Khảo sát khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số lactobacillus spp và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê

Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong thuỷ sản, chế phẩm Sadi Bio 1 là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2 của Viện công nghệ Mô

TRONG B ẢO QUẢN HẠT CÀ PHÊ

Chuyên ngành: CÔNG NGH Ệ SINH HỌC

Sinh viên thực hiê ̣n : Nguyễn Phương Uyên

TP.HCM, tháng 07/2017

L ỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiê ̣p này là công trı̀nh nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Tiến sı̃ Nguyễn Hoài Hương khoa Công nghê ̣ sinh học – Thực phẩm – Môi trường của trường

Đa ̣i Ho ̣c Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới

bất kỳ hı̀nh thức nào

Tp Hồ Chı́ Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiê ̣n

Nguyễn Phương Uyên

L ỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đı̀nh em Cảm ơn bố me ̣ đã nuôi nấng và ta ̣o điều kiê ̣n cho em ho ̣c tâ ̣p để em có được thành quả ngày hôm nay Cảm ơn anh hai đã bên ca ̣nh và động viên em

Trong suốt khoảng thời gian học ta ̣i trường Đa ̣i Học Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh, em đã được các Thầy Cô trong Khoa Công Nghê ̣ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trı̀nh học tâ ̣p ta ̣i trường, cũng như trong qua trı̀nh thực hiê ̣n đồ án Em xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô, nhờ có Thầy

Cô đã trang bi ̣ cho em kiến thức để có thể thực hiê ̣n đồ án này Em cũng xin cảm ơn

Thầy Cô trong phòng thı́ nghiê ̣m và các ba ̣n cùng khóa đồ án đã quan tâm, giúp đỡ và

ta ̣o điều kiê ̣n để em hoàn thành đồ án tốt nghiê ̣p

Đă ̣c biê ̣t, em xin chân thành cảm ơn Tiến sı̃ Nguyễn Hoài Hương đã tâ ̣n tı̀nh hướng

dẫn, chı̉ bảo em trong suốt quá trı̀nh xây dựng đề cương và thực hiê ̣n đồ án

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biê ̣n đã dành thời gian

đo ̣c và nhâ ̣n xét đồ án tốt nghiê ̣p này Em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe Trong quá trı̀nh làm đồ án, do kinh nghiê ̣m còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua

Tp Hồ Chı́ Minh, ngày 27 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiê ̣n

Nguyễn Phương Uyên

M ỤC LỤC

DANH M ỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH v

DANH M ỤC BẢNG vi

M Ở ĐẦU 1

1 T ı́nh cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên c ứu 1

3 M ục đích nghiên cứu 2

4 M ục tiêu nghiên cứu 2

5 N ội dung nghiên cứu 2

6 Phương pháp nghiên cứu 3

6.1 Phương pháp luận 3

6.2 Phương pháp xử lý số liệu 3

7 K ết quả đạt được 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm sợi 4

1.1.1 Gi ới thiệu chung 4

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4

1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố 4

1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin 7

1.1.2.3 Độc tố Patulin 7

1.1.2.4 Độc tố Fumonisin 8

1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố 9

1.1.3.1 Phương pháp vật lý học 9

1.1.3.2 Phương pháp hoá học 10

1.1.3.3 Phương pháp sinh học 11

1.2 T ổng quan về vi khuẩn lactic 14

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 14

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus 14

1.2.1.2 Nhu c ầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 16

1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn 17

1.2.2.1 Bacteriocins 17

1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác 18

1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic 19

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 19

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 21

1.3 T ác ha ̣i của nấm mốc lên ha ̣t cà phê 22

1.5 Ch ế biến và bảo quản ha ̣t cà phê truyền thống 23

1.5.1 C ác phương pháp bảo quản cà phê thóc: 23

1.5.2 C ác phương pháp bảo quản cà phê nhân: 25

1.6 B ảo quản ha ̣t cà phê bằng vi sinh vâ ̣t 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đi ̣a điểm nghiên cứu 27

2.2 Th ời gian thực hiê ̣n 27

2.3 V â ̣t liê ̣u nghiên cứu 27

2.3.1 Vật liê ̣u 27

2.3.2 H óa chất và môi trường sử dụng 27

2.3.2.1 H óa chất 27

2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy 28

2.4 Thi ết bị và dụng cụ 28

2.4.1 Thiết bị 28

2.4.2 Dụng cụ 28

2.5 Phương pháp luận 29

2.5.1 Mục tiêu đồ án 29

2.5.2 Nội dung 29

2.6 Phương pháp nghiên cứu 29

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29

2.6.2 Kh ảo sát đặc điểm hı̀nh thái, sinh hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus

spp 31

2.6.2.1 Nhuộm gram: 31

2.6.2.2 Thử nghiệm Catalase: 32

2.6.2.3 Xác định hàm lượng acid tổng: 32

2.6.3 Kh ảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 33

2.6.4 Xây d ựng đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 34

2.6.5 Kh ảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp v ới chủng nấm Aspergillus sp HCP2 36

2.6.6 Ứng dụng di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp trong đối kháng n ấm mốc Aspergillus sp HCP2 bảo quản hạt cà phê 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40

3.1 Kh ảo sát sinh lý – sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic 40

3.1.1 H ı̀nh thái khuẩn lạc 40

3.1.2 Nhuộm Gram 41

3.1.3 Th ử nghiê ̣m catalase 41

3.1.4 X ác đi ̣nh hàm lượng acid tổng 42

3.2 Khảo sát sự phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 45

3.3 Xây dựng đường chuẩn tế bào của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 46

3.4 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 47

3.6 Ứng du ̣ng di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp trong đối kháng nấm Aspergillus sp HCP2 bảo quản ha ̣t cà phê 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 60

1 K ết luâ ̣n 60

2 Ki ến nghi ̣ 61

T ÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PH Ụ LỤC 1

DANH M ỤC VIẾT TẮT

MRS agar: de Man, Rogosa và Sharpe agar

DANH M ỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố 6

Hı̀nh 3.1 Hı̀nh thái khuẩn la ̣c các chủng Lactobacillus spp 40

trên môi trường MRS Agar 40

Hı̀nh 3.2 Tế bào Bacillus spp bắt màu tı́m, Gram dương (A) 41

Tế bào E coli bắt màu hồng, Gram âm (B) 41

Hı̀nh 3.3 Chủng Lactobacillus sp L3 bắt màu tı́m, Gram dương 41

Hı̀nh 3.4 Chủng vi khuẩn Bacillus spp phản ứng dương tı́nh với catalase, bên trái – Chủng Lactobacillus spp âm tı́nh với catalase, bên phải (A) 42

Đối chứng là nước cất phản ứng âm tı́nh với catalase, bên trái - Chủng Lactobacillus spp âm tı́nh với catalase, bên phải (B) 42

Hı̀nh 3.5 Acid lactic (%) của chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L3 theo thời gian 43

H ı̀nh 3.6 Acid lactic (%) và giá tri ̣ OD ở bước sóng 600nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp 44

Hı̀nh 3.7 Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp HCP2 45

trên môi trường MRS Agar cải tiến 45

Hı̀nh 3.8 Đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp HCP2 47

H ı̀nh 3.9 Khả năng đối kháng trực tiếp bằng phương pháp cấy hai đường của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 49

Hı̀nh 3.10 Khả năng đối kháng của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 khi sử dụng dịch nuôi cấy không xử lý nhiệt 51

H ı̀nh 3.11 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14 (từ trái qua phải) 54

Các nghiê ̣m thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 không gia nhiê ̣t (từ trên xuống dưới) 54

H ı̀nh 3.12 Ngày theo dõi thứ 1, thứ 3, thứ 5, thứ 7, thứ 10, thứ 14(từ trái qua phải) 58

Các nghiê ̣m thức: ĐC (-), ĐC (+), L6, L5, L4, L3, C1, C7 gia nhiê ̣t ở 80oC trong 15 phút (từ trên xuống dưới) 58

H ı̀nh 3.13 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy gia nhiê ̣t và không gia nhiê ̣t các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 theo dõi qua từng ngày 59

DANH M ỤC BẢNG

B ảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 12 Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 18

B ảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB

Bảng 3.2 Số liê ̣u dựng đường chuẩn nấm mốc Aspergillus sp HCP2 46

Bảng 3.3 Tı̉ lê ̣ ức chế chủng nấm mốc Aspergillus sp HCP2 của các chủng

Lactobacillus spp 48

Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp với

chủng nấm Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 102 bt/g hạt cà phê) 50

Bảng 3.5 Khả năng đối kháng của di ̣ch nuôi cấy các chủng Lactobacillus spp gia nhiê ̣t

80oC trong 15 phút với chủng nấm Aspergillus sp HCP2 (nhiễm 102 bt/g) 55

M Ở ĐẦU

1 T ı́nh cấp thiết của đề tài

Vê ̣ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết ki ̣p thời để bảo vê ̣ sức

khỏe con người Ở nước ta, với đă ̣c điểm khı́ hâ ̣u nhiê ̣t đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khı́ thường cao, là điều kiê ̣n rất thuâ ̣n lợi cho nấm mốc phát triển, gây nhiễm

đô ̣c tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thương gan (ung thư gan…) Tı̀nh tra ̣ng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25%

mùa màng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bı̀nh 418 triê ̣u đô và ảnh hưởng trên gia

súc 472 triê ̣u đô mỗi năm (theo Bộ Nông Nghiê ̣p Mỹ, 2009) Ta ̣i Viê ̣t Nam, mỗi năm

bi ̣ ảnh hưởng khoản 13 – 16% lượng nông sản tùy loa ̣i

Trước thực tra ̣ng đó, con người đã và luôn tı̀m kiếm những hoa ̣t chất sinh học vừa có

tác dụng kháng nấm, vừa không gây ha ̣i cho cơ thể con người Một trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chı́nh là các chủng sinh acid lactic Vi khuẩn

da ̣ng này có hoa ̣t tı́nh sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diê ̣t vi sinh vâ ̣t có ha ̣i

và là nguồn vi sinh vâ ̣t hữu ı́ch, duy trı̀ hê ̣ cân bằng vi khuẩn đường ruột

Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic và vấn đề ngộ độ thực phẩm và hư hại nông sản

do nấm mốc gây ra mỗi năm Đây là lí do chúng tôi chọn để thực hiện đề tài “Khảo sát

khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của một số Lactobacillus spp và ứng dụng trong bảo quản hạt cà phê”

2 Tình hình nghiên c ứu

Trên thế giới, có rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm do vi khuẩn sinh acid lactic tạo thành, chẳng hạn như:

- Năm 2005, Johan Schnürer và Jesper Magnusson đã thực hiê ̣n nghiên cứu “Sự kháng

nấm ở vi khuẩn lactic là chất bảo quản sinh học”

- “Tiềm năng kháng nấm ở thực phẩm của vi khuẩn lactic” vào năm 2007 của S Rouse

cùng cộng sự

- Rosalia Trias cùng cộng sự vào năm 2008 đã công bố nghiên cứu “Vi khuẩn lactic từ

trái cây và rau củ là tác nhân kiểm soát sinh học đối với mầm bê ̣nh là nấm và vi khuẩn trên cây trồng”

- “Khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc và sản sinh độc tố mycotoxin bằng hợp

chất của vi khuẩn lactic” của Nevena Blagojev cùng cộng sự (2011)

Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong thuỷ sản, chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm Ngoài ra, sản phẩm còn chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải

3 M ục đích nghiên cứu

Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên men lactic

4 M ục tiêu nghiên cứu

Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng Lactobacillus spp phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống và thử ứng dụng chúng bảo quản hạt cà phê

5 N ội dung nghiên cứu

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp HCP2

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus spp HCP2

Ứng dụng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp trong bảo quản ha ̣t

6.2 Phương pháp xử lý số liệu

Phần mềm Excel để vẽ đồ thị

Phần mềm thống kê SAS 9.4

7 K ết quả đạt được

Xác định khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp đối với

chủng nấm mốc Aspergillus spp HCP2 phân lập từ hạt cà phê

Xác định được thời gian sinh hợp chất thứ cấp tốt nhất của các chủng vi khuẩn

Ứng dụng thành công các dạng sản phẩm khác nhau của vi khuẩn Lactobacillus spp

trong bảo quản hạt cà phê

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 T ổng quan về nấm sợi

1.1.1 Giới thiệu chung

Nấm (Fungi, số ít là Fungus) là một giới trong năm giới theo hệ thống phân loại của R.H.Whittaker (1996) Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta) là bộ môn nghiên cứu của nấm học (Mycology) Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, nước, không khí, chuồng nuôi…), chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên do chúng có khả năng phân giải các hợp chất như: cellulose, protein, lipid, chitin…

Vi nấm (Micro fungi) là những nấm không có mũ nấm và có thể nhìn thấy bằng mắt thường Căn cứ vào hình thái, ta chia thành hai loại là nấm men (Yeast) và nấm sợi (Filamentous fungi) còn được gọi là nấm mốc

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra

1.1.2.1 Các loài có kh ả năng sinh độc tố

Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người Điểm mấu chốt ở độc tố nấm mốc là chúng

có thể gây hại ở nồng độ thấp

Theo Nguyễn Thị Hiền (2009), trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loại ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, 15 loại trong số đó gây ung thư Trong suốt một thời gian dài, chúng ta không chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩm của nấm mốc Cho đến những năm 1960, người ta mới khẳng định con người có thể bị bệnh nếu ăn phải thức ăn nhiễm mốc, dù chỉ với lượng nhỏ Các loại độc tố chủ yếu được tiết ra bởi

5 chi nấm là: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), Ochratoxin A,

Stermatocystin, Acid cyclopianxoic

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A và Acid

cyclopianzoic toxin, Fumonisin, Moniliformin, Diacetocyscirpenon

 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2 toxin

 Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, Alternarion, Methyl ether alternarion

 Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện tổn thương ở gan và thận Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế bào nhu mô gan, xơ hoá Mycotoxin còn phá hủy tế bào gan và thâ ̣n, ảnh hưởng trực tiếp lên hê ̣ miễn di ̣ch, ăn mòn thành ruột và da ̣ dày Ngoài ra còn có các dấu hiệu tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận

Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết

Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể Nhiều độc tố như aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai

Ngoài ra, độc tố nấm mốc còn gây mất cân bằng trong chuyển hoá thức ăn và giảm tỉ lệ sinh sản Bên cạnh đó, các dẫn xuất của chúng thường độc với hệ thần kinh và gây tổn hại hệ thống cơ cùng rất nhiều hội chứng khác như: Bệnh ngoài da, chứng tăng sừng hoá, sảy thai…

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố

1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin

Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc loài Aspergillus, tập trung chủ yếu vào 3 chủng: A.flavus, A.parasiticus và A.nomius Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Giữa 4 loại trên thì aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004)

Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá thức ăn kém, sụt cân, nhưng

rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan

Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin

có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến Hậu quả của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức

độ tiếp xúc Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao

Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong số các aflatoxin Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh

1.1.2.3 Độc tố Patulin

Patulin có tên gọi khác là Clavaxin, được biết đến trước tiên như là thuốc có thể chữa trị cảm lạnh Trong quá trình sử dụng, người ta mới nhận biết được độc tính của patulin Patulin là hợp chất không màu, kết tinh và tan trong nước, các dung môi phân cực Người ta tách được patulin trên ngũ cốc, trên các sản phẩm dạng hạt và hoa quả

Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus và

Bysschchlamys t ạo ra Các chủng tổng hợp chủ yếu là các loài như A clavatus, A giganteus, P exppansum, P urticae, P griceofulvum

Patulin được coi như một độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật Gây

ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan đến các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, nghiên cứu đã cho thấy patuilin còn gây thiệt hại cho DNA hay nhiễm sắc thể ở người

1.1.2.4 Độc tố Fumonisin

Trong các độc tố về nấm mốc, mối quan tâm về fumonisin ngày càng tăng cao Đây là

độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp Đây là nhóm

độc tính cao với động vật và con người

Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong các fumonisin, chúng có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù ở ngựa, ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở

gà, suy tim cấp ở khỉ… Cơ quan Nghiên Cứu Quốc Tế về ung thư cũng đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B – nhóm các hợp chất gây ung thư cho người Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của fumonisin đến người cũng cho thấy, có sự liên quan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng lương thực nhiễm fumonisin

Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ sphingolopid tự do, tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin Các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận

1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố

1.1.3.1 Phương pháp vật lý học

Làm sa ̣ch: Trong quá trình xử lý nguyên liệu trước khi đưa vào sử dụng cần loại bỏ bụi, vỏ, tóc và hạt không đạt yêu cầu Đối với một số loại hạt cần thiết phải rửa sạch trước khi phơi khô

Phân loa ̣i cơ ho ̣c: Quá trình này loại bỏ các hạt nhiễm độc tố Mycotocxin Giai đoạn này rất quan trọng vì rất có thể việc loại bỏ không hết sẽ đến việc độc tố đi vào thức ăn Rửa bằng nước hoặc bằng dung dịch Na2CO3 cũng làm giảm nồng độ Mycotocxin trong hạt ngũ cốc Có thể cho hạt vào nước và loại bỏ những hạt nổi Phương pháp này cũng có thể loại bỏ Mycotocxin nhưng cần chú ý rằng, có một số hạt nổi nhưng không chứa mycotocxin

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu

có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt

độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở

120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở

120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào

và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô

cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một

số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức

ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg

Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.1.3.2 Phương pháp hoá học

Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về

khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng

là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.1.3.3 Phương pháp sinh học

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất

Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ

vi sinh vật

B ảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Bacillus

pumilus

Aspergillus parasiticus

Sử dụng các sản phẩm trao

đổi chất ngoại bào, sinh ra

trong quá trình nuôi cấy B

triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm

Asp parasiticus

C Munimbazi và LB.Bullerman, 1997

Streptomyces

sp.

Aspergillus parasiticus

Streptomyces sp tổng hợp

được aflastatin A, là hợp

chất có bản chất là protein,

ức chế 1 số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm

Cyclo (L-leucyl-L-prolyl),

là 1 cyclodipeptide, ức chế

sự phát triển và sự tổng hợp aflatoxin của nấm Asp

casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra

trong quá trình nuôi cấy L

casei, ức chế sự phát triển

và quá trình tổnghợp độc chất aflatoxin của nấm Asp

flavus.

Kim, 2007

Bacillus

subtilis B-FS06

Aspergillus flavus

B subtilis tổng hợp các enzyme ngo ại bào như

protease, chitinase, β-1,3- glucanase làm ức chế sự phát triển của nấm Asp

flavus.

R Thakaew và cộng sự, 2013

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao trên thế giới, 8 đến 10 tấn cà phê/hecta Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải

sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng

có những ưu điểm sau:

 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất

 Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

 Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

 Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm

 Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu

 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

 Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng

1.2 T ổng quan về vi khuẩn lactic

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus

Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 35°C Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 - 10% NaCl Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu

và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus:

 Giới: Vi khuẩn

 Ngành: Firmicutes

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian,

Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của

carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm:

 Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, được gọi là Thermobacterium,

cófructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45°C

 Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic

 Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau

 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải

sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể

sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone…

 Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin

 Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

 Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó

tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

 Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường

có oxy hay không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn

B ảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012)

dysgalaciae

Propionibacterium acne Streptococcus mutans

Plantaricin JK, Plantaricin S

Pediococcus Carnobacteria Clostiridia Propionobacteria Leuconostoc

Listeria monocytogenes Enterococcus feacalis

1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác

Các vi khuẩn sinh acid lactic còn có khả năng ức chế sự phát triển gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng ngoài bacteriocins

B ảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB

Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men

1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic

Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu Hoạt động kháng nấm của L

và cộng sự năm 1998) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic

Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

mevalonolactone

Lactobacillus plantarum VTTE-78076

Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic-

and n- valeric acid

Lactibacillus sanfranciscensis CB1

Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất Các chủng kháng

nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng

sự, 1996)

Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl,…

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

 Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử

lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối

 Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau

 Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…

 Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm

Trong bảo quản thực phẩm, có rất nhiều phương pháp được sử dụng, chẳng hạn như gia nhiệt, thay đổi pH, sử dụng các chất hoá học… Các phương pháp này đều được ghi nhận là có hiệu quả cao, tuy nhiên lại gây ảnh hưởng đến môi trường, sức khoẻ con người Các bacteriocins của vi khuẩn lactic có thể ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong

bảo quản sinh học, đặc biệt là trong bảo quản thực phẩm do chúng có độ an toàn và có hoạt tính cao (José Luis Parada, 2007) Chẳng hạn như Lacticin 3147 ức chế vi khuẩm gram dương và ngăn cản sự phát triển các vi khuẩn không mong muốn trong phô mai, Pediocin PA-1 có khả năng ức chế Listeria spp., Nisin có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và đây cũng là bacteriocin thương mại duy nhất được FDA cho phép sử dụng, Nisaplin – một dạng sản phẩm chứa 2,5% Nisin được sử dụng

ở hơn 50 quốc gia trong bảo quản thực phẩm Một dạng chế phẩm từ bacteriocins của

vi khuẩn lactic là BioProfit gồm Lactobacillus rhamnosus LC 705 và

(Khurana và cộng sự, 2007)

Tuy nhiên, các bacteriocins lại không có tác dụng cao khi được sử dụng riêng lẻ, chính

vì thế mà cần có các kỹ thuật hay kết hợp với các chất khác để làm tăng hoạt tính của chúng Chẳng hạn như Sodium acetate hay Sodium lactate sẽ làm tăng hoạt tính của bacteriocin Lactocin 705 (José Luis Parada, 2007)

Một trong những ứng dụng hiện đang được chú ý của bacteriocins từ vi khuẩn lactic đó chính là tạo bao bì sinh học, bảo vệ thực phẩm khỏi các nguy cơ gây hư hỏng (José Luis Parada, 2007) Các bacteriocins sẽ dần được giải phóng trên bề mặt màng bao và thực hiện chức năng sinh học của mình Có rất nhiều cách để tổng hợp bao bì sinh học

từ bacteriocins, chẳng hạn như phun, ngâm hay đóng gói trong các bao bảo quản Một trong những cách là kết hợp trực tiếp bacteriocin với polymer, chẳng hạn như cho Nisin kết hợp với polymer sinh học Một cách khác đó chính là tạo lớp màng bao từ bacteriocin hay hấp thụ bacteriocin lên bề mặt màng bao bằng polymer sinh học (Deegan L.H, 2006)

1.3 T ác ha ̣i của nấm mốc lên ha ̣t cà phê

Cũng như các loa ̣i ha ̣t khác, trái cà phê và ha ̣t cà phê là đối tượng dễ bi ̣ nhiễm vi sinh

vâ ̣t các khâu từ khi phát triển đến khi thu hoa ̣ch, bảo quản và vâ ̣n chuyển Hoa ̣t động

của vi sinh vâ ̣t gây bất lợi cho chất lượng và mức độ an toàn của thành phẩm sẽ phụ thuô ̣c vào điều kiê ̣n môi trường tùy theo cách bảo quản ha ̣t và thành phẩm (L R

Batista và cộng sự, 2003)

Các nghiên cứu về vi sinh vâ ̣t trên trái cà phê và ha ̣t cà phê đã chı̉ ra rằng chi nấm mốc

chủ yếu sinh ra độc tố (Aspergillus, Penicillium và Fusarium) là nhân tố gây ô nhiễm

tự nhiên trên cà phê (L R Batista và cộng sự, 2003)

Xuất hiê ̣n nấm mốc trên cà phê đồng nghı̃a với viê ̣c loa ̣i bỏ lượng cà phê khá lớn để

cách ly hoàn toàn phần bi ̣ nhiễm nấm và phần không nhiễm nấm để tránh lây lan, đồng

thời nấm mốc sản sinh ra độc tố aflatoxin tı́ch tụ trong ha ̣t cà phê gây nguy hiểm cho người sử dụng nếu không được xử lý tốt

1.5 Ch ế biến và bảo quản ha ̣t cà phê truyền thống

Có ba cách chế biến cà phê là chế biến khô, chế biến ướt và chế biến bán ướt Tùy thuô ̣c vào cách chế biến thı̀ cà phê thành phẩm sẽ có mùi, vi ̣ khác nhau Cà phê sau khi

chế biến nhưng chưa được rang được go ̣i là cà phê nhân, nhưng nếu còn phần vỏ trấu

thı̀ được gọi là cà phê thóc

Sau khi chế biến, tùy vào yêu cầu mà cà phê sẽ được rang ngay hoă ̣c đem đi bảo quản Môi trường bên ngoài có những tác nhân sau ảnh hưởng đến quá trı̀nh bảo quản cà phê:

- Đô ̣ ẩm của ha ̣t cà phê và môi trường xung quanh

- Nhiê ̣t đô ̣ của khối ha ̣t cà phê và môi trường xung quanh

- Đô ̣ thông thoáng khı́ bên trong khối cà phê

1.5.1 C ác phương pháp bảo quản cà phê thóc:

Bảo quản khô

- Phơi nắng

- Sấy bằng không khı́ khô

- Sấy bằng không khı́ nóng

- Sử dụng các hóa chất hút nước

Bảo quản ở tra ̣ng thái thoáng gió tı́ch cực

Cơ sở của phương pháp bảo quản thoáng gió tích cực là lợi dụng độ hổng của khối hạt

cà phê mà quạt không khí khô và mát vào khối hạt nhiều lần, với mục đích làm giảm được nhiệt độ và độ ẩm của khối hạt cà phê

Không khí thổi vào khối hạt cần đáp ứng các điều kiện sau:

- Không khí phải được quạt đều trong toàn bộ khối hạt

- Cần đảm bảo đủ lượng không khí khô và mát để thực hiện được mục đích làm giảm nhiệt độ và độ ẩm của khối hạt

- Chỉ quạt khi độ ẩm của không khí ngoài trời thấp, nghĩa là sau khi quạt độ ẩm của khối hạt phải giảm xuống

- Nhiệt độ không khí ngoài trời phải thấp hơn nhiệt độ của khối hạt

Bảo quản ở trạng thái nhiệt độ thấp

Ở nhiệt độ thấp thì hoạt động sống của hạt cà phê, vi sinh vật, côn trùng… đều bị hạn chế Phương pháp được tiến hành bằng cách quạt không khí lạnh và không khí khô vào khối hạt cà phê Do độ dẫn nhiệt của hạt cà phê kém nên không khí lạnh được giữ lại trong khối hạt một thời gian dài, hạn chế được các hoạt động sống của hạt cà phê giúp khối hạt cà phê được bảo quản được lâu

Với điều kiện thời tiết ở nước ta thường không áp dụng được phương pháp này, tuy nhiên có thể lợi dụng một số ngày lạnh và khô của mùa đông

Bảo quản kín

Bảo quản kín hay còn gọi là bảo quản thiếu hay không có mặt O2 Khi thiếu O2 thì các quá trình hô hấp của các cấu tử sống gần như chấm dứt hoàn toàn, nó chuyển sang hô hấp hiếu khí Hoạt động sống của các hệ vi sinh vật bị ngừng trệ vì trong khối hạt cà phê chủ yếu là vi sinh vật hiếu khí, trùng bọ bị tiêu diệt Giảm khí O2 bằng cách có thể

bổ sung vào khối hạt một lượng CO2 còn O2 mất đi do quá trình hô hấp của các cấu tử sống trong khối hạt cà phê

1.5.2 C ác phương pháp bảo quản cà phê nhân:

Do đặc tính lý học cũng như sinh lý của cà phê nhân thay đổi khác với cà phê thóc nên trong bảo quản cà phê nhân quá trình bất lợi xảy ra nhanh hơn, độ bền bảo quản kém hơn cà phê thóc vì lớp vỏ trấu, lớp vỏ lụa có tính chất bảo vệ bị bóc đi, hạt cà phê tiếp xúc trực tiếp với môi trường nên chế độ bảo quản và kiểm tra chất lượng cà phê khắt khe hơn so với cà phê thóc Hiện nay thường dùng các phương pháp sau để bảo quản Bảo quản trong bao

Đây là phương pháp phổ biến được áp dụng nhiều Khi bảo quản cần phải chú ý các điểm sau:

- Độ ẩm cà phê nhân đưa vào bảo quản phải nhỏ hơn 13 %

- Tạp chất trong cà phê càng ít càng tốt, đối với cà phê cấp I , II phần trăm tạp chất < 0,5 %

- Chọn kho ẩm có cách nhiệt, ẩm tốt

- Phải sát trùng và vệ sinh kho sạch sẽ trước khi xếp bao

- Không xếp trực tiếp xuống nền và sát tường: cách nền 0,3 m, cách tường 0,5m

- Để tránh hiện tượng nén chặt các bao do sức nén của tải trọng các bao phía trên, cứ sau 3 tuần phải đảo thứ tự xếp bao một lần

Đổ thành đống rời

Thực chất là bảo quản rời trong các silo Để tiết kiệm bao bì và bảo quản thời gian lâu hơn, người ta thường bảo quản cà phê nhân trong các silo bằng tôn, bằng bê tông, hoặc bằng gỗ tốt khép kín ưu điểm của phương pháp này là ngoài việc tiết kiệm bao bì và tăng thời gian bảo quản còn tiết kiệm được thể tích kho, tránh được hiện tượng nén chặt làm giảm độ rời của khối hạt cà phê nhân Có hương và dòng khí N2 thoát ra

1.6 B ảo quản ha ̣t cà phê bằng vi sinh vâ ̣t

Ngũ cốc và thực phẩm chế biến từ ngũ cốc có ý nghı̃a lớn trong sự phát triển của loài người vı̀ sự ảnh hưởng của chúng lên nền nông nghiê ̣p thế giới, kinh tế và giá tri ̣ dinh

dưỡng (G Font de Valdez và cộng sự, 2010) Nguồn dinh dưỡng đến từ ha ̣t ngũ cốc không chı̉ được con người ưa chuộng mà còn là mục tiêu của nấm mốc và vi sinh vâ ̣t gây ha ̣i Chất lượng và an toàn thực phẩm của các loa ̣i ngũ cốc da ̣ng ha ̣t và thực phẩm

có nguồn gốc từ ngũ cốc bi ̣ ảnh hưởng bởi nấm và vi khuẩn, dẫn đến thiê ̣t ha ̣i về kinh

tế và nguy ha ̣i đến sức khỏe người tiêu dùng Bảo quản sinh học được đi ̣nh nghı̃a là

kéo dài thời ha ̣n sử dụng sản phẩm bằng cách sử dụng hê ̣ thống sinh học hoă ̣c chất

kháng khuẩn của chúng – là một công cụ hữu ı́ch để tránh bi ̣ ảnh hưởng bởi các tác nhân gây ha ̣i, dù sử dụng riêng lẻ hay kết hợp cùng các phương pháp bảo quản truyền

thống, vâ ̣t lý hay hóa học khác (G Font de Valdez và cộng sự, 2010)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đi ̣a điểm nghiên cứu

Thı́ nghiê ̣m được tiến hành ta ̣i phòng thı́ nghiê ̣m vi sinh Khoa Công Nghê ̣ Sinh Học –

Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đa ̣i Học Công Nghê ̣ Thành Phố Hồ Chı́ Minh

2.2 Th ời gian thực hiê ̣n

Đề tài được thực hiê ̣n từ 02/2017 đến 07/2017

2.3 V â ̣t liê ̣u nghiên cứu

2.3.1 Vật liê ̣u

Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp sử dụng từ bộ sưu tâ ̣p giống Lưu

Đa ̣i Kim Phượng 12DSH phân lâ ̣p, với các chủng Lactobacillus sp C1 – 1, Lactobacillus sp C7 – 7 phân l â ̣p từ cơm mẻ; Lactobacillus sp L6, Lactobacillus sp

L4 và Lactobacillus sp L3 phân lâ ̣p từ nem chua Riêng chủng Lactobacillus sp L5 do

Lê Thi ̣ Hồng Thủy, 09DSH phân lâ ̣p Chủng nấm thuộc Aspergillus spp được phân lâ ̣p

từ cà phê (HCP2) do Đỗ Tuyết Mai và Nguyễn Thi ̣ Vân Hương 11DSH phân lâ ̣p

Carbendazim từ Công ty Cổ phần Bảo vê ̣ Thực vâ ̣t Sài Gòn,

Ha ̣t cà phê mua ở cửa hàng Phương Vy 432A Xô Viết Nghê ̣ Tı̃nh, Phường 25, Quâ ̣n

Bı̀nh Tha ̣nh, thành phố Hồ Chı́ Minh

2.3.2 H óa chất và môi trường sử dụng

2.3.2.1 H óa chất

Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS – broth, MRS cải tiến và PDA

Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Phenolphthalein

Các hóa chất để pha các loa ̣i thuốc nhuộm: thuốc nhuộm Malachite green, thuốc nhuô ̣m Safranin, thuốc nhuô ̣m Crystal violet

NaOH 0,1N

Cồn 96°, 70°

Nước cất

2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MRS broth, MRS agar, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic Môi trường PDA để nuôi cấy nấm mốc

Tủ sấy (Memmert Germany)

Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)

Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống

2.5 Phương pháp luận

2.5.1 Mục tiêu đồ án

Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp chất thứ

cấp của vi khuẩn Lactobacillus spp trong bảo quản hạt cà phê

2.5.2 Nội dung

Hoa ̣t hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp và chủng nấm mốc Aspergillus sp

HCP2

Khảo sát đă ̣c điểm hı̀nh thái, sinh hóa của các chủng Lactobacillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các chủng Lactobacillus spp với chủng nấm Aspergillus sp HCP2

Ứng du ̣ng di ̣ch nuôi cấy, hợp chất thứ cấp của các chủng Lactobacillus spp trong bảo

quản ha ̣t cà phê

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu

Quy trı̀nh được thực hiê ̣n theo sơ đồ sau:

2.6.2 Kh ảo sát đặc điểm hı̀nh thái, sinh hóa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

Các chủng vi khuẩn lactic có thể bi ̣ suy yếu và nhiễm các loài vi khuẩn khác trong quá

trı̀nh bảo quản Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng

Các chủng vi khuẩn lactic được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37°C sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy

2.6.2.1 Nhuộm gram: