Khả năng sử dụng một số vi khuẩn lab phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của lactobacillus fermentum

LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum” trong suốt quá trình

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đặng Vân Anh MSSV: 1311100138 Lớp: 13DSH02

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Hoài Hương Giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kì hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình

Tp.HCM, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đặng Vân Anh

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân

lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp

phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của TS Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của ngày hôm nay Em xin chân thành cảm ơn cô

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy Cô giảng viên và Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận được nhiều nguồn tài liệu để hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định

Dù đồ án đã hoàn thành nhưng không tránh khỏi những sai sót nhất định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ quá trình thực hiện đồ án Kính mong nhận được sự góp ý và chỉ dạy của các Thầy Cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này

Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày tháng năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đặng Vân Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 3

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 4

5 Phương pháp nghiên cứu 4

6 Các kết quả đạt được 5

7 Kết cấu đồ án 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) 6

1.2 Tổng quan về Probiotic 19

1.3 Màng sinh học 31

1.4 Sâu răng 37

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 Địa điểm nghiên cứu 44

2.2 Thời gian thực hiện 44

2.3 Vật liệu và thiết bị 44

2.4 Phương pháp luận 45

2.5 Phương pháp thí nghiệm 47

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64

3.1 Kết quả thử nghiệm sinh lý 64

3.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa 67

3.3 Kết quả khả năng sinh enzyme 71

3.4 Kết quả khả năng kháng khuẩn 75

3.5 Kết quả khả năng kháng kháng sinh 77

3.6 Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi qua xử lý nhiệt 81

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84

1 Kết luận 84

2 Kiến nghị 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 85

PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 94

 Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA)

 Thành phần môi trường Blood agar:

 Beef heart infusion 500g

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales MRS de Man, Rogosa and Sharpe

SAS Statistical Analysis Systems

TSI Triple sugar iron

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ

răng miệng 3

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic 11

Bảng 1.2 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB 19

Bảng 2.1 Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng 62

Bảng 3.1 Kết quả thử nghiệm sinh lý 64

Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa 67

Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate 69

Bảng 3.4 Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic 71

Bảng 3.5 Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%) 76

Bảng 3.6 Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic 77

Bảng 3.7 Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý nhiệt 82

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Một số vi khuẩn lactic điển hình 8

Hình 1.2 Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic 13

Hình 1.3 Cơ chế tác động của Lactobacillus spp lên những vi khuẩn trong khoang miệng 28

Hình 1.4 Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic 29

Hình 1.5 Các giai đoạn hình thành màng sinh học 32

Hình 1.6 Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử 32

Hình 1.7 Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng

sinh học 35

Hình 1.8 Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon 36

Hình 1.9 Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng 39

Hình 1.10 Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng 39

Hình 1.11 Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 40

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 46

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn lactic bị xử lý nhiệt 63

Hình 3.1 Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic 66

Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí Dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi không có khí O2 67

Hình 3.3 Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium) 68

Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm H2S 68

Hình 3.5 Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli) 69

Hình 3.6 Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic 70

Hình 3.7 Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic 72

Hình 3.8 Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein 73 Hình 3.9 Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin 73 Hình 3.10 Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với

thử nghiệm β- galactosidase 74

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic 75 Hình 3.12 Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic 80 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn

lactic sau khi xử lý nhiệt 81

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì các nghiên cứu khoa học thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng ngày càng phát triển Ngày nay con người

đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, từ công nghiệp, nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v

Các nhà khoa học cùng với các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu trên toàn thế giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật mới để cho ra đời các giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các giống hiện có Bên cạnh đó người ta còn tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, các

bộ kit xác định bệnh, những nhân tố mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế

- xã hội và bảo vệ môi trường

Ngoài ra, đã có nhiều kết quả nghiên cứu khoa học áp dụng cho lĩnh vực công nghệ thực phẩm Từ những nghiên cứu đó chúng ta cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan và bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm không đơn giản chỉ là bổ sung năng lượng mà còn có thể giúp con người phòng chống một số bệnh, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể

Đi đôi với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu sử dụng các chế phẩm, thực phẩm cũng như việc sinh hoạt lành mạnh để có được sức khỏe tốt luôn là mục tiêu của rất nhiều người đang hướng tới Thời gian gần đây, chúng ta thường nghe nhiều về khái niệm “Probiotics” mà không phải ai cũng hiểu Probiotics là gì Probiotics trên thực tế chính là các vi khuẩn sống có lợi đường ruột, khi ăn vào đem lại các lợi ích sức khoẻ con người nhờ cải thiện hệ vi sinh đường ruột và chức năng của ruột Hai loài vi

khuẩn probiotics thông dụng hiện này Bifidobacteria và Lactobacillus Vi khuẩn

probiotic giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư Ngoài ra, việc có thể phát hiện được một loài vi khuẩn có khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của các vi khuẩn có hại trong khoang miệng để hạn chế khả năng gây sâu răng đồng thời mang

tính an toàn như một chủng vi khuẩn Probiotic cũng được khá nhiều nhà khoa học quan tâm và đó là lý em em chọn thực hiện đề tài này Em muốn mình có thể tìm hiểu cụ thể hơn về loại vi khuẩn này cũng như hy vọng rằng có thể vận dụng những điều mình biết được vào thực tế, cụ thể là khi làm việc sau này

Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L acidophilus và L casei có trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp khác và Streptococcus mutans trong

nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [48] Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho mát,

LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho mát có thể làm giảm tỷ lệ sâu

răng ở trẻ nhỏ [49]

Hallstrom và cộng sự cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic

L reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 không góp phần hình thành mảng bám

trong khoang miệng [44]

Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều

thông qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang

miệng Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1

Bảng 0 Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ

răng miệng [50]

Tác giả Chủng probiotic

Thời gian nghiên cứu

Độ tuổi –

số đối tượng nghiên cứu

Tổng MS trong khoang miệng

Tình trạng sâu răng

Nase và cs, 2001 L rhamnosus GG 7 m 1–6, 594  

Ahola và cs, 2002 Lactobacillus spp 3 w 18–35, 74  - Nikawa và cs, 2004 L reuteri ATCC 55730 2 w 20, 40  - Montalto và cs, 2004 Lactobacillus spp 45 d 23–37, 35  - Caglar và cs, 2005 Bifidobacterium animalis ssp

lactis DN-173010 2 w 21–24, 21  - Caglar và cs, 2006 L reuteri ATCC 55730 2 w 21–25, 120  - Caglar và cs, 2007 L reuteri ATCC 55730 3 w 21–24, 80  - Caglar và cs, 2008 Bifidobacterium lactis BB-12 10 d 20–24, 40  - Caglar và cs, 2009 L reuteri ATCC 55730, L reuteri

ATCC PTA 5289 10 d 20, 20  - Cildir và cs, 2009 Bifidobacterium animalis ssp

lactis DN-173010 2 w 12–16, 24  - Stecksen-Blicks và cs,

2009

L rhamnosus LB21

21 m 1–5, 174  

Lexner và cs, 2010 L rhamnosus LB21 2 w 12–15, 20  - Singh và cs, 2011 L acidophilus La5

Bifidobacterium lactis Bb-12 10 d 12–14, 40  - Jindal và cs, 2011 L rhamnosus, Bifidobacterium

longum, Saccharomyces cerevisae 14 d 7–14, 150  - Marttinen và cs, 2012 L rhamnosus GG, L reuteri

SD2112, L reuteri PTA 5289 2 w 20–30, 13  - Chuang và cs, 2011 L paracasei GMNL- 33 2 w 20–26, 70  - Cildir và cs, 2012 L reuteri ATCC PTA 5289, L

reuteri DSM 17938 25 d 4–12, 19  - Petersson và cs, 2011 L rhamnosus LB21 15 m 58–84, 160  

Taipale và cs, 2012 Bifidobacterium animalis BB-12

15 m

2 tháng tuổi đến 2 tuổi, 106

Juneja và Kakade, 2012 L rhamnosus hct 70 9 w 12-15, 40  - Sudhir và cs, 2012 L acidophilus 3 w 10-12, 40  -

(d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , không thay đổi; -, âm tính)

3 Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ khoang miệng Mục tiêu cuối cùng sau khi thực hiện các thử nghiệm khảo sát là xác định xem chúng có khả

năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum không và có đủ

an toàn để bổ sung vào các sản phẩm sử dụng cho con người và động vật không

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa

_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn

_ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh

_ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum

5 Phương pháp nghiên cứu

a) Phương pháp luận

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý: khả năng chịu nhiệt ở 10oC, 45oC, 60oC; khả năng chịu mặn: 3,5% NaCl và 6,5% NaCl; khả năng sinh bào tử; khả năng sinh dưỡng trong điều kiện kỵ khí

_ Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa: khả năng lên men carbohydrate; thử nghiệm MR – VP; thử nghiệm Citrate; Thử nghiệm Indole; khả năng sinh H2S

_ Khảo sát khả năng sinh enzyme: enzyme thủy phân Gelatin; enzyme thủy phân Casein; thử nghiệm tan huyết; thử nghiệm 𝛽 – Galactosesidase

_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục

_ Khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar Diffusion Test)

_ Khả năng ức chế tạo màng sinh học của Lactobacillus fermentum sử dụng các vi

khuẩn lactic sau xử lý nhiệt

b) Phương pháp xử lý số liệu

- Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị

- Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu.

6 Các kết quả đạt được

_ Chọn được chủng vi khuẩn lactic an toàn và có thể ứng dụng để ức chế sự hình thành

màng sinh học của Lactocbacillus fermentum

7 Kết cấu đồ án

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến

các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án

Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề

tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được

Chương 4: Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề

tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB)

1.1.1 Giới thiệu chung

Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển Đến nay, những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc

để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1875, L Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic 21 năm sau đó (1878), Lister

đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là

Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic

đã được hình thành

Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được công nhận là

an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người

Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3]

Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và

vi khuẩn gram (-) Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên

tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) [4]

1.1.2 Đă ̣c điểm hình thái của vi khuẩn lactic

Các tế bào có hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn cong, thường tạo thành chuỗi Không có khả năng di động (ngoại trừ một số chủng có tiên mao hoặc lông roi trên bề mặt cơ thể), không sinh bào tử, gram dương Một số chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue [51]

Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề mă ̣t bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Còn với trực khuẩn thì từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi

 Đặc điểm hình thái giống vi khuẩn lactic điển hình:

Trong số các vi khuẩn lactic, giống Lactobacillus được xem là đa ̣i diê ̣n cho chủng

vi khuẩn này

Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng : hình cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài

Hình 1.1 Mô ̣t số vi khuẩn lactic điển hình

a) Lactobacillus casei b) Latobacillus brevis c) Lactobacillus bulgaricus d) Lactobacillus plantarum

a)

b)

c)

d)

Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis, L

casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus …

Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng

riêng lẻ hoặc ở dạng que kép Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động,

không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng,

và chịu được nhiệt độ cao Ngoại trừ loài L plantarum thì những loài khác không có

khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định

Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật

và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có

chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis,

Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi

chất của chúng Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau:

- Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium,

có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC

- Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic

- Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích

trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn

Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ

do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp

1.1.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

1.1.3.1 Đă ̣c điểm sinh lý, sinh trưởng

Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt môi trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2 Có thể bị ức chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số loài thuộc nhóm sinh vật kỵ khí bắt buộc

Có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid nucleic, vitamin, khoáng, acid béo, ester acid béo và carbohydrate Các yêu cầu dinh dưỡng đặc trưng cho từng loài, thường là các chủng đặc biệt Nhiệt độ tăng trưởng từ

2 – 53oC, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40oC

Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH môi trường trung tính hoặc kiềm

Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic

Chi

Hình thái tế bào

Lên men lactic

Nhiệt

độ tăng trưởng,

o C

Khả năng chịu muối,%

1.1.3.2 Đă ̣c điểm sinh hoá

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram (+), oxidase âm tính, không có khả năng di đô ̣ng đồng thời không sinh bào tử, có khả năng lên men carbonhydrate

Hiếm khi khử nitrate, chỉ khi pH cuối cùng từ 6.0 trở lên hoặc có bổ sung vào môi trường tăng trưởng Không thủy phân gelatine (làm gelatine hóa lỏng), không phân giải

casein nhưng một lượng nhỏ nitơ hòa tan được sản xuất ra bởi hầu hết các chủng Thử nghiệm Indole âm tính và không sản xuất H2S

Catalase và cytochrome âm tính (không có prophyrin), tuy nhiên, một vài chủng của một số loài phân hủy H2O2 bằng pseudocatalase hoặc bằng chính catalase của heme có mặt trong môi trường Phản ứng Benzidine âm tính Hiếm có trường hợp hình thành sắc tố, nếu có sẽ xuất hiện màu cam, vàng, đỏ gạch [51]

1.1.3.3 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo

ra cũng khác nhau

Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình Lên men đồng hình gồm con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic Trong khi đó ở lên men lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO2, acetaldehyde, ethanol

Hình 1.2 Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic

A) Lên men đồng hình B) Lên men dị hình

 Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic

tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol,

diacetyl Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)

được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli,

Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase

để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và

glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo

thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử

thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được

oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra

chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình (Hình

1.2A)

 Lên men lactic dị hình

Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục

chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP được

tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic

Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị

khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này ngoài sản

phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol,

acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ [79] Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

 Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng

 Yếu tố môi trường

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến enzyme của tế bào vi sinh vật Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt

độ càng cao thì sự lên men càng mạnh Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở

nhiệt độ 30 – 40oC Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5oC [5]

 Ảnh hưởng của pH

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm và khi

nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ảnh hưởng lên sự phát triển của vi khuẩn lactic Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi,

pH tối ưu phải giữa 5.5 và 6.0

 Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3

 Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

_ Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính cảm quan và

dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối đồng thời kéo dài được thời gian bảo quản của các sản phẩm thực phẩm như bánh mì

_ Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau

_ Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…

_ Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium, Aspergillus, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm, ức chế mô ̣t số vk gây bê ̣nh trên các loài thuỷ hải sản Ngoài ra còn được ứng du ̣ng trong bảo quản ha ̣t giống do sự phát triển của nấm mốc như: bắp, đâ ̣u phô ̣ng,…

1.1.6 Hoa ̣t tính sinh học

Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic

và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người [6] [7]

1.1.6.1 Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic

LAB cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vâ ̣t có ha ̣i gây thối rữa thông qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đă ̣c biê ̣t là bacteriocin

Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với

chúng [8] Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc [9]

Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic

Bacteriocin còn có mô ̣t số ha ̣n chế như: ít được biết đến hơn chất bảo quản hoá

ho ̣c Bi ̣ thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein

Bacteriocin được ứng du ̣ng: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm

Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử du ̣ng để chống la ̣i các vi sinh vâ ̣t gây thối rữa và chức năng hoá có thể ức chế vi sinh vâ ̣t của chúng được tóm tắt như sau:

Bảng 1.2 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB [5]

H2O2 Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein

Hệ thống lactoperoxidase với

H2O2

Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa)

Reuterin

1.2 Tổng quan về Probiotic

1.2.1 Lược sử nghiên cứu

Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà

vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người bệnh và người khỏe mạnh Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi

là probiotic

Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người và động vật [83]

Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới

và Tổ chức Lương nông thế giới (WHO/FAO, 2001): “Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của người sử dụng.” [90]

Đây là những nhóm vi khuẩn (VK) sống trong đường tiêu hóa của người, chúng tạo thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc, sử dụng chúng như một phương tiện để vận chuyển vi khuẩn probiotic vào trong cơ thể, từ đó giúp phòng và chữa bệnh

1.2.2 Các vi sinh vật probiotic thường gặp

Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn,

xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB

Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp:

 Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999), một

số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó chủ

yếu là những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L acidophilus, L

casei, L plantarum, L bulgaricus, L kefir, L delbruckii, L sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis,…

Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế phẩm như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là một tá dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L acidophilus hay L sprorogenes,…) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L acidophilus, L

sprorogenes, L kefir, Streptococcus faecalis,…) Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic

là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có

lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác dụng trong cơ thể người [71] [75]

 Bacillus subtilis

B subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm Chúng được sử dụng qua

đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng kháng

sinh B subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người sau khi dùng kháng sinh kéo dài Các chế phẩm B subtilis được bán ở hầu hết các nước

Châu Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng Bào tử

của B subtilis có thể vượt qua rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột Một số tác dụng lâm sàng của B subtilis

đã được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [83]

Bacillus clausii

Thuộc giống Bacillus, GP+P, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi

trường dinh dưỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp VK tồn tại trong điều

kiện khắc nghiệt Bào tử của B clausii có thể qua dạ dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể

sống được trong môi trường dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị kháng sinh

Khi vào ruột non, bào tử B clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trưởng và tiếp tục

sinh sôi nảy nở trong ruột Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng trống rối loạn hệ VK trong

đường ruột Đồng thời sự sinh trưởng của B claussi sẽ tái lập được điều kiện kỵ khí,

tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như

Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác

nhau

B clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm

Enterogermina ở dạng lỏng Bào tử được bào chế dưới dạng hỗn dịch không màu,

không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho trẻ em

 Nấm men

Được sử dụng làm probiotic như Saccharomyces cerevisiae, S boulardii Trong

các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài Chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản Ngoài ra, chúng còn tiết enzyme tiêu hóa như amylase, protease,… [78]

S boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950 Là thành phần chính của một

số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp) Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp Ngừa tiêu chảy do KS và trị liệu phối hợp

trong nhiễm trùng H pylori S boulardii tác động thông qua cơ chế:

 Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh

phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E coli tiết ra

 Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và aminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải

N- Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào

T

1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic

Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các sản phẩm probiotic hiện nay chủ yếu

là LAB, do chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế phẩm probiotic Tuy nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm probiotic Những chủng LAB được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau:

 Là VK hiện diện bình thường ở ruột của người, sinh trưởng và phát triển nhanh

 Là VK chịu được pH thấp nên có thể sống được khi qua dạ dày

 Lên men lactic làm giảm pH môi trường sống, ức chế sự phát triển của VSV gây bệnh khác

 Có khả năng làm mất sự liên kết của các acid mật nên chịu acid mật tốt

 Đề kháng được kháng sinh

 Tạo enzyme lactase giúp đồng hóa được đường lactose trong sữa

 Làm tăng quá trình tiêu hoá thức ăn, tăng hấp thu chất dinh dưỡng

 Sản sinh một số chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh

 Điều hoà khả năng miễn dịch

 Làm giảm lượng cholestrol trong huyết thanh

 Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư

1.2.4 Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, kháng sinh,…

 Chịu pH thấp

Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5 Do đó, các chủng được chọn lọc để sử dụng như trong chế phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90 phút Sống sót ở pH 3.0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l được xem như là khả năng chống đỡ đối với

acid tối ưu đối với các chủng probiotic [70]

Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng như lysozyme Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc

khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic [69]

 Chịu acid mật

Acid mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi

sự xâm nhập của các VSV gây bệnh Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm người), quá trình tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol Cơ thể tổng hợp khoảng 8mg cholesterol một ngày và dùng 4mg cholesterol để tổng hợp acid mật Tổng cộng

có khoảng 20 – 30 g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày [85]

Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột Tại đây, chúng chịu sự tác động của acid mật Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng thì số lượng VSV sẽ giảm Khả năng chịu đựng acid mật là một trong những đặc tính cần thiết của VSV có hoạt tính probiotic [1]

 Chịu kháng sinh

Kháng sinh được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh cho người cũng như vật nuôi Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương pháp trị liệu kháng sinh có một số hạn chế nhất định như là tác động loại bỏ không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong ruột Vì vậy, phương pháp trị liệu này đã dẫn đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này

Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định uống trong thời gian điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cân bằng hệ VSV trong đường ruột Do

đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu đựng được kháng sinh [77]

 Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột

Các chủng VSV probiotic khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau lên đường tiêu hóa Chúng chỉ có thể tác động được khi chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt

trong đường tiêu hóa Do vậy, bên cạnh khả năng sống sót thì chúng phải có khả năng bám vào thành biểu mô ruột, nhờ đó chúng mới không bị rửa trôi ra ngoài cùng với phân [67]

Sự kết bám với tế bào biểu mô ruột là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư lâu dài của VK probiotic trong đường ruột, chống lại sự loại bỏ do nhu động ruột và tạo được một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock 1989; Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [66] [68]

Bên cạnh đó vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, H2O2,… Những chất này được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái đường ruột

Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ,… [71] [75]

1.2.5 Cơ chế tác động chung của probiotic

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của

cơ thể vật chủ,…

 Cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh

Hệ vi sinh vật ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau, một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng kháng sinh dài ngày dẫn đến

việc tiêu diệt các VSV có lợi trong ruột Để khắc phục điều này, người ta thường bổ sung các VSV có lợi thông qua sử dụng probiotic Các VSV probiotic sẽ phát triển, chiếm ưu thế trong đường ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sản sinh Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột

Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều lượng thích hợp (1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột được duy trì [57] [64] [74] [76]

 Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn

Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng cạnh tranh vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như kháng sinh, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, acid béo, …), diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol,… Đặc biệt, nhiều chủng VSV còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn [58] Những chất này có tác dụng ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh ở đường ruột

 Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột

Một số chủng VSV probiotic khi được bổ sung vào đường tiêu hóa có vai trò

tăng cường hoạt động chuyển hóa của một số chủng VK đường ruột khác Chẳng hạn

như khi sử dụng L rhamnosus dưới dạng sữa lên men, chúng kích thích hoạt động

enzyme và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [57]

 Điều hòa phản ứng miễn dịch

Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua

ảnh hưởng lên lympho bào B Như khi cho chuột sử dụng L plantarum ATCC 14917

và L fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa P3PH - thymidine trong tế bào lách ở chuột Ngoài ra, L plantarum ATCC 14917 và L fermentum YIT 0159 cũng

có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [57]

Ngoài ra, VSV probiotic còn tác động lên hệ tiêu hóa của người cũng như vật nuôi bằng những cơ chế khác, như đồng hóa lactose trong sữa, Sự không dung hòa lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme lactase hay β-galactosidase Lactase cần thiết để đồng hóa lactose trong sữa, phân giải chúng thành các phân tử đường glucose và galactose đơn giản Các cá thể thiếu lactase

sẽ không tiêu hóa được sữa và thường gây ra những khó khăn trong quá trình tiêu hóa, đặc biệt ở trẻ sơ sinh Triệu chứng thường thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp

bẻ, đầy hơi, nôn và buồn nôn,… khi dùng sữa Một vấn đề khác có liên quan đến việc không dung hòa lactose là tình trạng thiếu canxi do không dùng sữa Ngoài ra, VK khu trú trong ruột kết không lên men tiêu hóa được lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra các triệu chứng như đau bụng, sưng phù và tiêu chảy

Các dòng probiotic đã được chứng minh là có thể giải quyết vấn đề không dung hòa được lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột non Do vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng probiotic Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [58]

 Cơ chế bảo vệ răng miệng của vi khuẩn Probiotic nói chung và

Lactobacillus spp nói riêng

Vi khuẩn probiotic có tác động trực tiếp lên các tế bào khác và môi trường xung quanh chúng Các cơ chế kháng này được chia như sau:

 Tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn khác

 Tăng khả năng miễn dịch của vật chủ

 Ức chế vi khuẩn khác thông qua khả năng sinh hydrogen peroxide, bacteriocins, và một số acid hữu cơ

Hình 1.3 Cơ chế tác động của Lactobacillus spp lên những vi khuẩn trong khoang

miệng [44]