Khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài “Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng lo

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG

U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN

MANG TÍNH GIA ĐÌNH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Hiền MSSV: 1515100017 Lớp: 15HSH01

đình” là thành quả nghiên cứu trên cơ sở số liệu thực tế và được thực hiện dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của giáo viên hướng dẫn

Mọi tham khảo trong đồ án này đều được trích dẫn rõ ràng nguồn gốc

Mọi sao chép vi phạm quy chế của nhà trường em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ Hiền

đạt những kiến thức, lòng nhiệt huyết cũng như niềm đam mê nghiên cứu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn em các thông tin về lâm sàng, về kiến thức sinh học phân tử trong suốt thời gian làm đồ án

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các anh chị ở Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Tp HCM đã luôn quan tâm, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này Thời gian học hỏi và làm việc trong môi trường thân thiện, luôn nhận được sự giúp đỡ cũng như góp ý nhiệt tình của anh chị ở Trung tâm là khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình làm việc

Và trên hết, con xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình Cảm ơn cha, mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng con khôn lớn, luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, dõi theo bước đường con đi

Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Mỹ Hiền

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.6.2 Phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.3 Vật liệu 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

3.2 Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu 35

3.3 Kết quả, bàn luận tinh sạch sản phẩm PCR 37 3.4 Phản ứng cycle sequencing và đọc kết quả giải trình tự 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại 2

MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging)

NCBI National Center For Biotechnology Information

RNA Ribonucleic acid

SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms) VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Trình tự mồi xuôi và mồi ngược dùng cho phản ứng PCR 21

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 2.3: Các thông số điê ̣n di DNA bằng gel agarose 28

Bảng 2.4: Thành phần trong một phản ứng cycle sequencing 32

Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA 33

Bảng 3.1: Kết quả đo nồng độ nucleic acid trong mẫu 35

Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự phát hiện SNP tại exon 11, 13 [1] 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết 5

Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang 8

Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10 10

Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET 12

Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide 14

Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide 15

Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân 18

Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 26

Hình 2.3: Các chu kỳ của PCR 26

Hình 2.4: Mô tả quá trình tinh sạch sản phẩm PCR 30

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm các exon 10, 11,13, 14 - 15,16 36

Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn 39

Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn 39

Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn 40

Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn 40

Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn 41

Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn 41

Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn 42

Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn 42

Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn 43

Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn 43

MỞ ĐẦU

U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) là bệnh nội tiết hiếm tại Việt Nam Tìm hiểu về căn bệnh này giúp chúng ta có những biện pháp phòng ngừa, giảm nguy cơ mắc bệnh cũng như kịp thời thăm khám nếu gặp các triệu chứng bất thường Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs), với các triệu chứng lâm sàng là đánh trống ngực, nhức đầu và ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp, tiết các chất catecholamines (CATE) [9] Theo dõi lâm sàng là điều cần thiết để chẩn đoán và điều trị PPGLs, hầu hết các khối u tiết CATE nếu không được điều trị thì tỷ lệ tử vong do tim mạch cũng như di căn sang các mô, cơ quan lân cận rất cao Việc xác định bất thường di truyền là quan trọng vì ít nhất 1/3 bệnh nhân bị PPGLs có đột

biến dòng mầm gây bệnh ở 1 trong số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [5,9,11] Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm

sàng, bệnh nhân PPGLs cần được thăm khám và kiểm tra di truyền cho người thân

để sàng lọc di truyền gây bệnh Xuất phát từ thực tiễn trên nhóm tiến hành đề tài

“Khảo sát đột biến gen RET trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận

mang tính gia đình” bằng cách sử dụng phương pháp mô tả hàng loạt ca, với mục

tiêu cụ thể:

- Giải trình tự 6 exon gen RET (exon 10,11,13,14,15,16)

- Phân tích kết quả giải trình tự gen dựa trên dữ liệu ngân hàng gen National Center For Biotechnology Information (NCBI)

Đồ án tốt nghiệp gồm có 4 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp

Chương 3: Kết quả – Bàn luận

Chương 4: Kết luận – Kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 U sắc bào tuyến thượng thận

1.1.1 Giới thiệu

Paragangliomas (PGLs) là khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm ở các hạch thần kinh giao cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể, khi khối u nằm ở tủy thượng thận thì gọi là pheochromocytomas (PCCs) và thường tiết các chất catecholamines (CATE): epinephrine, norepinephrine, dopamine Khoảng 80-85% các khối u là PCCs và 15-20% là PGLs [9]

Tủy thượng thận nằm ở trung tâm của mỗi tuyến thượng thận bao gồm các tế bào thần kinh nội tiết (chromaffin) sản xuất và giải phóng epinephrine (adrenaline) vào máu để đáp ứng với kích hoạt của hệ thống thần kinh giao cảm Neuroblastoma (u nguyên bào thần kinh) và pheochromocytomas (PCCs) là hai loại u quan trọng nhất phát sinh từ tủy thượng thận Cả hai loại u này cũng có thể phát sinh từ các vị trí ngoài tuyến thượng thận, cụ thể trong vùng cận hạch của chuỗi giao cảm [17]

U sắc bào tuyến thượng thận bao gồm u lành tính hoặc ác tính của thượng thận Một trong số đó được chú ý đến do sản xuất thừa hormones nội tiết Ung thư thượng thận là sự hiện diện của các khối u ác tính ở tuyến thượng thận, bao gồm u nguyên bào thần kinh, ung thư biểu mô vỏ thượng thận (adrenocortical carcinoma) và một

số u tế bào ưa crôm thượng thận (PGLs) [1] Hầu hết u tế bào ưa crôm và tất cả các

u tuyến thượng thận là những khối u lành tính, không di căn hoặc xâm lấn các mô lân cận, nhưng có thể gây ra vấn đề sức khỏe đáng kể bởi sự mất cân bằng hormones

Sự phổ biến của PPGLs ở bệnh nhân tăng huyết áp trong phòng khám ngoại trú nói chung dao động từ 0,2 - 0,6% Ở trẻ em bị tăng huyết áp, sự phổ biến của PPGLs là khoảng 1,7% Gần 5% bệnh nhân PCCs có khối u thượng thận tình cờ được phát hiện trên hình ảnh giải phẫu Nghiên cứu khám nghiệm tử thi cho thấy khối u không được chẩn đoán trong 0,05 - 0,1% bệnh nhân [9]

PCCs sản xuất, tích trữ và tiết CATE Hầu hết PCCs tiết cả epinephrine và norepinephrine và sự tiết này không liên quan đến kích thích thần kinh Ngoài ra, PCCs còn tiết các hormones khác như adrenocorticotropic hormone, somatostatin,

calcitonin, oxytocin và vasopressin Nhiều công trình nghiên cứu về PPGLs đã đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là: 10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài thượng thận và 10% không chức năng [11]

PCCs có ở mọi lứa tuổi, có thể độc lập hoặc liên kết với một hội chứng ung thư

di truyền, chẳng hạn như đa u thần kinh nội tiết (Multiple endocrine MEN) loại 2A và 2B, u xơ thần kinh (neurofibromatosis) loại 1 (NF1), hoặc hội chứng Von Hippel-Lindau (VHL) Chỉ có 10% PCCs thượng thận ác tính, phần còn lại là lành tính [21] Chẩn đoán xác định bằng đo nồng độ của các chất chuyển hóa CATE trong nước tiểu Hầu hết PCCs được điều trị ban đầu với các thuốc kháng adrenergic, phẫu thuật được sử dụng để loại bỏ khối u khi bệnh nhân ổn định

neoplasma-1.1.2 Nguyên nhân

U sắc bào tuyến thượng thận có thể xuất hiện đơn lẻ (các khối u đặc, một bên và

u ở trong vùng thượng thận) hoặc có tính chất gia đình (điển hình cũng ở tủy thượng thận nhưng thường nhiều ổ và ở cả 2 bên), ở hai nghiên cứu lớn, tần suất u tủy thượng thận có tính chất gia đình chiếm khoảng 30% và thường nằm trong bệnh cảnh của hội chứng di truyền trội nhiễm sắc thể thường Những bất thường di truyền phối hợp với u tủy thượng thận có thể là nguyên nhân do đột biến gen sinh ung thư

như RET hoặc gen ức chế u như VHL hoặc NF1 Khuyến cáo sàng lọc di truyền cho

những bệnh nhân được chẩn đoán u tủy thượng thận trước 20 tuổi, u thượng thận 2 bên, đa u cận hạch, hay cho những bệnh nhân có tiền sử gia đình có người mắc u tủy thượng thận hay u cận hạch [22]

Vì PCCs xuất phát từ vùng tủy thượng thận, các khối u này giải phóng không liên tục một lượng các CATE có tác dụng sinh học gây ra các triệu chứng co mạch với tăng cả huyết áp tâm thu, tâm trương và tăng nhịp tim Trong tế bào ưa crôm, norepinephrine và epinephrine được chuyển hóa bởi enzyme O-methyl transferase thành các dẫn xuất O-methyl tương ứng lần lượt là normetanephrine và metanephrine Vì chuyển hóa CATE trong khối u độc lập với sự tình trạng giải phóng CATE (CATE có thể được giải phóng từng lúc hoặc với tỷ lệ thấp), định lượng các chất chuyển hóa của CATE ở huyết tương và ở nước tiểu có độ nhạy cao

hơn và đóng vai trò căn bản trong chẩn đoán u tủy thượng thận [22]

Ngoài ra, môi trường ô nhiễm, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, sử dụng rượu bia trong thời gian dài,… cũng làm tăng nguy cơ ung thư tuyến thượng thận

1.1.3 Biểu hiện

- Triệu chứng lâm sàng thường có: đánh trống ngực, nhức đầu, ra nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp (lúc này triệu chứng trên sẽ có độ nhạy 91%, độ đặc hiệu 94%)

- Tiết nhiều CATE có thể dẫn đến suy tim, phù phổi, loạn nhịp và xuất huyết nội sọ Tuy nhiên triệu chứng nổi trội nhất vẫn là tăng huyết áp Tăng tiết CATE làm cho bệnh nhân loạn nhịp tim Các cơn kịch phát thường kéo dài dưới 1 giờ và có thể

bị thúc đẩy bởi phẫu thuật, thay đổi tư thế, tập thể dục, mang thai [22]

1.1.4 Xét nghiệm chẩn đoán

Theo hướng dẫn thực hành của Hội Nội tiết lâm sàng khuyến cáo:

- Xét nghiệm sinh hóa ban đầu: đo huyết tương metanephrines tự do hoặc metanephrines phân đoạn niệu, lấy mẫu máu bệnh nhân theo hướng dẫn của tài liệu tham khảo, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng: phổ khối lượng hoặc phát hiện điện hóa Đề nghị những bệnh nhân có kết quả xét nghiệm là dương tính cần được theo dõi mức độ tăng giá trị và biểu hiện lâm sàng [9]

- Hình ảnh học: chụp cắt lớp vi tính (CT), chụp MRI ở bệnh nhân có di căn, sử dụng 123 I-metaiodobenzylguanidine (MIBG) ghi xạ hình, sử dụng 18 F-fluorodeoxyglucose (18 FFDG) chụp cắt lớp phát xạ [9]

- Kiểm tra di truyền: thử nghiệm di truyền tại các phòng thí nghiệm uy tín với những bệnh nhân nghi ngờ đột biến dòng mầm và được tư vấn sau khi có kết quả [9]

1.1.5 Điều trị

- Cắt bỏ hoàn toàn khối u

- Điều chỉnh chế độ ăn uống có nhiều natri và chất lỏng để điều hòa việc tiết CATE gây ra co huyết khối để ngăn chặn hạ huyết áp nghiêm trọng sau khi loại bỏ khối u

1.2 Bất thường di truyền

Cứ 3 ca PPGLs thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ yếu là do đột biến

dòng mầm tại 1 trong số 14 gen gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A [9]

Hình 1.1: Mô tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn của Hội Nội tiết

Có thể nghi ngờ 6 bệnh khác nhau về gia đình có biểu hiện lâm sàng: bệnh NF1, MEN2, VHL, ung thư biểu mô tế bào thận với đột biến SDHB [13], khối u car-ney (u tuyến thượng thận, khối u hạch dạ dày, chondroma phổi) và hội chứng Carney-Stratakis (u tuyến tụy và sarcomas dạ dày) [14]

Các hội chứng MEN2 và VHL thường được đặc trưng bởi các dấu hiệu lâm sàng

riêng biệt hướng tới việc kiểm tra các gen RET và VHL Phát hiện đột biến gen NF1 rất

phức tạp mặc dù xét nghiệm có sẵn trong các phòng xét nghiệm trực tuyến, việc chẩn đoán xác định hội chứng chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng [12]

Tuy nhiên, một số bệnh nhân có đột biến gen NF1 và một số báo cáo về PPGLs đều

có đặc điểm tương đồng [4, 6] Những phát hiện này cho thấy tầm quan trọng của việc

điều tra về dấu hiệu lâm sàng có thể xảy ra của một đột biến cơ bản ở tất cả các bệnh nhân PPGL

Với bệnh gia đình (di truyền) việc phát hiện nguyên nhân gây bệnh giúp tư vấn di truyền chẩn đoán, điều trị sớm các thành viên khác trong gia đình

*Theo tờ báo của Hiệp hội Mỹ về việc quản lý bệnh Ung thư tuyến giáp dạng tuỷ [16]

Nhóm bệnh MEN2A có đến 95% bệnh nhân đột biến gen RET ở codon 609, 611,

618 và 620 ở vị trí exon 10 hoặc codon 630, 634 của exon 11

Hầu như tất cả bệnh nhân có biểu hiện u tuyến giáp dạng tuỷ và một số ít bệnh nhân mắc bệnh PCCs hoặc u tuyến cận giáp, thường phụ thuộc vào đột biến đặc

trưng của RET

Ví dụ như đột biến RET ở codon 634 khiến nguy cơ mắc PCCs cao và tăng theo

Khoảng 75% trường hợp MEN2B riêng lẻ và bệnh nhân bị ảnh hưởng bởi đột

biến ở gen RET, 25% trường hợp xảy ra có liên quan đến di truyền trong gia đình Với những bệnh nhân đột biến ở gen RET, có đến 95% bệnh nhân bị đột biến ở

exon 16 (codon M918T) và 5% ở exon 15 (codon A883F)

Tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh MEN2B phổ biến ở độ tuổi 20 cho đến 30

Tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2005 – 2010), theo khảo sát ở 74 bệnh nhân về đặc điểm

lâm sàng và cận lâm sàng các trường hợp u sắc bào tuỷ thượng thận, chúng tôi nhận thấy rằng độ tuổi mắc bệnh trung bình từ 40 – 49 tuổi (chiếm 39,2%) Đặc điểm thường gặp ở các khối u được thống kê như sau:

· U bên phải: thường nhỏ hơn u bên trái và có kích thước khoảng 5,38 ± 3,65 cm

· U ở cả 2 bên: 3 ± 0,82 cm và nhỏ hơn so với những trường hợp chỉ có 1 u (6,02

± 4,19 cm)

Một công trình khảo sát các yếu tố di truyền liên quan PCCs cho thấy:

- Khảo sát trên 2499 đối tượng trong khoảng thời gian 10 năm (2001 – 2010), có

1620 trường hợp riêng lẻ và 879 trường hợp liên quan đến di truyền gia đình [5]

- Trong 363 trường hợp riêng lẻ (22,4%) có 269 đột biến ở hệ gen SDHx (137 – SHDB, 100 – SDHD, 30 – SHDC, 2 – SHDA), 64 đột biến xảy ra ở gen VHL, 23 – RET và 7 – TMEM127 [5]

- Xét theo tỷ lệ 363/1620 trường hợp đột biến riêng lẻ (22,4%; 23,5% là các bệnh

nhận bị hội chứng NF1) Các gen SDHB, SDHD và gen VHL là những gen đột biến xảy ra ở phần lớn các bệnh nhân, mà trong đó đột biến SDHB chiếm 37,7%; 27,5%

ở SDHD; 17,6% ở VHL; 8,26% ở SDHC; 6,3% ở RET; 1,93% ở TMEM127 và 0,55% ở SDHA Không phát hiện đột biến ở gen SDHAF2 [5]

- 137 bệnh nhân đột biến gen SDHB (119 đột biến điểm, bao gồm: đột biến thay

thế, nhân đôi, cắt hoặc chèn 1 điểm nhỏ và 18 trường hợp đột biến vùng) [5]

- Ở gen VHL có 64 bệnh nhân (63 trường hợp đột biến điểm và 1 đột biến vùng)

- Bệnh nhân mang gen đột biến SDHD có 100 người (95 trường hợp đột biến

điểm và 5 trường hợp đột biến vùng)

- Đột biến SDHC có 30 bệnh nhân (25 trường hợp đột biến điểm và 5 trường hợp

· Đột biến gen RET – 1,42%

· Đột biến gen TMEM127 – 0,43%

· Đột biến gen SDHA – 0,12%

1.3 Các bệnh và hội chứng liên quan

1.3.1 Hội chứng NF1

NF1 là một rối loạn di truyền đa chức năng được đặc trưng bởi các phát hiện về

da, đặc biệt là các điểm hạt cà phê và tàn nhang, do loạn sản xương và do sự phát triển của hệ thống khối u thần kinh lành tính và ác tính, đáng chú ý nhất là các mô thần kinh lành tính [17]

Hình 1.2: Bé trai 4 tuổi có biểu hiện điểm hạt cà phê và tàn nhang

1.3.2 Hội chứng VHL

Hội chứng VHL có liên quan đến PCCs PCCs thường không gây ung thư, chúng

có thể không gây triệu chứng, nhưng trong một số trường hợp, chúng có liên quan đến nhức đầu, các cơn hoảng loạn, đổ mồ hôi quá nhiều hoặc huyết áp cao nguy

hiểm và có thể không đáp ứng với thuốc PCCs đặc biệt nguy hiểm nếu chúng phát triển trong thai kỳ [18]

1.3.3 Hội chứng MEN

Đa u tuyến nội tiết là một nhóm rối loạn ảnh hưởng đến mạng lưới sản sinh hormones của cơ thể được gọi là hệ thống nội tiết Hormones là những chất hoá học được phóng thích vào máu, điều chỉnh chức năng của tế bào và các mô khắp cơ thể

Đa u tuyến nội tiết thường liên quan đến khối u ở ít nhất hai tuyến nội tiết, khối u cũng có thể phát triển ở các cơ quan và mô khác Những sự tăng trưởng này có thể không ung thư (lành tính) hoặc ung thư (ác tính) Nếu khối u trở thành ung thư, tình trạng có thể đe dọa tính mạng [19]

Các đột biến gen MEN1 gây ra nhiều loại đa u tuyến nội tiết loại 1 Gen này mã

hóa cho việc sản xuất một protein gọi là menin Menin hoạt động như một chất ức chế khối u, có nghĩa là nó giữ cho tế bào không tăng trưởng và phân chia quá nhanh hoặc phân chia không kiểm soát được Mặc dù chức năng của menin không rõ ràng, nhưng nó có thể tham gia vào chức năng khác của tế bào như sao chép và sửa chữa DNA và điều chỉnh hoạt động của các gen khác Khi đột biến làm vô hiệu hóa cả

hai bản sao của gen MEN1, menin không còn khả dụng để kiểm soát sự tăng trưởng

và phân chia tế bào, sự mất mát của protein này làm cho các tế bào phân chia quá nhiều, dẫn đến sự hình thành các khối u đặc trưng của đa u tuyến nội tiết loại 1 [19, 23]

Dấu hiệu phổ biến nhất của đa u tuyến nội tiết loại 2 là một dạng ung thư tuyến giáp được gọi là ung thư tuyến giáp dạng tủy Một số người bị rối loạn này cũng đồng mắc PCCs dẫn đến cao huyết áp Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân típ: loại 2A, loại 2B và ung thư tuyến giáp dạng tủy mang tính gia đình (FMTC) Những phân nhóm này khác nhau về dấu hiệu, triệu chứng đặc trưng và nguy cơ của các khối u cụ thể Ví dụ, cường giáp xảy ra chỉ ở loại 2A và ung thư tuyến giáp là đặc điểm duy nhất của FMTC Các dấu hiệu và triệu chứng của đa u tuyến nội tiết loại 2 là tương đối phù hợp trong bất kỳ một gia đình nào [19, 23]

Các đột biến trong gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 Gen này mã hóa cho

việc sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào Protein RET kích hoạt các phản ứng hóa học hướng dẫn tế bào phản ứng với môi trường của chúng, ví dụ

bằng cách phân chia hoặc sinh trưởng Các đột biến trong gen RET kích hoạt chức

năng báo hiệu của protein, có thể kích hoạt sự tăng trưởng và phân chia tế bào khi không có các tín hiệu từ bên ngoài tế bào Sự phân chia tế bào không kiểm soát này

có thể dẫn đến sự hình thành các khối u ở các tuyến nội tiết và các mô khác[19, 23]

1.4 Cấu trúc, đột biến, chức năng của gen RET

Gen RET được tìm thấy sau khi gây nhiễm dòng tế bào nguyên bào sợi 3T3 với DNA lấy từ các tế bào lymphoma của người Gen RET nằm trên nhiễm sắc thể số

10, nhánh dài, vùng 1, băng 1, băng phụ 2 (10q11.2) và gồm 20 exon [10, 20]

Hình 1.3: Vị trí gen RET trên nhiễm sắc thể số 10

Sự nối ghép tự nhiên của gen RET tạo ra 3 dạng đồng phân khác nhau của

protein RET: RET51, RET43 và RET9 chứa 51, 43 và 9 Aa trong đuôi C cuối cùng của chúng [10]

RET là protein xuyên màng Mỗi protein được chia thành ba miền: một miền ngoại bào N với bốn lần lặp đi lặp lại giống như cadherin (là một protein 2 thành phần, phần bên trong tế bào gắn với khung xương của tế bào và phần bên ngoài tế bào là polypeptide có 5 đồng phân gắn kết với nhau) và một vùng giàu Cystein, một miền màng xốp kẽm và một miền tyrosine kinase nội bào, được chia ra bởi sự chèn thêm

27 Aa Trong miền tyrosine kinase nội bào, có 16 Tyrosines (Tyrs) trong RET9 và 18 trong RET51 Tyr1090 và Tyr1096 chỉ có ở dạng đồng vị RET51 [10, 15]

Miền ngoại bào của RET chứa chín vị trí N-glycosyl hóa Protein RET được

glycosyl hóa hoàn toàn được báo cáo có trọng lượng phân tử là 170 kDa mặc dù không rõ ràng là nó có cấu tạo nên trọng lượng phân tử này liên quan [10]

Gen RET mã hóa sản xuất một protein liên quan đến tín hiệu trong tế bào Protein

này dường như rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của một số loại tế bào thần kinh, bao gồm hệ thống thần kinh tự trị, thần kinh ruột non Protein RET cũng cần thiết cho sự phát triển bình thường của thận và sản sinh ra tinh trùng (sự hình thành tinh trùng)

Protein RET có một đầu của protein nằm trong màng tế bào và đầu còn lại nằm ngoài màng tế bào Chính vị trí này của protein cho phép nó tương tác với các yếu

tố cụ thể bên ngoài tế bào và nhận các tín hiệu giúp tế bào phản ứng với môi trường của nó Khi các phân tử kích thích sự phát triển và tăng trưởng (các yếu tố tăng trưởng) gắn với protein RET, một chuỗi các phản ứng hóa học phức tạp bên trong tế bào được kích hoạt Những phản ứng này chỉ dẫn cho tế bào trải qua những thay đổi nhất định, chẳng hạn như phân chia hoặc trưởng thành để có các chức năng đặc biệt

Đột biến gen RET được biết là gây ra một dạng đa u tuyến nội tiết loại 2 Đa u

tuyến nội tiết thường liên quan đến sự phát triển của các khối u ở hai hoặc nhiều tuyến sản sinh hormones của cơ thể, được gọi là tuyến nội tiết Những khối u này có thể không ung thư hoặc ung thư Đa u tuyến nội tiết loại 2 được chia thành ba phân típ: loại 2A, loại 2B, và carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình Những phân típ này được phân biệt bằng các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng và nguy cơ của các khối u đặc biệt [18]

Hầu hết các đột biến gen RET gây ra đa u tuyến nội tiết loại 2 làm thay đổi

protein RET (thông qua thay đổi trình tự amino acid (Aa)) Loại 2A thường xuất phát từ đột biến thay thế Aa Cysteine bằng Arginine ở codon 634 (Cys634Arg hoặc C634R) Hơn 90% các trường hợp loại 2B là do đột biến thay thế Aa Methionine bằng Threonine ở codon 918 (Met918Thr hoặc M918T) Một số thay thế Aa có thể gây ra carcinoma tuyến giáp dạng tủy mang tính chất gia đình [5,9]

Thụ thể tyrosine kinase là một protein xuyên màng, trong điền kiện tự nhiên các thụ thể này được kích hoạt khi có sự phối hợp của các đồng thụ thể (co-receptor) để

tiến hành chuyển nhóm phosphate của phân tử Aa Tyrosine cao năng thành các phân tử đặc hiệu phục vụ chuyển hóa năng lượng cho hoạt động sống bình thường Khi bị đột biến gen, các thụ thể này hoạt động không kiểm soát, sinh ra các bệnh và

có thể là ung thư [10]

Hình 1.4: Cơ chế phân tử của đột biến gen RET

Gen RET mã hóa cho thụ thể tyrosine kinase là thành phần của yếu tố dẫn xuất dòng tế bào thần kinh (GDNF) có nguồn gốc tín hiệu ngoại bào, đột biến gen RET

có liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư ở người, bao gồm phình đại tràng bẩm sinh (Hirschsprung disease), ung thư phổi, ung thư tuyến giáp, đa u tuyến nội tiết loại 2A và 2B, tăng hồng cầu và tăng sản cận tử cung và một số ung thư khác [10]

khác nhau trong họ GFRα (GFRα1, GFRα2, GFRα3, GFRα4) có hoạt động ràng buộc cụ thể đối với một GFL cụ thể Khi tạo phức GFL-GFRα, phức hợp sau đó sẽ kết hợp hai phân tử của RET, gây ra trans-autophosphorylation các dư lượng Tyrosine cụ thể trong miền tyrosine kinase của mỗi phân tử RET Tyr900 và Tyr905 trong vòng lặp kích hoạt (vòng lặp A) của miền kinase đã được chứng minh là các

vị trí tự quang phổ bằng quang phổ khối Phosphoryl hóa Tyr905 ổn định cấu hình hoạt tính của kinase, do đó dẫn đến sự tự phospho hóa các dư lượng Tyrosine khác, chủ yếu nằm trong vùng đuôi C của phân tử [3, 15]

1.5 Các phương pháp giải trình tự

1.5.1 Phương pháp hóa học

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh ra phương pháp hóa học để giải trình tự một đoạn DNA Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert khó thực hiện vì phải xác định nhiều thông số cho thí nghiệm Vì vậy, hiện nay người

ta sử dụng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội [21]

đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào Nhờ vậy trong ống phản ứng có các

mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc

- Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính (hình 1.5) Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam

và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải trình tự của đoạn DNA [21]

Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide

1.5.3 Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)

Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chủ yếu, đó là: Phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ [21] Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA (hình 1.6)

Hình 1.6: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyarylamide

Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng bốn màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu bốn loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chi trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây Nếu dùng điện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít [21]

1.5.4 Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-454 Pyrosequencing

Kỹ thuật pyrosequencing 454 được sáng tạo đầu tiên bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi của Viện Kỹ thuật Stockholm, Thụy Điển năm 1996

Kỹ thuật này được phát triển bởi công ty 454 Life Science, là một hệ thống giải trình tự DNA hai bước có độ tương đồng cao với dung lượng lớn hơn rất nhiều so với hệ thống giải trình tự Sanger Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý “giải trình tự bằng tổng hợp” bao gồm khởi động một sợi DNA được giải trình tự, và giải trình sợi DNA bổ sung bằng phản ứng của enzyme Đây là một hệ thống được kết hợp với việc khuếch đại số lượng lớn các đoạn DNA kèm cùng pyrosequencing dung

khối lớn trong các giếng picotiter Nguyên lý “giải trình tự bằng việc tổng hợp” cũng dựa trên việc nhận biết các pyrophosphate (PPi) được giải phóng trong quá trình gắn nucleotide, tạo ra một tín hiệu ánh sáng, hiệu quả hơn kỹ thuật kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide [7]

1.6 Cơ sở dữ liệu và phần mềm phân tích trình tự nucleotide

sở dữ liệu gen của tổ chức National Center For Biotechnology Information (NCBI) Trong đó, NCBI là cơ sở dữ liệu thường được lựa chọn vì quy mô lớn và phổ biến rộng rãi NCBI có giao diện liên kết đơn giản, dễ sử dụng với khả năng lưu trữ, tìm kiếm, so sánh và tính toán nhanh chóng

1.6.2 Phần mềm phân tích trình tự nucleotide

Công cụ CLC Sequence Viewer: Được thiết kế vào năm 2005 với tên gọi ban đầu

là CLC Free WorkBench bởi các nhà khoa học của CLC Bio Năm 2008, phần mềm này được đổi tên lại thành CLC Sequence Viewer Đây là phần mềm hỗ trợ cho phép người sử dụng dễ dàng thực hiện những phân tích dữ liệu trình tự DNA, ribonucleic acid (RNA) và protein như: sắp gióng cột các trình tự, nhận biết vị trí cắt giới hạn của các enzyme, phân tích biểu hiện gen, thiết kế mồi, sao chép phân

tử, phân tích phát sinh loài, kết hợp với quản lý dữ liệu theo thứ tự [8]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca được thực hiện trong thời gian từ 02/2017 đến tháng 05/2017 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân đã được chẩn đoán u sắc bào tuyến thượng

thận, những bệnh nhân này đồng ý tham gia nghiên cứu khảo sát đột biến gen RET

Mẫu thí nghiệm là 2 ml máu EDTA của người trong một gia đình gồm: 2 chị em gái và 2 người con gái của họ và một mẫu không phải là người trong gia đình này

Cha bệnh nhân có 2 người vợ:

Người vợ thứ 1: có 8 con chung, trong số này có 1 người con trai đột tử ở tuổi

30 (không rõ nguyên nhân), 1 người con trai đã phẫu thuật cắt khối u thượng thận 2 bên (không rõ chẩn đoán) và 1 người con gái có khối u thượng thận trái đã được phẫu thuật nhưng đã qua đời do đột quỵ

Người vợ thứ 2: Có 2 người con gái bao gồm bệnh nhân và chị gái Người chị gái đã phẫu thuật khối u thượng thận hai bên và bị đột quỵ sau khi phẫu thuật

Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân

Không có biểu hiện lâm sàng các hội chứng MEN2A, VHL, NF1

Huyết áp: 100/60 mmHg, trong cơn: 150/100 mmHg

Không có các sang thương da

Về cận lâm sàng:

- Xét nghiệm sinh hóa:

Catecholamin niệu/24h: (thể tích nước tiểu 2300 ml/24 h)

Adrenalin: 7,6 µg (bình thường <20 µg)

Noradrenalin: 199 µg (bình thường <90 µg)

Dopamin: 278,3 µg (bình thường <600 µg)

Metanephrine máu: 758 pg/ml (bình thường <90 µg/ml)

Cortisol máu (sau test Dexa liều thấp 1 mg qua đêm): 87,25 nmol/l

Calcitonin: 4,25 pg/ml (bình thường <14 pg/ml)

PRL: 9,28 ng/ml Calcium: 4,5 mEq/L

fT4, TSH: trong giới hạn bình thường

Siêu âm tuyến giáp: nhân giáp 18x9 mm FNA: lành tính

- Hình ảnh học:

CT scan: kết quả cho thấy khối u thượng thận phải 5x5cm

Sau mổ, kết quả giải phẫu bệnh: pheochromocytomas

Chẩn đoán sau phẫu thuật: U sắc bào tuyến thượng thận phải (pheochromocytomas)

- Xét nghiệm di truyền:

Bệnh nhân không có biểu hiện lâm sàng các hội chứng MEN2A, NF1 và VHL nên chúng tôi tiếp cận theo sơ đồ khuyến cáo của Hội Nội tiết Hoa Kỳ Theo khuyến cáo này, bệnh nhân có tăng tiết noradrenalin và khối u ở thượng thận nên

sẽ ưu tiên gen VHL

Tuy nhiên, được sự hỗ trợ tư vấn, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát gen

RET đầu tiên ở exon 10, 11, 13, 14, 15, 16 của gen và đã phát hiện bệnh nhân bị đột

biến c.1900T>C (p.Cys634Arg), một đột biến thường gặp gây ra hội chứng MEN2A

Bệnh nhân có tiền căn gia đình có tính chất nghi ngờ cao nên đã được tư vấn và chỉ định xét nghiệm di truyền cho những người thân trực hệ

- Thiết bị điện di (khay, lược)

- Bình tam giác thủy tinh

- Ống đong

Thiết bị:

- Máy lắc rung (vortex) - Micro ONE, Milipore

- Máy ly tâm eppendorf 5415 R (Eppendorf, Mỹ)

- Cân kỹ thuật

- Lò vi sóng

- Máy điện di Mupid – EXU (Advance, Nhật Bản)

- Máy soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản)

- Máy PCR Mastercycler Pro AG 6325 (Đức)

- Máy giải trình tự ABI 3500 Genetic analyzer (Appied Biosystems, Mỹ)

- Tủ mát (Sanyo, Nhật Bản)

- Tủ âm sâu 300

- Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 2000/2000c (Mỹ)

2.3.2 Hóa chất

Hóa chất tách chiết: sử dụng bộ kit tách máu QIAGEN DNA Mini Kit

Thành phần bộ kit: QIAamp Mini Spin Columns, Collection tubes (2ml), QIAGEN Protease (proteinase K), Ethanol (96 – 100%) và Buffers: AL, AW1, AW2, AE

Bảo quản: hóa chất được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 – 250C) và nơi khô ráo

Hóa chất PCR:

- Nước cất khử ion

- Takara TaqTM Hot Start Version (Takara, Nhật) (5units)

- dNTPs (mỗi loại 2,5 mM) Hòa tan trong nước có pH 7 - 9

- Mồi xuôi, mồi ngược