Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho chăn nuôi heo, gà quy mô pilot

Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu cấp thiết nhằm tiến tới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Huỳnh Ninh

TP Hồ Chí Minh, 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Sinh viên thực hiện

Trần Lệ Quyên

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp tốt nghiệp ở Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt đồ án này Em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

Em xin kính dâng lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Ba Mẹ cùng tất cả những người thân trong gia đình đã nuôi em khuôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho em được học tập và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Ngôi trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, nơi em đã gắn bó suốt bốn năm qua, giúp em có thể tiếp cận được những điều bổ ích, những kinh nghiệm trong cuộc sống

Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, các Thầy

Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

đã trang bị cho em những kiến thức cơ bản, làm nền móng để em thực hiện đề tài và làm tốt công việc sau này

TS Phạm Huỳnh Ninh, Phó bộ môn Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ, Thầy đã tạo điều kiện cho em được làm đề tài tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ cho em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Chị Lê Hoàng Bảo Vi, anh Vũ Minh, anh Lê Quang Trí phòng Dinh Dưỡng và Thức Ăn Chăn nuôi, Phân Viện Chăn Nuôi Nam Bộ đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về probiotic 3

1.1.1Lịch sử nghiên cứu probiotic 3

1.1.2Định nghĩa probiotic 4

1.1.3Các VSV probiotic thường gặp 4

1.1.4Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 7

1.1.5Cơ chế tác động của Probiotic 8

1.1.6Vai trò của probiotic đối với vật nuôi 11

1.1.7Probiotic từ bào tử 12

1.1.8Tình hình nghiên cứu và sử dụng Probiotic trên thế giới và Việt Nam 13

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus 18

1.2.1Đặc điểm sinh học của Bacillus 18

1.2.2Bào tử Bacillus 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài…… ……… ……… 25

2.2 Vật liệu 25

2.2.1 Chủng vi sinh vật: ……….……… ………25

2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ……….… … 25

2.3 Môi trường nghiên cứu……… …………26

2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)………… 30

2.5 Phương pháp nhuộm Gram……… …31

2.6 Phương pháp nhuộm bào tử theo Schaeffer và Fulton ….32

2.7 Xác định mật độ TB bằng phương pháp đếm khuẩn lạc……… …………32

2.7.1Xác định mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang………… ….33

2.7.2Lập đường cong tăng trưởng……… 34

2.7.3Khảo sát sự tạo thành bào tử……… .35

2.8 Khảo sát các đặc điểm probiotic……… … … ….35

2.8.1Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày……… …35

2.8.2Khảo sát khả năng chịu muối mật……… … 36

2.8.3Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào ….……… … 37

2.8.4Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak……… ….40

2.8.5Khảo sát môi trường tạo bào tử……… …….40

2.8.6Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều nhất……… ….41

2.8.7Sản xuất bào tử dạng pilot……… ….42

2.8.8Phân tích thống kê dữ liệu……… ….44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… ….45

3.1 Khảo sát các đặc điểm probiotic……… ……… 45

3.1.1 Khả năng chịu axit dạ dày……… ……… 45

3.1.2 Khả năng chịu muối mật……… ………46

3.1.3Khả năng sinh enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase)…… …48

3.1.4Khả năng đối kháng kháng với vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak……….… ……51

3.2 Đặc tính sinh học và phân loại chủng đã tuyển chọn……… ………… 53

3.2.1Đặc tính hình thái của chủng Sub và Yoi……… …… 53

3.2.2Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi……… …… 54

3.3 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Sub……… ……….54

3.3.1Thiết lập đường chuẩn……… … 54

3.3.2Thiết lập đường cong tăng trưởng……… ……….56

3.4 Thiết lập đường cong tăng trưởng chủng Yoi……… ……….56

3.4.1Thiết lập đường chuẩn……… 56

3.4.2Thiết lập đường cong tăng trưởng……… ……….58

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành bào tử của các chủng Sub và Yoi……… … ……58

3.6 Kết quả khảo sát các điều kiện tạo bào tử tốt nhất……… ……… 59

3.7 Sản xuất bào tử quy mô pilot……… …… 61

3.7.1Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot………….……… … ……61

3.7.2Tiến hành tạo bào tử………… ……… … … 62

3.8 Tạo chế phẩm……… …… 64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ……… ……… 65

4.1 Kết luận……… ……… … …….65

4.2 Kiến nghị……….… ………65

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… …66

PHỤ LỤC……….… 74

Phụ lục I: Bảng biểu……… ……….….74

Phụ lục II: Hình ảnh……… ………….….85

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị

trường 17

Bảng 1.2 Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử 23

Bảng 3.1 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn vi khuẩn trong môi trường pH thấp 45

Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót của 11 chủng vi khuẩn trong môi trường muối mật 2% 47

Bảng 3.3 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus 49

Bảng 3.4 Hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus với vi khuẩn kiểm định 51

Bảng 3.5 Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng Sub và Yoi 54

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Sub 55

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát đường chuẩn chủng Yoi 57

Bảng 3.8 Tỷ lệ hình thành bào tử ở các khoảng thời gian khác nhau với quy mô pilot 63

Bảng 5.1 Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường pH thấp 74

Bảng 5.2 Số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào vi khuẩn sống sót trong môi trường muối mật 2% 75

Bảng 5.3 Số liệu đường chuẩn của chủng Sub 76

Bảng 5.4 Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Sub 77

Bảng 5.5 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Sub 78

Bảng 5.6 Số liệu đường chuẩn chủng Yoi 79

Bảng 5.7 Kết quả phân tích sự tuyến tính giữa giá trị OD và log N của chủng Yoi 80

Bảng 5.8 Số liệu đường cong tăng trưởng chủng Yoi 81

Bảng 5.9 Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào

và bào tử của các chủng Sub 82 Bảng 5.10 Số liệu khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành tế bào

và bào tử của các chủng Yoi 82 Bảng 5.11 Tỷ lệ hình thành bào tử qua 7 môi trường của 2 chủng Sub và Yoi .83 Bảng 5.12 Mật độ bào tử của các phương pháp tạo bào tử tốt ở các khoảng thời gian khảo sát khác nhau 83 Bảng 5.13 Tỷ lệ hình thành bào tử theo thời gian của các phương pháp khác nhau 84 Bảng 5.14 Kết quả khảo sát thời gian thích hợp để đạt sinh khối cao nhất với quy mô pilot 85 Bảng 5.15 Kết quả khảo sát mật độ bào tử theo thời gian với quy mô piot .86

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật…… … 9

Hình 1.2 Các cấu trúc chính của bào tử B Subtilis 23

Hình 1.3 Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus 24

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30

Hình 3.1 Vòng phân giải gelatin (protease), tinh bột (amylase), cellulose (cellulase) của các chủng Bacillus…… ……… 50

Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định của các chủng Bacillu… 52

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Sub 53

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và bào tử của chủng Yoi 53

Hình 3.5 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Sub 55

Hình 3.6 Đường cong tăng trưởng chủng Sub theo thời gian 56

Hình 3.7 Đường tương quan giữa giá trị OD và Log N chủng Yoi 57

Hình 3.8 Đường cong tăng trưởng chủng Yoi theo thời gian… 58

Hình 3.9 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của chủng Sub và Yoi……… ………59

Hình 3.10 Tỷ lệ hình thành bào tử bằng các phương pháp khác nhau theo thời gian của chủng Bacillus subtilis ……… 60

Hình 3.11 Mật độ tế bào với quy mô pilot của chủng Bacillus subtilis 61

Hình 5.1 Máy ly tâm Avanti JXN Series 87

Hình 5.2 Chế phẩm thử nghiệm bào tử Bacillus subtilis… 87

Hình 5.3 Hệ thống lên men 5 L……… 88

1

LỜI MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Khí hậu Việt Nam nóng ẩm theo mùa, thời tiết thay đổi thường xuyên, nhiệt độ không ổn định là môi trường lí tưởng để vi khuẩn gây bệnh bùng phát ở các chuồng trại chăn nuôi Ngành chăn nuôi gặp rất nhiều vấn đề về bệnh tật xuất phát từ đường ruột

và hệ tiêu hóa Theo thống kê hằng năm, tỷ lệ gia súc và gia cầm chết do mắc bệnh đường ruột lớn nhất so với nguyên nhân gây bênh khác Không chỉ vậy, trong chăn nuôi còn tồn tại các vấn đề khác như lạm dụng kháng sinh và chất tăng trọng gây tác hại đối với người sử dụng, lãng phí thức ăn do vật nuôi không hấp thụ hết thức ăn, dinh dưỡng Vì vậy, để giải quyết được những vấn đề trên đồng thời có thể nâng cao năng suất hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân, Probiotic là một giải pháp hiệu quả nhất hiện nay Các tác dụng cơ bản của probiotic là tăng cường khả năng miễn dịch, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng của vi khuẩn

có hại trong hệ tiêu hóa

Một lượng lớn các sản phẩm probiotic được sản xuất hay nhập khẩu, phân phối

và sử dụng trong chăn nuôi Các chế phẩm này chủ yếu chứa các vi khuẩn sống thuộc

các giống Bacillus, Lactobacillus, Enteroccocus, nấm men Số lượng và chủng loại chế

phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam hiện nay rất đa dạng Tuy nhiên, không phải chế phẩm nào cũng đạt chuẩn và phù hợp với môi trường, khí hậu, điều kiện chăn nuôi Việt Nam Một chế phẩm probiotic đạt hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp tiên tiến nhưng có thể hoàn toàn không hiệu quả ở một quốc gia nông nghiệp đang phát triển như Việt Nam Nguyên nhân lớn nhất xuất phát từ hệ sinh thái

vi sinh từng nơi

Hiện nay, trong công nghiệp chế biến thức ăn dạng viên thì nguyên liệu thức ăn

sẽ được xử lý ở nhiệt độ từ 70 - 80oC, có khi lên đến 90oC nhằm kiểm soát nguy cơ về

nhiễm khuẩn, ví dụ như Salmonella (Jones và cộng sự, 2004; Doyle và cộng sự, 2006)

2

cũng như để hồ hóa tinh bột Quá trình xử lý nhiệt làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật probiotic trong chế phẩm (chứa các tế bào sinh dưỡng) Vì vậy để đảm bảo cung cấp đủ lượng vi sinh vật probiotic trong thức ăn viên thì cần phải chọn ra một chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic và có khả năng chịu được nhiệt độ cao Bào tử vi khuẩn

probiotic thuộc chi Bacillus được xem là một giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng trong thức ăn ép viên cho chăn nuôi gia súc và gia cầm Bào tử Bacillus khá bền nhiệt,

tính kháng axit cao hơn so với tế bào sinh dưỡng Các nghiên cứu gần đây cho thấy bào

tử Bacillus nảy mầm và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật nuôi khoảng 70 - 90% Ở Việt Nam, hiện có rất ít các nghiên cứu về việc sử dụng bào tử của các chủng Bacillus

bổ sung vào thức ăn cho động vật, hoặc là chưa được quan tâm thực hiện hoặc đã thực hiện nhưng không công bố, nếu có cũng rất hạn chế về số lượng các nghiên cứu

Từ hiện trạng nghiên cứu và sản xuất probiotic như trên cho thấy, việc nghiên

cứu sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử Bacillus ở quy mô pilot là một yêu cầu

cấp thiết nhằm tiến tới sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi an toàn và góp phần hạn chế nhập khẩu, chủ động nguồn sản phẩm và làm giảm giá thành sản phẩm Đây là cơ sở cho việc thực hiện khóa luận

“ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic chịu nhiệt sử dụng trong thức ăn cho

chăn nuôi heo, gà quy mô pilot”

Mục đích đề tài

Sản xuất chế phẩm probiotic chứa bào tử vi khuẩn Bacillus với quy mô pilot

Nhiệm vụ của đề tài

 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có đặc tính probiotic tốt

 Khảo sát điều kiện tạo bào tử trong điều kiện lên men lỏng

 Sản xuất bào tử Bacillus dạng pilot (5 lít )

 Tạo chế phẩm Probiotic

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về probiotic

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [53]

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng

minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật

đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908) [53]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [37]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [38] Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu

Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo

bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [37] Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult”

từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên

80 [38]

4

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

1.1.2 Định nghĩa probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống” Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” [26] Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic

đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng

có lợi cho vật chủ

Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” [26]; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”

1.1.3 Các VSV probiotic thường gặp

Chế phẩm probiotic là một tập hợp các chủng VSV có ích Đó là các TB sống của các chủng VSV, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất sinh học có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi, cải thiện MT, đồng thời cũng có tác dụng dương tính đối với sức khỏe con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [12]

Chế phẩm probiotic thường gồm các nhóm VSV sau:

Các nhóm VSV cơ bản:

 Nhóm VK lactic [17]:

Đây là nhóm VK thân thuộc với con người từ ngàn xưa Trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, cà

5

muối, mắm chua, sữa chua…Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và

dị hình, VK lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi chung là bacterioxin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin,…Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi

Các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng VK lactic sau: L

acidophilus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L kefir, L delbruckii, L sporogenes, Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S faecalis…[24]

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng 1 chủng VSV như chế phẩm Antibio của

Hàn Quốc (100% là L acidophilus) hay Biosubtyl của Đà Lạt (100% là bào tử B

subtilis) hoặc kết hợp nhiều chủng VSV như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học

Nông nghiệp Hà Nội (ngoài VK lactic còn có VK Bacillus, VK quang dưỡng khử H2S

và nấm men ) [17]

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các VK lactic có một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ Nhờ khả năng sản sinh ra axit lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme…nên có tác dụng ức chế VSV đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ…

 Nhóm VK Bacillus

Các VK Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện nhưng

trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người

và động vật Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như

protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào khá mạnh như: amylase, cellulase, protease [17]

6

Ngoài các enzyme trên, các VK này còn có khả năng sinh bacterioxin-chất có hoạt tính kháng sinh có khả năng ức chế một số VSV gây bệnh đường ruột đặc biệt là E coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi

Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống

Bacillus sau: B subtilis, B mesentericus, B megathericum, B licheniformis, B clausii,…[8, 17] Các chủng này rất có ích, không gây bệnh cho người và vật nuôi

 Nấm men Saccharomyces:

Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang…Trong thành phần của TB nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm probiotic để làm giàu sinh khối TB [17] Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản [14, 20] Ngoài ra, TB nấm men có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm, giúp cải thiện mùi cho MT và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi

Để sản xuất probiotic, người ta thường dùng các chủng sau: S cerevisiae, S

carlsbergensis, S vini hoặc S pombe [13], đặc biệt là S boulardii S boulardii có tác

động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy do kháng sinh

và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H pylori [10]

 Nấm mốc:

Điển hình là Asp oryzae, Asp niger Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai

trò sản sinh các enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn của con người và vật nuôi, đồng thời cũng có thể được bổ sung vào chế phẩm để hỗ trợ quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ do thức ăn thừa hay phân do vật nuôi bài tiết ra [17]

Ngoài ra, còn một số nhóm VSV khác cũng được bổ sung vào chế phẩm probiotic giúp cải thiện MT nước nuôi trồng thủy sản, tăng khả năng làm sạch ao hồ,

7

giảm hoặc mất mùi hôi thối do H2S… như: VK nitrat (Nitrobacter và Nitrosomonas),

VK quang dưỡng khử H2S, VK tía có lưu huỳnh và VK tía không chứa lưu huỳnh

(Rhodobacter sp., Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas

palustris…) [17]

1.1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật probiotic với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa vật chủ Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

- Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày:

Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chịu được áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5 Do đó, các chủng được sử dụng làm probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic [10]

- Khả năng chịu muối mật:

Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi

sự xâm nhập của các VSV gây bệnh Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật

Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic [10, 21, 23] Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1 – 3 % [50] Để tồn tại

8

và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%

- Khả năng sinh enzyme ngoại bào:

Một số chủng probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh

enzym tiêu hoá như: amylase, cenlulase và protease, lipase và phytase có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ

- Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh:

Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế

vi khuẩn gây bệnh như E coli, Salmonella và Staphylococcus aureus Hoạt tính kháng

khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic

+ Tạo ra H2O2

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt

+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh

- Khả năng sinh enzyme ngoại bào:

1.1.5 Cơ chế tác động của Probiotic

Đã có nhiều nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic, song vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau Sau đây là tóm tắt những kiểu tác động của probiotic được nhiều nhà khoa học chấp nhận [9, 24, 26]

Cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau [9, 27]

9

Hình 1.1 Cơ chế tác động chung của probiotic đối với động vật

- Probiotic giúp duy trì hệ VSV có lợi trong đường ruột bằng hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh [28]

Đối kháng là hiện tượng một loài VSV bằng cách này hay cách khác ức chế hoặc tiêu diệt sự ST và phát triển của một loài VSV khác Một số nhà khoa học cho

Cải thiện sức khỏe và năng suất

Tăng độ hữu dụng của chất dinh dưỡng

Phân giải các chất dinh dưỡng như protein,…

Vi sinh vật có lợi đường ruột

Giảm thiểu sự sản sinh

Kích thích miễn

dịch

Trung hòa các độc tố đường ruột

10

rằng, cơ chế tác động đối kháng xảy ra khi nguồn thức ăn cạn kiệt do sự phát triển nhanh chóng của một vài loại VSV và tạo điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VSV khác

Hoạt động đối kháng với VSV gây bệnh bao gồm:

 Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra Khi VSV gây bệnh bị cạnh tranh, thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được Từ đó có thể ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột Phương pháp sử dụng probiotic để loại trừ các VK có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh [24]

 Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với VSV gây bệnh, VSV probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những chất này được sinh ra trong quá trình sống của VSV, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột [17, 20]

- Gia tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn, tiết các enzyme tiêu hóa như amylase, cellulase, lipase, protease…giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp thành chất đơn giản dễ hấp thụ

- Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với MT [17]

- Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách TB vi khuẩn (peptidoglycan) Sự phân hủy peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại thực bào (Tannock, 1997) Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống

1.1.6 Vai trò của probiotic đối với vật nuôi [17]

Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy sản Cụ thể như sau:

- Probiotic giúp phát triển hệ VSV đường ruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn Đối với gia súc dạ cỏ, probiotic còn giúp hệ VSV dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn

- Ức chế và có thể tiêu diệt được các VSV có hại Làm tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh

thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở heo con do E coli

Nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002) về tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm EM1 (do Nhật Bản sản xuất) cho thấy: chế phẩm này có tác dụng ức chế

E coli, Salmonella, Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium perfringens, Sarcina lutea Sau khi dùng chế phẩm EM1 trộn với thức ăn

cho heo (khoảng 109 cfu /kg thức ăn), kết quả kiểm tra số lượng E coli trong 1g phân

heo đã giảm 7% ở heo từ 1 - 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở heo từ 22 - 60 ngày tuổi [24]

- Làm cho gia súc, gia cầm cái mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt và tăng năng suất chăn nuôi [17]

Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt với kết quả như sau: Đối với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal

12

và ctv, 1995) Khi bổ sung hỗn hợp L acidophilus và L casei (khoảng 106 cfu /kg thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng trắng (Tortuero và Fernandez, 1995) Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức ăn thấp hơn đối chứng Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung

hỗn hợp L acidophilus và S faecium (2 x 109 cfu /kg thức ăn) cho gà thịt [9]

- Góp phần cải thiện chất lượng nước, chống ô nhiễm MT nước, tăng cường khả năng phân hủy các chất hữu cơ, giảm nồng độ N và P, kích thích sinh trưởng của tảo, giảm nguy cơ mắc bệnh và tăng năng suất tôm, cá,…[3, 27, 28] Chẳng hạn như sử

dụng chế phẩm chứa B subtilis, B licheniformis, B polymixa, B circulans, B

laterosporus đã làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng của ấu

trùng cá tầm Acipenser nudiventris [59]

- Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi

sẽ làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối gây ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi Có thể dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật nuôi như chó, lợn…sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại [17]

Tóm lại, probiotic đã trở thành sản phẩm hữu hiệu, là bạn đồng hành của người chăn nuôi, giúp người chăn nuôi tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi [1, 8]

phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng Cácloài được

nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis.[41]

13

Các ưu điểm của probiotic từ bào tử:

- Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ởđiều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống

- Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH axit của dịch vị dạdày

[30,54], trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt [58] Một

liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thờihạn không cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vàoruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng

- Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn,

các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B clausii, B subtilis, B cereus, B.

licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau

1.1.8 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic từ các chủng Bacilllus trong

chăn nuôi gia súc và gia cầm trên thế giới và Việt Nam

Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú,

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học… Đặc biệt là trong chăn nuôi, con

người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế phẩm

probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm…

1.1.8.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế

giới

Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura

từ B subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Asp

Flavus, Asp Paraciticus Nghiên cứu này được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ

sản xuất thức ăn chăn nuôi

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc dạng lỏng chứa B subtilis chủng IP

5832, đến năm 1955 có thêm dạng bột và viên nang mềm Năm 1962, Guy Albot còn

14

phát hiện B subtilis có tác dụng tốt trong điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn tính Còn khi trộn thêm với VK lactic, B subtilis chữa chứng loạn

khuẩn rất hiệu quả ở người và vật nuôi

Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (Effective

Microorganisms) trong đó có Bacillus, do GS.TS TeRuo Higa, Trường Đại học

Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản nghiên cứu năm 1980 Chế phẩm này được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo vệ môi trường và đã mang lại hiệu quả khả quan Cho đến nay, đây là chế phẩm được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam

Năm 1999, Kyriakis và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic LSP

122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy trên heo con giai đoạn 28 ngày tuổi Thí

nghiệm này được tiến hành trên 4 lô: Lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng B toyoi

với liều 106 cfu/kg thức ăn, lô 3 và 4 sử dụng B licheniformis với liều 106

và 107 cfu/kg thức ăn Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (2, 3 và 4) đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng Ngoài ra, sự tăng trọng và tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng Trong đó, lô sử dụng 107

cfu B

licheniformis/kg thức ăn cho kết quả tốt nhất

Năm 2001, Lema và cộng sự đã dùng probiotic trộn với thức ăn cho cừu ăn liên tục trong 7 ngày với liều 6 x 106 cfu/kg thức ăn để khảo sát sự bài thải của E.coli O157:H7 Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự bài thải E coli trong phân thấp hơn so với

đối chứng không sử dụng probiotic trộn với thức ăn

1.1.8.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt

Nam

Năm 1962, yaourt và canh trùng subtilis được Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng dùng để phòng và trị bệnh phân trắng ở heo con, bước đầu cho kết quả khả quan [5]

15

Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản

xuất chế phẩm B subtilis dạng viên, nuôi cấy trên MT đậu tương, cua đồng,…hấp thu

bằng tinh bột tan Chế phẩm này dùng cho heo uống với liều 0,5 - 1g/kg thể trọng Kết quả sau khi sử dụng chế phẩm, heo tăng trọng nhanh

Năm 1979-1984, Phan Thanh Phượng và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Biolactyl để phòng và trị bệnh đường ruột ở heo

Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm

Coli-subtyl (E.coli và B subtilis) đã làm giảm tỷ lệ tái phát tiêu chảy ở heo so với phương

pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt

Năm 1996, Lê Thị Tài sử dụng Biseptol và Biosubtyl kết hợp với Cloramphenicol trong điều trị loạn khuẩn đường ruột ở heo con và chó con Kết quả ghi nhận được như sau: trên heo con sau cai sữa, tỷ lệ khỏi bệnh khi dùng Biseptol là 80%, Cloramphenicol là 70%, Biosubtyl là 68%, Biseptol + Biosubtyl là 98% và Biosubtyl + Cloramphenicol là 95 %; còn trên chó con, sử dụng Biseptol cho tỷ lệ khỏi bệnh là 80%, Biseptol + Biosubtyl là 95% và Cloramphenicol là 80%

Năm 1998, Lã Văn Kính đã thử nghiệm probiotic trên gà đẻ cho kết quả sản lượng tăng 5% so với đối chứng không sử dụng probiotic

Năm 1999, Lưu Thị Uyên sử dụng chế phẩm EM (Effective Microorganisms) của Nhật Bản trong phòng ngừa và điều trị hội chứng tiêu chảy ở heo, cho thấy số

lượng E.coli trong 1g phân giảm từ 31,1 đến 80,95 triệu vi khuẩn

Năm 2001, Lê Thị Phượng ghi nhận hiệu quả phòng ngừa tiêu chảy ở heo con

của các chế phẩm sinh học Paciflor (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 cfu/g)

và Pacicoli (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP*, 109 cfu/g + các kháng sinh: Colistin 4mg + Lincomycin 3mg) Chế phẩm Paciflor bổ sung trong thức ăn heo nái

mang thai giai đoạn cuối và liên tục 28 ngày sau khi sinh đã làm giảm số lượng E coli

trong phân heo nái và heo con, giảm tỷ lệ tiêu chảy của heo con theo mẹ; heo con ăn

16

thức ăn có bổ sung Paciflor hoặc Pacicoli thì số lượng E coli trong phân giảm, giảm tỷ

lệ tiêu chảy và cải thiện tăng trọng heo

Cũng trong năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong chăn nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20 - 34%, tỷ lệ thịt xẻ tăng 1,3%, tỷ lệ nạc tăng 4,5%

Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với liều 0,8, 1,0 và 1,2 tỷ cfu /kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa

Cũng trong năm 2002 này, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng chế

phẩm VITOM 1.1 và VITOM 3 (do Nga sản xuất, chứa B subtilis chủng

VKPMV-7092-) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa trên heo và gà Qua đó nhận thấy khi dùng VITOM 3 tăng trọng trên heo tăng 6%, tỷ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 100% và không có tái phát, còn khi dùng VITOM 1.1 tăng trọng trên gà tăng 11,8%, tỷ lệ khỏi bệnh đạt 99%

Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng

probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E coli trên heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E coli thải qua phân, giảm tỷ lệ tiêu chảy,

cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn

Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi Kết quả đã tìm

ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỷ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men

BioGuard Việt Nam 107

E.lac Hàn Quốc 2 x 107 4 x 107BioSix Việt Nam 105 105

Lactacids Việt Nam 107

Adepro Việt Nam 107

Lactizym Việt Nam 6 x 105

Ferment Trung Quốc 109

Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 108 4,6 x 106

Tóm lại, các công trình nghiên cứu được tóm lược ở trên đã sử dụng các chế phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm Mỗi công trình nghiên cứu về những khía cạnh khác nhau nhưng điều kết luận là probiotic có ảnh hưởng tốt cho vật nuôi như ức chế VSV gây bệnh, phòng ngừa và điều trị tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và hệ số tiêu tốn thức ăn,…

1.1.8.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng probiotic dạng bào tử Bacillus

Hồ Thị Việt Thu (2012) đã nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh của bào tử Bacillus

subtilis biểu hiện Interferon alpha gà (B subtilis - ChIFN), một sản phẩm của bộ môn

Vi sinh Ký sinh – Khoa Dược, Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, trong phòng bệnh Newcastle cho gà được thực hiện trên gà giống Tam Hoàng 3 tuần tuổi Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả thử nghiệm cho gà uống với liều 0,5 x 1010 bào tử B

subtilis - ChIFN, sau đó công cường độc virus Newcastle độc lực cao với liều 104

ELD50 cho mỗi gà thí nghiệm, đồng thời so sánh hiệu quả của ChIFN chuẩn với liều

104 IU Kết quả thí nghiệm cho thấy bào tử B.subtilis - ChIFN có khả năng phòng

18

bệnh Newcastle với tỷ lệ bảo hộ là 79,17% cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ bởi ChIFN

chuẩn (45,83%) và so với lô đối chứng Bacillus subtilis (12,50%)

Phạm Kim Đăng và cộng sự (2016) nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm

probiotics NeoAvi GroMax chứa Bacillus dạng bào tử (trộn thức ăn với tỷ lệ 0,3%) đến

khả năng sản xuất gà thịt, giống Ri Ninh Hoà và gà được bổ sung kháng sinh BMD (Bacitracin Methylene-Disalicylate) 10% (0,4g/kg thức ăn) Kết quả cho thấy rằng số

lượng vikhuẩn E coli và Salmonella sp.trong hồi tràng và trong phân giảm xuống; số lượng Lactobacillus sp trong hồi tràng tăng lên, đồng thời chiều cao và chiều dày lông

nhung biểu mô tá tràng và không tràng tăng lên Điều này chứng minh tác dụng của probiotics dạng bào tử chịu nhiệt đến năng suất gà thịt thông qua tác dụng cải thiện hệ

vi sinh vật đường ruột và sức khỏe biểu mô ruột

Hầu hết các sản phẩm probiotic dạng bào tử Bacillus hiện đang bán tại Việt

Nam đều được nhập khẩu từ nước ngoài hay sản xuất tại Việt Nam nhưng nguyên liệu thô được nhập từ nước ngoài (ví dụ như NeoPig Topgold và PigMax chứa bào tử

Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans và Bacillus indicus với các

nồng độ khác nhau dùng cho heo hay Neoavi Supamax dùng cho gà của Biospring,

Anh Quốc) Một sản phẩm nữa chứa bào tử Bacillus đang được phân phối tại Việt Nam

là BioPlus®YC của công ty Evonik, sử dụng cho tất cả các loại vật nuôi

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus

1.2.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus

- Đặc điểm phân loại: Theo Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,

Bacillus thuộc: [46]

Giới: Bacteria

Nghành:Firmicutes

Lớp: Bacilli

19

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae

Chi: Bacillus, Geobacillus

Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio

subtilis” Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B subtilis (Gordon, 1981) Đó là thành viên

của một chi lớn và đa dạng được Cohn nghiên cứu đầu tiên, là một phần của họ

Bacillaceae Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus,

Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của họ này là hình thành nội bào tử [33, 39]

- Đặc điểm hình thái:

Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -7 µm Các tế bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông Là VK Gram dương, hầu hết có catalase dương tính Chúng thường di động nhờ roi

Họ Bacillaceae được Fischer trình bày có hệ thống năm 1895 thì nội bào tử được dùng trong khóa phân loại vi khuẩn Đặc điểm của chi Bacillus là tất cả có nội

bào tử, hiếu khí, có thể bắt buộc hay tùy ý, hình que và tạo catalase Một tế bào chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ Bào tử

có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp

xúc không khí Các loài thuộc chi Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà

vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút [17] Tùy theo loài, bào tử có thể nằm giữa, gần cuối, hoặc ở cuối [13, 34]

Tuy nhiên, cũng có một số loài thuộc chi Bacillus không tạo bào tử như B

thermoamylovorans, B halodenitrificans [46]

- Đặc điểm phân bố:

Nhờ khả năng sinh bào tử nên Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau Chúng rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ

20

nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, không khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn chủ yếu là đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N [28, 33]

- Dinh dưỡng và tăng trưởng:

Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus là những sinh vật hóa dị dưỡng, thu năng

lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino axit, axit hữu cơ, Một

số VK tự dưỡng không bắt buộc (B schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường

chỉ có CO2 Một số loài Bacillus (B subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác như B sphaericus, B cereus cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng như B

thuringiensis, B popllae, B lentimorbus, B cereus, B anthracis (trong đó B cereus,

B anthracis gây bệnh trên người) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát

triển được trong môi trường VK thông thường như NA, NB [28, 29, 33]

Phần lớn các loài thuộc chi Bacillus là VK hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, nhiệt

độ sinh trưởng tối ưu từ 30 – 45o

C, một số VK chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trưởng tối

ưu lên tới 65oC, hoặc ưa lạnh (5oC – 25oC) Các loài VK thuộc chi Bacillus sinh trưởng

trong khoảng pH rộng từ 2 – 11 Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng

tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài [23, 28]

- Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên:

B subtilis có khuẩn lạc khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn

hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào

MT thạch Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 36 - 50oC, tối đa là 60oC Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao,

có hình bầu dục, phân bố lệch tâm Nhờ khả năng sinh một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease,…) và sinh tổng hợp được nhiều loại KS như subtilin,

21

subtilosin A, sublancin,…mà B subtilis được ứng dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi, y

học, thực phẩm,…[17]

B amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự B subtilis

Nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước Do có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease [73], lipase [48], phytase, xenlulase

và xylanase [36] nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công

nghiệp thuộc da [31, 39] Ngoài ra, B amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các

lĩnh vực khác như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [42, 43], chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [39, 42,

43, 56] Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ Bacillus

amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng cường các

phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm, cá,…[46]

B licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán chủ yếu trong

đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt buộc

B pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B subtilis

Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới Tế bào của nó gần giống tế bào B

subtilis

B megaterium có khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép

tròn hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, trông giống như giọt bạch lạp (nến trắng), thường có vòng hoặc các vòng đồng tâm trên mặt Tế bào dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp

thành chuỗi Bào tử hình elip, nằm lệch tâm B megaterium được sử dụng trong sản

xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin amidase Bên cạnh đó, chúng còn có

22

thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học, sản sinh vitamin B12, oxetanocin, cytochromes P450 và một số axit amin khác

B polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung quanh,

mép đôi khi có thùy Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn Bào tử hình bầu dục kéo dài Loại vi khuẩ này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm Đây là một vi khuẩn rất phổ biến trong đất

B cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục Tế bào đứng

riêng rẽ hay xếp thành chuỗi Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, tế bào chất có chứa các hạt và không bào nhỏ Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm

1.2.2 Bào tử Bacillus

1.2.2.1 Cấu tạo bào tử vi khuẩn Bacillus

Quan sát bào tử khi không nhuộm, thấy có lớp màu đen ở mép rất sáng và chiết quang, cấu trúc bào tử bao gồm

- Vỏ bào tử (spore coat): bao quanh lớp màng ngoài, gồm những protein di động, phức tạp, gồm ba lớp khác nhau Có chức năng bảo vệ lớp peptidoglycan của bào tử khỏi bị các tác nhân bên ngoài tấn công như enzyme, UV, chất oxy hóa,

- Cortex: lớp peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong Cortex là thành phần quan trọng giúp bào tử không bị khử nước, do đó tạo sự bền vững và dạng sống tiềm sinh Lớp cortex tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, lớp này sẽ nhanh chóng

bị thủy giải do enzyme có sẵn trong bào tử

- Lõi tế bào (core): đây là thành phần quan trọng nhất của bào tử, bao gồm đầy đủ các thành phần gần giống như tế bào sinh dưỡng như protein bào tương, ribosom, thể nhân chứa DNA Tuy nhiên, thành phần bào tưởng của bào tử chứa khoảng 30 – 50% nước, trong khi tế bào sinh dưỡng là 70 – 88% nước

23

Hình 1.2 Các cấu trúc chính của bào tử Bacillus [57]

Bảng 1.2 Các đặc điểm khác nhau của tế bào sinh dưỡng và bào tử [2] Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử

Cấu trúc Tế bào Gram dương, điển

hình

Vỏ bào tử dày, khó thấm

nước Thành phần hóa học

Protein Thấp hơn Cao hơn

Hoạt tính enzyme Cao Thấp

Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao

24

1.2.2.2 Quá trình hình thành và nảy mầm của bào tử vi khuẩn Bacillus

Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử

Quá trình bào tử hóa bắt đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức ăn cạn kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại

Bào tử vi khuẩn Bacillus có khả năng chịu nhiệt, chịu chất độc và enzyme phân giải Trong thời kỳ mới bắt đầu hình thành nội bào tử, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất

kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh

Ở các loài thuộc chi Bacillus được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử

tương tự nhau Toàn bộ quá trình diễn ra trong khoảng từ 8 – 10 giờ, bắt đầu bằng việc phân chia DNA, tách một nhiễm sắc thể bao quanh bởi màng sinh chất tạo thể nguyên sinh là dạng bào tử sơ khởi, và kết thúc bằng việc hình thành vỏ bào tử, rút hết nước tạo thành bào tử trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào mẹ

Sự nảy mầm bào tử là quá trình chuyển bào tử từ trạng thái ngủ sang trạng thái sinh dưỡng của vi khuẩn Quá trình này gồm 3 giao đoạn: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng Có thể hoạt hóa bào tử bằng cách nâng nhiệt độ trong thời gian ngắn, hạ thấp

pH, xử lý hóa chất Ví dụ bào tử B subtilis có thể được hoạt hóa bằng cách đun 65oC trong 5 phút

Hình 1.3 Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacilllus [44]

25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng công nghệ sinh học, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ

Thời gian thực hiện : 4/2017 – 7/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Chủng vi sinh vật:

11 chủng Bacillus do phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn dinh dưỡng và thức ăn chăn nuôi thuộc Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ cung cấp

3 chủng vi sinh vật gây bệnh: Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella

typhimurium (ATCC 14028), Streptococcus aureus (ATCC 65338)

26

2.2.2.3 Thiết bị

Các loại máy móc: tủ ấm, nồi hấp vô trùng, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ sấy, máy đo OD, kính hiển vi quang học, cân phân tích điện tử, tủ lạnh, máy đo pH, tủ giữ giống, bồn lên men 5l Biostat, máy ly tâm Avanti JXN Series

2.3 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường 1: (Môi trường LB) (MT1) (g/l)

30

2.4 Các phương pháp nghiên cứu (theo sơ đồ bố trí TN tổng quát)

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

11 Chủng Bacillus

Sàng lọc chủng

Bacillus có đặc tính

probiotic tốt

Khảo sát khả năng chịu axit dạ dày

Khảo sát khả năng chịu muối mật

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

Khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn

kiểm định

Chủng Bacillus

được chọn

Dựng đường cong tăng trưởng

Khảo sát các môi trường tạo bào tử

Khảo sát các phương pháp tạo bào tử nhiều

nhất

Sản xuất bào tử

quy mô pilot

Tạo chế phẩm