Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại tegalase r660l để thu nhận chất màu astaxanthin ở dạng carotenoprotein từ phế liệu đầu tôm sú

HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN

CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG

CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS Nguyễn Lệ Hà

Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08

TP Hồ Chí Minh, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THƯƠNG MẠI TEGALASE R660L ĐỂ THU NHẬN

CHẤT MÀU ASTAXANTHIN Ở DẠNG

CAROTENOPROTEIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ

Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS Nguyễn Lệ Hà

Sinh viên thực hiện: Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08

TP Hồ Chí Minh, 2017

Khoa: Công nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường

PHIẾU ĐĂNG KÝ

ĐỀ TÀI ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hệ:Đại học chính quy (CQ, LT, B2, VLVH)

1 Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên đăng ký đề tài (sĩ số trong nhóm): 1

Văn Thị Công Tâm MSSV: 1311110775 Lớp: 13DTP08

Ngành: Công nghệ thực phẩm

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

2 Tên đề tài đăng ký: Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease thương mại

Tegalase R660L trong tận thu chất màu astaxanthin ở dạng carotenprotein từ phế liệu tôm sú

3 Giảng viên hướng dẫn: GVC.TS Nguyễn Lệ Hà

Sinh viên đã hiểu rõ yêu cầu của đề tài và cam kết thực hiện đề tài theo tiến độ và hoàn thành đúng thời hạn

Ý kiến giảng viên hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên) TP HCM, ngày … tháng … năm ……… Sinh viên đăng ký

(Ký và ghi rõ họ tên)

Trưởng khoa ký duyệt

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi Các tài liệu và số liệu sử dụng để phân tích trong nghiên cứu đều đã được công bố trên các tạp chí, giáo trình theo đúng quy định Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi

tự tìm hiểu, thực hiện thí nghiệm, phân tích một cách khách quan và phù hợp với thực tiễn Và các số liệu của kết quả này chưa được công bố trong các nghiên cứu đã được thực hiện trước đây

Sinh viên thực hiện

Văn Thị Công Tâm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy các kiến thức cũng như sự đam mê về ngành học cho em trong suốt bốn năm em học tại trường Vì đây là những kiến thức nền tảng

để em có thể thực hiện đề tài nghiên cứu này và sẽ là hành trang kiến thức cho em áp dụng vào thực tiễn công việc sau này Bên cạnh đó, em cũng gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Khoa đã tạo điều kiện về phòng ốc, trang thiết bị, dụng cụ cũng như hoá chất

để em thực hiện đề tài nghiên cứu

Và em cũng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên Nguyễn Lệ Hà đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu, hoàn thành báo cáo tốt nghiệp Em không chỉ học được thêm những kiến thức mới từ cô, ngoài ra, cô còn truyền dạy về các kỹ năng sống bổ ích cho công việc sau này

Cuối lời, em kính chúc quý thầy cô luôn dồi dào sức khoẻ để có thể truyền dạy kiến thức và sự đam mê với ngành, nghề cho các thế hệ sau Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô

Sinh viên thực hiện

Văn Thị Công Tâm

i

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon 3

1.1.1. Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon 3

1.1.2. Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon 4

1.1.3. Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm 6

1.2 Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết rút 7 1.2.1. Carotenoid 7

1.2.2. Astaxanthin 9

1.2.3. Caotenprotein 11

1.2.4. Các ứng dụng astaxanthin: 13

1.3 Enzyme protease 15

1.3.1 Giới thiệu chung về enzyme protease 15

1.3.2 Phân loại proease 15

ii

1.3.3. Tính chất chung của enzyme 16

1.3.4 Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme 17

1.4 Quá trình thuỷ phân protein [4] 19

1.4.1 Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein: 19

1.4.2 Các phương pháp thuỷ phân protein 19

1.5 Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước: 21

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước: 21

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước: 24

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên liệu cứu: 27

2.1.1 Đầu tôm: 27

2.1.2 Enzyme protease: 27

2.1.3 Hoá chất 27

2.2 Dụng cụ và thiết bị 27

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 29

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 30

iii

Phế liệu đầu tôm trước khi được đưa vào thủy phân được xử lý theo thứ tự

trình bày trong hình 2.2 30

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu: 37

2.3.4. Xử lý số liệu: 37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Các thông số cơ bản của nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm 38

3.1.1 Biến đổi số đơn vị hoạt tính enzyme 38

3.1.2 Thành phần nguyên liệu 39

Bảng 3.2 Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon 39

3.2 Điểm pI của dịch thuỷ phân 40

3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme prtotease Tegalase R660L 42

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme protease Tegalase R660L 42

3.3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin 42

3.3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng astaxanthin thu nhận trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi astaxanthin 45

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến quá trình thuỷ phân. 48

iv

3.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzyme) protease Tegalase R660L đến hàm lượng acid amin thu được trong dịch thủy phân và hiệu suất thu hồi acid amin 48

3.3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (số đơn vị hoạt độ enzym) đến hàm lượng astaxanthin và hiệu suất thu hồi astaxanthin 52

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thuỷ phân 57

3.3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch thủy phân 57

3.4 Tối ưu hoá nhiệt độ và thời gian thuỷ phân phế liệu đầu tôm để thu sản phẩm bột carotenoprotein 60

3.4.1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân 61

3.4.2 Xác định chỉ tiêu tối ưu của quá trình thuỷ phân 61

3.4.3 Thiết lập phương trình hồi qui của hàm lượng acid amin AP và xác định nhiệt dộ và thời gian tối ưu của quá trình thuỷ phân thu nhận carotenoprotein 62

3.4.3.1 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tới thu hồi hàm lượng acid amin 62

3.4.3.2 Thiết lập phương trình hồi qui và phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới thu hồi astaxanthin 65

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

4.1 Kết luận 70

v

4.2 Kiến nghị 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme protease Tegalase R660L 27

Bảng 3.1 Thành phần nguyên liệu đầu tôm P.monodon (tính trên nguyên liệu

khô) 39

Bảng 3.2: Khoảng biến thiên của các yếu tố cần tối ưu khi thuỷ phân đầu tôm61

Bảng 3.3 Thông số nhiệt độ và thời gian tối ưu của quá trình thu nhận bột carotenoprotein 67 Bảng 3.4: Thành phần hóa học trong bột carotenoprotein 68

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam 5

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của carotenoid 9

Hình 2.1 Nội dung nghiên cứu 29

Hình 2.2 Chuẩn bị đầu tôm 30

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thuỷ phân phế liệu đầu tôm 34

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ enzyme dùng thuỷ phân phế liệu đầu tôm 36

Hình 3.3 Hàm lượng acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 42

Hình 3.4 Hàm lượng acid amin của dịch thủy phân theo nhiệt độ ở thời gian thủy phân là 6 giờ 43

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi acid amin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 44

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi protein ở các nhiệt độ thủy phân sau 6 giờ thủy phân 44

Hình 3.7 Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các nhiệt độ khác nhau 46

46

Hình 3.8 Hàm lượng astaxanthin sau 6 giờ thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau 46

Hình 3.9 Hiệu suất thu hồi astaxanthin qua các thời gian thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau 47

Hình 3.15 Hiệu suất thu hồi protein sau 6 giờ thủy phân 51

Hình 3.16 Hàm lượng astaxanthin theo thời gian ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 53

Hình 3.17 Hàm lượng astaxanthin thu được trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 54

Hình 3.18 Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nahxo caroteinoprotein từ dịch thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 55

Hình 3.19 Hiệu suất thu hồi astaxanthin trong bột nhão carotenoprotein từ dịch thủy phân phân sau 6 giờ thủy phân ở các số đơn vị hoạt độ enzyme khác nhau 55

Hình 3.20 Hàm lượng acid amin và astaxanthin của dịch thuỷ phân sau 6 giờ với các số đơn vị hoạt độ khác nhau, 550C 56

ix

Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin thu được khi thủy

phân ở 30UI và 550C 58

Hình 3.22 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng astaxanthin thu được khi thủy phân ở 30UI và 550C 59

Hình 3.23 Bề mặt đáp ứng của hàm AP ở nồng độ C= 5% 64

Hình 3.24 Bề mặt đáp ứng của hàm AsP ở nồng độ enzyme C= 5% 66

Hình 4.1 Quy trình thu nhận bột nahxo carotenoprotein 72

1

MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ

Astaxanthin được biết đến là một chất chống oxy hoá mạnh với năng lượng chống oxy hoá gấp 10 lần so với ß- carotene và 500 lần so với vitamin E.[23] Chính vì lý do này, hiện nay, chất màu này được sử dụng nhiều trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm và cả trong thức ăn thuỷ sản, đặc biệt là thức ăn cho cá hồi Tính

đến hiện tại, astaxanthin chủ yếu được thu nhận từ tảo Haematococcus pluvialis và nấm men Phaffia Và những năm gần đây, lớp vỏ của các loài giáp sát được chú ý

đến trong các nghiên cứu chiết rút astaxanthin, đặc biệt là phế liệu đầu và vỏ tôm

Ngày nay, ngành chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn, tạo ra nhiều công ăn việc làm và mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nước, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt được những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến cũng như xuất khẩu Trong công nghệ chế biến thủy sản xuất khẩu của Việt Nam, tỷ lệ các mặt hàng giáp xác đông lạnh chiếm từ 70 – 80% sản lượng chế biến Trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu Cùng với khối lượng tôm xuất khẩu hằng năm thì phế thải liệu của nó bao gồm đầu và vỏ tôm cũng khá lớn Thông thường đầu tôm chiếm 25 – 40% so với khối lượng toàn cơ thể thì cùng với lượng tôm xuất khẩu năm 2016 là 6.7 triệu tấn sẽ suy ra được lượng phế liệu đầu tôm là 1 – 3 triệu tấn được thải ra trong quá trình chế biến Trong phế liệu đầu tôm chứa một lượng lớn protein, chitin, chất màu astaxanthin và một số hợp chất sinh học khác Tuy nhiên, hiện nay phế liệu đầu tôm chỉ được sử dụng chủ yếu để làm thức ăn gia súc, một phần nhỏ để sản xuất chitin Đây là một cách tận thu phế liệu mang lại hiệu quả kinh tế nhưng không mang lại hiệu quả cao Vì vậy, cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa để tìm ra hướng sử dụng nguồn phế liệu này hiệu quả hơn, mang lại lợi ích kinh tế, kỹ thuật và môi trường Và hiện nay cũng đã có nhiều nghiên cứu về việc chiết rút astaxanthin từ nguồn phế liệu tôm bằng việc thuỷ phân bằng tác nhân hoá học hay trích ly astaxanthin bằng dung môi

2

Tuy vậy, các tác nhân hoá học ảnh hưởng đến chất lượng màu của sản phẩm cũng như không thể sử dụng làm thực phẩm cho người

Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong việc thuỷ phân phế

liệu tôm sú Penaeus monodon nhằm tận thu astaxanthin ở dạng bột

carotenprotein cho mục đích thực phẩm” được tiến hành với mong muốn nâng cao hiệu suất thu được astaxanthin với sự có mặt của protein hoà tan để có thể ứng dụng vào mỹ phẩm, thực phẩm

MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Mục đích chung của đề tài này nhằm xác định các thông số của quá trình thủy phân để nâng cao hiệu suất thu nhận carotenprotein cao nhất và bước đầu thăm dò điều kiện thủy phân tối ưu dựa vào bề mặt đáp ứng

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi thực hiện các bước nghiên cứu như sau:

+ Khảo sát điểm pH có thể tủa carotenprotein nhiều nhất

+ Khảo sát các điều kiện của quá trình thuỷ phân (nồng độ enzyme, nhiệt

độ và thời gian thủy phân)

+ Bước đầu tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian thủy phân dựa vào bề mặt đáp ứng

+ Xác định các thông số của bột nhão carotenprotein: màu sắc, mùi, hàm lượng astaxanthin

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon

1.1.1 Giới thiệu về tôm sú Penaeus monodon

Tôm sú (Tên Tiếng Anh: Giant/ Black Tiger Shrimp) được định loại là:

Ngành: Arthropoda – Ngành chân khớp

Lớp: Crusstacea – Lớp giáp xác

Bộ: Decaoda – Bộ mười chân

Họ chung: Penaeidea

Họ: Penaeus Fabricius

Giống: Penaeus

Loài: Monodon

Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

Cấu tạo của tôm gồm 2 phần: phần đầu và phần thân Hầu hết các cơ quan nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần như hoàn toàn ở thân Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng, lipid bao phủ khung chitin Toàn bộ lớp vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải lột xác từng thời kì sinh trưởng của bản thân Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm Kề trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là astaxanthin Chính nhờ sự biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm Phần đầu thường chiếm khoảng 35 – 45% trọng lượng, phần vỏ chiếm 10 – 15% trọng lượng

Tỷ lệ các phần đầu, thân, vỏ luôn thay đổi phụ thuộc vào giống loài

Vỏ tôm được cấu tạo từ một phức hợp chitin – protein liên kết với một số hợp chất hữu cơ khác (astaxanthin, lipid), bị hóa cứng do kết hợp với canxi cacbonat Chitin là các loại polysaccharide phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose Nó được cấu tạo bởi các cầu nối 1,4 glucozit Ngoài lớp màng sáp bao phủ bên ngoài lớp vỏ epicuticle, lipid còn tồn tại dưới dạng phức chất sterol- protein chứa trong lớp

cam

1.1.2 Phế liệu đầu tôm sú Penaeus monodon

Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn của Thái Bình Dương, có diện tích khoảng 3.448.000 km2, có bờ biển dài 3260 km Vùng nội thuỷ

và lãnh hải rộng 226.000 km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền Biển Việt Nam có tính đa dạng sinh học khá cao, cũng là nơi phát sinh và phát tán của nhiều nhóm sinh vật biển vùng nhiệt đới ấn Độ

- Thái Bình Dương với chừng 11.000 loài sinh vật đã được phát hiện Bên cạnh đó, nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản Sản lượng thủy sản Việt Nam đã duy trì tăng trưởng liên tục trong 17 năm qua với mức tăng bình quân là 9,07%/năm Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm qua, bình quân đạt 12,77%/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản của cả nước Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự nhiên và trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng thủy sản từ hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình quân 6,42%/năm [1]

5

Hình 1.1 Sản lượng nuôi trồng và khai thác thuỷ sản Việt Nam

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản sản xuất năm

2016 đạt hơn 6,7 triệu tấn, tăng 2,5% so với năm 2015 Năm 2016, mặc dù tình hình

hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu năm Tuy nhiên, mưa nhiều trong những tháng cuối năm, độ mặn giảm cùng với sự chỉ đạo sát sao của các cấp trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch tăng vào những tháng cuối năm Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước đạt 650 nghìn tấn Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tốm sú ước đạt 569.500 ha, sản lượng đạt 251 nghìn tấn Diện tích tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015, sản lượng ước đạt 253,1 nghìn tấn Tính trên cả nước, trong những năm gần đây, diện tích và sản lượng tôm nuôi không ngừng tăng, đến năm 2015, diện tích nuôi tôm nước lợ đạt trên 700.000 ha với sản lượng trên 650.000 tấn Bên cạnh diện tích nuôi trồng rộng lớn, số lượng doanh nghiệp tham gia chế biến và xuất khẩu cũng không ngừng gia tăng Trên cả nước có khoảng 160 doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung, Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu…), Đồng Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà

6

Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ hải sản, một lượng lớn đầu và vỏ tôm được thải ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, đây lại là nguồn phế liệu chứa nhiều thành phần mang giá trị kinh tế cao: protein, chintin, astaxanthin Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và mảnh vỏ, ngoài ra, còn có phần thịt vụn… tùy theo giống loài và phương pháp chế biến mà lượng phế liệu tôm có thể vượt quá 60% sản lượng tôm khai thác được Ví dụ tôm càng xanh, phê liệu chiếm khoảng 60% khối lượng toàn bộ, với tôm sú thì phế liệu chiếm 40% [1]

1.1.3 Tình hình xử lý đầu và vỏ tôm

Trước đây vấn đề xử lý phụ phế phẩm tôm từ các cơ sở chế biến, các công ty gặp nhiều khó khăn, chủ yếu đem đỗ bỏ Gần đây phụ phế phẩm tôm đã được dùng làm thức ăn cho gia súc, góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường Tuy nhiên phương pháp này không đem lại hiệu quả kinh tế cao, việc làm thức ăn đòi hỏi phải sấy mà quá trình này không làm giảm khoáng và chitin, 2 chất này gây khó tiêu cho gia súc

Vì vậy người ta hướng đến một giải pháp mới là sản xuất Chitin – Chitosan

Chất Chitin- Chitosan chứa trong vỏ tôm là một loại nguyên liệu có thể ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế Theo đó, phế liệu tôm được thu gom tại các cơ sở chế biến đông lạnh, sau khi rửa sạch, sấy khô được đưa vào nồi phản ứng để loại bỏ muối vô

cơ (muối can xi, muối phốt pho) và các protein Sản phẩm thu được từ công đoạn này có tên là chitin; sau đó lại được đưa vào ngâm trong dung dịch kiềm khoảng 2 giờ sẽ cho ra một chất mới là Chitosan Theo một số nhà khoa học, Chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư; đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả khá cao trong công nghệ bào chế dược phẩm (làm thuốc chữa bỏng (phỏng), thuốc giảm đau, hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, thuốc chữa chứng đau xương khớp, chống viêm cấp trên mô lành ) Một số kết quả nghiên cứu của các bác sĩ ở Bệnh viện K Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa học những năm gần đây đã chứng minh những tác dụng đó của chất Chitosan trong vỏ tôm Và trên thị trường dược phẩm hiện nay, loại thuốc chữa bệnh khớp làm từ vỏ tôm có tên

7

Glucosamin ngày càng được sử dụng rộng rãi do ít gây tác dụng phụ Ngoài ra, chất Chitosan cũng được ứng dụng trong một số ngành công nghiệp: hóa chất, mỹ phẩm, xử lý nước thải Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hay kết hợp giữa phương pháp hóa học và sinh học

Tuy nhiên, khi xử lý phế liệu tôm để thu chitin và chitosan thì sử dụng acid và bazo sẽ phần nào gây ảnh hưởng môi trường, tăng chi phí xử lý nước thải nhưng chỉ thu được một phần thành phần hoá học có giá trị kinh tế trong đầu tôm Từ đó

đã có thêm nhiều nghiên cứu tách chiết carotenprotein trong qui trình sản xuất chintin bằng HCl, HCOOH, thu protein, tách chiết astaxanthin bằng phương pháp lên men lactic và enzyme nhằm nâng cao hiệu quả kinh tế

1.2 Carotenprotein trong động vật thuỷ sản và một số phương pháp chiết

rút

1.2.1 Carotenoid

Carotenoid là nhóm hợp chất màu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm Carotenoid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, tất cả chất màu của rau quả đều là nguồn hợp chất màu tốt Carotenoid được sử dụng trong công nghiệp được tổng hợp bằng phương pháp hoá học, một lượng nhỏ được tách từ thực vật hoặc tảo Tất cả sinh vật quang hợp ( bao gồm tảo thực vật và khuẩn tảo lục) và một số vi khuẩn không quang hợp và nấm tổng hợp carotenoid Nhóm chất màu này tan trong chất béo bao gồm hơn 700 hợp chất tạo ra màu đỏ, cam, vàng Carotenoid là một mạch hydrocabon dài gồm 40 nguyên tử cacbon và 2 vòng cuối [23]

Hai loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên: ß – caroten, dẫn xuất oxy hoá của caroten như là lutein, violaxanthin, neoanxanthin, và zeanxanthin, được biết như là xanthophylls Từ hàng trăm hợp chất carotenoid hiện diện trong tự nhiên, chỉ

50 có hoạt tính sinh học và chúng có thể được chia thành 2 nhóm, tiền vitamin A và không tiền vitamn A Vitamin A có vai trò quan trọng cho sự phát triển, duy trì một

Carotenoid là hợp chất kỵ nước, ưa dầu mỡ, không tan trong nước và tan trong các dung môi như acetone, alcohol và chloroform Bởi vì carotenoid là chất màu tan trong chất béo phổ biến trong tự nhiên, chúng có ích bởi màu của chúng [23]

9

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của carotenoid (a) xanthophylls; (A) zeaxanthin, (B) lutein, (C) beta – cryptoxnthin, (D) astaxanthin; (b) Carotenes; (E) neurosporene, (F) lycopene, (G) ß – carotene, (H) α – carotene [Reference: Britton et al]

1.2.2 Astaxanthin

Astaxanthin (3,3’ – dyhydroxy – ß – carotene – 4,4’ – dione) với công thức hoá hoc là C40H52O4, là chất màu đỏ, làm thay đổi màu của tôm hồng, tôm hùm, cua, các loài nhuyễn thể và giáp sát khác [28] Ở nhiều loài động vật không xương sống, đặc biệt là ở động vật giáp xác, màu sắc rực rỡ ở lớp mô phía ngoài, của máu,

10

trứng và cơ thịt dưới da là kết quả của sự tương tác giữa carotenoid với protein Loại carotenoid thường kết hợp với protein là ketocarotenoid, trong đó thường gặp nhất là astaxanthin và các hợp chất có chứa gốc này Astaxanthin có khung cấu tạo gần giống ß – carotene nhưng tính chất hoá hoc lại khác nhau, nó có tính chống oxy hoá mạnh hơn nhiều các chất chống oxy hoá khác như ß – caroten và thậm chí cả α – tocopherol [21] Astaxnthin là chất màu được tìm thấy ở động vật sống dưới nước, như là tôm hùm, cua, tôm Một sự quan tâm trong sử dụng astaxanthin cho nuôi trồng cá và gia cầm được phát triển, chất màu này không tổng hợp bởi động vật và phải cho thêm vào khẩu phần ăn nhằm mục đích có màu hấp dẫn để tiêu thụ Xanthophyll này có tính chống oxy hoá gấp 10 lần ß - carotene và 500 lần vitamin

E Ngoài ra, chất màu này được xem là quan trong trong việc phòng ngừa và chữa bệnh với đặc tính chống oxy hoá và chống lại gốc tự do Trong sự sát nhập của astaxnthin trong thức ăn cho nuôi trồng thuỷ hải sản là kết quả của sự tạo màu cho cá hồi và loài giáp sát, vì vậy sự hiện diện của nó trong tôm, tôm hùm, cua và động vật có vỏ xương ngoài Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy nhiều ở tảo

Haematococus [20] Astaxanthin tồn tại dưới 3 dạng: sterified, phân tử tự do, phân

tử phức tạp với protein, carotenoprotein Protein này thường tồn tại ở loài giáp sát [17] Trong vỏ của loài giáp sát, lớp protein đan xen với lớp chitin nơi mà chúng cùng tồn tại [29] Trong tự nhiên, astaxanthin thường kết hợp với các phân tử khác nhau Nó thường tồn tại ở dạng phức chất với protein và tạo ra nhiều màu sắc ở nhiều động thực vật khác nhau Ví dụ, nó là chromophore trong sắc xanh biển, xanh

lá và vàng của tôm hùm Có nhiều trường hợp, astaxanthin chỉ đơn giản hoà tan trong dầu mỡ của các phân tử phức tạp như lipoprotein ở trứng, cũng có thể kết hợp với các phân tử acid béo chẳng hạn bằng một liên kết hoá học thật sự và tạo thành ester [15] Đúng với bản chất màu của carotenoid, astaxanthin được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược, mỹ phẩm, và công nghiệp thức ăn động vật Ngoài

ra, chúng được sử dụng rộng rãi trong việc tạo màu, làm bền vững thực phẩm bởi vì hoạt động của chúng như vitamin A và hoạt tính sinh học của chúng tốt cho sức

11

khoẻ, như là cũng cố hệ thống miễn dịch, giảm nguy cơ bệnh thoái hoá, đặc tính chống oxy hoá

1.2.3 Carotenprotein

1.2.3.1 Sự tồn tại của carotenoprotein:

Trong các loài động vật biển không xương sống, ketocaroten thường tồn tại ở dạng phức chất carotenoprotein Phức chất này là sự kết hợp giữa caroenoid và protein, lipo-protein hoặc glycoprotein Mặt khác, carotenprotein kết hợp chặt chẽ với các chất thuộc cấu trúc lớp da như: chitin, calcium cacbonate [8] Sự tồn tại của carotenoprotein là nguyên nhân thay đổi sự hấp thu quang phổ, do đó phức chất thường có màu tía, màu lam, màu xanh lục, tương phản lại màu vàng và màu cam của carotenoid ở dạng tự do Nhóm keto của carotenoid thường là astaxanthin hoặc cantaxanthin [27] Carotenoprotein tồn tại 2 dạng chính: (1) carotenoid liên kết với lipoprotein hoặc glycoprotein, (2) carotenoid liên kết với một protein hay một glycoprotein Phản ứng giữa các nhóm 4 và 4’ keto trong các vòng đầu mạch của axtaxanthin với các nhóm chức của protein là điều kiện tiên quyết để hình thành phức carotenoprotein giữa astaxanthin và protein

1.2.3.2 Bản chất và tính chất chung của carotenoprotein

Bản chất của carotenoprotein

Qua một số protein thu được khi tinh chế carotenoprotein, người ta thấy rằng, các protein có mặt trong phân tử này thuộc nhiều nhóm khác nhau Crustacyanin, loại protein màu xanh biển ở vỏ tôm hùm được tách ra sau khi loại nhóm carotenoid dường như là một protein thuần tuý chỉ gồm các gốc amino acid tạo thành Ngoài ra, còn có cả thành phần carbonhydrate có chứa hexosamin và gốc đường không chứa nhóm amino chiếm 4,8% trọng lượng phân tử [16]

Tính chất chung của carotenoprotein

Carotenoid và carotenoprotein, cả hai dều được xem là chất màu tự nhiên và

có hoạt tính sinh học như: chống oxy hoá, kháng khuẩn [26] Phức hợp carotenoprotein tan trong nước và có tính bền vững Trong một vài trường hợp, màu

12

sắc của nó bền đến về năm trong không khí ở điều kiện nhiệt độ phòng Các carotenoid liên kết với protein ít bị oxy hoá hơn so với chúng ở dạng tự do Carotenoid ở dạng tự do có màu vàng, cam hoặc đỏ Tuy nhiên, trong cơ thể những loài động vật biển không xương sống, các phức hợp carotenorotein tạo nên nhiều màu khác nhau như: xanh lá cây, xanh dương và tía Trong các loài giáp xác thuỷ sản có chứa 3 loại crustacyanine là α,ß vàγ- crustacyanine Cả 3 loại này đều có astaxanthin và ở dạng nhóm liên kết Trong đó, astaxanthin thường liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α- crustacyanin, hấp thụ cực đại ở bước sóng (λmax = 628 nm), có màu xanh đen đặc trưng thường thấy ở các loài thuỷ sản sống Dưới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá huỷ và giải phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam (λmax = 480 nm)

Cấu trúc của carotenoid cũng quyết định các chức năng sinh học của chúng, trong đó phần lớn các carotenoid có mạch 40 carbon liên kết với các nhóm chức chứa oxy khác nhau Trong phế liệu tôm, carotenoid chủ yếu là astaxanthin (trên 95%), thuộc nhóm chất tetraterpenoid, là sắc tố màu đỏ cam Tương tự như carotenoid khác, nó có tính phân cực thấp và tan tốt trong dầu mỡ [9]

1.2.3.3 Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến động vật giáp xác

Phế liệu chế biến các loài giáp xác như tôm, cua, ghẹ, tôm hùm thường bao gồm một số thành phần như: các muối kim loại (15 – 35%), protein (25 – 50%), chitin (25 – 35%), lipid và chất màu Đã có rất nhiều nghiên cứu của các tác giả khác nhau về thành phần carotenoid và carotenoprotein trong nguồn phế liệu này Chất chủ yếu tạo nên màu của tôm cua là astaxanthin ở dạng tự do hay ester hoá với hàm lượng thường dao động trong khoảng 119 và 148 μg/g, ngoài ra còn có một lượng nhỏ các chất màu khác như lutein, zeaxanthin và astacene [25]

Hiện nay, xu hướng làm thế nào có thể sử dụng chất màu này đang được các chuyên gia quan tâm, chủ yếu là astaxanthin đang bị bỏ phí trong phế liệu chế biến Các số liệu đã được công bố đã chứng tỏ, hàm lượng chất màu trong phế liệu này thường thấp, ví dụ astaxanthin thường tồn tại với lượng nhỏ hơn 1000 μg/g

13

nguyên liệu thô Điều này cũng cho thấy, để thu được lượng màu đáng kể thì cần một lượng lớn phế liệu Vì vậy, trong sản xuất thức ăn cho động vật, người ta thường bổ sung phế phẩm này Tuy nhiên, phương pháp này không đạt hiệu quả cao

và không thể áp dụng cho người cần bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn Bên cạnh

đó, quá trình sấy khô phế liệu với tác nhân nhiệt tác động mạnh mẽ lên chất màu này, chúng sẽ bị biến đổi do quá trình oxy hoá Cùng với đó, việc còn tồn tại chitin

và tro trong phế liệu rất cao sẽ làm cá khó tiêu hoá, do đó, việc bổ sung phế phẩm này vào thức ăn cho cá cần phải được xem xét kỹ lưỡng

Nhiều công trình đã nghiên cứu nhằm khắc phục nhược điểm trên khi bổ sung nguyên phế phẩm Một trong những hướng thử nghiệm là ủ chua, tức là xử lý phế liệu bằng acid hữu cơ hoặc vô cơ, việc này có thể giúp ngăn cản việc xâm nhập của vi sinh vật và tách màu được tốt hơn Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu chiết rút carotenoid trong dung môi chất béo như: dầu dừa, dầu đậu nành, hướng dương, dầu cọ Ngoài ra, trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu ứng dụng enzyme thương mại vào việc tách chiết astaxanthin

Từ những dẫn chứng trên cho thấy, carotenoprotein là một chất có tiềm năng trong việc sử dụng làm thực phẩm chức năng cho người và trong chăn nuôi, đặc biệt

là carotenoprotein chiết rút từ động vật giáp sát giàu astaxanthin ở dạng bền vững Sản phẩm này không chỉ mang lai lợi ích cho con người về sức khoẻ mà ngay cả về kinh tế Bên cạnh đó, việc tách chiết astaxanthin từ nguồn phế liệu đầu tôm cũng phần nào giải quyết được vấn đề chất thải rắn và tạo ra giá trị gia tăng

1.2.4 Các ứng dụng astaxanthin:

1.2.4.1 Ứng dụng trong y khoa:

Chất chống oxy hoá mạnh: tác dụng của astaxanthin đã được chứng minh có khả năng tăng cường lưu lượng máu, giảm các stress oxy hóa ở những người nghiện thuốc lá và người thừa cân, béo phì Một nghiên cứu so sánh giữa astaxanthin và các carotenoid khác đã chỉ ra rằng hợp chất này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh chống lại các các gốc tự do [11]

14

Giảm nguy cơ mắc ung thư: do đặc tính chống oxy hóa mạnh, người ta đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu về tác dụng của astaxanthin trong điều trị nhiều loại ung thư Theo một nghiên cứu, astaxanthin có lợi ích cả trong thời gian ngắn và lâu dài đối với bệnh ung thư vú, bao gồm việc ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư [11]

Tốt cho tim mạch: các nhà khoa học cũng đồng thời thực hiện những nghiên cứu về tác dụng của astaxanthin đối với sức khỏe tim mạch Một nghiên cứu vào năm 2006 đã đánh giá hiệu quả của astaxanthin trên chuột mắc chứng cao huyết áp, kết quả cho thấy astaxanthin giúp cải thiện mức elastin và độ dày của thành động mạch Người ta còn cho rằng astaxanthin có thể giúp phòng các bệnh lý tim mạch

và hạ cholesterol máu, tuy nhiên vẫn chưa có đủ bằng chứng để xác nhận những ý kiến trên [11]

Chữa bệnh đau khớp: astaxanthin trong tương lai có thể trở thành một liệu pháp đầy hứa hẹn trong điều trị chứng đau khớp như trong bệnh viêm khớp dạng thấp (đây là một căn bệnh có ảnh hưởng đến 1 trong tổng số 5 người Mỹ) và hội chứng ống cổ tay Tuy nhiên, ý kiến này vẫn còn gây nhiều tranh cãi Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin có thể giúp giảm các triệu chứng đau và sưng viêm trong bệnh viêm khớp [11]

1.2.4.2 Ứng dụng trong thức ăn nuôi trồng thuỷ hải sản

Ngăn ngừa Hội chứng màu xanh ở tôm: một nghiên cứu đã chỉ ra, khi bổ sung Astaxanthin với lượng 50 ppm cho tôm bị “Hội chứng màu xanh” sau 4 tuần thì tôm trở lại màu sắc bình thường của chúng Khi phân tích mô từ các nhóm thử nghiệm xác nhận rằng với những con tôm bị bệnh được bổ sung Astaxanthin, hàm lượng Carotenoid tăng 318%; nhóm còn lại không bổ sung Astaxanthin, chỉ dùng thức ăn thị trường thì sự gia tăng Carotenoid chỉ có 14% và vẫn có “màu xanh” [6]

Nâng cao tỷ lệ sống của tôm: bổ sung Astaxanthin với lượng 100 ppm sẽ làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng tôm lên 91% sau 4 - 8 tuần Bổ sung 2% nguồn Carotenoids bằng ớt bột với thức ăn tươi cũng giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ sống của

15

ấu trùng Zoea 2 Bổ sung Astaxanthin ở mức 50 mg/kg thức ăn giúp tăng sản lượng trứng ở tôm sú Với 150 ppm Astaxanthin cho tôm bố mẹ, cải thiện đáng kể chất lượng Nauplii và tỷ lệ sống Zoea [6]

1.3 Enzyme protease

1.3.1 Giới thiệu chung về enzyme protease

Enzyme protease thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho các quá trình thỷ phân các liên kết peptide (-CO – NH - ) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất

đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phâ bố rất rộng rãi trên nhiều đối tương từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protesae vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật

là một hệ thống rất phức tạp bao gồm những enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách dưới dạng tinh thể đồng nhất [4]

1.3.2 Phân loại proease

Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân thành 2 loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotrysin và subtilisin Nhóm

16

chymotrysin bao gồm enzyme động vật như: chymotrysin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serineproteinase thường hoạt động ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine protease: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài rotein động vật và proteinase ký sinh chung Các cystein proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepepsin, renin Các asparrticproteinase có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt động giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, proteinase được phân loại một cách đơn giản thành 3 nhóm:

+ Protease acid: pH 2 – 4

+ Protease trung tính: pH 7 – 8

+ Protease kiềm: pH 9 – 11

1.3.3 Tính chất chung của enzyme

Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo [5]

Chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu

cơ có cực khác [5]

Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác [5]

17

1.3.4 Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme

1.3.4.1 Ảnh hưởng của nông độ enzyme: Khi thừa cơ chất thì nồng độ

enzyme tăng, vận tốc tăng Khi nồng độ enzyme bão hoà với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng, vận tốc không thay đổi [3]

1.3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 500C Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau hoàn toàn Một số enzyme khác có nhiệt độ phản ứng tối ưu ở 600C, một số khác có nhiệt độ tối ưu ở

00C, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở

900C [3]

Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính Ngược lại, ở nhiệt độ 00

C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính Phản ứng vô hoạt enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ thường biểu diễn thứ bậc một

1.3.4.3 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme:

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên, cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu Một số khác lại hoạt đông ở

pH kiềm và cả pH acid Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hoà

và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào vi sinh vật Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và các chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được trạng thái cân bằng [3]

Chất kìm hãm cạnh tranh: Các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động Nếu chất kìm hãm đã chiếm được vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận trung tâm này Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất Kết quả hoạt động của enzyme sẽ giảm [3]

Vì có cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh và cơ chất đều

có xu hướng chiếm vị trí trong trung tâm hoạt động Vận tốc phản ứng lúc này phụ thuộc vào hai yếu tố [3]:

 Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất cạnh tranh

 Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với ezyme

Chất kìm hãm không cạnh tranh: Nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzyme thì trong cơ chế kìm hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà

19

là vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác Vì thế, các chất kì hãm làm giảm hoạt động của enzyme

1.3.4.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá:

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme gọi là chất hoạt hoá enzyme Các chất hoạt hoá enzyme có bản chất hoá học rất khác nhau Chúng có thể là những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở một nồng độ nhất định Vượt quá nồng độ chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme [3]

1.4 Quá trình thuỷ phân protein

1.4.1 Khái niệm và bản chất của quá trình thuỷ phân protein:

Khái niệm: thuỷ phân được định nghĩa là sự phản ứng với nước Nó là một quá trình hoá học, cái mà phân tử bị cắt thành 2 phần bởi sự tham gia một phân tử nước Một phân tử nhận một một ion H+

từ nước, nhóm khác thu nhận nhóm hydroxyl [4]

Bản chất: Bản chất của quá trình thủy phân protein: là quá trình phá vỡ các liên kết peptide khi có mặt của nước Do liên kết peptide là liên kết bền, nên quá trình thủy phân cần có mặt chất xúc tác Các tác nhân xúc tác gồm:

+ Tác nhân hóa học: acid (HCl) hay base (NaOH)

+ Tác nhân hóa sinh học: enzyme thủy phân protein (protease)

1.4.2 Các phương pháp thuỷ phân protein

1.4.2.1 Phương pháp hoá học:

Đây là phương pháp thủy phân protein dưới xúc tác của acid mạnh (HCl,

H2SO4) hay kiềm mạnh (NaOH) ở nhiệt độ cao để cắt đứt các liên kết peptide Quá trình này cắt đứt tất cả các liên kết peptide trong protein cơ chất, đồng thời phá hủy một số acid amine [4]

20

+ Phương pháp acid

Dùng HCl ở nồng độ 6 – 10N, nhiệt độ (100 – 1800C), thời gian thủy phân từ

24 – 48 giờ Sau quá trình thủy phân, dung dịch được trung hòa đến pH về 6,5 – 7

Ưu điểm của phương pháp này có thể nói đến là thời gian diễn ra thủy phân ngắn,

pH thấp có thể ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật Tuy nhiên, phương pháp này vẫn tồn tại các khuyết điểm Do sử dụng acid nồng độ cao và nhiệt độ thủy phân cao nên một số acid amine bị phá hủy Tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, các acid amine như serine và threonine bị phá hủy một phần Asparagine, glutamine bị chuyển thành dạng acid, hầu hết các vitamin bị phá hủy

Bên cạnh đó, muối được hình thành trong quá trình trung hòa nên kết quả là sản phẩm có hàm lượng muối đáng kể Ngoài ra, chi phí năng lượng và thiết bị cao

do phải chịu nhiệt và chống acid ăn mòn, bên cạnh đó,mức độ độc hại cao và gây ô nhiễm môi trường, có thể sinh ra độc tố 3-MCPD, 1,3-DCP Thực tế, phương pháp này được sử dụng nhiều vì thời gian thủy phân nhanh, hiệu suất cao từ 85 – 90%, mùi vị sản phẩm ngọt và thơm ngon

+ Phương pháp kiềm

Sử dụng NaOH nồng độ từ 4 – 8N, nhiệt độ 100 – 1100C, thời gian 24 –

48 giờ Đối với phương pháp này, tryptophan được bảo toàn nhưng xảy ra hiện tượng racemic hóa làm giảm giá trị dinh dưỡng, tạo lysineolanine làm giảm lysine trong thành phần nên phương pháp này ít sử dụng trong công nghiệp

1.4.2.2 Phương pháp hóa sinh học

+ Phương pháp vi sinh

Đây là quá trình thủy phân protein nhờ xúc tác enzyme từ vi sinh vật Các enzyme này có thể được tạo ra từ việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường riêng sau đó được đưa vào nguyên liệu giàu đạm như trong sản xuất nước tương hoặc tận dụng các enzyme có sẵn trong nguyên liệu ban đầu như sản xuất nước mắm Thành phần thu được trong dung dịch bao gồm cả protein, pepton, peptide và acid amine [4]

21

+ Phương pháp enzyme

Đây là phương pháp thủy phân protein trong điều kiện ôn hòa không yêu cầu nhiệt độ cao (thường 40 – 500C) Sử dụng nguồn enzyme từ các chế phẩm enzyme thương mại, có thể kết hợp nhiều loại enzyme với nhau để tăng hiệu suất thủy phân như: protease, cellulase, amylase Phương pháp này hạn chế sử dụng hóa chất nên ít làm biến đổi acid amine, sản phẩm an toàn và giá trị dinh dưỡng không giảm nhiều, hiệu suất tối đa đạt 70% Không giống như phương pháp acid, enzyme thủy phân liên kết peptide thường có tính đặc hiệu Ví dụ: papain sẽ cắt liên kết peptide trong chuỗi gần kề với arginine, lysine và phenylalanine; pepsin cắt các chuỗi có phenylalanine hoặc leucine tham gia liên kết Bên cạnh những ưu điểm kể trên, phương pháp này vẫn tồn tại khuyết điểm, đó là thời gian thủy phân kéo dài [4]

Trong phương pháp này, enzyme protease đóng vai trò thủy phân chính Chúng phân cắt các liên kết peptide theo hai cách (exopeptidase và endopeptidase)

Vì vậy, tùy theo yêu cầu sản phẩm cuối cùng, mà có thể lựa chọn enzyme phù hợp [4]

Từ những mô tả của các phương pháp thủy phân trên, một nhận xét có thể được đưa ra là phương pháp thủy phân bằng tác nhân hóa học chỉ có thể rút ngắn thời gian thủy phân, nhưng lại làm ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng dịch thủy phân Trái ngược lại, phương pháp thủy phân bằng tác nhân sinh học chỉ có mỗi khuyết điểm là thời gian thủy phân kéo dài, nhưng lại ít làm biến đổi thành phần hóa học dịch thủy phân, điều kiện thủy phân ôn hòa, dễ xảy ra Vì vậy có thể nói phương pháp thủy phân bằng enzyme cho ra sản phẩm an toàn và đảm bảo được giá trị dinh dưỡng

1.5 Các nghiên cứu tách chiết carotenoprotein trong và ngoài nước:

1.5.1 Các nghiên cứu trong nước:

a) Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus monodon vào chế biến thuỷ sản _ TS Nguyễn Lệ Hà[12]

22

Trong nghiên cứu này, hỗn hợp đầu và vỏ tôm xay nhỏ 2 -5 mm được thuỷ phân bằng chế phẩm enzyme protease tôm sú trong môi trường Na2 – EDTA với các thông số ban đầu: tỉ lệ phế liệu: dung dịch Na2 – EDTA 0.5M pH 7 là 1:3, lượng muối ăn bổ sung 1%, dịch thuỷ phân được khuấy trộn đều sau mỗi nửa giờ

Quá trình thuỷ phân phế liệu đầu và vỏ tôm được thực hiện với enzyme CPE (được thu nhận từ đầu hoặc nội tạng tôm sú) với ba nồng độ 2; 3,5 và 5% ở các nhiệt độ 40, 50 ,60 và 65oC theo thời gian 0; 3; 6; 9;12;15 giờ Và kết quả thu được

là thuỷ phân đầu tôm ở nhiệt độ 53oC, thời gian 10 giờ ở nồng độ CPE 4,5% sẽ thu nhận carotenprotein với hàm lượng carotenoid là 0,7056mg/g

b) Trích carotenoprotein từ đầu tôm sử dụng acid vô cơ và acid hữu cơ _ Phạm Thị Đa Phượng, Nguyễn Công Minh, Nguyễn Thị Như Thường, Ngyễn Văn Hoà, Anil Kumar Anal, Trang Sĩ Trung.[8]

Trong nghiên cứu này, các tác giả sử dụng HCl và HCOOH để làm tác nhân thuỷ phân Đầu tiên, đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân với HCl ở các nồng độ khác nhau: 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5% trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó, mẫu được thuỷ phân bằng cách cho HCCOH 0.3% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng

Thí nghiệm thứ hai để xác định thừi gian thuỷ phân Mẫu được thuỷ phân với nồng độ được xác định ở thí nghiệm 1 trong thời gian 1; 2; 3; 4; và 5 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó, mẫu được thêm HCOOH 0.3% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng

Thí nghiệm thứ ba để xác định nồng độ HCCOH Mẫu đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân ở nhiệt độ phòng Dịch thu được từ nồng độ và thời gian thuỷ phân tối ưu từ thí nghiệm 1 và 2, mẫu được thuỷ phân với HCCOH ở các nồng

độ khác nhau: 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1% trong 2 giờ ở nhiệt độ thường

Thí nghiệm bốn xác định thời gian thuỷ phân với HCOOH Đầu tôm xay nhỏ được thuỷ phân ở nhiệt độ thường với nồng độ tối ưu thu được từ thí nghiệm 3 ở các thười gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5 giờ ở nhiệt độ phòng

23

Kết quả thu được: điều kiện tối ưu để thuỷ phân thu carotenoprotein từ đầu tôm là HCl 2% trong 1 giờ và sau đó thêm vào HCOOH 4% trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng Với điều kiện thủy phân này, lượng carotenoid thu được là 473,9 ppm

c) Chiết rút chế phẩm đạm giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng _ Phạm Thị Đan Phượng, Trần Thị Luyến Tạp chí Khoa học – Công nghệ thuỷ sản

số 1/2013 [10]

Đạm giàu carotenoid được thu nhận bằng cách thuỷ phân dùng kết hợp 2 enzyme: Alcalase và Flavourzyme Trong nghiên cứu này, đầu tôm được thuỷ phân tuần tự bằng enzyme Alcalase trước và Flavourzyme Nguyên liệu được thủy phân bằng enzyme Alcalase với các nồng độ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w: khối lượng enzyme trên khối lượng đầu tôm) ở nhiệt độ 550C trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian là 2 giờ, ở pH tự nhiên (pH = 6,9) để xác định tỷ lệ Alcalase/nguyên liệu thích hợp Để xác định ảnh hưởng của thời gian thủy phân, nguyên liệu được thủy phân bằng Alcalase với tỷ lệ Alcalase thích hợp đã được xác định ở thí nghiệm trên, ủ mẫu ở nhiệt độ 550C trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian thực hiện thí nghiệm là 1; 2; 3; 4; 5 giờ Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 850C trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 550

C, tiếp tục thủy phân mẫu thí nghiệm bằng Flavourzyme 0,2% (w/w) trong bể ổn nhiệt lắc đảo ở 550C trong 2 giờ

Sau khi thủy phân bằng Alcalase ở điều kiện thích hợp đã xác định, nguyên liệu được tiếp tục thủy phân bằng Flavourzyme với các tỷ lệ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w) ở 550C trong 2 giờ để xác định tỷ lệ Flavourzyme/nguyên liệu thích hợp Để xác định thời gian xử lý bằng Flavourzyme thích hợp, mẫu xử lý được xử lý bằng Flavourzyme với nồng độ thích hợp đã được xác định ở các khoảng thời gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5 giờ ở 550C Sau khi thủy phân tiến hành ép để tách riêng phần dịch thu hồi chế phẩm đạm giàu carotenoid bằng phương pháp điểm đẳng điện kết hợp xử lý nhiệt có bổ sung chitosan theo Trang Sĩ Trung và cộng sự (2008) Cụ thể: dịch thủy phân chứa đạm giàu carotenoid được điều chỉnh pH về pH 4,3 - 4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein sau đó kết hợp gia nhiệt ở nhiệt độ 700C trong thời gian 10 phút và bổ sung chitosan ở nồng độ 100ppm Việc chọn chế độ xử lý tối ưu

d) Tối ưu hoá quá trình trích ly astaxanthin từ vỏ tôm bằng dầu thực vật _ Lê Thị Thuỳ Nga [7]

Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu

mè là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,54:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 39,82 Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu nành là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian:

169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,56:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 41 Điều kiện tối ưu để trích ly astaxanthin từ vỏ tôm sú đối với dung môi dầu cải là nhiệt độ: 92,2oC, thời gian: 169 phút, tỉ lệ dung môi : mẫu là 2,5:1; với lượng astaxanthin tối ưu trích ly đạt được là 36,03mg/kg Trong ba loại dung môi khảo sát thì dung môi dầu nành cho hiệu suất trích ly astaxanthin tốt nhất

1.5.2 Các nghiên cứu ngoài nước:

a) Extraction of astaxanthin from giant tiger (Penaeus monodon) shrimp waste using palm oil: Studies of extraction kinetics and thermodynamic.[14]

Carotenoid trong phế liệu tôm khô được trích ly bằng cách sử dụng dầu cọ ở nhiệt độ 50; 60 và 700C Sau khi đạt nhiệt độ cần thiết thì cho 50g phế liệu tôm vào Nồng độ carotenoid trong dầu cọ được đo bằng UV – 1200 tại λmax (482 nm)

25

b) Astaxanthin extraction from shrimp waste by lactic fermentation and enzymatic hydrolysis of carotenprotein complex – R.Armenta – Lospez, I.Guerrero L., and S.Huerta [24]

Mẻ cấy vi khuẩn Lactobacillus làm giảm pH hiệu quả nhất sau 48 giờ lên men đạt được pH 4,0 Năng suất trích ly cao nhất thu được với ether dầu mỏ : acetone : nước (15:75:10), cộng thêm BHA:BHT và đưa vào bóng tối để tránh oxy hoá

c) Extraction of carotenprotein from shrimp process wastes with the aid of trysin from atlantic cod [13]

Carotenprotein được thu nhận từ phế liệu tôm bằng cách sử dụng enzyme proteolytic thương mại Trích ly carotenprotein với sự hiện diện tri – sodium EDTA Trong nghiên cứu này, enzyme proteolytic được sử dụng trích ly carotenprotein dễ dàng Enzyme thương mại được so sánh với các loại khác, và di – sodium EDTA và nước cất được sử dụng để so sánh với tri – sodium EDTA

d) Recovery of carotenoids from shrimp waste in organic solvents – N.M.Sachidra, N.Bhaskar, N.S Mahendrakar.[22]

Trong nghiên cứu này, tác giả đã dùng dung môi hữu cơ để tách chiết carotenoid từ phế liệu tôm sú tại vùng Mangalore, Indo Phế liệu được vận chuyển ở điều kiện -40C đến phòng thí nghiệm và được bảo quản lạnh ở - 200C cho đến khi sử dụng Tác giả đã sử dụng các dung môi như: acetone, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, ethyl acetate, ehtyl metyl ketone, petroleum ether, và hexane để trích ly carotenoid trong phế liệu tôm sú và so sánh hiệu quả với việc sử dụng hỗn hợp dung môi acetone và hexane, cũng như hỗn hợp 50:50 isopropyl alcohol và hexane Kết quả cho thấy được, khi dùng hỗn hợp isopropyl alcohol và hexane cho hiệu quả trích ly cao nhất (43,9µg/g phế liệu)

Qua các kết quả của các nghiên cứu trong và ngoài nước ở trên, một điều được nhận thấy là với phương pháp trích ly chỉ thu được astaxanthin mà không thu được acid amin cũng như peptide mạch ngắn, ngược lại, với phương pháp thủy

26

phân bằng các tác nhân hóa học cũng như enzyme sẽ thu được cả chất màu carotenoid, acid amin và peptide mạch ngắn Khi so sánh kết quả thu được giữa tác nhân hóa học và enzyme thì kết quả thủy phân với tác nhân là enzyme sẽ cho kết quả thu được chất màu cao hơn so với tác nhân hóa học