Nghiên cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (anoectochilus setaceus) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi

Lớp: 13DSH01

MSSV: 1311101018

Page 1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Hà Thị Loan Các số liệu sử dụng phân tích trong đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây, nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017

Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân

Em xin bày tỏ lòng biết ơn và sự tri ân sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về kinh phí và trang thiết bị

để em thực hiện đề tài này Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Tiến

sĩ Hà Thị Loan cùng với những Anh (Chị) cán bộ làm việc tại phòng Thực nghiệm cây trồng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học hỏi, tiếp cận những kiến thức thực tế, tích lũy nhiều kinh nghiệm về thao tác trong phòng thí nghiệm Đồng thời các Anh (Chị) đã góp ý, bổ sung và chỉnh sửa những kiến thức thiếu sót để em có thể hoàn thành tốt đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình những người đã luôn bên cạnh em, cổ vũ tinh thần và đã ủng hộ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 6 năm 2017

Sinh viên trường ĐH Công Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Kim Ngân

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 4

1.1.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật 4

1.1.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.1.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật 12

1.1.4 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật 13

1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 14

1.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 14

1.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn 15

1.2.4 Nuôi cấy tế bào trần 15

1.2.5 Nuôi cấy hạt phấn 16

1.2.6 Nuôi cấy protoplast 16

1.3 Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 16

1.3.1 Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ 16

1.3.2 Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus) 19

1.3.3 Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng 21

1.4 Tổng quan về cây lan kim tuyến 22

1.4.1 Nguồn gốc và phân bố 22

1.4.2 Phân loại 23

1.4.3 Đặc điểm hình thái 23

1.4.4 Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến 25

1.4.5 Giá trị dược liệu của lan kim tuyến 25

1.4.6 Nhân giống cây lan kim tuyến 26

1.4.7 Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến 27

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Vật liệu nghiên cứu 29

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 31

2.2.4 Điều kiện nuôi cấy 31

2.3 Phương pháp 31

2.3.1 Pha môi trường 31

2.3.2 Các thao tác trong phòng cấy 32

2.4 Nội dung nghiên cứu 33

2.5 Bố trí thí nghiệm 33

2.5.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy chồi lan kim tuyến 33

2.5.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi

lan kim tuyến 34

2.5.3 Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined. 3.1 Nội dung 1: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến… 38

3.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến 43

3.3 Nội dung 3: Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974) 6 Bảng 2.1 Khảo sát nồng độ BA và NAA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến 34 Bảng 2.2 Khảo sát nồng độ BA và NAA dùng để nhân nhanh chồi lan kim tuyến 35 Bảng 2.3 Các cơ quan của lan kim tuyến được chuyển gen 37 Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi 39 Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến sau 8 tuần theo dõi 44 Bảng 3.3 Khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được lây

nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng 15834 và chủng TR7 sau 4 tuần

nuôi cấy 48

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy 40 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến tỷ lệ tái sinh chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy 41 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và BA đến số chồi và chiều cao chồi của mẫu cấy đốt thân lan kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 19

Hình 1.2 Lan kim tuyến ở ngoài vườn ươm 23

Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên 29

Hình 3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi lan kim tuyến 38

Hình 3.2 Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự nhân nhanh chồi lan kim tuyến 44 Hình 3.3 Ảnh hưởng của việc chuyển gen chứa vi khuẩn Agobacterium rhizogenes chủng Tr7 và chủng 15834 vào các cơ quan của lan kim tuyến sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, NT4 51

LỜI MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa dành cho bậc vương giả Lan là một loài hoa được trồng rất phổ biến ở Việt Nam nói riêng và ở các nước trên thế giới nói chung Lan ở việt nam tượng trưng cho một vẻ đẹp thuần khiết, thanh cao và mang nhiều ý nghĩa Cùng với sự phát triển của ngành trồng lan trong thời gian qua, loài hoa quý này không chỉ hấp dẫn mọi du khách do sự đa dạng về hình dáng và màu sắc mà còn mang lại giá trị hiệu quả kinh tế cao

Họ Lan Orchidaceae là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi Thông thường Lan được sử dụng làm cảnh Ngoài ra, có nhiều loài Lan còn được sử dụng làm thuốc (Nguyễn Tiến Bân, 2005)

Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác

Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl được biết đến nhiều không những bởi giá

trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc

từ rất lâu, nên loài Lan kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, Lan kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và trong Sách Đỏ Việt Nam (2007), phân hạng EN A1a,c,d (Sách Đỏ Việt Nam, 2007)

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào trần đã được công bố trên nhiều loài cây dược liệu, đáng chú ý là sản xuất và thương mại hóa shikonin, berberine and ginseng ở Nhật Bản Tuy nhiên sản xuất các hợp chất thứ cấp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào vẫn còn một số tồn tại như dòng tế bào không ổn định, năng suất thấp và khi nuôi cấy quy mô lớn gặp khó khăn như dễ bị lây nhiễm, việc điều chỉnh nguồn khí oxy, … (Rao and Ravishankar, 2002) Hướng mới để sản xuất các hợp chất thứ cấp là nuôi cấy rễ chuyển gen (rễ tóc) Nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình

thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật bị

tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật (Lê Thu Ngọc và cs, 2013) Công nghệ chuyển gen tạo rễ tóc cho phép nhanh chóng thu được sinh khối lớn trong thời gian ngắn đã thành công trên một số loài thực vật, điển hình là sâm ngọc linh đem lại hiệu quả cao Trên thế giới cũng như trong nước đã có một số đề

tài nghiên cứu về lan kim tuyến: Nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus

formosanus (Chow và cs, 1982) Nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl (Phùng Văn Phê và cs, 2010)…

Lan kim tuyến được xem như là loài dược liệu quý cho sức khỏe con người nên hiện nay loài thực vật này đang có nguy cơ bị người dân khai thác cạn kiệt để bán cho các thương nhân nước ngoài bởi giá trị kinh tế cao với mức giá dao động từ 1,2 – 1,6 triệu đồng / 1 kg lá tươi Mặt khác khả năng tái sinh của cây lan kim tuyến trong tự nhiên thấp, đặc biệt là những nơi môi trường sinh thái bị tàn phá Loài thực vật này chủ yếu mọc trong rừng già trên vùng núi cao, nơi có ẩm độ cao và nhiệt độ thấp, ở những nơi đất tốt và tơi xốp, không có ánh sáng trực tiếp của mặt trời (Dương Đức Chiến, 2014) Chính vì môi trường sống ngoài tự nhiên khá khó khăn cũng như loài dược liệu quý này có giá trị kinh tế cao nên việc ứng dụng công nghệ nuôi rễ tóc thu sinh khối là cần thiết

Xuất phát từ những cơ sở đó, người thực hiện đề tài đã tiến hành: “Nghiên

cứu nhân nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro phục vụ công tác chuyển gen tạo rễ tóc”

II Mục đích, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu

1 Mục đích

Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anotoecchilus setaceus

Blume), chi Lan kim tuyến

Tạo nguồn vật liệu in vitro làm vật liệu cho các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ

tóc

2 Nhiệm vụ

Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA đến vị trí mẫu cấy lan kim tuyến

Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên nhân nhanh chồi lan kim tuyến Bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tóc từ các cơ quan của lan kim tuyến được

lây nhiễm từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

3 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS và Microsoft Excel 2010

III Các kết quả đạt được và kết cấu của đồ án

1 Các kết quả đạt được của đề tài

Xác định nồng độ NAA và BA tối ưu lên sự tái sinh chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến

Xác định nguồn mẫu (các mô hay cơ quan của lan kim tuyến) phù hợp cho

hiệu suất chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

2 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Đồ án gồm 4 chương

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Chương 4: Kết luận và kiến ghị

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.1.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô thực vật

Theo Dương Công Kiên (2002), những mốc chính trong lịch sử phát triển của công nghệ tế bào thực vật:

Năm 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa

ra khái niệm tế bào

Năm 1838: Mattias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

Năm 1902: Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công

Năm 1904: Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài

họ cải Crucifers

Năm 1922: Knudson và Bot Gaz Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro Năm 1924: Blumenthal và cộng sự nuôi cấy hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic

Năm 1929: Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa hợp khi lai ở Linum spp

Năm 1934: White đã thành công khi nuôi cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài

Năm 1934: Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, 1 phytohormone thực vật đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia

tế bào

Năm 1936: LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau Năm 1939: Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy, mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá

Năm 1941: Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non

Năm 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi trường MS

Từ năm 1964 – 1998: hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gene để lai tạo giống mới thương mại hóa sản phẩm nuôi cấy mô

Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

1.1.2 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.2.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a Điều kiện vô trùng

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối thiểu cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự

phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy Vì thế, nuôi cấy in vitro luôn được nuôi cấy

trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng, mô nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, chết (Dương Công Kiên, 2002)

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao

- Dùng kẹp vô trùng gắp chuyển mẫu sang dung dịch khử trùng (kẹp này không dùng lại nữa nếu không khử trùng lại), ngâm (lắc nhẹ) mẫu trong dung dịch khử trùng trong thời gian ấn định

- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần Nếu rửa không sạch, chất khử trùng có thể làm chết mẫu

- Nhập mẫu sau khi khử trùng chuyển mẫu ra giấy thấm đặt trên đĩa petri vô trùng Tiến hành cắt tỉa tách mẫu, tỉa bỏ các phần dập nát, hư hỏng và cấy chuyền ngay vào môi trường đã chuẩn bị trước

Bảng 1.1 Thời gian và nồng độ các chất khử trùng (Street, 1974)

Tác nhân vô trùng Nồng độ

(%)

Thời gian xử lý (phút)

b, Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy

ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng,

có khả năng quang hợp Trong giai đoạn này, cường độ ánh sáng được Murashige

(1974) đề nghị là 3.000 – 10.000 lux và nhiều phòng thí nghiệm cho rằng con số 40 – 75 µmol/m2/s (tương đương 3.300 – 6.200 lux) là thích hợp (Edwin, 1993)

 Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhiệt độ thích hợp nhất cho

sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

1.1.2.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002)

Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau Trong đó, có một

số môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng

đa lượng cao Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

- Nguồn cacbon

- Các vitamin

- Các chất điều hòa sinh trưởng

- Các chất hữu cơ bổ sung: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây…

a Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg (Trần Văn Minh, 2010)

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro

là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kĩ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta không nghĩ tới việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, …(Trần Văn Minh, 2010)

b Nguồn cacbon

Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không

quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối Các loại đường thường được sử dụng là saccharose, d-glucose, d-fructose Saccharose là nguồn các cacbon được sử dụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ saccharose thay đổi từ 2 – 3% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Dodds và Roberts, 1985)

c Các vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của

chúng Trong nuôi cấy in vitro thì một số vitamin được bổ sung vào môi trường và

trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng như: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Trần Văn Minh, 2010)

Thiamine là một vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Vitamin C đôi khi được sử dụng ở nồng độ cao như là một chất chống oxi hóa Myo-inositol có vai trò quan trọng cho sự phân chia tế bào vì thúc đẩy sự hình thành thành

tế bào Thường sử dụng ở nồng độ cao 50 – 100 ppm (Trần Văn Minh,2010)

d Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (plant growth regulator), có tên khoa học

là phytohormon, là chất hữu cơ có mặt trong cây với hàm lượng rất nhỏ nhằm tham gia vào điều khiển quá trình trao đổi chất và các quá trình hình thành mới các cơ quan

ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây Cho đến nay người ta đã tìm được rất nhiều chất tự nhiên hoặc nhân tạo ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật Người ta chia các phytohormon ra làm 5 nhóm chính: Auxin, Gibberrellin, Cytokinin, Abcisic acid và Ethylene (Nguyễn Văn Uyển, 1993) Trong đó, auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất

 Nhóm các auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin Các auxin sử dụng có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm (IAA, NAA, 2,4-D, IBA) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ nhưng nếu sử dụng liều lượng quá cao dễ tạo ra các đột biến (Hoàng Minh Tấn và

CS, 1993)

Vai trò sinh lý của Auxin

- Kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào

- IAA kích thích chồi bên sản sinh ra ethylene làm ức chế sinh trưởng chồi đỉnh

- Kích thích hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính

- 2,4-D sử dụng rộng rãi cho sự phát sinh mô sẹo

- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus)

- Kích thích tạo chồi bất định ở nồng độ thấp

 Nhóm các cytokinin

Trong nuôi cấy mô thực vật, cytokinin dùng để kích thích sự phát sinh chồi,

sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994) Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ Auxin/Cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ, nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi, ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành

mô sẹo Cytokinin gồm có kinetin, BAP, zeatin, TDZ

- Kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi

- Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng

- BAP có hoạt tính cao hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin

Vai trò sinh lý của nhóm Cytokinin

- Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng chồi in vitro

- Kìm hãm sự già hóa và kéo dài tuổi thọ của cây

- Ức chế sự hình thành rễ

- Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ

- Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh

e Các chất hữu cơ bổ sung

 Nước dừa

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây Thông thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 – 20% thể tích môi trường (George, 1993; George, 1996)

 Dịch chiết nấm men

Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp (Trần Văn Minh, 2010)

 Dịch chiếc khoai tây

Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và các yếu tố khoáng như kali, sắt, magie rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của mô, tế bào Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác (Trần Văn Minh, 2010)

 Độ pH và agar

Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào Độ pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0 Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng (Trần Văn Minh, 2010)

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi nếu môi tường lỏng và tĩnh (Trần Văn Minh, 2010)

1.1.3 Các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật

1.1.3.1 Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu

Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt trong môi trường nuôi cấy Để tiến hành

nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan

được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và

vị trí lấy mẫu đó Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, clorua thủy ngân, …(Dương Công Kiên, 2003)

1.1.3.2 Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân

giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối

với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác (Dương Công Kiên, 2003)

1.1.3.3 Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra

nhanh Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài

(Dương Công Kiên, 2003)

1.1.3.4 Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên

ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ

thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của

mẫu, kiểu di truyền Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in

vitro (Dương Công Kiên, 2003)

1.1.3.5 Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm

Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự thoát hơi nước ở lá Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác

biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro (Dương Công Kiên, 2003)

1.1.4 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô thực vật

Về mặt lý luận và thực tiễn, nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô có những ưu điểm sau:

- Hệ số nhân giống cao

- Các cây đồng nhất về mặt di truyền

- Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu nhân giống

- Có thể nhân giống quanh năm

- Khắc phục được đặc tính khó nhân giống và bất thụ ở một số cây trồng

- Chất lượng giống cao, tạo nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất

- Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm

- Dễ dàng tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen

Bên cạnh những ưu điểm thuận lợi cho nuôi cấy mô tế bào thực vật, phương pháp vi nhân giống còn có nhiều nhược điểm cần khắc phục:

- Đầu tư trang thiết bị tốn kém, đòi hỏi trình độ chuyên môn kỹ thuật cao nên dẫn đến giá thành cây con sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống khá cao

- Cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình

- Có thể xảy ra đột biến do các chất điều hòa tăng trưởng bổ sung vào môi trường

- Sự nhiễm mẫu và hoại mẫu

- Hiện tượng thủy tinh thể: là hiện tượng thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi ra ngoài môi trường do mất nước rất mạnh

1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên) Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Môi trường thích hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cây, nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng và bổ sung chất kích thích sinh trưởng là thích hợp nhất Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra

rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường khác (Ngô Xuân Bình, 2015)

1.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành

chồi Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo (Ngô Xuân Bình, 2015)

1.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt lên máy lắc

có tốc độ điều chỉnh thích hợp Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất

hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống như hệ thống nuôi cấy vi sinh Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid…) Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia phóng

xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng (Ngô Xuân Bình, 2015)

1.2.4 Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống

và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu + enzym) trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền) Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng Quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua) Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc,

tế bào trần dễ dàng hấp thu các AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng Hiện nay kỹ

thuật tách và nuôi cấy tế bào trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện (Ngô Xuân Bình, 2015)

1.2.5 Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro Bao phấn chứa các bào tử

hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới Nuôi cấy bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa nước, thuốc lá, ngô,… (Ngô Xuân Bình, 2015)

1.2.6 Nuôi cấy protoplast

Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môi trường lỏng Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới

ở thực vật bậc cao nói chung Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng khác nhau Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây Thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như trong công tác giống cây trồng (Ngô Xuân Bình, 2015)

1.3 Chuyển gen tạo rễ tóc nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã cho thấy

có một số ưu điểm vượt trội và đạt hiệu suất cao hơn các phương pháp khác

1.3.1 Đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ

 Đặc điểm

Agrobacterium là vi khuẩn đất, nhuộm gram âm, háo khí, thuộc họ

Rhizobiacea (Kerters và De Ley, 1984) Nhiều nghiên cứu đã khẳng định

Agrobacterium có xu hướng chuyển gen vào những vùng mô đang phân sinh mạnh

Đây là lợi thế lớn nhất của phương pháp này vì mô phân sinh là nơi mà chồi con hay

rễ (đã “bị” thay đổi thông tin di truyền) có thể dễ dàng được tạo thành

Vi khuẩn A tumefaciens (chứa plasmide pTi – tumor inducing) có thể gây

khối u dễ dàng cho cả cây khỏa tử và cây hai lá mầm nhưng lại khó khăn hơn trong việc gây khối u cho cây một lá mầm (Smith và Townsend, 1907) Lý do là cây một

lá mầm thuộc nhóm thực vật tiến hóa hơn (tiến hóa nhất trong giới thực vật), nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh hơn các cây hai lá mầm như vách cellulose tẩm silic làm tăng độ bền của thành tế bào, hoặc khi bị thương, phần mô tại điểm đó có xu hướng hóa gỗ để bảo vệ, chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiết hợp chất phenol như

cây hai lá mầm Nhưng hiện nay người ta đã tìm được nhiều chủng Agrobacterium có

khả năng chuyển gen cho một số cây một lá mầm như bắp, lúa, cỏ, mía, lan, ứng dụng chuyển gen tạo ra gạo vàng, phong lan phát sáng,…

Còn vi khuẩn A rhizogenes (chứa plasmide pRi – root inducing) là tác nhân

gây bệnh tạo rễ tóc (hairy root) cho thực vật Nó cảm ứng kích thích tạo rễ khi xâm

nhiễm vào tế bào thực vật tại điểm bị thương (Riker và cs., 1930) tạo nên bộ rễ gồm

những rễ chuyển và những rễ không chuyển gen

 Cơ chế xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào chủ

Đầu tiên vi khuẩn xâm nhiễm qua vết thương của mô, của cây Sau khi di

chuyển đến vết thương, Agrobacterium gắn chặt vào bề mặt tế bào thực vật Việc các

vi khuẩn gắn vào bề mặt tế bào còn được xem như phản ứng trả lời của các vi khuẩn với các hợp chất phenolic như acetosyringon và hydroxyl acetosyringon mà tế bào thực vật tiết ra Các chất này được tiết ra khi cây bị thương và có tác động tạo vùng

tế bào phân chia mạnh nhằm chữa lành vết thương, các chất phenolic sẽ hàn gắn vết thương và polymer hóa tạo lignin Các phân tử phenolic này có tác động cảm ứng các

gen vir nằm trên Ti (đối với A tumefaciens) hoặc Ri plasmide (đối với A rhizogenes)

của vi khuẩn (Birot và cs, 1987)

Các gen vir định vị trên một vùng có kích thước 35kb nằm ngoài vùng T– DNA Ở đây có 25 gen virsắp xếp trong 7 operon Các sản phẩm của gen vir có tác

dụng chuyển và gắn T–DNA vào genome của tế bào thực vật (Chilton và cs, 1982)

Quá trình chuyển T–DNA cũng tương tự như quá trình chuyển plasmide từ

tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tương tác với nhau T–DNA được chuyển ở dạng phân tử sợi đơn từ plasmide vào tế bào thực vật và được tổ hợp vào DNA nhiễm sắc thể Đầu 5’ của sợi đơn T–DNA xuất phát từ bờ phải và đầu cuối 3’ ở vị trí bờ trái Sự hình thành sợi đơn DNA được tiến hành nhờ sự cắt đặc hiệu hai vùng bờ phải

và bờ trái, sự tổ hợp T–DNA vào genome tế bào chủ phụ thuộc vào một trình tự đặc hiệu định vị ở bờ phải của T–DNA, vùng bờ phải và bờ trái đều có 25 cặp base tương

tự nhau, tuy nhiên việc loại bỏ bờ trái không gây ảnh hưởng đến sự gắn T–DNA vào nhiễm sắc thể tế bào chủ (Meyer và cs, 2000)

Trong quá trình cài T–DNA vào nhiễm sắc thể thực vật có sự loại bỏ một đoạn giữa DNA của nhiễm sắc thể ở điểm gắn Ngoài ra sự cài T–DNA vào DNA thực vật xảy ra ở những vị trí ngẫu nhiên, bờ T–DNA vi khuẩn phải có được một số điểm tương đồng với DNA thực vật ở vùng cài vào Hầu hết các gen định vị trong vùng T–DNA chỉ được thể hiện sau khi T–DNA được cài vào genome thực vật (Meyer và cs, 2000)

Trong vùng T–DNA của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có các gen iaaM và iaaH mã hóa cho các enzyme tổng hợp auxin (IAA) Vùng này còn chứa gen tmr còn gọi là ipt mã hóa cho các enzyme tạo ra cytokinin Auxin và cytokinin

sẽ điều khiển hình thành khối u (đối với vi khuẩn A tumefaciens) Vùng T–DNA của

vi khuẩn A rhizogenes mang các oncogen rol A, B, C hoặc D (Jouanin và cs, 1987)

Hình 1.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

(nguồn:www.slideshare.net)

1.3.2 Vai trò, chức năng của oncogen rol (root inducing locus)

Nguyên nhân của sự hình thành rễ tơ được xác định có liên quan đến vùng

T-DNA nằm trên plasmid Ri của các chủng A rhizogenes, T–DNA của A

rhizogenes chứa các oncogen mã hóa cho tổng hợp các phytohocmon (auxin và

cytokinin) Mặt khác, T-DNA chứa các oncogen rol A, B, C hoặc D (còn gọi là gen rol) đã được định danh và phân lập bởi Schmulling và cộng sự (1998), là tác

nhân làm tăng tính mẫn cảm của tế bào đối với các chất điều hòa sinh trưởng thực

vật Những gen rol chịu trách nhiệm tạo nên rễ tóc ở tế bào thực vật (Cardarelli và

cs, 1987a, b): rễ phân nhánh mạnh, không hướng đất Sự biểu hiện của gen rol (A, B

và C) tạo cho tế bào chuyển gen có tính mẫn cảm mạnh đối với auxin nội sinh (Maurel

và cs, 1991) gây ra sự tạo rễ Sự kiện này được chứng minh bởi các cây trồng chuyển

gen bằng một gen rol độc lập hoặc nhiều gen rol liên kết đã gây ra sự biến đổi về sinh

trưởng (Nilsson và cs, 1993a, b; Martin-Tanguy và cs, 1996) cũng như nhiều biến đổi

về mặt hình thái Tuy nhiên, hiện nay vai trò và chức năng của gen rol D vẫn còn

chưa có nhiều tài liệu công bố

Phương thức điều hoà sự phiên mã của gen rol đã mang đến những thông tin

quan trọng cần thiết để tế bào cảm ứng tạo “hairy root” Người ta đã nghiên cứu cơ

chế điều hoà biểu hiện gen rol bằng việc dung hợp promotor với một gen chỉ thị GUS

và phân tích hoạt động của gen GUS trong những cây đã bị chuyển gen theo hệ thống

này Cũng tương tự, gen rol B và C biểu hiện ở những mô đặc biệt, chủ yếu ở vùng libe và trong mô phân sinh của rễ Gen rol B biểu hiện ở tế bào mô mềm tự do

(Altamura và cs, 1991) Hoạt động của phiên mã của gen C là những tế bào mang libe

rễ (Guiva’h và cs, 1996) Gen rol B và C biểu hiện trong tế bào trụ bì của những rễ

được hình thành đầu tiên của cây dương (Nilsson và cs, 1997) Nilsson và Olsson

(1997) cũng chứng minh sự chuyển hoá của gen rol B đóng vai trò trung tâm trong cảm ứng tế bào rễ tóc Gen rol B điều hoà tổng hợp auxin (Maurel và cs, 1994) và gen rol C điều hòa tổng hợp saccharose (Yokoyama và cs, 1994) Những gen này có

thể biểu hiện độc lập và làm tăng hàm lượng hoạt chất thứ cấp cho tế bào ở vùng libe

Nhưng để cảm ứng tạo rễ, nhờ gen rol tế bào sẽ tăng độ mẫn cảm với tỷ lệ auxin lên nhiều lần Điều này có thể do chức năng của tyrosine phosphate mã hóa bởi gen rol B,

là nguồn gốc của việc tạo mô phân sinh vùng rễ

Khi lây nhiễm bởi vi khuẩn A rhizogenes, những tế bào mục tiêu sẽ là

những tế bào ở vùng libe Sự thể hiện ở mô đặc biệt này được điều hòa bởi 2 tác nhân nội sinh là auxin và saccharose như đã nêu ở trên Như Nilsson và Olsson (1997) đã chứng minh rằng những chất này là cần thiết để cảm ứng cho rễ bất định và có mặt với một lượng quan trọng trong tế bào vùng libe

1.3.3 Tình hình nghiên cứu rễ tóc trên một số loài dược liệu và cây trồng

Chuyển gen rol tạo rễ tóc trên cây dược liệu đã được rất nhiều nhóm nghiên

cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt là để nhân sinh khối và sản xuất hoạt chất thứ cấp

có giá trị kinh tế cao (Bulgakov, 2008) Đến năm 1990 đã có 116 loài cây trồng đã được chuyển gen nhằm tạo rễ tóc (Tepfer, 1990) Đối với nhân sâm đã có nghiên cứu

chuyển gen tạo rễ tóc nhờ A rhizogenes trên sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm

Mỹ (P quinquefolium), sâm lai (P ginseng x P quinquefolium), sâm Ngọc linh (Panax vietnamensis) (Washida và cs, 1998 ; Yang và Choi, 2000 ; Kochan và cs,

2012; Hà Thị Loan và cs, 2014)

Nguyễn Như Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một

số yếu tố lên sự cảm ứng rễ tơ cây dừa cạn (catharanthus roseus) của chủng

Agrobacterium rhizogenes C26 Kết quả nghiên cứu này cho thấy sự cảm ứng tạo rễ

tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A rhizogenes C26 chịu ảnh hưởng của yếu

tố mật độ tế bào trong huyền phù vi khuẩn (OD600 nm), thời gian gây nhiễm, thời gian ủ cảm ứng, chế độ chiếu sáng và môi trường nuôi cấy Điều kiện gây nhiễm thích

hợp để thu nhận rễ tơ từ giống dừa cạn VIN077 bằng chủng A rhizogenes C26 là

OD600 = 0,2 với thời gian ngâm mẫu là 10 phút Tỷ lệ mẫu hình thành rễ đạt cao nhất khi mẫu được ủ cảm ứng 6 ngày trong tối và loại nhiễm vi khuẩn ở điều kiện chiếu sáng 1000 lux trên môi trường White bán đậm đặc

Ninh Thị Thảo và cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ

tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

ATCC 15834 và bước đầu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối rễ

tơ Trong ba loại vật liệu lây nhiễm với vi khuẩn (lá, cuống lá và đoạn thân), mô lá là vật liệu thích hợp nhất để cảm ứng rễ tơ đan sâm Mật độ vi khuẩn cho tỷ lệ mô lá cảm ứng tạo rễ đạt cao nhất (53,85%) tương ứng với giá trị mật độ quang OD600 = 0,2

Bùi Đình Thạch (2016) tiến hành nghiên cứu tạo rễ tơ cây bạch hoa xà

(Plumbago zeylanica L.) từ chủng vi khuẩn A.rhizogens ATCC 11325 đã tạo được 4

dòng rễ tơ mang gen rolB, trong đó chỉ có 1 dòng mang cả 2 gen rolB và rolC Qua

mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu

với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao

nhất (0,025%)

Phan Trung Hải và cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy

rễ tơ cây hoa móng tay (impatiens balsamina) từ mười bốn chủng Agrobacterium

rhizogenes và kết quả là ba chủng vi khuẩn (C02, C18 và C26) cho tỷ lệ cảm ứng

hình thành rễ tơ cao trên cây Hoa Móng tay và khảo sát được một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng tạo rễ tơ từ các chủng chọn lọc Trong đó mô lá là vật liệu thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ trên cây Hoa Móng tay khi xâm nhiễm với mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 1,0 với thời gian gây nhiễm là 5 đến 15 phút và thời gian đồng nuôi cấy là 72 giờ Dòng rễ tơ được cảm ứng từ chủng C02 cho khả năng sinh trưởng nhanh nhất

Lê Xuân Thao (2014) tiến hành thực hiện tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang

gen cry3 thông qua chủng Agrobacterium rhizogens ATCC15834/PTN289 và Chủng

Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3 đã xác định được điều kiện thích hợp cho quá

trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A rhizogens sử

dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus Bước đầu đã thu nhận được một dòng khoai lang KB1 mang gen cry3 kháng bọ hà

1.4 Tổng quan về cây lan kim tuyến

1.4.1 Nguồn gốc và phân bố

Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm

1810 thuộc phân họ Orchidoideae Trên thế giới đã thống kê được 51 loài Ở việt nam

hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc (Sách đỏ Việt Nam, 2007) Các loài lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 – 1600m cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí Trên thế giới, lan

kim tuyến có mặt ở Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Indonexia,… Riêng ở Việt Nam, nó phân bố ở Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô, Đắc Uy), Gia Lai (Kbang, Kon Hà Nừng)… (Phùng Văn Phê và cs, 2010)

Cây lan kim tuyến hay còn gọi là cây kim cương, lan gấm, mộc sơn thạch tùng,

là cây thân thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước, mang các

 Thân

Thân rễ: nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dài thân

rễ từ 5 - 12 cm Đường kính thân rễ từ 3 - 4 mm Số lóng trên thân rễ từ 3 - 7 lóng Chiều dài của lóng từ 1 - 6 cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông

Thân khí sinh: thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4 - 8 cm Đường kính thân khí sinh từ 3 - 5 mm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2 - 4 lóng Chiều dài mỗi lóng từ 1- 4 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt

rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với

5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ

Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ

lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6 lá, thông thường có 4 lá Kích thước của lá cũng thay đổi Các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau

rõ rệt

 Hoa, quả

Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng Cây ra hoa 1 lần vào tháng 10 - 12 Mùa quả chín

từ tháng 12 tới tháng 3 năm sau

1.4.4 Điều kiện sinh sống của lan kim tuyến

Lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 – 1600 m Cây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm,

kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí (Liu, Su, 1978 và Teuscher, 1978) Chúng thường mọc rải rác hoặc thành các đám nhỏ lẫn trong lớp thảm mục hoặc ở hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm Cây sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, chịu được thời tiết có sương mù dài ngày

Khí hậu nơi loài lan kim tuyến phân bố thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm Lượng mưa trung bình năm là 1,826 mm Độ ẩm không khí trung bình 85% Nhiệt độ trung bình năm từ dưới 200C đến 220C - 230C

1.4.5 Giá trị dược liệu của lan kim tuyến

Lan kim tuyến không chỉ đơn thuần là loài hoa đẹp làm cảnh mà người ta còn

sử dụng lan kim tuyến để chế tạo thảo dược, làm thuốc chữa bệnh Lan kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông,

có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyền)

Trước đó, lan kim tuyến là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958) Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa tuyên bố: Kim tuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong tiệm thuốc bắc Đài Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, giải trừ u uất, tiêu đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái tháo đường, chữa viêm gan, trị mụn dùng cây tươi sắc uống Nghiên cứu của Đại học Y Tapei (Đài Loan) chứng minh dịch chiết từ lan kim tuyến có khả năng làm ngưng sự phát triển của tế bào ung thư Chính vì lan kim tuyến có nhiều công dụng chữa các loại bệnh khác nhau như vậy nên trở thành thảo dược quý hiếm cần được bảo tồn

1.4.6 Nhân giống cây lan kim tuyến

 Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt hay còn gọi là nhân giống vô tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan là do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó Hoa lan là một loài hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính

bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự

nhiên được côn trùng thực hiện trên cở sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

Ở vườn trồng lan, để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo, có thể cùng cây hoặc khác cây Phương pháp này có nhiều ưu điểm, dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khỏe, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm của thụ phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống Tuy nhiên trong thực tế hạt lan kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỷ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

 Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3 – 5 lá, cây cứng cáp có thể tách

để trồng riêng Đây là cách nhân giống đơn giản, dễ làm

 Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu Đặt các đoạn này vào nơi ẩm, chỉ cần cát và rêu Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới Phương pháp này cổ điển, dễ làm, quen với tập tính, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp Tuy nhiên, phương pháp này cũng

có một số trở ngại: chậm (tăng khoảng 2 – 4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hóa, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển,

từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Phí Thị Cẩm Miện, 2012)

 Nhân giống in vitro

Để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của hạt lan kim tuyến, hiện nay người ta dùng

nấm Rhizoctonia cộng sinh với hạt, đã làm tăng tỷ lệ nảy mầm lên 80% trong môi

trường OMA, gồm bột yến mạch, dịch chiết nấm men và agar (Ling-Chin Chou and Doris Chi-Ning Chang, 2003)

1.4.7 Tình hình nghiên cứu cây lan kim tuyến

 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) đã nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một

cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005) Chow và cs (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh

khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng Năm 1987, Liu và cs đã chọn

chồi đỉnh để nuôi cấy mô Cũng năm 1987, Ho và cs, năm 1992, Lee và cs đã sử dụng phôi hạt để làm vật liệu nuôi cấy

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen,

Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài lan kim tuyến

(Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2

MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA

Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus

formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2

mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 2% than hoạt tính

 Tình hình nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây, nước ta đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình

thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan kim tuyến như:

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi

đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1 g/l + 20N-20P-20K 1 g/l) + 2 g/l peptone Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1 mg/l BAP (hoặc 1 - 2 mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành,

đã đạt những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài lan kim tuyến –

Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl

Năm 2010, Phan Ngọc Khoa, trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu

ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan kim tuyến

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 2/2017 đến cuối tháng 6/2017

- Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Hình 2.1 Cây Lan Kim tuyến ngoài tự nhiên

(nguồn: www.botanyvn.com)

Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan kim tuyến

(Anoectochilus setaceus Blume) của Trunng tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM

2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất

 Trang thiết bị - dụng cụ

- Tủ cấy vô trùng