Phân lập định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay

Tuy nhiên ở Việt Nam các cơ sở sản xuất chao hiện nay chủ yếu sử dụng mốc chao tự nhiên, thời gian bảo quản và chất lượng sản phẩm khó kiểm soát và không ổn định, làm khả năng nhiễm vi s

MSSV: 1311100548

là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh, HVCH.Ngô Đức Duy Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các nguồn tài liệu trong báo cáo và tài liệu tham khảo

Mọi sao chép không hợp lệ, không trung thực và vi phạm quy chế nhà trường, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trước ban giám hiệu trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Như

Trương Bích Như

đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến:

Các thầy cô bộ môn trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường cùng các thầy cô trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, đã trực tiếp giảng dạy

và truyền đạt kiến thức cho em khi còn học ở trường, giúp em có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

Thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, một người thầy luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm

và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt quá trình nghiên cứu

Các bạn lớp 13DSH06, trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã sát cánh bên

em trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học

Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội

Trương Bích Như

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 1

3 Mục đích nghiên cứu 3

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Các kết quả đạt được của đề tài 3

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cây đậu nành 5

1.1.1 Nguồn gốc 5

1.1.2 Gía trị kinh tế của cây đậu nành 6

1.1.3 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8] 8

1.2 Tổng quan về đậu phụ 11

1.3 Tổng quan về chao [8] 11

1.4 Nấm mốc thường gặp trong chao 12

1.5 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 13

1.5.1 Các phương pháp ly trích DNA 13

1.5.2 PCR trong định danh vi sinh vật 14

1.5.3 Xây dựng cây phát sinh loài 16

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Thời gian và địa điểm 18

2.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất 18

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 18

2.2.2 Nguồn mẫu 18

2.2.3 Hóa chất 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phân lập chủng nấm 20

2.3.2 Phương pháp phòng ẩm 21

2.3.3 Định danh bằng sinh học phân tử 21

2.3.4 Khảo sát khả năng sinh enzym protease 26

2.3.5 Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28

3.1 Kết quả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử 28

3.2 Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS 35

3.2.1 Kết quả ly trích thu nhận bộ gen DNA 36

3.2.2 Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS của nấm mốc 36

3.3 Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng CM1, CDN và CSG và thiết lập cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI 37

3.3.1 Trình tự vùng gen ITS của các chủng CM1, CDN VÀ CSG 37

3.3.2 Thiết lập cây phát sinh loài 38

3.3.3 Kết quả khảo sát protease 40

3.3.4 Kết quả khảo sát lipase 41

3.3.5 Khả năng lên men chao của 3 chủng nấm CM1,CDN và CSG 42

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường 1

PHỤ LỤC B: Kết quả cấy phân lập nấm ban đầu 2

PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gen bảo tồn ITS 3

PHỤ LỤC D: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI 6

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid

TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành 8

Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành 9

Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành 9

Bảng 1.4 Thành phần khoáng trong đậu nành 10

Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành 10

Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao 11

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu chao được thu tại TP.HCM, Long An và Đồng Nai 18

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 25

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng gen ITS 16

Hình 3.1 Khuẩn lạc, tế bào của chủng CTP trên môi trường PDA trong 72 giờ 28

Hình 3.2 Chủng CM2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 29

Hình 3.3 Chủng CVP2 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng ở 72 giờ 30

Hình 3.4 Chủng CVP1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 31

Hình 3.5 Mẫu CM1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 32

Hình 3.6 Mẫu CDN trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ 33

Hình 3.7 Mẫu CSG trên môi trường PDA ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ 34

Hình 3.8 Kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng CM1,CDN và CSG trên gel agarose 1,5% 36

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng CM1, CDN và CSG trên gel agarose 1,5% 37

Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng CM1, CDN và SGN với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI 40

Hình 3.11 Khả năng sinh caseinase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG 41

Hình 3.12 Kết quả sinh enzyme lipase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG 42

Hình 3.13 Khảo sát khả năng lên mốc chao của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG 42

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay nhu cầu thực phẩm của con người ngày càng tăng cao, không chỉ dừng lại việc ăn ngon mà thực phẩm phải an toàn và có giá trị dinh dưỡng Do vậy tìm

ra các phương pháp sản xuất thực phẩm an toàn và có giá trị dinh dưỡng cao là vấn đề thiết yếu hiện nay

Chao truyền thống có vai trò khá quan trọng trong đời sống tâm linh của người dân Việt Nam Sản phẩm chao hiện nay sản xuất theo lối thủ công và chất lượng của sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khách quan và chủ quan trong quá trình sản xuất trong đó đáng kể nhất là chủng nấm mốc

Chao là sản phẩm được dùng phổ biến như gia vị trong bữa ăn Chao bổ sung thêm phần protein và các acid amine quan trọng, cung cấp đáng kể nguồn năng lượng, khoáng và vitamin,…trong bữa ăn của người dân Châu Á nói chung và người dân Việt Nam nói riêng Tuy nhiên ở Việt Nam các cơ sở sản xuất chao hiện nay chủ yếu sử dụng mốc chao tự nhiên, thời gian bảo quản và chất lượng sản phẩm khó kiểm soát và không ổn định, làm khả năng nhiễm vi sinh vật và nguy cơ hư hỏng cao làm thay đổi giá trị dinh dưỡng và hương vị sản phẩm, thậm chí nhiễm cả nấm mốc gây độc như

Aspergillus Flavus và Aspergillus Parasiticus sinh ra độc tố aflatoxin có thể gây ung

thư cho người dùng[4]

Để có thể chọn được chủng nấm thích hợp hạn chế được hư hỏng nhanh của chao và tăng hương vị chao Chính vì vậy việc: “ phân lập định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay ” góp phần đưa chao đến gần với người tiêu dùng hơn cũng như nâng cao chất lượng và hương vị sản phẩm

2 Tình hình nghiên cứu

Một số công trình nghiên cứu về các chủng nấm mốc ứng dụng sản xuất chao đã được công bố Năm 1929, Wai là người đầu tiên đã phân lập một loại mốc thuộc dòng

Mucor và đặt tên là Mucor sufu (mốc chao)[17] Năm 2011, Nguyễn Văn Thành và

Trần Nguyễn Ngọc Quỳnh đã nghiên cứu về sản xuất tối ưu bột bào tử nấm

Actinomucor elegans để ứng dụng vào quy trình sản xuất chao Kết quả cho thấy mật

độ bào tử nấm đạt cao nhất (1010 bào tử /g cơ chất khô) với nghiệm thức 17 sử dụng cơ chất tấm cám (2:1), chủng 105 bào tử/ gck thu hoạch sau 7 ngày ủ 300C Sau 5 tháng bảo quản mật độ bào tử duy trì sức sống cao ở nhiệt độ 40C (trong tủ lạnh) Trong khi

đó các nghiệm thức trong phòng hoặc trong bình hút ẩm 250C duy trì sức sống thấp hơn và tương đương nhau [11]

Năm 2012, Lê Minh Nguyệt và Phan Thị Phương Thảo đã tiến hành xác định được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tạo thành bào tử và sinh tổng hợp

enzyme protease của nấm mốc Mucor elegans để xây dựng quy trình sản xuất giống

khởi động từ loại nấm mốc này phục vụ cho sản xuất chao Kết quả cho thấy đã xác định được loại nguyên liệu thích hợp là bột đậu tương, tỷ lệ phối trộn với gạo là 50/50.[10]

Wang và Hesseltine (1975) sản xuất lượng lớn bào tử Rhizopus oligosporus trên

cơ chất tấm gạo và lúa mì kết quả cho thấy đạt sản lượng 109 bào tử/gck dùng sản xuất tempeh, và khi trữ ở 40C thì có thể bảo quản được trong 6 tháng [38]

Thanh và Nout (2004) đã xác định số lượng bào tử tổng số, số bào tử nấm mốc

Rhizopus oligosporus sống bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu

Xác định số lượng bào tử sống, chết và miên trạng bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang mẫu trước và sau xử lý [36]

Thanh và Nout (2002) đã nghiên cứu bảo quản bào tử của Rhizopus oligosporus

khả năng sống của bào tử đã giảm đi nhiều sau 1 tháng bảo quản ở 250C cũng như 50C

và tiếp tục giảm ít đi sau đó [37]

Shambuyi et al (1992) đã nghiên cứu bảo quản bào tử nấm mốc cho kết quả sức sống bào tử vẫn duy trì ở mức cao sau 30 tuần bảo quản ở 50C, 250C và 370C nhưng tốt nhất ở 50C [35]

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập định danh chủng nấm mốc

Chọn lọc chủng nấm ứng dụng sản xuất thay thế lên men tự nhiên tránh sự tránh

sự tạp nhiễm gây hư hỏng chao

Mục đích của đề tài là xác định được chủng nấm trên sản phẩm chao, sau khi xác định được chủng nấm mốc, sẽ dựa vào đặc điểm và những nghiên cứu về nấm mốc trên chao để xây dựng quy trình lên men đạt chất lượng cao nhất

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập và làm thuần chủng nấm từ các mẫu chao

Quan sát hình thái học ( khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử)

Định danh bằng sinh học phân tử

Khảo sát khả năng sinh protease, lipase

Khảo sát khả năng lên men trên đậu hủ

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân lập và làm thuần chủng nấm

Phương pháp phòng ẩm (xem khuẩn ty và bào tử)

Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB) Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1F và ITS4R

Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (Chromaspro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seview4 4.32.0.0)

Phương pháp thử hoạt tính protease, lipase(trên môi trường đĩa thạch)

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Qua kết quả nghiên cứu, đề tài đã đạt được các kết quả như sau:

Kết quả phân lập và làm thuần chủng nấm trên các sản phẩm chao

Kết quả thu nhận được bộ gen DNA

Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR

Kết quả có hoạt tính protease, phân giải protein tạo vòng trong suốt

Kết quả lên mốc tốt

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương:

Chương I: Tổng quan tài liệu giới thiệu chi tiết về cây và hạt đậu nành, thành phần hóa học trong hạt đậu nành, giới thiệu về đậu nành, chao và các chủng nấm mốc thường có trong chao, một số nghiên cứu các chủng nấm mốc ứng dụng sản xuất các sản phẩm chao truyền thống

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (bao gồm các nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài)

Chương III: Kết quả và biện luận đưa ra kết quả các thí nghiệm tiến hành trong đề tài và phân tích các số liệu cụ thể

Chương IV: Kết luận và kiến nghị đưa ra các kết luận thí nghiệm trong đề tài

đã đạt được và những vấn đề cần phải làm tiếp trong thời gian tới

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

đó được chuyển sang Nhật Đến giữa thế kỷ XVII, đậu nành mới được nhà thực vật học người Đức Engelbert Caempfer đưa về châu âu và đến năm 1954 đậu nành mới du nhập vào Mỹ

Một số tài liệu cho rằng đậu nành được đưa vào nước ta từ thời vua Hùng và xác định rằng nhân dân ta trồng cây đậu nành trước cây đậu xanh và đậu đen [5] Mặc dù được trồng từ rất sớm nhưng chỉ trong vài chục năm gần đây cây mới được quan tâm, phát triển và ngày nay nó được xem là giống cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế Nhưng diện tích trồng và sản lượng vẫn còn thấp so với các nước trên thế giới, hiện nay nước ta còn phải nhập khẩu đậu tương

từ Mỹ, Trung Quốc và một số quốc gia khác

Các nước trồng đậu nành đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích gieo trồng và sản lượng là: Mỹ, Braxin và Trung Quốc

Ở nước ta đậu nành được trồng tập trung ở các tỉnh miền núi và trung du: Sơn

Hàm lượng axit quan trọng có chứa lưu huỳnh như methionin và sixtin của đậu tương cao gần bằng hàm lượng các chất này có trong trứng gà Hàm lượng cazein, đặc biệt lisin cao gần gấp rưỡi lần chất này có trong trứng Vì thế mà khi nói về giá trị của protein trong hạt đậu tương là nói đến hàm lượng protein cao và sự cân đối của các loại axit amin cần thiết Protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và không có các thành phần tạo colesteron Ngày nay người ta mới biết thêm hạt đậu tương có chứa lexithin,

có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ, tái tạo các mô, làm cứng xương

và tăng sức đề kháng của cơ thể Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Lipit của đậu tương chứa một tỉ lệ cao các axít béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm (52-65%), oleic từ (25-36%), linolenolic khoảng (2-3%) [1] Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ động mạch Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng vitamin B1 và B2 ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C, Đặc biệt trong hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt là vitamin C Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm

lượng vitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fe .Chính vì thành phần dinh dưỡng cao như vậy nên đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao khoảng 4700 cal/kg [3] Hiện nay, từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại làm thực phẩm được chế biến bằng cả phương pháp cổ truyền, thủ công

và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men như làm giá, đậu phụ, tương, xì dầu đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, bánh kẹo và thịt nhân tạo Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và ruột Đậu tương là thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suy dinh dưỡng

1.1.2.2 Gía trị về mặt công nghiệp

Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật Đặc điểm của dầu đậu tương: khô chậm, chỉ số iốt cao : 120 - 127 ; ngưng tụ ở nhiệt độ -(15 – 18)0C Từ dầu này người ta chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phòng, ni long

1.1.2.3 Gía trị về mặt nông nghiệp

Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi Toàn cây đậu tương (thân, lá, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N(6,2%),

P2O5(0,7%), K2O(2,4%), vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [5]

Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kgN Trong hệ thống luân canh, nếu

bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm (0,05%), trong lá (0,19%) [3]

1.1.3 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8]

Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)

Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ lượng rất lớn Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngoài hai thành phần methionin và tryptophan ra còn có các acid amin khác, có số lượng khá cao tương

đương lượng acid amin có trong thịt

Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành

Trong protein đậu nành glubolin chiếm (85 – 95)% Ngoài ra còn có một lượng

nhỏ anbumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin

Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành Phần hydratcacbon có thể chia làm 2 loại: loại tan trong nước và loại không tan trong nước Loại tan trong nước chỉ chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon

Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành

Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô của hạt đậu nành Trong

đó đáng chú ý nhất là canxi, photpho, mangan, kẽm và sắt

Bảng 1.4 Thành phần khoáng trong đậu nành

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)

Ngoài ra đậu nành còn chứa nhiều vitamin khác nhau

Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)

Đậu nành là một loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipit, gluxit, muối khoáng và vitamin Chính vì thế, đậu nành là một nguồn thực phẩm quan trọng Trong công nghiệp thực phẩm đậu nành được coi là một nguyên liệu quan trọng để sản xuất dầu thực phẩm và các sản phẩm lên men

1.2 Tổng quan về đậu phụ

Đậu phụ là một sản phẩm được sản xuất từ đậu nành Đậu phụ không chỉ được sản xuất ở Việt Nam mà còn được sản xuất nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, các nước Đông Nam Á và cả các nước Châu Âu như Hà Lan, Pháp,…[8]

Đậu phụ là thực phẩm phổ biến ở các nước Đông Nam Á, có hàm lượng protein rất cao [34] Đậu phụ chứa khoảng (6,0 – 8,4) % protein và (79 – 87)% nước, pH trung tính (5,2 – 6,2)

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)

Do quá trình lên men các enzyme của vi sinh vật tham gia thủy phân protein thành các acid amin, lipit thành các este thơm nên chao có giá trị dinh dưỡng cao và có mùi vị rất đặc trưng

1.4 Nấm mốc thường gặp trong chao

Để sản xuất chao thường sử dụng giống khởi động từ giống nấm mốc: Mucor spp, Rhizopus spp, Actinomucor spp

Đây là các giống nấm có màu trắng đục, trắng ngà không làm ảnh hưởng tới màu sắc của sản phẩm, hệ sợi nấm mảnh nhưng dài có khả năng tạo thành một lớp màng mỏng xung quanh miếng chao, có tác dụng giữ hình dáng cho chao được ổn định

[9]

Tuy nhiên, hầu hết các chủng nấm Actinomucor spp chỉ thích hợp với nhiệt độ

môi trường tương đối thấp 18-200C đó chỉ sử dụng được các loài nấm mốc này ở

những khoảng thời gian nhất định trong năm

Rhizopus spp rất nhanh hình thành bào tử, bào tử lại có màu đen đậm do đó ít

nhiều ảnh hưởng tới màu sắc sản phẩm, do đó có ngưỡng nhiệt độ thích hợp rất rộng 20-350C người ta chỉ sử dụng các loài nấm mốc Rhizopus spp vào mùa hè

Giống nấm mốc Mucor spp thường được lựa chọn hơn cả vì nó khắc phục được nhược điểm của cả hai giống trên Các loài nấm mốc Mucor spp thường sử dụng trong

sản xuất chao là Mucor elegans, Mucor sivaticus, Mucor subtilis, trong đó Mucor elegans thường được sử dụng nhất [18]

1.5 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

1.5.1 Các phương pháp ly trích DNA

1.5.1.1 Nguyên tắc

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ) Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase)

1.5.1.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi theo từng môi trường Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là những quần thể vi sinh vật Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá Do đó, việc tách chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết Quá trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng

số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp

Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên thường được sử dụng:

- Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo Phương pháp ly trích sử dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K

- Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic Ly trích DNA cần phải có

cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết

- Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến

650C Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại kết quả khá cao

- Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên

1.5.2 PCR trong định danh vi sinh vật

1.5.2.1 Kỹ thuật PCR

Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen

PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của

khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược

1.5.2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS - rDNA

Gen rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và vùng không mã hóa cho bất kì protein nào Đây là vùng gene bảo tồn nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của vi sinh vật cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường không chính xác và cần khoảng thời gian dài[16]

Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm Bằng cách tách gen, khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA Đặc biệt phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến rDNA Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ

sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) – rDNA là vùng

có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa

của vi sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các biệt hóa trong cùng loài để lập phổ hệ di truyền [18] Cặp mồi được sử dụng trong đề tài này là mồi xuôi ITS1-F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A) [40] Và mồi ngược ITS4-R (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)[40]

Hình 1.1 Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng ITS

Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài không chỉ bao gồm các loài giống nhau mà còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài Cụ thể, người ta đã dựa vào vùng gene ITS

của các loài nấm rễ ngoài Tricholoma matsutake và một số loài có quan hệ Hay mô tả

sự phong phú và đa dạng của nấm trong hỗn hợp mẫu, các nhà nghiên cứu đã dùng kỹ thuật qPCR sử dụng các đoạn mồi ITS, ITS1F và ITS4R[14]

1.5.3 Xây dựng cây phát sinh loài

Các phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S - rDNA và việc xây dựng cây phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh học và tin học (sinh tin học) Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình

tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp

những thông tin có liên quan đến tiến hóa Một cây phát sinh loài gồm các thành phần như sau:

- Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gen bắt nguồn từ tổ tiên chung Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài

- Nút giao điểm của các nhánh

- Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gen được sử dụng phổ biến trong định danh phân loại

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ 21/2/2017 – 14/7/2017 tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất

Các mẫu thu được ký hiệu dưới bảng sau:

Bảng 2.1: Danh sách các mẫu chao được thu tại TP.HCM, Long An và Đồng Nai

Ký

hiệu

191 Quang Trung, phường Hiệp Phú, quận 9, TP.HCM

21/2/2017

CBM Chao Bông Mai Co.opmart Văn Thánh

Tòa nhà Pearl Plaza, 561A Điện Biên Phủ, P.25, quận Bình Thạnh

23/2/2017

CVP Chao Vĩnh Phong Chợ P.25 quận Bình Thạnh 25/2/2017

CNH Chao Ngọc Hạnh Chợ Thủ Đức 27/2/2017 CPBD Chao Phúc Bình Dương Chợ tỉnh Đồng Nai 28/2/2017 CTP Chao Thuận Phát Siêu thị Lotte Mart quận Gò Vấp 28/2/2017

2.2.3 Hóa chất

2.2.3.1 Môi trường

Môi trường phân lập và nuôi cấy

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

Môi trường khảo sát caseinase

Môi trường LB (Luria – Bertani) – bổ sung 1% sữa gầy

Master Mix (2x My taq MixP)

Mồi xuôi ITS1F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG

Mồi ngược ITS4R :TCCTCCGCTTATTGATATGC

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập chủng nấm

Có nhiều phương pháp phân lập nấm trong đó người ta có thể dùng các chất kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và thu nhận nấm, cụ thể trong đề tài này sử dụng chất kháng khuẩn Chloramphenicol

Các bước phân lập

Chuẩn bị dụng và môi trường

Môi trường PDA, đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng, nước cất

Các dụng cụ và môi trường trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất 1210C, 1atm trong 90 phút

Phân lập

Mẫu chao sau khi thu mua về sẽ tiến hành phương pháp pha loãng

Cân 1g chao cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng được nồng độ pha loãng

10-1

Hút 0.1ml dịch pha loãng ở nồng độ trên cho vào đĩa petri chứa môi trường PDA sau đó trang đều bằng que cấy trang, mỗi mẫu trang 2 đĩa petri đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ

Làm thuần và giữ giống

Sau 24 giờ dùng que cấy thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc riêng lẻ có đặc trưng khác với khuẩn lạc còn lại, cấy điểm trên đĩa petri khác, và đem ủ để tạo khuẩn lạc đơn

Lặp lại việc cấy điểm để có được giống thuần

Kiểm tra tính thuần và giữ giống trên môi trường PDA thạch nghiêng trong ngăn mát tủ lạnh

2.3.2 Phương pháp phòng ẩm

Cách tiến hành:

Chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và thanh thủy tinh chữ “u”

bên trên, cùng với nước cất và môi trường PDA đem hấp khử trùng

Dùng pipetman hút môi trường nhỏ vào lame sao cho môi trường trang mỏng để môi trường đông tự nhiên

Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm theo dấu “-“ rồi đậy lamelle lại

Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm đều giấy lọc

Đậy nắp đĩa lại và gói cẩn thận ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày

Quan sát dưới kính hiển vi

2.3.3 Định danh bằng sinh học phân tử

2.3.3.1 Phương pháp tách chiết bộ gen DNA bằng CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium

Bromide) [31]

Các bước thực hiện:

Hút 1ml dịch nuôi cấy nấm trong môi trường PDB sau 2 ngày vào eppendorf 1ml

Sau khi ly tâm thu dịch nổi Hút 600µl dịch nổi vào eppendorf mới

Thêm một thể tích phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) tương đương với thể tích phần dịch lấy ra (600µl)

Đem vortex, ly tâm 14000 rpm/ 5 phút/ 40C

Thu dịch nổi vào eppendorf mới

2.3.3.2 Kiểm tra và thu nhận bộ gene DNA

Điện di ở bước này nhằm mục đích xem sản phẩm ly trích DNA có bị gãy hay không và sản phẩm có tinh sạch không, tiến hành điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose 1,5%

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5%, cân 1,5g agarose vào 100ml TAE1X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nóng trong microwave ở 650W trong 2 phút Để

chai nguội khoảng 600C, đổ nhẹ dung dịch vào khay điện di, khoảng 45 phút thì gel đông lại, gel có màu trắng đục

Bước 2: Tiến hành điện di Trộn dung dịch gồm 4µl DNA sau ly trích và 2µl loading dye 6X Bơm dung dịch này vào giếng trên gel Khởi động nguồn điện, chọn

90 voltage, nhấn nút run.Sau khi DNA chạy được khoảng 30 phút thì ấn nút stop

Bước 3: Nhuộm gel Bảng gel được chuyển vào khay chứa thuốc nhuộm ethidium bromide trong khoảng 15 phút

Bước 4: Quan sát kết quả điện di.Kết quả điện di được quan sát dưới đèn UV Nếu sản phẩm ly trích có DNA thì trên gel điện di sẽ có band DNA phát sáng dưới dạng vạch Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của bảng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA

2.3.3.3 Phản ứng PCR [41]

Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose

tiêu và mồi bị biến tính , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch đơn Sau đó, chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94 - 980C khoảng 20 - 30 giây

Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với mạch khuôn DNA đơn Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được hình thành Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu tổng hợp DNA Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi và thông thường khoảng 50-64oC trong thời gian 20 - 40 giây

Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung đối với DNA mạch khuôn Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động tối ưu của DNA polymerase Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70 - 74oC, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72oC Nối hydrogen giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao Mồi đã lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo dài Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5 - 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn

Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại, điện

di trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những đoạn DNA

có kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR Các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV (bước sóng 312 nm)

Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase… Vì vậy,

cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả

2.3.3.4 Dùng PCR để khuyếch đại đoạn gen ITS

Phương pháp PCR do Karl Mullis và ctv phát minh vào năm 1985, là một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử Đây là kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuyếch đại nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống Hiện nay, PCR đã trở thành một kỹ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm sinh học và y học để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột biến gene, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gene

Sử dụng cặp mồi ITS1-F và ITS4 để khuếch đại trình tự vùng gene ITS

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR

Mater mix (2x Mytaq HSMix) 12 µl

Sản phẩm PCR được điện di 100V, 30 phút trên gel agarose 1,5%, nhuộm bằng ethidium bromide, quan sát và chụp hình dưới đèn UV