ môn Di truyền miễn dịch, viện khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp

Sử dụng các primer ngẫu nhiên

3 Các bước tiến hành:

a Tạo cây con và thu lá

Cây mạ: Hạt lúa được ngâm, ủ cho nảy mầm

Khi cây mạ được 3-5 lá thật thì thu lá non vì lá non có ít sản phẩm trao đổi chất trở ngại cho khảnăng hòa tan của DNA thu được

b Tách chiết DNA tổng số:

Theo phương pháp của Egnin và CS (1998)

Quy trình :Thu 0,1- 0,2g lá lúa non, ghiền nhanh trong nitơ lỏng (đảm bảo mẫu được nghiền triệt

để, DNA thu được có dạng sứa, có phân tử lượng cao, không đứt đoạn) đến khi mẫu có dạng bột mịn

Pha đệm tách chiết AND:

c Xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA.

c Xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA.

Hàm lượng tính đa hình (PIC) của 36 giống lúa

d Phân tích số liệu RAPD:

o 0 Không xuất hiện phân đoạn DNA

o 1 Xuất hiện phân đoạn DNA

Kết quả điện di sản phẩm RAPD

Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij):

- Sij: hệ số giống nhau giữa hai cá thể i và j

- a: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i,j

- b: Số phân đoạn DNA xuất hiện ở i và không xuất hiện ở j

- c: Số phân đoạn DNA không xuất hiện ở i và xuất hiện ở j

- d: Số phân đoạn DNA không xuất hiện ở i và j

- Xác định hệ số di truyền tương đồng (Sij)

Giá trị tương quan kiểu hình

‐ Lập bản đồ cây di truyền dựa vào giá trị tương quan kiểu hình:

Đưa ra nhận xét và kết luận

ỨNG DỤNG RFLP TRONG NGHIÊN CỨU SỰ LIÊN KẾT VỚI GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA

3 Kỹ thuật RFLP

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP): Là kỹ thuật tìm những trình tự DNA khác

biệt Trong phân tích RFLP, DNA mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn (RE) để tạo ra các đoạn DNA nhỏ sau đó điện di trên gel

RFLP là công nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên, rẻ nên được ứng dụng rộng rãi RFLP

là công cụ quan trọng trong lập hồ sơ di truyền, lập bản đồ hệ gene, định vị gene cho các rối loạn di truyền, nguy cơ mang bệnh, và xét nghiệm phả hệ

VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

1 Nguyên liệu thực vật

• Dòng IR-BB1 mang một gen kháng bệnh bạc lá Xa-1 từ Kogyoku

• IR-BB3 mang gen khángXa-3 từ Chugoku45

• IR - BB4 mang gen kháng Xa-4 từ IR20

• IR24, Kogyoku, Chugoku45 và IR20 cũng được sử dụng làm giống kiểm tra

• Để phân tích mối liên hệ giữa Xa-1, Xa-2 và marker RFLP, tiến hành thử nghiệm các quần thể F2 và F3 (20 cây / dòng) được lai từ giống cây nhạy cảm Kinmaze không có Xa-1 và Xa-2 và Te-tep kháng với Xa-1 và Xa-2 trong đó Xa-1 giao kháng với chủng tộc gây bệnh 1 của Nhật Bản,và Xa-2 giao kháng với chủng tộc 2 (Ezuka et al., 1975)

2 Phân tích RFLP của NIL

Các điểm đánh dấu RFLP 151 trên bản đồ liên kết RFLP đã được sử dụng (Saito và ctv., 1991)

Chín marker khác được gọi là Q1 đến Q9 cũng được sử dụng Những marker này bắt nguồn

từ thư viện gen lúa được xây dựng với pUC19 và IR24, tổng DNA và vị trí nhiễm sắc thể không rõ

Kiểu gen ở mỗi locus của marker RFLP được xác định bằng cách lai tạo Southern

DNA được ly trích từ lá của IR24, ba dòng gây bệnh và các thể cho bằng phương pháp cethyltrimethyl amoni bromua (Ctab) (Murray và Thompson, 1980)

DNA được phân cắt với năm enzyme giới hạn khác nhau (BamHI, DraI, EcoRI, EcoRV và HindIII)

3 Phân tích liên kết:

• DNA từ mỗi cây trong quần thể F2 được lai tạo với bốn dòng RFLP: Npb102, 120, 197

và 235 được đánh dấu bằng ánh xạ trên nhiễm sắc thể số 4, vì Xa-1 và Xa2 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 (Sakaguchi, 1967)

• Ba kiểu gen được đánh dấu RFLP có thể được phát hiện trong quần thể F2: P1

(Kinmaze), F1 và P2 (Te-tep)

• Các dòng F3 đã được thử nghiệm cho các phản ứng bạc lá

+ Vi khuẩn được sử dụng Xanthomonas oryzae pv chủng oryzae T7174 và T7147, tương ứng với các chủng đại diện gây bệnh chủng 1 và 2 của Nhật Bản để kiểm tra sự phân biệt Xa-1 và Xa- 2 Mỗi chủng vi khuẩn được chuyển lên các môi trường thạch khoai tây bán tổng hợp và ủ ở 30 o C trong 3 ngày Nuôi cấy bằng cách cho sinh khối huyền phù vi khuẩn với nước cất ở nồng độ khoảng 10^9 tế bào / ml

+ Các cây con sau khi gieo 31 ngày và 54 ngày được lây nhiễm với T7147 và T7174, tương ứng, bằng phương pháp cắt lá (Kauffman et al., 1973) Các dòng được cấy

đã được đánh giá sau 10 ngày và 14 ngày sau khi cấy và được phân thành ba loại: kháng, kháng vừa và dễ mẫn cảm

KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

ỨNG DỤNG RAPD NGHIÊN CỨU LIÊN KẾT BỆNH ĐẠO ÔN Ở LÚA GIỚI THIỆU KỸ THUẬT RAPD

2.1 Nguyên lý

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách

sử dụng những primer ngắn (khoảng 6 - 10 nucleotide)

Khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhưnhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau

Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn thì đoạn DNA sẽ được nhân lên và được quan sát sau khi điện di.

Hình 2 Nguyên lý kỹ thuật RAPD

2.2 Ứng dụng

 Đánh giá đa dạng di truyền

 Phân tích đa dạng di truyền ở nấm bệnh thực vật

 Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao

 Chi phí thực hiện thấp đồng thời không dùng chất phóng xạ độc hại

2.3.2 Nhược điểm

 Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất

 Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu

 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao

ỨNG DỤNG RAPD TRONG PHÁT HIỆN GEN KHÁNG ĐẠO ÔN Ở LÚA

3.1 Vật liệu

 Chủng phân lập 106 (JMB840610) của Pyricularia oryzea

 Giống lúa Tongil của Hàn Quốc được sử dụng làm đối chứng kháng bệnh đạo ôn

 Giống CO39 được sử dụng là giống nhạy cảm với bệnh đạo ôn

 Hai mồi với trình tự như sau:

F6: GGGAATTCGGH18: GAATCGGCCA

3.2 Cách tiến hành

- Tạo quần thể cây con từ các phép lai của 2 giống lúa Tongil và CO39

- Đánh giá khả năng kháng và nhạy cảm với bệnh đạo ôn bằng cách phun bào tử nấm bệnh với nồng độ 6 x 104 bào tử trên mỗi ml được phun lên lá

- Trong quá trình sinh trưởng của cây, các mẫu lá được lấy để chiết DNA để phân tích RAPD với

100 µM0.4 µM

40 ng

1 unit

Giai đoạn Chu trình Số chu kỳ

nhiệtBiến tính 960C / 85s 45

Bắt cặp 360C / 70s

Kéo dài 740C / 2 phút

Giữ sản phẩm 40C

Bảng 2 Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD

- Các sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1,8% và quan sát với thuốc nhuộm ethidium bromide

- Nếu có band xuất hiện ở những cây kháng mà không có ở những cây nhạy cảm thì xác định gen

ở band đó là gen kháng bệnh đạo ôn

3.3 Kết quả

Hình 3 Kết quả điện di RAPD với mồi F6

Hình 4 Kết quả điện di RAPD với mồi H18 3.4 Thảo luận và kiến nghị

Việc sử dụng phân tích RAPD phân lập hàng loạt trên các dòng kháng đồng hợp tử và nhạy cảm

là một chiến lược hiệu quả cho việc tìm ra các marker phân tử liên quan đến gen kháng bệnh đạo

ôn trong cây lúa

Sau khi phân tích RAPD nên thực hiện thêm các kỹ thuật khác như RFLP để xác định vị trí của

gen kháng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tạo dòng gen kháng để tạo cây lúa kháng bệnh đạo ôn

ỨNG DỤNG SSR TRONG LIÊN KẾT GEN KHÁNG ĐẠO ÔN Ở LÚA

III Ứng dụng SSR trong nghiên cứu gen kháng bệnh đạo ôn

 Khái niệm: SSR( simple sequence repeats): chuỗi lặp lại đơn giản, được thực hiện bằng phản ứng PCR với mồi SSR xuôi và ngược Sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc ( AgNO3) hoặc bằng máy giải trình tự tự động

• Các bước thực hiện SSR:

Xây dựng thư viện SSR Xác định locus SSR xác định vùng phù hợp để thiết kế mồi PCR với các mồi được thiết kế Đánh giá và phân tích mẫu băng Đánh giá đa hình của sản phẩm PCR

* Ưu điểm:

Cho nhiều allen trong 1 locus

Phân bố đều trong genome

Cho thông tin cụ thể

Là chỉ thị đồng trội

Có tính đa hình và đặc thù cao

Có thể lặp lại ở các thí nghiệm, sử dụng ít DNA, rẻ, dễ tiến hành, không dùng phóng xạ

Phân biệt được các cá thể có mối quan hệ gần

* Nhược điểm:

Cần phải đọc trình tự genome để dựa vào đó thiết kế các cặp mồi đặc thù và tối ưu hóa điều kiện các mồi trước khi sử dụng

 3 Vật liệu nghiên cứu:

Giống nhận gene: giống lúa OM6976 có nắng suất cao , phẩm chất gạo tốt, nhiễm bệnh đạo ôn

 Vật liệu cho gene kháng: là dòng đẳng gene (NIL) mang gene kháng tương ứng với gene Piz ( kích thước 195 bp) và Pik-m( kích thước 245 bp) là IRBL 9 và IRBL 25

 Các mồi sử dụng trong phản ứng PCR:

Bước 1: Lai hồi giao và sử dụng các chỉ thị phân tử để chọn cá thể lúa mang gene kháng bện đạo ôn.

Bước 2: ly trích DNA

Bước 3: Chạy PCR bằng mồi liên kết với chỉ thị SSR

Thiết kế mồi Chuẩn bị mẫu dò Pha mix các thành phần Cho vào máy, set chương trình Kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Bước 4: Chạy PCR bằng mồi liên kết với chỉ thị STS

Thực hiện thao tác tương tự , thay với mồi liên kết với chỉ thị STS

Bước 5: Chọn các dòng lúa mang gene kháng bệnh đạo ôn bằng chỉ thị phân tử

Chọn các dòng lúa mang một và hai gene kháng bệnh đạo ôn dựa vào chỉ thị RM3431 liên kếtvới gen Piz và RM144 liên kết với gen Pik-m để xác định cá thể mang gen kháng dị hợp tử

Kết luận và thảo luận

a Đánh giá tính đa hình của các chỉ thị phân tử giữa bố và mẹ:

Chỉ thị phân tử có tính đa hình khi có sự khác nhau rõ rệt về kích thước của 2 băng bố mẹ, sựkhác nhau này được đánh giá dựa trên kết quả chạy điện di

Tính đa hình giữa bố và mẹ cặp primer RM144 (1, 3:OM6976; 2, 4: IRBL25)

• b Chọn lọc các dòng hồi giao dựa vào chỉ thị phân tử với các dòng lúa mang một gen kháng bệnh đạo ôn :

Kết quả lai tạo trong quần thể hồi giao BCnF1 xuất hiện hai dạng kiểu gen là kiểu gen dị hợp tử kháng (hai băng) và kiểu gen đồng hợp tử nhiễm (một băng), kiểu gen dị hợp tử kháng ở quần thể BC1F1 sẽ được chọn và chọn cá thể càng giống dạng hình của OM

6976 càng tốt để sử dụng trong chương trình lai hồi giao tiếp theo Ở thế hệ BC2F1 và BC3F1 cũng làm tương tự thế hệ BC1F1

Kiểu gen của bố mẹ và các cá thể BC1F1 mang gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m và Piz (M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, p3: IRBL9, land 1,2, 6, 9, 10, 13, 14 các cá thể BC1F1 mang gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m, cá thể số 3, 5 và 11 các cá thể BC1F1 manggen kháng bệnh đạo ôn Piz)

Kiểu gen các cá thể BC2F1 của tổ hợp lai OM6976 x IRBL25 mang gen kháng bệnh đạo ôn Pik-m (M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25,1-8 các cá thể BC2F1)

Ảnh điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ cá thể F2 có từ cặp lai OM6976/IRBL9// 3*OM6976///OM6976/IRBL25//3*OM6976 sử dụng 2 mồi RM3431 và RM144

M: 100bp DNA ladder, p1: OM6976, p2: IRBL25, p3: IRBL 9, 1-10 các cá thể F2, cá thể số

1, 2, 6, 7 và 10 mang 2 gen kháng Pi z + Pi k-m được chon lọc qua sự hiện diện của 2 băng ở vị trí khoảng 195bp và 245bp

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GẦN (SSR) TRONG CHỌN GIỐNG LÚA CHỊU NGẬP CHÌM

II - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

1) Giống lúa nghiên cứu

- Giống lúa cho gen: IR64Sub1 là giống chịu ngập chìm là Giống lúa chống chịu ngập đầu tiên tại Philippines

- Giống lúa nhận gen: AS996 là giống lúa chất lượng cao

- Các giống lúa khác: Q5c, Q5l, OM5472, FL478, KDDB, BT

2) Phương pháp nghiên cứu

- Tách chiết và tinh sạch DNA theo phương pháp CTAB cải tiến

- Chọn lọc cây con mang gen kháng thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị SSRliên kết với gen quy định tính chịu ngập chìm (Sub1) Chọn lọc nền gen thông qua phương pháp PCR đối với các chỉ thị phân bố trên 12 NST lúa

- Điện di trên gel agarose 0,8% nhuộm Ethidium Bromide

- Điện di trên gel polyacrylamide biến tính 4,5% nhuộm bạc

- Điện di trên gel polyacrylamide không biến tính 6% nhuộm Syber safe

- Phân tích dữ liệu trên chương trình Graphical Genotyper

III – Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết gần (SSR) trong chọn giống lúa chịu ngập chìm

Giếng số 1: Lambda DNA nồng độ chuẩn (200ng/µl), Các giếng từ 2 -17: DNA mẫu nghiên cứu

2) Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ

Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng để phát hiện gen chịu ngập trong các cá thể con lai

Đa hình giữa hai giống lúa có thể được phát hiện bằng chiều dài khác nhau của các đoạn lặp lại được khuyếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR.

4) Quy tụ gen chịu ngập chìm Sub1 vào giống lúa AS996

b) Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC1F1

- P1(AS996) x F1 => 497 cá thể BC1F1=> tách chiết DNA và kiểm tra sự có mặt của gen đích (Sub1) bằng hai chỉ thị liên kết chặt là ART5 và SC3 => thu được165 cá thể dị hợp

tử với cả hai chỉ thị

- Những cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị ART5 và SC3 được lựa chọn để chọn lọc các cá thể tái tổ hợp

- Sàng lọc cá thể tái tổ hợp từ các cá thể dị hợp tử mang gen đích Sub1 tiến hành sử dụng các chỉ thị cho đa hình trên nhiễm sắc thể số 9 => 14 cá thể tái tổ hợp

- 14 cá thể tái tổ hợp tiếp tục được phân tích

- Số liệu của từng cá thể được đưa vào phân tích trên chương trình Graphical Genotyper để lựa chọn 5 cá thể có nền di truyền cao nhất tiếp tục lai tạo thế hệ BC2F2

c) Quy tụ gen Sub1 vào giống AS996 ở thế hệ BC2F1

- Từ 5 cá thể BC1F1 được lựa chọn đã lai tạo được quần thể thế hệ BC2F1 Tiến

hành tách chiết DNA, làm phản ứng PCR với các bước như ở thế hệ BC1F1

Sau khi sàng lọc với 10 chỉ thị trên NST số 9 chọn ra được 17 cá thể tái tổ hợp

Kết quả:

-Cá thể có nền gen cây nhận gen cao nhất là 93,75 % là cá thể số P442 -11 và P442 -14

-Các cá thể P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 có nền gen cây nhận gen là 92,25%.-P442-12, P422-3, P39-17, P39-25 được chọn để lai tạo quần thể BC3F1.

Tương tự như với quần thể BC2F1 cho thế hệ BC3F1 với 445 cá thể Sử dụng hai chỉ thị ART5 và SC3 là hai chỉ thị liên kết chặt với gen Sub1 để lựa chọn cá thể mang gen Sub1

ở thế hệ BC3F1

- Xác định được 124 cá thể dị hợp tử với cả hai chỉ thị mang gen Sub1

- Tiếp tục sàng lọc với các chỉ thị trên NST số 9 để tìm ra các cá thể tái tổ hợp

Sau khi sàng lọc từ 10 chỉ thị cho đa hình trên NST số 9 với 124 cá thể Kết quả chọn được 22 cá thể tái tổ hợp Những cá thể này được tiếp tục chọn lọc nền di truyền của giống nhận gen Sử dụng 19 chỉ thị trên 11 nhiễm sắc thể còn lại

- Số liệu của từng cá thể được đưa vào phân tích trên chương trình Graphical Genotyper

để lựa chọn cá thể BC3F1 Các cá thể nào mang gen đồng hợp tử cây mẹ nhiều nhất sẽ được lựa chọn để lai cho lai tạo thế hệ BC4F1

IV Kết quả và Đề nghị

1) Kết quả

- Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ AS996 x IR64Sub1 thu được 53 chỉ thị

đa hình trong tổng số 372 chỉ thị Xác định được 11 cá thể mang gen Sub1 từ 22 cá thể F1

- Kết quả sàng lọc các cá thể BC1F1 chọn lọc được các cá thể tái tổ hợp mang genSub1 và chứa tối đa nền gen giống nhận gen từ 62,5%- 87,50% Cá thể có nền gen của giống nhận gen cao nhất là 87,50%

- Dòng BC2F1 chọn lọc được cá thể tái tổ hợp mang gen Sub1 chứa nền gen của giống nhận gen cao nhất đạt 93,75 %

- Dòng BC3F1 có nền di truyền cây nhận gen cao nhất là 100% alen từ AS996 trên tổng số chỉ thị đã phân tích

2) Đề nghị

Các dòng BC4F1 và BC3F2 sẽ tiếp tục được nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử, đánh giá ngập nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo các dòng AS996- Sub1 có thể trồng ở các vùng ngập nước, lũ lụt góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa ứng phó vớibiến đổi khí hậu

DEVELOPMENT OF SCAR MARKER FOR PHYTOPHTHORA RESISTANCE IN

BLACK PEPPER (PIPER NIGRUM L.)

GIỚI THIỆU CHỈ THỊ SCAR

• Kỹ thuật SCAR là kỹ thuật chỉ thị dựa vào PCR tạo ra các phân đoạn DNA tại các locus được xác định bằng sử dụng các mồi nucleotide đặc thù

• SCAR được tiến hành bằng cách tách dòng sản phẩm PCR với các mồi ngẫu nhiên sau đóđọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng

• Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mồi với độ dài 15 đến 30 bp để nhân băng đơn với kích thước tương tự như phân đoạn được nhân dòng

• Sự đa hình được xác định bằng sự có mặt hay vắng mặt của băng được nhân bản hoặc sự xuất hiện đa hình về chiều dài đồng thời chuyển chỉ thị trội thành chỉ thị SCAR đồng trội

Ưu điểm

• Sử dụng các chỉ thị xác định được bằng các mồi ngẫu nhiên (như RAPD, AFLP v.v.) khắc phục nhược điểm mẫn cảm với điều kiện phản ứng của các phản ứng với mồi ngẫu nhiên