PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ SAPONIN TỪ LOÀI BƯỚM BẠC NHIỀU LÔNG

Tổng hợp cấu trúc hóa học của một số hợp chất saponin phân tách được từ phân đoạn EtOAc loài Mussaenda pilosissima Valeton... Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất phân tách được b

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ TƯƠI

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ SAPONIN TỪ LOÀI BƯỚM BẠC NHIỀU LÔNG

(MUSSAENDA PILOSISSIMA VALETON.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHAN THỊ TƯƠI

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG

MỘT SỐ SAPONIN TỪ LOÀI BƯỚM BẠC NHIỀU LÔNG

(MUSSAENDA PILOSISSIMA VALETON.)

Ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GVC TS Vũ Kim Thư

THÁI NGUYÊN - 2018

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam trong khuôn khổ đề tài Nafosted mã số 2016.27

104.01-Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Kim Thư -

người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Phan Văn Kiệm

cùng toàn thể cán bộ phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo khoa Hóa họcTrường Đại học Khoa học, Trường Đại học Thái Nguyên đã dạy dỗ và dìu dắt em trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin được gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường THPT chuyên Hưng Yên và các thầy cô tổ bộ môn đã điều kiện thuận lợi cho em có thời gian theo học khóa học này

Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè

và người thân đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ em trong quá trình em học tập

và nghiên cứu

Hà Nội, ngày….tháng 5 năm 2018

Tác giả luận văn

Phan Thị Tươi

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Thông tin về chi Mussaenda 3

1.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Mussaenda 6

1.3 Loài Mussaenda pilosissima Valeton 14

1.4 Phương pháp sắc kí trong phân tích, phân tách các hợp chất hữu cơ 14

1.4.1 Sắc kí lớp mỏn 15

1.4.2 Sắc kí cột 16

1.5 Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ 17

1.5.1 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 18

1.5.2 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều 19 Chương 2 THỰC NGHIỆM 21

2.1 Nguyên liệu, hóa chất 21

2.2 Phương pháp phân tách các hợp chất tinh khiết 21

2.2.1 Phương pháp chiết 21

2.2.2 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 21

2.2.3 Sắc kí cột (CC) 22

Trang 5

2.3 Phương pháp phân tích phổ xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

22 2.4 Thu thập và xử lý mẫu loài bướm bạc nhiều lông 22

2.5 Thực nghiệm 23

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 26

3.1 Mẫu thực vật 26

3.2 Thông số vật lí của 4 hợp chất phân tách được từ loài bướm bạc nhiều lông 26

3.2.1 Hợp chất MP1: Quinovic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester 26

3.2.2 Hợp chất MP2: 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-quinovic acid-28-O-[β-D-glucopyranosyl] ester 26

3.2.3 Hợp chất MP3: 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl]-quinovic acid-28-O-[β-D-glucopyranosyl]ester 26

3.2.4 Hợp chất MP4: Phelasin B 26

3.3 Phân tích cấu trúc hóa học, đánh giá hàm lượng của các hợp chất 27 3.3.1 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất MP1 27

3.3.2 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất MP2 34

3.3.5 Tổng hợp cấu trúc hóa học của một số hợp chất saponin phân tách được từ phân đoạn EtOAc loài Mussaenda pilosissima Valeton và đánh giá sơ bộ hàm lượng 52

KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Trang 6

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

EtOAc Ethyl acetate Dung môi CH3COOC2H5

HMBC Heteronuclear multiple Bond

TLC Thin layer chromatography Sắc kí lớp mỏng

TMS Tetramethylsilane Si(CH3)4

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thống kê các loài thuộc chi Mussaenda ở Việt Nam được dùng

làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm trong dân gian 3

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất MP1 và chất so sánh 32

Bảng 3.5 Thống kê 4 hợp chất phân tách được từ phân đoạn EtOAc loài Mussaenda pilosissima Valeton 52

Bảng 3.6 Đánh giá sơ bộ về hàm lượng của các hợp chất saponin trong

mẫu bướm bạc nhiều lông Mussaenda pilosissima Valeton 53

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh hoa và lá của loài Mussaenda pilosissima

Valeton 14

Hình 2.1 Qui trình xử lý mẫu tổng loàibướm bạc nhiều lông (Mussaenda pilosissima Valeton.) 24

Hình 2.2 Qui trình xử lý mẫu tách chất từ phân đoạn dịch chiết EtOAC loài bướm bạc nhiều lông (Mussaenda pilosissima Valeton.) 24 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất MP1 27

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất MP1 27

Hình 3.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất MP1 29

Hình 3.4 Phổ DEPT của hợp chất MP1 29

Hình 3.5 Các tương tác HMBC chính của hợp chất MP1 30

Hình 3.6 Phổ HSQC của hợp chất MP1 30

Hình 3.7 Phổ HMBC của hợp chất MP1 31

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất MP2 34

Hình 3.23 Phổ DEPT của hợp chất MP4 48

Trang 9

Trang 10

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật rất đa dạng và phong phú Đây là nguồn dược liệu quí giá phục vụ sức khỏe và cuộc sống con người Theo dự đoán có khoảng 12.000 loài, trong đó hiện đã biết khoảng 4.000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [1 - 3] Do đó, việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính… nhằm tạo ra các sản phẩm thuốc có tác dụng chữa bệnh là một trong những nhiệm vụ đặc biệt quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm

Các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên thể hiện ưu điểm so với các chất tổng hợp, do có độc tính thấp và khả năng dung nạp cao trên cơ thể sinh vật

Do đó việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loại thảo dược có ý nghĩa to lớn nhằm giải thích ý nghĩa khoa học về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc và góp phần tạo cơ sở phát triển các loại thuốc chữa bệnh phục vụ chăm sóc sức khỏe cho con người [4 - 7]

Chi Mussaenda thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) là một nguồn dược liệu

quan trọng từ thiên nhiên, trong đó bao gồm các lớp hợp chất chính là iridoid, triterpenoid và flavonoid Điểm thuận lợi của các loài thuộc chi này là dễ trồng,

ít sâu bệnh và chịu được sự lược tỉa tốt Trong dân gian, người ta đã sử dụng

một số loài thuộc chi Musseanda để chữa bệnh như lợi tiểu, giải nhiệt, hạ sốt,

chữa viêm mũi cấp, viêm dạ dày, bệnh lỵ, Trên thế giới, một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi này đã cho thấy khả năng thể hiện hoạt tính bao gồm gây độc tế bào, kháng viêm, kháng virus, chống oxi hóa, kháng khuẩn [8] Tiêu biểu là các hợp chất triterpene saponin rất điển hình và được biết đến về khả năng thể hiện hoạt tính sinh học mạnh Ở Việt Nam mới chỉ có một bài báo công bố về thành phần hóa học một

số hợp chất từ loài Mussaenda pubescens [9], các loài khác chưa được nghiên

Trang 11

cứu.Với mục đích phân tích, làm rõ cơ sở khoa học và nâng cao giá trị sử dụng

của dược liệu bướm bạc nhiều lông, tôi đã lựa chọn đề tài: “Phân tích cấu trúc

và hàm lượng một số saponin từ loài bướm bạc nhiều lông (Mussaenda pilosissima Valeton.)”

Mục đích nghiên cứu:

1 Xử lí mẫu, nghiên cứu phân tách 2-4 hợp chất saponin từ dịch chiết

methanol loài Mussaenda pilosissima Valeton bằng các phương pháp chiết,

phương pháp sắc kí

2 Phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất phân tách được bằng phương pháp phổ hiện đại

3 Xác định hàm lượng của các hợp chất phân tách được

Đối tượng nghiên cứu:

Loài loài bướm bạc nhiều lông (Mussaenda pilosissima Valeton.)

được thu hái tại Trạm Đa dạng sinh học Mê Linh, xã Ngọc Thanh, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn:

- Tổng quan nghiên cứu về chi Mussaenda và loài Mussaenda pilosissima

Valeton

- Phân tách và phân tích phổ NMR xác định cấu trúc của 2 - 4 hợp chất

saponin từ loài Mussaenda pilosissima Valeton.bằng các phương pháp hóa

lý hiện đại

- Xác định hàm lượng của các chất phân tách được

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Thông tin về chi Mussaenda

Mussaenda là một chi trong họ Cà phê (Rubiaceae) Theo thống kê trên

thế giới có khoảng gần 200 loài thuộc chi Mussaenda [10] Ở Việt Nam, theo

GS Phạm Hoàng Hộ, chi Mussaenda có 27 loài, bao gồm: M aptera Pit., M

baviensis, M bonii Pit., M cambodiana Pierre., M chevalieri Pit., M dehiscens

Craib., M densiflora Li., M dinhensis Pierre ex Pit., M erosa Champ ex Benth., M erythrophylla Schum & Thonn., M flara (Verde), M frondosa L.,

M glabra, M hilaris Pierre ex Pit., M hoaensis Pierre ex Pit., M hossei Craib.,

M laosensis, M longipetala Li., M phlippica, M pilosissima Valeton., M pubescens W.T Aiton., M rehderiana Hutch., M saigonesis Pierre ex Pit., M sanderiana Ridl., M squireii Merr., M theifera Pierre ex Pit và M thorelii Pit

[11]

Trong số các loài thuộc chi Mussaenda ở Việt Nam có 11 loài đã được

dùng làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm trong dân gian [12] Thống kê theo bảng sau:

Bảng 1.1 Thống kê các loài thuộc chi Mussaenda ở Việt Nam

được dùng làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm trong dân gian

khoa học

Tên tiếng Việt

Bộ phận

sử dụng

Nơi sống và phân bố

Tác dụng chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian

Làm thuốc giảm đau, trị ho, bạch đới, tê thấp

Hà Nam, Thanh Hóa,

Bổ, trị ho, suyễn

Trang 13

Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Bắc Giang, Thái Nguyên, Phú Thọ,

Trị ho, hen, sốt rét

có chu kỳ, đau thắt bụng, chữa bệnh ngoài da Lá dùng làm trà uống giải nhiệt

hossei Craib

Bướm bạc Hosseus

Lá và

rễ

Mọc ở vùng núi độ cao trên 600m

Phân bố ở vùng núi Trung bộ

Thanh nhiệt, giải độc, lượng huyết, chỉ huyết Ở Vân Nam (Trung Quốc), rễ dùng trị sốt rét, lá dùng trị gãy xương

frondosa L

Bướm bạc

lá, bướm vàng

Hoa

Mọc ở bìa rừng và các lùm bụi Phân

bố Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Gia Lai, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Bà Rịa

- Vũng Tàu

Hoa được xem như bố phổi, lợi tiểu Dùng trị suyễn, sốt rét định

kỳ và thủy thũng Dùng rửa các vết thương ngoài và mụn nhọt

Thân,

lá

Mọc ở ven rừng, trên các trảng Phân bố ở Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Kon Tum, Đắc Lắc, Lâm Đồng

Vị hơi ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thũng Ở Vân Nam (Trung Quốc) được dùng

để trị cảm mạo, ghẻ lở, nhiệt tích, vết bỏng

Trang 14

7 Mussaenda

glabra Vahl

Bướm bạc nhẵn

Lá,

rễ, hoa

Mọc ở rừng thưa, ven rừng Phân bố ở Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Nội, Hà Nam, Khánh Hòa, Đắc Lắc

Hoa lợi tiểu Ở Ấn

Độ, lá dùng ăn với trầu không và dùng làm thuốc hãm uống trị ho, nước sắc rễ dùng trị ho Hoa dùng trị hen suyễn, trị sốt hồi quy và phù

Rễ, thân

và vỏ

Mọc rải rác ven rừng, trảng cây bụi, các bãi đất hoang

Phân bố Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Ba Vì, Thanh Hóa, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu

Vị ngọt nhạt, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu viêm, lợi niệu, khư phong khóa đàm

Rễ, thân dùn chữa ôn nhiệt Vỏ dùng chế nước uống cho trẻ em

Lá, hoa

Mọc rải rác trong rừng thưa, nơi sáng

Phân bố ở Lạng Sơn

Lá giã ra đắp trị sốt

và sắc uống trị lỵ Hoa được dùng ở Campuchia làm thuốc lợi tiểu và trị hen

Lá, hoa

Mọc ở vùng đồi núi

Phân bố ở Tây Ninh, thành phố Hồ Chí Minh và Nghệ An

Đồng bào dân tộc Thái (Con Cuông - Nghệ An) dùng trị bệnh đau yết hầu

Mọc ven rừng, trên các trảng cây bụi, trong lùm bụi Phân

bố ở Lâm Đồng, Bình Thuận, Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu

Quả dùng chế nước uống như trà

để trị bệnh sốt

Trang 15

1.2 Những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

một số loài thuộc chi Mussaenda

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của

một số loài thuộc chi Mussaenda đã được thông báo Những nghiên cứu này đã

đem đến nhiều kết quả thú vị Cụ thể:

- Loài M philipica

Thành phần hóa học được phân tách từ đài hoa loài M philipica là ba

hợp chất iridoid glycosides, đó là 5-hydroxy davisiosides (1), methoxy secologanin (2) và 6-methoxy mussaenoside (3), cùng với 2 hợp chất flavone, 5,7,4′-trihydroxy-3′-methoxy flavone (4) và 5,7-dihydroxy-6, 3′,4′- trimethoxy flavone (5) [13]

4-acetoxy-7-Những bộ phận khác nhau của loài này được ứng dụng trong chữa bệnh khác nhau, chẳng hạn vỏ thì chữa đau bụng, bệnh lỵ; lá có tác dụng điều trị phổi

và nhiễm trùng ngực; đài hoa chữa bệnh vàng da [14]

Dịch chiết etyl axetat của đài hoa loài M philippica (400 mg/kg) thể

hiện hoạt tính chống u bướu thuộc dòng tế bào Caco-2 ở chuột đực cho ung thư ruột kết và dòng tế bào MCF-7 ở chuột cái cho ung thư vú [15]

Trang 16

- Loài M arcuata

Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết methanol lá của loài M

arcuata đã xác định được bốn hợp chất flavonoid glycoside là astragalin (6),

isoquercitrin (7), kaempferol-3-O-β-rutinoside (8), rutin (9) và hai dẫn xuất của

phenylpropanoid là melilotoside (10) và dihydromelilotoside (11) [16]

Người ta dùng cả cây để hạ sốt, chữa hen suyễn, chứng đái abumin,

bệnh về da, viêm dạ dày Hoạt tính chống oxi hóa và gốc tự do của loài M

arcuata được đánh giá khi dùng dịch chiết methanol và diclometan của

cành và lá Kết quả cho thấy dịch chiết methanol và diclometan của lá có hoạt tính trung bình cho cả thử nghiệm chống gốc tự do theo phương pháp DPPH và chống oxi hóa, còn dịch chiết tương ứng của cành cho hoạt tính yếu hơn [17]

- Loài M erythrophylla

Nghiên cứu về thành phần hóa học của dịch chiết etyl axetat extract của

cành lá loài M erythrophylla xác định được các hợp chất β-sitosterol (12),

5-hydroxy-7,4-dimethoxy flavones (13), 3-iso cumaryloxy-cyclopropane-1-oic

acid (14) và 4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid (15) [18]

Trang 17

Rễ của cây này được dùng để chữa ho, bệnh vàng da và khi nhai thì

sẽ kích thích ăn ngon miệng Tác dụng lợi tiểu của dịch chiết rễ clorofom và

ethanol M erythrophylla trên chuột đã được nghiên cứu Dịch chiết của rễ

cây này được đưa vào chuột bằng đường uống với liều 250 và 500 mg/kg và Furosemide (10 mg/kg) được dùng như là đối chứng dương Thí nghiệm cho thấy lượng nước tiểu đã tăng lên đáng kể do đó có thể kết luận về tác dụng

lợi tiểu của M erythrophylla [19]

- Loài M pubescens

Nhóm tác giả Zhao Wei Min và Xu Junping (Trung Quốc) nghiên

cứu thành phần hóa học dịch chiết của phần trên cạn loài M pubescens xác

định được ba hợp chất monoterpenes là mussaenins A (16), B (17), C (18)và monoterpene argyol (19); các hợp chất triterpenoid saponins, mussaendosides D (20), E (21), F (22), G (23), H (24), K (25), O (26), P (27), Q (28), R (29), S (30), U (31), V (32) [20 - 26]; hai hợp chất cycloartane-type triterpenoidal saponin là mussaendosides M (33) và mussaendosides N (34) [27]

Trang 18

M pubescens được sử dụng như là tác nhân lợi tiểu, kháng viêm, giải

độc nấm độc Axit rotundic (35), một hợp chất triterpenoid được phân tách từ

loài M pubescens thể hiện hoạt tính gây độc tế bào [28] M pubescens đã thể

hiện hoạt tính kháng virus hợp bào đường hô hấp [29] và hoạt tính kháng nấm

Phytium ultimum, Rhizoctonia solani, Aspergillus fumigatus [30]

Trang 19

Dịch chiết ethanol của loài M frondosa được phân tích theo phương pháp

GC MS xác định thành phần có 20 hợp chất Trong đó, thành phần chính là

(-)-Quinic acid (36) (32.87 %), 4-((1E)-3-Hydroxy-1-propenyl)-2-methoxyphenol (37)

(8.30%), Naphthalene, decahydro-2-methoxy (38) (7.20 %), 1,2,3-Benzenetriol (39)

(7.70%) Dịch chiết cũng thể hiện nhiều hoạt tính dược lý như là khử trùng, chống oxi hóa, chống viêm da, kháng nấm, trừ sâu, chống khối u,… [31]

Lá được sử dụng chữa bệnh vàng da, hen suyễn, dạ dày dư thừa axit, sốt, ung nhọt, bệnh phong, lợi tiểu, bảo vệ gan [32]

- Loài M roxburghii

Từ phần trên cạn của loài M roxburghii đã phân tách được một hợp chất iridoid

là shanzhiol (40) Hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tụ cầu

Staphylococcus aureus và Escherichia coli với giá trị MIC là 100 µg/mL [33]

Loài M roxburghii được sử dụngđể chữa đầy bụng, buồn nôn[34] Rễ được sử

dụng để chữa thấp khớp [35] Lá sạch dán vào các vết cắt, vết thương, ngoài ra

lá cũng được sử dụng kết hợp với thảo mộc khác làm tác nhân ủ rượu bia [36]

28-O-β-D-và glucopyranosyl-(1→2)}-O-β-D-glucopyranosyl(1→3)-O-β-D-glucopyranosyl -

{[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-β-D-cycloarta-22,24-dien-27-oic acid (44), acetyloleanolic acid (45), acetyldaturadiol (46), rotundic acid (35) và 16α-hydroxyprotobassic acid (47) [37]

Trang 20

Loài M macrophylla thể hiện hoạt tính ức chế trung bình đối với vi khuẩn viêm lợi Periodontopathic Porphyromonas với giá trị MIC là 78µg/mL

[38] Phần dịch chiết trong CCl4 của loài này thể hiện sự ức chế khuẩn thương

hàn Salmonellaparatyphi và nấm Aspergillus niger với vùng giá trị ức chế là

15,0 và 13,0 [39]

- Loài M dona-aurora

Hợp chất iridoid glycoside,

Sanshiside D (48) được phân tách từ

đài hoa của loài M dona-aurora, thể

hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với

dòng tế bào gan vero, HeLa và

SMMC-7721 với giá trị IC50 lần lượt

là 1,99, 0,12 và 1,53mg/mL Kết quả

này được so sánh với đối chứng là

thuốc methrotrexate và taxol với IC50

lần lượt là 3,89, 0,07, 1,37; 2,05, 0,05

và 0,74mg/mL [40]

- Loài M hainanensis

Trang 21

Dịch chiết etyl axetat, butanol và nước của loài M hainanensis cho kết quả với thử nghiệm thu dọn gốc tự do theo phương pháp DPPH với các giá trị IC50 (mg/mL) lần lượt là 0,0958, 0,4488, 0,9844 Từ loài M hainanensis đã phân tách được 12 hợp chất

là pinostrobin (49), quercetin (50), 8-O-acetyl-shanzhiside methyl ester (51), [2-hydroxyl-tetracosan-cosoyl]-1-O-β-D-glucopyranosy1- 8-en-octadecasphingenine (52), caffeic acid (53), quercetin-3-O-β-D-glucosid (54), quercetin-7-O-β-D-glucoside (55), 3-O-β-D-glucopyranosyl pomolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (56), 3,4-di-o-caffeoylquinic acid (57), chlorogenic acid (58), lamalbid (59), shanzhiside methyl ester (60) [41] Người ta dùng nước sắc của

8[E]-N-rễ loài này để giải độc rượu [42]

- Loài M glabrata

Trang 22

Dịch chiết methanol của lá loài M glabratathu hái tại Banglades có khả

năng gây độc tế bào đáng kể với (IC50< 1,0 mg/mL) với bốn dòng tế bào ung thư người (gastric, AGS; colon, HT-29; breast, MCF-7 và MDA-MB-231) bằng phép thử MTT [43]

Quá trình sàng lọc hóa thực vật cho thấy các thành phần hóa học loài M

glabratacó alkaloid, phenol, tannin, protein, carbohydrate, saponin,

glycoside và cardiac glycoside Phép thử in vitro về hoạt tính chống oxi hóa

và kháng viêm của dịch chiết methanol của rễ loài M glabrata roots đã

được thử nghiệm Axit ascorbic vàaxit gallic acid được sử dụng là chất

chuẩn chống oxi hóa và đối chứng dương Dịch chiết M glabratavới nồng

độ thấp hơn cho khả năng kháng viêm tốt như chất đối chứng là thuốc kháng

viêm Diclofenac và Hydrocortisone Nghiên cứu chỉ ra rằng loàiM

glabratacó thể được khai thác làm dược phẩm cho khả năng chống oxi hóa

và kháng viêm [44]

Như vậy, những nghiên cứu và tìm hiểu về chi Mussaenda đã cho

thấy thành phần hóa thực vật quan trọng là iridoid, triterpenoid và flavonoid Những thử nghiệm đã chứng minh lớp chất này có khả năng mang lại những hoạt tính ý nghĩa về khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư, kháng viêm và chống oxi hóa Ngoài ra, một số loài trong chi

Mussaenda đã được sử dụng phổ biến trong kho tàng thuốc cổ truyền để

chữa bệnh về gan, chống viêm nhiễm, kháng sinh, chống oxi hóa Do đó,

chi Mussaenda có triển vọng là nguồn dược liệu mang tiềm năng lớn về các

hợp chất có hoạt tính sinh học Hiện nay, ở Việt Nam chưa có công trình khoa học công bố về kết quả của đề tài Do đó, việc định hướng tập trung nghiên cứu một cách hệ thống về tiềm năng các hoạt chất sinh học của chi này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Trang 23

1.3 Loài Mussaenda pilosissima Valeton

Tên thường gọi: bướm bạc nhiềulông

Tên khoa học: Mussaenda pilosissima Valeton., thuộc chi Mussaenda,

họ Cà phê (Rubiaceae)

Hình 1.1 Hình ảnh hoa và lá của loài Mussaenda pilosissima Valeton

Mô tả: Theo GS Phạm Hoàng Hộ Mussaendapilosissima Valeton là cây

tiểu mộc lao; cành tròn, lúc non đầy lông trắng Lá có phiến bầu dục, to đến 8

x 3,5 cm, chóp nhọn, đáy tà, mặt dưới có lông dày nhu nhung trắng, mặt trên

có lông ngắn thưa; cuống dài 8-10 mm, lá bẹ chẻ hai Phần hoa ở ngọn, cọng chung 2-3 cm; lá dài 4 mm, lá đài dạng cánh xoan, trắng, to 4x3 cm; vành có lông vàng mặt ngoài, ống dài 2,2 cm, tai 5mm[11]

Theo nhóm tác giả Đỗ Sĩ Hiến thì loài thực vật Mussaendapilosissima Valeton

được đồng bào dân tộc Mường tại khu bảo tồn thiên nhiên Hang Kia - Pà Cò

sử dụng làm thuốc trị bệnh thận, đái ra máu bằng cách dùng toàn cây sắc lấy nước uống [45]

Theo kết quả tra cứu thì cho đến nay trên thế giới và Việt Nam chưa có công

bố nghiên cứu nào về loài Mussaendapilosissima Valeton

1.4 Phương pháp sắc kí trong phân tích, phân tách các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc kí là một trong những phương pháp phổ biến và hữu hiệu sử dụng để phân tách các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng Cơ sở của phương pháp sắc kí dựa trên sự khác nhau về bản chất hấp phụ

Trang 24

và phân bố của các chất giữa hai pha: pha tĩnh và pha động Tùy theo bản chất của pha tĩnh hoặc pha động hay dựa trên cách thức triển khai sắc kí mà người ta phân loại thành các phương pháp sắc kí khác nhau như sắc kí khí, sắc kí lỏng, sắc kíđiện

di, sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột, sắc kí cột trọng lực, sắc kí cột trung áp, sắc kí cột cao áp Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân tách người ta lựa chọn những phương pháp sắc kí phù hợp Thông thường để phân tách một hợp chất cần có sự kết hợp của các phương pháp sắc kí khác nhau và thường thấy là sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột trọng lực Trong khi đó, để phân tích định tính hay định lượng của một hợp chất trong thuốc, dược liệu thì cần đến phương pháp sắc kí hiện đại như sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), HPLC gắn khối phổ

Chất phân tích được hòa tan trong dung môi dễ bay hơi và đưa lên bản mỏng thành một điểm gọn nhờ một mao quản (capillary) và sấy đuổi dung môi Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lượng chất phân tích đưa lên bản mỏng là khác nhau

SKLM được triển khai trong một bình sắc kí bằng thủy tinh, hình dạng

đa dạng, có nắp đậy và bão hòa pha động Pha động di chuyển chậm dọc theo bản mỏng và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó Tùy theo khả năng hấp phụ-

Trang 25

giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trên bản mỏng là hệ số di chuyển Rf Hệ số này được tính bằng tỉ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất phân tích và khoảng dịch chuyển của pha động trên bản mỏng

Do vậy Rf sẽ có giá trị từ 0 đến 1 và mỗi hợp chất sẽ có một giá trị Rf xác định đối với một hệ dung môi

Dấu vết của các chất phân tích trên bản mỏng sau khi triển khai có thể được quan sát bằng mắt thường (dựa trên màu sắc của chất phân tích) hay hiện hình nhờ tia tử ngoại (thông thường sử dụng tia tử ngoại với bước sóng 254 và/hoặc 365 nm), hay bằng các phản ứng hóa học bằng cách phun các dung dịch thuốc thử khác nhau tùy theo bản chất của chất phân tích Chẳng hạn ninhydrin phát hiện amino acid hay amin; 2,4-dinitrophenyl hydrazine phát hiện aldehyde hay ketone, dragendorff phát hiện các hợp chất alkaloid… Với các hợp chất hữu cơ thông thường có thể dùng dung dịch acid H2SO4 loãng (khoảng 10%) và hơ nóng để phát hiện các vết chất trên bản mỏng

SKLM có một số ưu điểm như chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích, thực hiện dễ dàng cho kết quả nhanh với độ chính xác cao, có thể phân tích đồng thời mẫu phân tích và chất chuẩn đối chứng Tuy nhiên, SKLM chỉ hiệu quả trong việc phân tích, định tính các hợp chất khó có tính khả thi trong phân tách lượng lớn các hợp chất Do đó, người ta sử dụng SKLM chủ yếu cho mục đích phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc kí cột để phân tách các hợp chất hữu cơ

1.4.2 Sắc kí cột

Sắc kí cột là phương pháp sắc kí phổ biến, đơn giản và hay sử dụng nhất trong phân tách các hợp chất hữu cơ từ nguồn tự nhiên Trong sắc kí cột, pha tĩnh được nạp trên các cột thủy tinh, pha động đi qua cột ở điều kiện áp suất

Trang 26

khí quyển nhờ lực hút của Trái đất do đó còn được gọi là sắc kí cột trọng lực, sắc kí cột hở Đồng thời pha tĩnh phải là các hạt có kích thước đủ lớn để pha động có thể đi qua dễ dàng nhờ trọng lực Thông thường kích thước hạt trung bình từ 50-150 µM Với chất hấp phụ silica gel, kích thước cỡ hạt trung bình (40-63 µM) thường được sử dụng để phân tách các hợp chất tự nhiên Pha tĩnh được nạp lên cột sắc kí theo hai phương pháp khác nhau là nạp ướt

và nạp khô

Trong phương pháp nạp khô, chất hấp phụ được đưa riêng lẻ, từ từ lên cột, gõ nhẹ cho chất hấp phụ phân bố đều lên cột và ổn định cột bằng pha động trước khi triển khai

Ở phương pháp nạp ướt, chất hấp phụ được tẩm ướt hoàn toàn trong pha động Hỗn dịch gồm pha động và pha tĩnh sau đó được đưa lên cột sắc kí và liên tục cho pha động chảy qua cột để ổn định cột sắc kí

Hỗn hợp chất cần phân tách được đưa lên đầu cột, phía trên pha tĩnh Thông thường, trước khi đưa hỗn hợp chất phân tích lên cột sắc kí, hỗn hợp này được trộn đều với chất hấp phụ theo phương pháp tẩm ướt (với chất hấp phụ là silica gel) hay đưa trực tiếp lên cột bằng cách hòa tan hoàn toàn trong thể tích tối thiểu pha động (với chất hấp phụ là pha đảo)

Hợp chất cần phân tách sau đó được rửa giải từ từ ra khỏi cột sắc kí bằng pha động Quá trình các hợp chất rửa giải ra khỏi cột sắc kí được theo dõi bằng phân tích SKLM

Quá trình sắc kí cột có thể được tiến hành lặp lại với các pha động khác nhau, hay kết hợp vơi các phương pháp khác đến khi thu được hợp chất có độ tinh khiết mong muốn

1.5 Phương pháp phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ có thể được xác định nhờ vào các tính chất

lý hóa đặc trưng của chúng Cách xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu

cơ hiện nay phổ biến là phân tích kết hợp một hay nhiều phương pháp phổ như

Trang 27

phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng, nhiễu xạ tia X (X-Ray), …, hay tiến hành các chuyển hóa hóa học Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì càng yêu cầu phân tích kết hợp nhiều các phương pháp phân tích khác nhau Với các hợp chất có hấp thụ UV, phân tích phổ

UV cho phép dự đoán về sự xuất hiện của các nhóm mang màu, khung carbon của hợp chất phân tích Trong khi đó phổ IR lại cho các tín hiệu dao động của các nhóm chức, từ đó cho phép xác định sự có mặt của các nhóm chức này trong cấu trúc hóa học của hợp chất phân tích Với các hợp chất có cấu trúc hóa học mới hoặc khó xác định được công thức phân tử thì phổ khối lượng (đặc biệt là phổ khối lượng phân giải cao) và phương pháp phân tích nguyên tố là những phương pháp cần thiết ban đầu cho phép xác định chính xác công thức phân tử của hợp chất cần phân tích Trong trường hợp các hợp chất có cấu trúc lập thể bất đối xứng thì nhiều trường hợp cần thiết phải phân tích phổ X-Ray hay phổ lưỡng sắc tròn (CD) để xác định chính xác cấu trúc tuyệt đối, phân bố trong không gian của các hợp chất này Trong các phép phân tích phổ để xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất hữu cơ thì phổ NMR được sử dụng phổ biến và là một trong những phép phân tích đòi hỏi cho việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Các kỹ thuật phân tích NMR được chia thành hai loại chính là phân tích NMR một chiều và hai chiều

1.5.1 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phân tích NMR một chiều gồm phân tích cộng hưởng từ hạt nhân proton (1NMR), cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) và các kỹ thuật phân tích DEPT như DEPT-45, DEPT-90, DEPT-135

H Phổ 1 H-NMR: cho biết tín hiệu cộng hưởng của các proton có trong phân tử

hợp chất cần phân tích Dựa vào bản chất liên kết giữa proton với nguyên tử khác hay ảnh hưởng bởi các nguyên tử, nhóm nguyên tử gần cạnh mà các proton cho các tín hiệu có độ chuyển dịch hóa học và sự phân tách hình dạng tín hiệu khác nhau Độ chuyển dịch hóa học của các proton được so với hợp chất chuẩn

Trang 28

nội TMS và thường nằm trong khoảng thang chia 0-14 ppm Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu cộng hưởng của một proton được phân tách theo quy tắc (n+1) trong

đó n là số lượng các proton tương đương về tính chất từ ở gần cạnh nó Mỗi dạng phân tách cho một tên gọi của tín hiệu khác nhau như singlet (s, tín hiệu đơn), douplet (d, tín hiệu đôi, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách 1:1), triplet (t, tín hiệu ba, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách 1:2:1), quartet (q, tín hiệu bốn, tỉ lệ chiều cao mỗi tín hiệu phân tách 1:3:3:1), multiplet (m, tín hiệu đa) Trong khi đó, tỉ lệ diện tích các tín hiệu cho biết tương quan về tỉ lệ số proton tương ứng với tín hiệu đó

- Phổ 13 C-NMR: cho biết số nguyên tử carbon trong phân tử của chất phân tích

Tương tự như phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR nhận được các tín hiệu cộng hưởng của carbon với các giá trị độ chuyển dịch hóa học khác nhau nhưng với biên độ rộng hơn Thông thường các tín hiệu của carbon xuất hiện trong thang chia từ

0 tới 230 ppm Số lượng tín hiệu nhận được trên phổ carbon sẽ tương ứng với

số lượng nguyên tử carbon không tương đương về tính chất từ có trong phân tử chất phân tích

- Phổ DEPT: cho phép phân loại các tín hiệu trên phổ carbon thành các nhóm

carbon khác nhau bao gồm: carbon không liên kết trực tiếp với hydro C, nhóm metin CH, nhóm methilen CH2 và nhóm methyl CH3 Để phân loại được các tín hiệu này cần sử dụng kết hợp một số kỹ thuật phân tích DEPT khác nhau, tối thiểu

là kết hợp giữa DEPT-90 với DEPT-135 và 13C-NMR Trên phổ DEPT135 sẽ vắng mặt tín hiệu của carbon không liên kết trực tiếp với hydro, các tín hiệu của

CH2 có hướng về phía dưới và các tín hiệu của CH cùng với CH3 có hướng lên trên Trong khi đó phổ DEPT90 chỉ nhận được các tín hiệu của CH Từ đó cho phép phân loại được 4 dạng tín hiệu carbon khác nhau

1.5.2 Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Kỹ thuật phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều cho phép xác định mối liên hệ giữa các proton với proton (phổ hai chiều tương tác đồng hạt nhân), proton với carbon (phổ hai chiều tương tác dị hạt nhân) trong phân tử hợp chất phân tích Các kỹ thuật phân tích phổ hai chiều thường gặp là COSY (tương tác

Trang 29

đồng hạt nhân proton theo mạch liên kết), NOESY (tương tác đồng hạt nhân theo phân bố trong không gian), HSQC (tương tác dị hạt nhân qua một liên kết), HMBC (tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết)

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): cho biết các tương

tác trực tiếp H-C Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, trục còn lại là 13C-NMR Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ nối giữa hai trục là tín hiệu 1H- và 13C-NMR

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): đây là phổ biểu

diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần cấu trúc của phân tử cũng như toàn phân tử được xây dựng

và ghép nối với nhau

- Phổ 1 H- 1 H COSY (1H-1H Corelation Spectroscopy): phổ này biểu diễn tương tác H-H theo mạch liên kết, chủ yếu là các proton đính trên cùng một nguyên tử carbon hoặc với nguyên tử cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các khung cơ sở/mảnh cấu trúc cơ sở của chất phân tích có thể được thiết lập

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): phổ này biểu diễn

các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này

có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử Ngoài ra, người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE một chiều để xác định cấu trúc không gian của phân tử Các proton có cùng phía cũng như gần nhau về không gian

sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiểu phổ với cường độ mạnh hơn bằng việc đưa chúng vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định

Trang 30

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu, hóa chất

+ Mẫu nguyên liệu: cành và lá loài Mussaenda pilossisima Valeton đã

sấy khô, nghiền nhỏ

+ Dung môi hữu cơ thông thường: n-hexane, dichloromethane,

ethylacetate, methanol là dung môi công nghiệp được chưng cất lại trước khi

sử dụng

+ Dung môi đo NMR: CD3OD

+ Bản mỏng Silica gel/pha đảo

+ Bột sắc kíSilica gel/pha đảo

+ Chất hấp phụ khác: sephadex LH-20, diaion HP-20

+ Các loại cột sắc kí: thủy tinh

2.2 Phương pháp phân tách các hợp chất tinh khiết

2.2.1 Phương pháp chiết

Mẫu dược liệu được chiết bằng cách ngâm trong dung môi methanol với

sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm (Elma S300H, Đức)

Các phân đoạn chiết được thực hiện theo phương pháp chiết lỏng-lỏng

để phân đoạn sơ bộ các hợp chất dựa theo độ phân cực của chúng và tính không trộn lẫn của các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau

2.2.2 Sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng TLC tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn

DC-tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu

Trang 31

2.2.3 Sắc kí cột (CC)

Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gelpha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)

2.3 Phương pháp phân tích phổ xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý với phương pháp phân tích hiện đại là đo phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)một chiều và hai chiều

Phổ NMR đo trên máy BRUCKER AVANCE 500 MHz tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (với chất nội chuẩn là TMS)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): phổ proton 1NMR, phổ carbon 13C-NMR vàphổ DEPT

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): phổ HSQC đo tín hiệu các tương tác trực tiếp giữa carbon với hidro và phổ HMBC đo các tín hiệu giữa proton và các carbon kế cận hay xa hơn

- Dung môi được sử dụng CD3OD Việc lựa chọn dung môi đo phụ theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử

2.4 Thu thập và xử lý mẫu loài bướm bạc nhiều lông

Mẫu nghiên cứu được thu thập và xử lý theo phương pháp thường quy

sử dụng trong phân lập các hợp chất tự nhiên từ nguồn dược liệu thực vật

- Mẫu thực vật được thu thập và giám định tên khoa học và làm tiêu bản bởi các nhà thực vật học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Mẫu thực vật sau khi thu thập được rửa sạch, để ráo nước, cắt thành các đoạn nhỏ 3-5 cm sau đó được sấy khô ở 50oC Mẫu khô tiếp tục đem nghiền nhỏ dưới dạng bột và bảo quản trong phòng lưu mẫu đến khi nghiên cứu

Trang 32

2.5 Thực nghiệm

Để có thể thu được các hợp chất từ cây bướm bạc nhiều lông, đầu tiên

áp dụng phương pháp chiết lỏng/rắn Sử dụng dung môi chiết có độ phân cực trung bình là methanol với mục đích khảo sát cả các hợp chất có độ phân cực

ít đến trung bình và khá phân cực Trong quá trình chiết, sử dụng nhiệt độ nhằm rút ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết

Để tách thô các phân đoạn giúp cho quá trình phân lập trên sắc ký cột thuận lợi chúng tôi sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏng/lỏng với việc sử dụng các dung môi không tan vào nhau và phân bố chất vào các pha khác nhau Dung môi chiết được tăng dần độ phân cực từ ít phân cực đến phân cực nhiều Quá trình làm giầu chất được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trước khi tiến hành phân tách bằng các loại sắc ký cột với các loại chất hấp phụ khác nhau Đối với những hỗn hợp khó có khả năng tách trên sắc ký pha thường cần thiết sử dụng chất phấp phụ khác

đó là silice gel ngược pha (YMC) với chiều dài mạch chất hấp phụ khác nhau

(RP-8 hoặc RP-1(RP-8) nhằm tăng thêm khả năng tách Trong quá trình tách, điều cần lưu

ý là làm sao cho hệ dung môi kiểm tra trên TLC và trên cột là giống nhau và phải lựa chọn chiều dài cột, đường kính cột phù hợp với khối lượng chất cần tách cũng như Rf của từng chất trong hỗn hợp

Mẫu bướm bạc nhiều lôngMusaenda pilossisima Valeton sau khi thu hái

được phơi khô, nghiền mịn thu được 4,2kg bột khô Bột này được chiết với methanol (3 lần x 3 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 2 giờ) Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng thiết bị cất quay chân không thu được 320g cặn chiết methanol Cặn chiết này được hòa tan vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với dung môi n-hexan, dichloroform và ethyl acetate Các dịch chiết được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn n-Hexan (FMP1 56,8 g), phân đoạn dichloroform (FMP2 57,8g), phân đoạn ethyl acetate (FMP3 23 g) và cặn nước (FMP4)

Trang 33

Quá trình thực hiện được mô tả theo qui trình sau:

Hình 2.2 Qui trình xử lý mẫu tổng loàibướm bạc nhiều lông

(Mussaenda pilosissima Valeton.)

Để định hướng cho việc phân tách các hợp chất, bốn phân đoạn trên được chấm kiểm tra trên bản mỏng TLC và chạy bằng các hệ dung môi khác nhau phù hợp với từng phân đoạn Với mục tiêu là phân tích các hợp chất triterpen saponin (một lớp chất đặc trưng và có hoạt tính sinh học thú vị) trong mẫu nghiên cứu, theo kinh nghiệm chuyên môn thì lớp chất này thường có màu tím đỏ khi chấm kiểm tra trên bản mỏng TLC rồi nhúng trong axit H2SO4 10% sau đó sấy khô hơ nóng từ từ đến khi hiện màu Sau khi chấm kiểm tra bằng bản mỏng TLC các phân đoạn thì nhận thấy phần cặn EtOAc tập trung một số vệt màu tím đỏ, do đó đã giúp định hướng chọn phân tách các chất trong phân đoạn FMP2 (23 g)

Hình 2.3 Qui trình xử lý mẫu tách chất từ phân đoạn dịch chiết EtOAC

loài bướm bạc nhiều lông (Mussaenda pilosissima Valeton.)

Trang 34

Phần cặn EtOAc (FMP2 23g) được hòa tan với một lượng tối thiểu dichloromethane sau đó tẩm với 50,0 g silica gel, cất quay cho đến khi bột tơi khô Tiến hành phân tách hỗn hợp này bằng cột silica gel pha thường, rửa giải gradient bằng hệ dung môi D/A với độ phân cực tăng dần (D/A, 100/0

→0/1, v/v) thu được 8 phân đoạn chính 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F,3G và 3R Phân đoạn 3F được phân tách bằng sắc kí cột pha đảo với hỗn hợp dung môi M/W (1/1,5, v/v) thu được 8 phân đoạn 3F1→3F8 Phân đoạn 3F2 sử dụng cột pha đảo hệ dung môi rửa giải A/W (1/1,3, v/v) thu được ba phân đoạn

3F2A→3F2C Hợp chất MP1 (17 mg) thu được từ phân đoạn 3F2C được

phân tách bằng sắc kí cột silica gel pha thường với hệ dung môi D/A/W (1/2,5/0,15, v/v)

Tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột silica gel pha đảo phân đoạn 3F6 bằng sắc kí cột silica gel pha thường với hệ dung môi D/A/W (1/2,5/0,15, v/v)

thu được hai phân đoạn 3F6A và 3F6B Hợp chất MP3 (30 mg) thu được từ

hai phân đoạn 3F6B bằng sắc kí cột silica gel pha đảo với hệ dung môi A/W (1/1,3, v/v)

Phân đoạn 3F8 được phân tách bằng sắc kí cột pha đảo với hỗn hợp dung

môi A/W (1/1,3, v/v) thu được hai phân đoạn 3F8A và 3F8B Hợp chất MP2

(22 mg) thu được từ phân đoạn 3F8B bằng sắc kí cột silica gel pha thường với

hệ dung môi D/A/W (1/2,5/0,15, v/v)

Phân đoạn 3R được phân tách bằng sắc kí cột pha thường với hệ dung môi D/A/W (1/3/0,2, v/v) thu được ba phân đoạn 3R1→3R3 Tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột silica gel pha đảo phân đoạn 3R3 thu được hợp chất

Trang 35

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Mẫu thực vật

Cành và lá loài bướm bạc nhiều lông (Mussaendapilosissima Valeton.)

được thu hái tại trạm Mê Linh - Tam Đảo - Vĩnh Phúc ngày 12/2/2017 Mẫu mang số hiệu NCCT-P69 và được giám định bởi TS Nguyễn Thế Cường - phòng Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.2 Thông số vật lí của 4 hợp chất phân tách được từ loài bướm bạc nhiều lông

3.2.1 Hợp chất MP1: Quinovic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl ester

Chất bột, vô định hình màu trắng;

CTPT C36H56O10 (M = 648)

Phổ NMR: Xem biện giải cấu trúc mục 3.3.1.(trang 27)

3.2.2 Hợp chất MP2: 3-O-[β-D-glucopyranosyl]-quinovic glucopyranosyl] ester

acid-28-O-[β-D-Chất bột, vô định hình màu trắng;

CTPT C42H66O15 (M = 810)

Phổ NMR: Xem biện giải cấu trúc mục 3.3.2 (trang 33)

3.2.3 Hợp chất MP3: 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl]-quinovic glucopyranosyl]ester

Trang 36

3.3 Phân tích cấu trúc hóa học, đánh giá hàm lượng của các hợp chất

3.3.1 Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất MP1

C

COOH

O O

HO

O OH HO

HO HO

1

10

23 24

25 26

12

17 18

20

MP1

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất MP1

Hợp chất MP1 phân tách được dưới dạng chất rắn dạng bột vô định hình màu trắng Công thức phân tử của MP1 được xác định là C36H56O10, khối lượng phân tử M =648phù hợp với tín hiệu của 36 carbon trên phổ 13C-NMR

Trang 37

Phổ 1H-NMR của hợp chất MP1 cho thấy tín hiệu proton của 4 nhóm

methyl dưới dạng singlet tạiH 0,78 (3H, s), 0,90 (3H, s), 0,95 (3H, s), 0,99 (3H, s) và 2 nhóm methyl dưới dạng doublet tạiH 0,92 (3H, d, J = 6,0 Hz), 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz); một proton olefin tại H 5,64 (1H, br s); 1 proton anome tại H 5,39 (1H, d, J = 8,0 Hz), gợi ý hợp chất này có một đơn vị đường

Các tín hiệu proton của phần đường, tín hiệu proton dạng singlet và doublet của 6 nhóm methyl thuộc phần aglycone và sự xuất hiện một số lượng lớn các tín hiệu proton ở vùng trường mạnh (δH 0,74 ~ 2,30) cho phép dự đoán đây là một hợp chất saponin có cấu trúc khung aglycone dạng ursan-12-ene

Phổ 13C-NMRcủa hợp chất MP1 xuất hiện tín hiệu của 36 carbon và

được phân loại bằng phổ DEPT thành: 2 carbon carboxyl (C 178,0 và 179,0);

6 carbon không liên kết với hydro (C), 12 nhóm methine (CH), 10 nhóm methylene (CH2), 6 nhóm methyl (CH3) Trong đó, có 30 carbon thuộc phần khung triterpene, 6 carbon của một đơn vị phân tử đường hexose Các số liệu phổ proton được gán với các số liệu carbon tương ứng thông qua phổ HSQC Phân tích số liệu phổ 1H-, 13C-NMR và phổ HSQC cho phép xác định sự tồn tại cấu trúc bộ khung ursan-12-ene với các tín hiệu đặc trưng: 6 nhóm methyl tại

C 16,4 (H 0,78, 3H, s), 16,9 (H 0,99, 3H, s), 18,1 (H 0,90, 3H, s), 28,7 (H

0,95, 3H, s), 19,2 (H 0,92, 3H, d, J = 6,0 Hz) và 21,3 (H 0,94, 3H, d, J = 6,0

Hz); hai carbon olefin tại C 130,9 (H 5,64, 1H, br s) và 133,4 cho thấy sự có mặt của một liên kết đôi C=C đã bị thế ba proton Sự tồn tại của 1 phân tử đường hexose được gán cho 6 tín hiệu của carbon tại C 95,6 (H 5,39, 1H, d, H-1), 73,9, 78,3, 71,3, 78,6 và 62,6 (H 3,82, 1H, d, J = 12,0 Hz và 3,69, 1H, m), đây là các tín hiệu đặc trưng cho một đơn vị đường β-D-glucose

Vị trí các nhóm thế và qui kết các giá trị phổ 1H- và 13C-NMR của hợp

chất MP1 được thực hiện bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

HSQC và HMBC

Trang 39

tiếp HSQC gồm H-3/C-3, H-24/C-24, H-23/C-23 cho phép qui kết các giá trị phổ 1H-, 13C- tại các vị trí này Tương tác HMBC từ H-25 (δH 0,99) tới C-1 (δC39,8)/ C-5 (56,6)/ C-9 (δC48,1)/ C-10 (δC38,2) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-1/C-1, H-25/C-25) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-1, C-9, C-10 và C-25 Tương tác HMBC từ H-26 (δH0,90) tới C-7 (δC 38,1)/ C-

8 (δC 40,8)/ C-9 (48,1) / C-14 (δC 57,4) và tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-7/C-7, H-26/C-26) cho phép qui kết các giá trị phổ tại C-7, C-8, C-14 và C-26

C

COOH

O O

HO

O OH HO

HO HO

1

10

23 24

25 26

12

17 18

20

MP1

Hình 3.8 Các tương tác HMBC chính của hợp chất MP1

Hình 3.9 Phổ HSQC của hợp chất MP1

Trang 40

Hình 3.10 Phổ HMBC của hợp chất MP1

Tiếp theo, tương tác HMBC từ proton olefin H-12 (δH 5,64) tới C-11 (δC23,9)/ C-13 (δC 133,4)/ C-14 (δC57,4)/ C-18 (δC55,4) và tín hiệu carbon không liên kết với hydro ở vùng Csp2 của C-13 cho thấy vị trí liên kết đôi C=C tại C-12/C-13 kết hợp với tương tác trực tiếp trên phổ HSQC cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-12, C-13, C-15 và C-27 Các tương tác HMBC từ H-29 (δH

0,92) tới C-13 (δC 133,4)/ C-18 (δC55,4), C-20 (38,1); H-30 (δH 0,94) tới C-19 (δC40,0)/ C-20 (δC38,1), C-21 (31,2)và các tương tác trực tiếp trên phổ HSQC (H-19/C-19, H-21/C-21, H-29/C-29, H-30/C-30) cho phép quy kết các giá trị phổ tại C-18, C-19, C-20, C-21, C-29 và C-30

Vị trí gắn của phân tử đường glucose vào phần aglyone được khẳng định bằng tương tác HMBC giữa tín hiệu của proton H-1 (δH5,39, d, J = 8,0 Hz) tới

carbon carboxyl C-28 (δC178,0) Ngoài ra còn quan sát thấy tương tác HMBC trong phân tử đường giữa H-1 (δH5,39) và C-2(δC73,9)/ C-3 (δC 78,3)

Hợp chất MP1 cho tín hiệu cộng hưởng của proton H-3 tại 3,13 (dd, J =

4,5, 11,0 Hz) Giá trị hằng số tương tác proton giữa H-2/H-3 có J lớn (11,0 Hz) cho phép khẳng định proton H-3 ở vị tríaxial (a) suy ra nhóm thế tại C-3 ở vị trí

Định dạng
Số trang	98
Dung lượng	4,35 MB