Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đâu phộng

44 3.4 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.. Đây là lí do chúng tôi chọn để thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chấ

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài: 1

2 Tình hình nghiên cứu: 1

3 Mục đích nghiên cứu: 2

4 Mục tiêu nghiên cứu: 2

5 Nội dung nghiên cứu: 2

6 Phương pháp nghiên cứu: 3

6.1 Phương pháp luận: 3

6.2 Phương pháp xử lý số liệu: 3

7 Kết quả đạt được: 3

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm sợi: 4

1.1.1 Giới thiệu chung: 4

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra: 4

1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố: 4

1.1.2.2 Độc tố Aflatoxin: 7

1.1.2.3 Độc tốc Patulin: 7

1.1.2.4 Độc tố Fumonisin: 8

1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố: 8

1.1.3.1 Phương pháp vật lý học: 8

1.1.3.2 Phương pháp hoá học: 10

1.1.3.3 Phương pháp sinh học: 10

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic: 13

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic: 13

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus: 13

1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic: 14

1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn: 16

1.2.2.1 Bacteriocins: 16

1.2.2.2 Các chất có khả năng kháng khuẩn khác: 17

1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic: 17

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic: 17

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic: 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Địa điểm nghiên cứu: 21

2.2 Thời gian thực hiện: 21

2.3 Vật liệu nghiên cứu 21

2.3.1 Vật liệu: 21

2.3.2 Hoá chất và môi trường sử dụng: 21

2.3.2.1 Hoá chất: 21

2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy: 21

2.4 Thiết bị và dụng cụ: 22

2.4.1 Thiết bị: 22

2.4.2 Dụng cụ: 22

2.5 Phương pháp luận: 22

2.5.1 Mục tiêu đồ án: 22

2.5.2 Nội dung: 22

2.6 Phương pháp nghiên cứu: 24

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu: 24

2.6.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá vi khuẩn Lactobacillus sp L5: 25

2.6.2.1 Nhuộm gram: 25

2.6.2.2 Nhuộm bào tử: 26

2.6.2.3 Thử nghiệm Catalase: 26

2.6.2.4 Xác định hàm lượng acid tổng: 26

2.6.2.5 Thử nghiệm khả năng lên men đường: 27

2.6.2.6 Thử nghiệm Protease: 27

2.6.2.7 Thử nghiệm Chitinase: 27

2.6.3 Khảo sát sự phát triển của các nấm chủng nấm Aspergillus spp.: 28

2.6.4 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 29

2.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 31

2.6.6 Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 33

2.6.7 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt: 34

2.6.7.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 34

2.6.7.2 Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm: 36

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37

3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá của chủng vi khuẩn lactic: 37

3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: 37

3.1.2 Nhuộm Gram: 37

3.1.3 Nhuộm bào tử: 38

3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 38

3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng: 39

3.1.6 Thử nghiệm khả năng lên men đường: 40

3.1.7 Thử nghiệm protease: 41

3.1.8 Thử nghiệm chitinase: 42

3.2 Khảo sát khả năng phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp.: 42

3.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 44

3.4 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 46

3.4.1 Dịch ly tâm không trung hoà pH: 47

3.4.2 Dịch ly tâm trung hoà pH = 6: 49

3.5 Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 51

3.5.1 Khảo sát thời gian chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 sinh hợp chất thứ cấp: 51

3.5.2 Khảo sát khả đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.: 55

3.5.3 Khảo sát thành phần hoá học của cao Ethyl acetate: 58

3.6 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong

bảo quản hạt: 59

3.6.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng: 59

3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: 69

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

4.1 Kết luận: 75

4.2 Kiến nghị: 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

UV: Ultra Violet

TLC: Thin Layer Chromatography

EA: Ethyl Acetate

PDA: Potato Dextrose Agar

MRS: de Man, Rogosa và Sharpe

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

VRB: Violet Red Bile

TPC: Tổng số vi sinh vật hiếu khí

PCA: Plate Count Agar

BPW: Buffered Peptone Water

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn 11

Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 16

Bảng 1.3 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB (Holzapfel và cộng sự, 1995) 17

Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 18

Bảng 3.1 Khả năng lên men các loại đường của Lactobacillus sp L5 41

Bảng 3.2 Đường kính phát triển của các chủng nấm mốc Aspergillus spp 43

Bảng 3.3 Tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của Lactobacillus sp L5 44

Bảng 3.4 Tỉ lệ ức chế nấm mốc của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 không trung hoà pH khi không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt 47

Bảng 3.5 Tỉ lệ ức chế nấm mốc của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH = 6 khi không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt 49

Bảng 3.6 Khả năng đối kháng nấm của dịch ly tâm 16 giờ, 24 giờ và 40 giờ Lactobacillus sp L5 51

Bảng 3.7 Tỉ lệ đối kháng với các chủng nấm mốc của cao ethyl acetate 55

Bảng 3.8 Kết quả thí nghiệm thành phần hoá học của cao ethyl acetate 58

Bảng 3.9 Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy khi tạo màng bao ứng dụng trên đậu phộng 60

Bảng 3.10 Khả năng kháng nấm của dịch nuôi cấy gia nhiệt 100°C khi tạo màng bao ứng dụng trên đậu phộng 63

Bảng 3.11 Khả năng kháng nấm của cao Ethyl acetate khi tạo màng bao ứng dụng trên đậu phộng 66

Bảng 3.12 Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform 69

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố 6

Hình 3.1 Khuẩn lạc của Lactobacillus sp L5 trên môi trường MRS Agar 37

Hình 3.2 Kết quả nhuộm gram chủng Lactobacillus sp L5 38

Hình 3.3 Kết quả nhuộm bào tử chủng Lactobacillus sp L5 38

Hình 3.4 Thử nghiệm catalase chủng Lactobacillus sp L5 39

Hình 3.5 Hàm lượng acid lactic của chủng Lactobacillus sp L5 theo thời gian 40

Hình 3.6 Kết quả lên men các loại đường chủng Lactobacillus sp L5 41

Hình 3.7 Thử nghiệm protease chủng Lactobacillus sp L5 42

Hình 3.8 Thử nghiệm chitinase chủng Lactobacillus sp L5 42

Hình 3.9 Khả năng phát triển của các chủng nấm mốc Aspergillus spp trên môi trường MRS Agar cải tiến 43

Hình 3.10 Đồ thị thể hiện sự ức chế của dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm mốc 45

Hình 3.11 Khả năng ức chế nấm mốc của dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5 46 Hình 3.12 Đồ thị thể hiện tỉ lệ ức chế của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 không trung hoà pH khi gia nhiệt và không gia nhiệt 47

Hình 3.13 Khả năng ức chế nấm CĐP1 (I), ĐN2 (II), ĐN3 (III) và HCP2 (IV) của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khi không trung hoà pH 48

Hình 3.14 Đồ thị biểu thị tỉ lệ ức chế nấm mốc của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 trung hoà pH = 6 khi không xử lý nhiệt và xử lý nhiệt 49

Hình 3.15 Khả năng ức chế nấm CĐP1 (I), ĐN2 (II), ĐN3 (III) và HCP2 (IV) của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 khi trung hoà pH 50

Hình 3.16 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm CĐP1 của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 53

Hình 3.17 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm ĐN2 của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 53

Hình 3.18 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm ĐN3 của dịch ly tâm chủng

Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 54

Hình 3.19 Đồ thị thể hiện khả năng đối kháng nấm HCP2 của dịch ly tâm chủng Lactobacillus sp L5 và giá trị OD cùng hàm lượng acid lactic 54

Hình 3.20 Đồ thị thể hiện sự đối kháng các chủng nấm Aspergillus spp của cao Ethyl acetate so với Trung hoà pH không gia nhiệt và gia nhiệt 100°C 56

Hình 3.21 Khả năng ức chế nấm Aspergillus spp của cao Ethyl acetate 57

Hình 3.22 Kết quả thử nghiệm Lipid của cao Ethyl acetate 58

Hình 3.23 Kết quả thử nghiệm Đường khử, Protein, Acid amin của cao Ethyl acetate 59

Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy 62

Hình 3.25 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy gia nhiệt 100°C 65

Hình 3.26 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của cao Ethyl acetate 68

Hình 3.27 Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí 70

Hình 3.28 Kết quả Coliform trên môi trường VRB 71

Hình 3.29 Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1 – NT2 (Dịch nuôi cấy và Chitosan 0,4% 72

Hình 3.30 Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar 73

Hình 3.31 Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và TN1-NT2 (Dịch nuôi cấy và Chitosan 0,4%) 74

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài:

Vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề xã hội cần giải quyết kịp thời để bảo

vệ sức khoẻ con người Ở nước ta, với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, độ ẩm trong không khí thường cao, là điều kiện rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển gây nhiễm độc tố cho thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, gây độc cho người và gia súc, gây tổn thương gan (ung thư gan…) Tình trạng phơi nhiễm của nấm mốc ảnh hưởng đến 25% mùa màng trên toàn thế giới, làm tổn thất trung bình 418 triệu đô

và ảnh hưởng trên gia súc 472 triệu đô mỗi năm (theo Bô Nông Nghiệp Mỹ, 2009) Tại Việt Nam, mỗi năm bị ảnh hưởng khoảng 13-16% lượng nông sản tuỳ loại Trước thực trạng đó, con người đã và luôn tìm kiếm những hoạt chất sinh học vừa có tác dụng kháng nấm, vừa không gây hại cho cơ thể con người Một trong những chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất chính là các chủng sinh acid lactic Vi khuẩn dạng này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diệt vi sinh vật có hại và là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột

Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic và vấn đề ngộ độ thực phẩm và hư hại nông sản do nấm mốc gây ra mỗi năm Đây là lí do chúng tôi chọn để thực hiện đề

tài “Khảo sát khả năng kháng nấm của hợp chất thứ cấp vi khuẩn lactic và ứng dụng trong bảo quản hạt đậu phộng”

 Năm 2004, Cassandra De Muynck và công sự nghiên cứu “Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất thứ cấp trong thực phẩm”

 Kim Jeong Dong với “Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic

phân lập từ kimchi kháng Aspergillus fumigatus” năm 2005

 R Muñoz và cộng sự với nghiên cứu “Ngăn cản sự sản xuất độc tố của

Aspergillus nomius vsc 23 của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae” năm 2010

Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như Chế phẩm EM bảo vệ cây trồng hay ứng dụng trong thuỷ sản, chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt Nam, được sản xuất từ các

chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm sinh tổng hợp

mạnh các enzym ngoại bào, có khả năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn

Gram âm Ngoài ra, sản phẩm còn chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế

mạnh các vi khuẩn gây bệnh Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải

3 Mục đích nghiên cứu:

Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm sinh học bảo quản hạt từ vi khuẩn lên men lactic

4 Mục tiêu nghiên cứu:

Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp

chất thứ cấp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng

5 Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus

sp L5

Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp

Ứng dụng Dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp chất thứ cấp của vi

khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng

6 Phương pháp nghiên cứu:

6.1 Phương pháp luận:

Trên cơ sở khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic đối với các nấm gây hư hỏng thực phẩm và sinh độc tố, người thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu các tác nhân gây ức chế nấm nhiễm thực phẩm Sau khi xác định tác nhân gây ức chế là hợp chất thứ cấp, sẽ trích ly thu hoạt chất và ứng dụng trong bảo quản đậu phộng đã cảm nhiễm nấm mốc

Xác định được thời gian sinh hợp chất thứ cấp tốt nhất của chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 nuôi cấy trên môi trường MRS Agar cải tiến

Chứng minh được cao Ethyl acetate trích ly từ dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 có khả năng kháng nấm

Ứng dụng thành công các dạng sản phẩm khác nhau của vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng

Chương 1: TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về nấm sợi:

1.1.1 Giới thiệu chung:

Nấm (Fungi, số ít là Fungus) là một giới trong năm giới theo hệ thống phân loại của R.H.Whittaker (1996) Nấm thuộc ngành nấm (Euphycophyta) là bộ môn nghiên cứu của nấm học (Mycology) Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, nước, không khí, chuồng nuôi…), chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên do chúng có khả năng phân giải các hợp chất như: cellulose, protein, lipid, chitin…

Vi nấm (Micro fungi) là những nấm không có mũ nấm và có thể nhìn thấy bằng mắt thường Căn cứ vào hình thái, ta chia thành hai loại là nấm men (Yeast) và nấm sợi (Filamentous fungi) còn được gọi là nấm mốc

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra:

1.1.2.1 Các loài có khả năng sinh độc tố:

Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người Điểm mấu chốt ở độc tố nấm mốc

là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp

Theo Nguyễn Thị Hiền (2009), trong 300 loại độc tố vi nấm đã biết, chỉ có 20 loại ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, 15 loại trong số đó gây ung thư Trong suốt một thời gian dài, chúng ta không chú ý đến khả năng gây bệnh trong thực phẩm của nấm mốc Cho đến những năm 1960, người ta mới khẳng định con người có thể

bị bệnh nếu ăn phải thức ăn nhiễm mốc, dù chỉ với lượng nhỏ Các loại độc tố chủ

yếu được tiết ra bởi 5 chi nấm là: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),

Ochratoxin A, Stermatocystin, Acid cyclopianxoic

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A và

Acid cyclopianzoic toxin, Fumonisin, Moniliformin, Diacetocyscirpenon

 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2

toxin

 Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, Alternarion, Methyl ether

alternarion

 Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện tổn thương ở gan và thận Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế bào nhu mô gan, xơ hoá Ngoài ra còn có các dấu hiệu tăng ure huyết, albumin niệu

và viêm cầu thận

Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết

Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể Nhiều độc tố như aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai Ngoài ra, độc tố nấm mốc còn gây mất cân bằng trong chuyển hoá thức ăn và giảm

tỉ lệ sinh sản Bên cạnh đó, các dẫn xuất của chúng thường độc với hệ thần kinh và gây tổn hại hệ thống cơ cùng rất nhiều hội chứng khác như: Bệnh ngoài da, chứng tăng sừng hoá, sảy thai…

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của một số loại độc tố

và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004)

Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá thức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan

Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến Hậu quả của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao

Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong số các aflatoxin Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh

1.1.2.3 Độc tốc Patulin:

Patulin có tên gọi khác là Clavaxin, được biết đến trước tiên như là thuốc có thể chữa trị cảm lạnh Trong quá trình sử dụng, người ta mới nhận biết được độc tính của patulin Patulin là hợp chất không màu, kết tinh và tan trong nước, các dung môi phân cực Người ta tách được patulin trên ngũ cốc, trên các sản phẩm dạng hạt và hoa quả

Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do các nấm mốc Penicillinum, Aspergillus

và Bysschchlamys tạo ra Các chủng tổng hợp chủ yếu là các loài như A clavatus,

A giganteus, P exppansum, P urticae, P griceofulvum

Patulin được coi như một độc tố có khả năng gây ung thư cho người và động vật Gây ra hoạt tính suy giảm miễn dịch liên quan đến các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột, nghiên cứu đã cho thấy patuilin còn gây thiệt hại cho DNA hay nhiễm sắc thể ở người

1.1.2.4 Độc tố Fumonisin:

Trong các độc tố về nấm mốc, mối quan tâm về fumonisin ngày càng tăng cao

Đây là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp Đây

là nhóm độc tính cao với động vật và con người

Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong các fumonisin, chúng có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù ở ngựa, ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ… Cơ quan Nghiên Cứu Quốc Tế về ung thư cũng

đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B – nhóm các hợp chất gây ung thư cho người Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của fumonisin đến người cũng cho thấy, có sự liên quan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng lương thực nhiễm fumonisin Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ sphingolopid tự do, tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin Các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với tế bào thận

1.1.3 Các cách khử nhiễm độc tố:

1.1.3.1 Phương pháp vật lý học:

Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb Nếu tăng nhiệt độ lên tới

165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt

độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68% Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin (Đậu Ngọc Hào

và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: Các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: Than hoạt tính, một số polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg

Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím

Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.1.3.2 Phương pháp hoá học:

Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin

Phương pháp sử dụng các chất kiềm: Ammonium Hydroxide (NH4OH) và Natri Hydroxide (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt aflatoxin Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin

Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5%

và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003)

1.1.3.3 Phương pháp sinh học:

Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo

áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương

thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất

Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật

Bảng 1.1 Các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn

Bacillus

pumilus

Aspergillus parasiticus

Sử dụng các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào, sinh ra

trong quá trình nuôi cấy B

pumilus, ức chế sự phát

triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm

Asp parasiticus

C Munimbazi và LB.Bullerman,

1997

Streptomyces

sp

Aspergillus parasiticus

Streptomyces sp tổng hợp

được aflastatin A, là hợp chất có bản chất là protein,

ức chế 1 số enzyme esterase tham gia quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm

casei flavus đổi chất ngoại bào, sinh ra

trong quá trình nuôi cấy L

B subtilis tổng hợp các

enzyme ngoại bào như

protease, chitinase, glucanase làm ức chế sự

β-1,3-phát triển của nấm Asp

flavus

R Thakaew và cộng sự, 2013

Các loại nông sản Việt Nam được thế giới biết đến càng nhiều như lúa gạo, cà phê, tiêu, điều, thanh long, vú sữa Chỉ tính riêng cà phê, Việt Nam hiện có năng suất cao trên thế giới, 8 đến 10 tấn cà phê/hecta Để đạt được năng suất ấy, người nông dân phải sử dụng đến 2 tấn urê/1 ha cùng với rất nhiều phân bón hóa chất khác

và không ít các loại thuốc bảo vệ thực vật Hệ quả không chỉ nông dân phải mất nhiều tiền vào hóa chất mà hệ sinh vật đất và chất lượng đất bị tàn phá nghiêm trọng Phương pháp sinh học sử dụng cho cây trồng đang được các nhà khoa học khuyến khích sử dụng vì chúng có những ưu điểm sau:

 Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người, vật nuôi, cây trồng như thuốc bảo vệ thực vật từ hóa chất

 Cân bằng hệ sinh thái trong môi trường đất nói riêng và môi trường nói chung

 Không làm thoái hóa đất mà còn góp phần tăng độ phì nhiêu của đất

 Cây trồng hấp thu chất dinh dưỡng dễ hơn, góp phần tăng năng suất và chất lượng nông phẩm

 Tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các loại thuốc BVTV có nguồn gốc hóa chất Tác dụng của CPSH đến từ từ chứ không nhanh như các loại hóa chất nhưng tác dụng dài lâu

 Có khả năng phân hủy, chuyển hóa các phế thải sinh học, phế thải nông nghiệp, công nghiệp, góp phần làm sạch môi trường

 Các chủng nấm sinh độc tố sẽ không thể hình thành cơ chế kháng

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic:

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic:

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus:

Vi khuẩn lactic có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 35°C Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 - 10% NaCl Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que, đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus:

 Giới: Vi khuẩn

 Ngành: Firmicutes

 Lớp: Bacilli

 Bộ: Lactobacillales

 Họ: Lactobacillacea

 Giống: Lactobacillus

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis, L casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus,

Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và

thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao

đổi chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm:

 Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, được gọi là Thermobacterium,

cófructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 45°C

 Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDPaldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic

 Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

1.2.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic:

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau

 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide

(tinh bột, dextrin) Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn

nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng

và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men,

trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone…

 Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình

trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa

số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy

cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin

 Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn

lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần

môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

 Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy

đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động

của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

 Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi

trường có oxy hay không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh

khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

1.2.2 Khả năng sinh các chất kháng khuẩn:

 Lớp II (Non-lantibiotics): Các bacteriocin nhỏ (< 10 kDa), không chứa Lanthionine, tương đối ổn định nhiệt và có màng peptide

 Lớp 3: Đây là nhóm các bacteriocin lớn (> 30 kDa), có tính thấm nước, không ổn định nhiệt và không được nghiên cứu rộng rãi

 Lớp 4: Là các đại phân tử, kị nước, thường là những phức vì còn có thêm chất khác

Bảng 1.2 Một số bacteriocins được sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012)

dysgalaciae Enterococcus feacalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans

L acidphilus spp Acidophin CH5 Vi khuẩn gram dương

L plantarum spp Plantaricin EF, Plantaricin W,

Plantaricin JK, Plantaricin S

Pediococcus Carnobacteria Clostiridia

Propionobacteria

Leuconostoc

Listeria monocytogenes Enterococcus feacalis

L casei spp Lactocin 705 Listeria monocytogenes

Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối

Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men

1.2.3 Khả năng kháng nấm và ứng dụng sản phẩm của vi khuẩn lactic:

1.2.3.1 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic:

Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các

vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất

ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995) Khả năng kháng nấm và các thành phần

ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu Hoạt động kháng

nấm của L coryniformis ổn định khi bị ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson

và Schnurer, 2001)

Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như

L plantarum và L sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính

kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - Nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của

vi khuẩn acid lactic

Bảng 1.4 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic-

and n- valeric acid

Lactibacillus sanfranciscensis CB1

Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai

cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus

NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng

cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)

Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất Các

chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996)

Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit

và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất

proteinaceous, acid béo hydroxyl,…

1.2.3.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic:

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:

 Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu

và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối

 Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau

 Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá…

 Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm

Fusarium, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm

Trong bảo quản thực phẩm, có rất nhiều phương pháp được sử dụng, chẳng

hạn như gia nhiệt, thay đổi pH, sử dụng các chất hoá học… Các phương pháp này đều được ghi nhận là có hiệu quả cao, tuy nhiên lại gây ảnh hưởng đến môi trường, sức khoẻ con người Các bacteriocins của vi khuẩn lactic có thể ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học, đặc biệt là trong bảo quản thực phẩm do chúng có độ an toàn và có hoạt tính cao (José Luis Parada, 2007) Chẳng hạn như Lacticin 3147 ức chế vi khuẩm gram dương và ngăn cản sự phát triển các

vi khuẩn không mong muốn trong phô mai, Pediocin PA-1 có khả năng ức chế

Listeria spp., Nisin có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và

đây cũng là bacteriocin thương mại duy nhất được FDA cho phép sử dụng, Nisaplin – một dạng sản phẩm chứa 2,5% Nisin được sử dụng ở hơn 50 quốc gia trong bảo quản thực phẩm Một dạng chế phẩm từ bacteriocins của vi khuẩn lactic

là BioProfit gồm Lactobacillus rhamnosus LC 705 và Propionibacterium freudenreichii JS dùng để bảo quản các loại thực phẩm từ sữa (Khurana và cộng

sự, 2007)

Tuy nhiên, các bacteriocins lại không có tác dụng cao khi được sử dụng riêng

lẻ, chính vì thế mà cần có các kỹ thuật hay kết hợp với các chất khác để làm tăng hoạt tính của chúng Chẳng hạn như Sodium acetate hay Sodium lactate sẽ làm tăng hoạt tính của bacteriocin Lactocin 705 (José Luis Parada, 2007)

Một trong những ứng dụng hiện đang được chú ý của bacteriocins từ vi khuẩn lactic đó chính là tạo bao bì sinh học, bảo vệ thực phẩm khỏi các nguy cơ gây hư hỏng (José Luis Parada, 2007) Các bacteriocins sẽ dần được giải phóng trên bề mặt màng bao và thực hiện chức năng sinh học của mình Có rất nhiều cách để tổng hợp bao bì sinh học từ bacteriocins, chẳng hạn như phun, ngâm hay đóng gói trong các bao bảo quản Một trong những cách là kết hợp trực tiếp bacteriocin với polymer, chẳng hạn như cho Nisin kết hợp với polymer sinh học Một cách khác đó chính là tạo lớp màng bao từ bacteriocin hay hấp thụ bacteriocin lên bề mặt màng bao bằng polymer sinh học (Deegan L.H, 2006)

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu:

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm-Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Thời gian thực hiện:

Đề tài được thực hiện từ 16/05/2016 đến 07/08/2016

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu:

Giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sp (L5) và các loại nấm thuộc Aspergillus spp được phân lập từ đậu phộng (CĐP1), đậu nành (ĐN2, ĐN3) và hạt

cà phê (HCP2) do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực

Phẩm-Môi Trường trường Đại Học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Nystatin từ nhà sản xuất F.T.Pharma 500000IU/viên, 1mg chứa 4855IU và 1IU tương đương 0,0002059mg chế phẩm, tương đương 1mg chứa 0,9996445mg Nystatin

Chitosan từ cơ sở sản xuất Hùng Tiến

Hạt đậu phộng mua từ chợ Thị Nghè, quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh

2.3.2 Hoá chất và môi trường sử dụng:

2.3.2.1 Hoá chất:

Các hoá chất dùng để pha môi trường MRS - broth, MRS cải tiến và PDA Các hoá chất dùng để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Lugol, thuốc thử Bromophenol blue (BPB), thuốc thử Phenolphthalein

NaOH 0,1N, NaOH 2N

Dimetylsulfoxide (DMSO)

Cồn 96°, 70°

Nước cất

2.3.2.2 Môi trường nuôi cấy:

Môi trường MRS broth, MRS agar cải tiến để nuôi cấy vi khuẩn lactic

Môi trường PDA để nuôi cấy các chủng nấm mốc

Môi trường PCA, VRB, EC Broth dùng kiểm tra vi sinh vật

Tủ sấy (Memmert Germany)

Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA)

Pipet thuỷ tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 - 1000µl

Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml, ống falcon 50ml

Bông thấm nước, bông không thấm nước, giấy lọc, giá đỡ ống

2.5 Phương pháp luận:

2.5.1 Mục tiêu đồ án:

Khảo sát khả năng ứng dụng của dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp

chất thứ cấp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng

2.5.2 Nội dung:

Hoạt hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 và các chủng nấm Aspergillus

spp

Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp

Khảo sát khả năng đối kháng của hợp chất thứ cấp chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp

Ứng dụng dịch nuôi cấy, sản phẩm trao đổi chất và hợp chất thứ cấp của vi

khuẩn Lactobacillus sp L5 trong bảo quản hạt đậu phộng

2.6 Phương pháp nghiên cứu:

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu:

Quy trình được thực hiện như sơ đồ sau:

Chủng vi khuẩn LAB

Khảo sát hình thái, sinh hoá

Khảo sát khả năng đối kháng nấm của sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn LAB

Khảo sát khả năng kháng nấm của

dịch trong sau ly tâm vi khuẩn

lactic khi không trung hoà pH gia

nhiệt nhiệt và không gia nhiệt

Khảo sát khả năng kháng nấm của dịch trong sau ly tâm vi khuẩn lactic khi trung hoà pH 6 gia nhiệt và không gia nhiệt

Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong

bảo quản hạt đậu phộng

Khảo sát khả năng đối kháng nấm của hợp chất thứ cấp của vi khuẩn lactic

Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn với nấm mốc Khảo sát khả năng phát triển

Chủng vi nấm mốc

2.6.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hoá vi khuẩn Lactobacillus sp L5:

Các chủng vi khuẩn lactic có thể bị suy yếu và nhiễm các loài vi khuẩn khác trong quá trình bảo quản Do đó, người thực hiện đề tài tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng

Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth và ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau đó, tiến hành cấy chuyển trên MRS Agar và ủ 1 ngày ở 37°C sau đó quan sát hình thái khuẩn lạc và khảo sát đặc điểm nuôi cấy

2.6.2.1 Nhuộm gram:

Mục đích: Xác định vi khuẩn thuộc gram dương hay gram âm

Tiến hành: Dựa theo phương pháp Hucker cải tiến và sử dụng dịch nuôi cấy sau 24 giờ

Kết quả: Vi khuẩn gram dương bắt màu tím, gram âm bắt màu hồng

Chủng vi khuẩn L5

Tăng sinh trong môi trường MRS Broth

Cấy chuyển sang MRS agar

37°C, 24 giờ

Khảo sát đặc điểm nuôi cấy của chủng vi khuẩn L5

Khẳng định chủng thuần khiết

Quan sát hình thái khuẩn lạc Nhuộm gram Khả năng lên men đường Thử nghiệm Catalase Hàm lượng acid tổng

2.6.2.2 Nhuộm bào tử:

Mục đích: Vì vi khuẩn Lactobacillus không sinh bào tử và do tế bào chất của

bào tử và tế bào chất bắt màu khác nhau Phương pháp này nhằm loại bỏ các vi

khuẩn sinh bào tử như Bacillus spp hay Clostridium spp

Tiến hành: Phương pháp Schaeffer – Fulton

Kết quả: Bào tử bắt màu lục, tế bào bắt màu hồng

2.6.2.3 Thử nghiệm Catalase:

Mục đích: Xác định vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase

Tiến hành: Dùng H2O2 nhỏ trực tiếp lên khuẩn lạc 18-24 giờ Quan sát kết quả Kết quả: Vi khuẩn có khả năng sinh enzyme catalase nếu xuất hiệt bọt khí sủi bọt mạnh và nhanh, âm tính khi không có hiện tượng xảy ra

2.6.2.4 Xác định hàm lượng acid tổng:

Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic

để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein

Tiến hành: Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên nuôi cấy vi khuẩn, thêm 2 – 3 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,0 và ghi kết quả Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic như sau:

Trong đó: V1 – Thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml)

K - Hệ số đổi ra acid tương ứng, với acid lactic là 0,009

V2 – Thể tích dịch nuôi cấy đem đi chuẩn độ (ml)

2.6.2.5 Thử nghiệm khả năng lên men đường:

Mục đích: Kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau của vi khuẩn Tiến hành: Môi trường MRS Broth lần lượt thay thế đường glucose thành các loại đường cần kiểm tra Sau đó phối vào ống nghiệm có ống durham có Phenol red, hấp khử trùng và cấy vi khuẩn vào, ủ ở 37°C trong 24 giờ và quan sát

Kết quả: Dương tính khi môi trường đục, chuyển vàng và có hay không sinh khí trong ống durham Kết quả âm tính khi môi trường trong, không sinh hơi

2.6.2.6 Thử nghiệm Protease:

Mục đích: Xác định khả năng tiết enzyme protease phân huỷ cơ chất casein Tiến hành: Đĩa petri được phối môi trường gồm casein 1% bổ sung 2% agar đã được hấp khử trùng Đục lỗ đĩa thạch và bơm dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào các

lỗ Sau đó ủ ở 37°C trong 24-48 giờ và đo đường kính vòng phân giải

Kết quả: Vi khuẩn có khả năng phân huỷ casein khi xung quanh lỗ có vòng phân giải, nếu không có thì xung quanh lỗ, môi trường vẫn sẽ đục

Kết quả: Vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme chitinase khi môi trường xung quanh tạo quầng sáng không bắt màu thuốc thử Lugol

2.6.3 Khảo sát sự phát triển của các chủng nấm Aspergillus spp.:

Các chủng nấm Aspergillus spp phân lập từ hạt đậu phộng (CĐP1), hạt đậu

nành (ĐN2, ĐN3), hạt cà phê (HCP2) được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường trường đại học Công Nghệ Hồ Chí Minh, người thực hiện tiến hành kiểm tra sự phát triển của các chủng nấm, vì chủng nấm mốc cần khoẻ mạnh để làm đề tài

Chủng nấm mốc được cấy điểm sang đĩa môi trường PDA đã được hấp khử trùng và ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ

Sau đó dùng que đục, đục lỗ thạch nấm và chuyển từ môi trường PDA sang môi trường MRS Agar cải tiến, ủ ở 37°C trong vòng 72 giờ

Tiến hành đo đường kính vòng phát triển của nấm

Đo đường kính tăng trưởng của nấm

2.6.4 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của chủng Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.:

Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%

Tiến hành khảo sát khả năng kháng nấm

 Môi trường sử dụng là MRS Agar cải tiến, được đục lỗ thạch 4 góc cách đều tâm đĩa 1,5cm

 Các chủng nấm lần lượt được đục từ môi trường PDA đã cấy trước đó 3 ngày

và đặt vào tâm đĩa Ủ ở 37°C trong 24 giờ

 Hút 0,1ml dịch của dịch nuôi cấy Đĩa đối chứng âm không bơm dịch và Đối chứng dương bơm dịch Nystatin trong DMSO nồng độ 1g/50ml tương ứng 0,9996445mg Nystatin/50ml DMSO

 Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và ủ ở 37°C trong 72 giờ Sau đó đo đường kính vòng nấm và tính tỉ lệ kháng nấm

Đo đường kính tăng trưởng của nấm

Công thức tính tỉ lệ kháng nấm:

Trong đó: Dđối chứng – Đường kính vòng nấm đĩa đối chứng (mm)

Dthí nghiệm – Đường kính vòng nấm đĩa thí nghiệm (mm)

2.6.5 Khảo sát khả năng đối kháng của sản phẩm trao đổi chất chủng

Lactobacillus sp L5 với các chủng nấm Aspergillus spp.:

Chủng vi khuẩn lactic L5 được tăng sinh trong môi trường MRS Broth ở 37°C trong 24 giờ, tỉ lệ cấy giống là 5%

Dịch nuôi cấy được đi ly tâm 14000 vòng/phút trong 20 phút để loại bỏ sinh khối

Gia nhiệt 100°C trong 15 phút

Khônggia nhiệt

Đĩa petri MRS agar cải tiến

Đo đường kính tăng trưởng của nấm