Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

Trong đó ngộ độc do vi sinh vật chủ yếu là nấm mốc chiếm phần lớn, bắt nguồn nhiễm từ nông sản, các sản phẩm thực phẩm,… Cuộc sống công nghiệp với tốc độ vũ bão cuốn con người chúng ta v

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH

KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN LACTIC

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính

kháng nấm của vi khuẩn lactic” do chính tôi thực hiện

Các số liệu và kết luận nghiên cứu trình bày trong đồ án này chƣa từng đƣợc công bố ở các nghiên cứu khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Tp.Hồ Chí Minh, 8/2014

Sinh viên thực hiện

Phan Thị Ngọc Ái

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Hoài Hương đã định hướng, tận tình hướng dẫn và quan tâm theo dõi em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp

Em xin cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện về thời gian giúp em hoàn thành tốt đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp 10DSH01 cùng các bạn thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã đồng hành cùng tôi trong suốt quãng đời sinh viên, động viên tinh thần và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em, những người đã luôn bên cạnh chia sẻ, quan tâm, kịp thời cổ vũ và động viên tinh thần, giúp em có thêm nghị lực để hoàn thành tốt đồ án này

Với khuôn khổ đồ án này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được

sự đóng góp giúp đỡ của quý thầy cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, 8/2014

Sinh viên thực hiện

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm 4

1.1.1 Giới thiệu chung 4

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4

1.1.3 Tác hại của nấm 5

1.1.4 Một số chủng nấm mốc gây độc cho thực phẩm 6

1.1.5 Các biện pháp chống nấm sau thu hoạch 13

1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 15

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 15

1.2.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 29

1.2.3 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 30

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Địa điểm nghiên cứu 37

2.2 Thời gian thực hiện 37

2.3 Vật liệu nghiên cứu 37

2.3.1 Giống vi sinh vật 37

2.3.2 Hóa chất và môi trường sử dụng 37

2.4 Thiết bị và dụng cụ 38

2.4.1 Thiết bị 38

2.4.2 Dụng cụ 38

2.5 Phương pháp luận 38

2.6 Phương pháp nghiên cứu 40

2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 40

2.6.2 Thí nghiệm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết 41

2.6.3 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm 42

2.6.4 Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi

khuẩnlactic 48

2.6.5 Phương pháp định danh và tuyển chọn 50

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53

3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý – sinh hóa và sự thuần khiết của chủng vi khuẩn lactic 53

3.1.1 Nhuộm Gram 53

3.1.2 Nhuộm bào tử 54

3.1.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann 55

3.1.4 Kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 55

3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng 57

3.2 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính nấm 58

3.2.1 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm không ảnh hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic 59

3.2.2 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trưởng của nấm mốc 60

3.3 Khảo sát khả năng kháng Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic 70

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

4.1 Kết luận 74

4.2 Kiến nghị 74

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chủng nấm Aspergillus độc thường gặp trong thực phẩm và độc tố

vi nấm do chúng sinh ra 8

Bảng 1.2 Chủng nấm mốc Fusarium và độc tố 10

Bảng 1.3 Một số chủng nấm Penicillium và độc tố của chúng 12

Bảng 1.4 Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) 19

Bảng 1.5 Một số hợp chất xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men 31

Bảng 1.6 Các loài LAB khác nhau và sản xuất các chất kháng nấm 33

Bảng 3.1 % acid lactic của 5 chủng LAB trong 24 giờ nuôi cấy 57

Bảng 3.2 Kết quả định danh sơ bộ của các chủng phân lập 58

Bảng 3.3 Bảng theo dõi mật độ quang của vi khuẩn acid lactic trong 4 môi trường

59 59 Bảng 3.4 Đường kính (cm) và đặc điểm nấm Mucor sp.B1 trên 4 môi trường MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3 60

Bảng 3.5 Khả năng phát triển của nấm Mucor sp.B1 trên 4 môi trường nuôi cấy 62

Bảng 3.6 Đường kính (cm) và đặc điểm nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 môi trường MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3 64

Bảng 3.7 Khả năng phát triển của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 môi trường nuôi cấy 65 64 Bảng 3.8 Đường kính (cm) và đặc điểm nấm Aspergillus sp.Đ1 trên các môi trường MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3 67

Bảng 3.9 Khả năng phát triển của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 môi trường nuôi cấy 68

Bảng 3.10 Tỉ lệ ức chế cực đại của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chủng nấm Aspergillus 7

Hình 1.2 Chủng nấm Fusarium 10

Hình 1.3 Chủng nấm Penicillium 11

Hình 1.4 Hình dạng tế bào Lactobacillus 18

Hình 1.5 Hình dạng tế bào Streptococcus 20

Hình 1.6 Hình dạng tế bào Leuconostoc 21

Hình 1.7 Hình dạng tế bào Pediococcus 22

Hình 1.8 Hình dạng tế bào Bifidobacterium 23

Hình 1.9 Sơ đồ tổng quan nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 36

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm 40

Hình 2.2 Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng 41

Hình 2.3 Sơ đồ chọn lọc môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic 44

Hình 2.4 Sơ đồ chọn lọc môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trưởng của nấm mốc 46

Hình 2.5 Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic 48

Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn 54

Hình 3.2 Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn 54

Hình 3.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn 55

Hình 3.4 Khả năng lên men đường của vi khuẩn lactic 56

Hình 3.5 Đồ thị biểu hiện % acid lactic sinh ra của các chủng vi khuẩn lactic sau 24 giờ nuôi cấy 57

Hình 3.6 Đường kính (cm) nấm Mucor sp.B1 trên 4 môi trường trong 7 ngày nuôi cấy 63

Hình 3.7 Đường kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 môi trường trong 7 ngày nuôi cấy 66

Hình 3.8 Đường kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.Đ1 trên 4 môi trường

trong 7 ngày nuôi cấy 69

Hình 3.9 Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp.L5

khi không pha loãng 71

Hình 3.10.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp.L5 từ 1

đến 20 lần pha loãng 72

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu ăn uống của con người ngày càng được chú trọng, do đó vấn đề an toàn thực phẩm lại trở nên quan trọng hơn bao giờ hết Vệ sinh an toàn thực phẩm trong cả nước nói chung và của thực phẩm nói riêng đang là vấn đề xã hội bức xúc cần giải quyết kịp thời và có hiệu quả

Theo thống kê hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm đã tăng lên đáng kể trong bối cảnh xã hội đang phát triển, gây hoang mang cho người tiêu dùng Trong đó ngộ độc do vi sinh vật chủ yếu là nấm mốc chiếm phần lớn, bắt nguồn nhiễm từ nông sản, các sản phẩm thực phẩm,…

Cuộc sống công nghiệp với tốc độ vũ bão cuốn con người chúng ta vào vòng quay của các sản phẩm đông lạnh, thức ăn nhanh mà hầu hết chúng đều được bảo quản bằng các chất hóa học Hàng trăm loại hóa chất khác nhau được sử dụng cho mục đích bảo quản thực phẩm Trong số đó loại sở hữu độc tính cao và bị hạn chế, cấm sử dụng đối với các loại đồ ăn, thực phẩm như: natri nitrate (NaNO3), lưu huỳnh dioxit, muối diêm, hàn the, Tuy nhiên, những hóa chất trên vẫn được sử dụng trái phép.Thậm chí, một số chất như natri benzoat và kali sorbate, hàn the cũng bị một số nhà sản xuất lạm dụng vượt liều Theo các chuyên gia, việc sử dụng hóa chất độc hại có thể gây hậu quả nghiêm trong tới sức khỏe con người như ung thư, đột biến gene, quái thai,…

Trước thực trạng đó, đòi hỏi con người phải có hướng giải quyết kịp thời để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng Hướng giải quyết là sử dụng các lợi khuẩn từ

vi khuẩn lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm Do

đó, chúng tôi xin đề xuất đề tài “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng

nấm củavi khuẩn lactic”

2 Tình hình nghiên cứu

Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong nông nghiệp cả trong nước và trên thế giới

Ở trong nước có các công trình nghiên cứu như sản xuất chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện công nghệ Môi trường Việt Nam Chế phẩm Sadi Bio 1 được sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc

nhóm xạ khuẩn Streptomyces ưa ấm (nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 15 -370C) sinh

tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza và proteinaza) có khả

năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm Ngoài ra, sản phẩm còn

chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh (Coliform, Salmonella) Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi

chuồng trại chăn nuôi và bãi chôn lấp chất thải

Ngoài nước có các công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn

lactic cách ly từ Kim chi chống Aspergillus fumigatus của Jeong-Dong Kim của

viện công nghệ sinh học công nghiệp thuộc đại học Inha, Inhcheon 402-75, Hàn Quốc

Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới

3 Mục đích ngiên cứu

Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic Mục đích cuối cùng là sản xuất chế phẩm vi sinh vật LAB hay sản phẩm trao đổi chất của chúng để ức chế nấm mốc

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn thí nghiệm để khẳng định là vi khuẩn lactic và tính thuần khiết

- Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm không gây ảnh hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic và không ảnh hưởng lên khả năng tăng trưởng của nấm mốc

- Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn

lactic

5 Phương pháp nghiên cứu

a Phương pháp luận

Có nhiều phương pháp khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp nấm mốc Phương pháp sử dụng hai môi trường khó thực hiện Có thể sử dụng một môi trường khảo sát, môi trường MRS là môi trường chuyên biệt biệt cho vi khuẩn lactic chứa nhiều tác nhân kháng nấm

Do đó chúng tôi cần xác định môi trường thí nghiệm kháng nấm sao cho vi khuẩn lactic tăng trưởng cực đại và thành phần môi trường không ức chế sự phát triển của nấm mốc Các thí nghiệm trong đồ án tốt nghiệp nhằm loại bỏ một số thành phần kháng nấm trong môi trường MRS mà vẫn giữ được khả năng tăng trưởng cao của vi khuẩn

lactic

b Phương pháp xử lí số liệu

- Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị

- Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lí số liệu

6 Kết quả đạt được của đề tài

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm tốt từ bộ sưu tập vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua

Xác định được môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm tốt

Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của chủng vi khuẩn lactic

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm

1.1.1 Giới thiệu chung

Giới nấm (Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có thành tế bào bằng kitin (chitin).Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium) Nấm thường sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu

tính

Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể) Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác.Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất

Nấm được sử dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất.Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men.Nấm còn được dùng để sản xuất chất kháng sinh trong y học và nhiều loại enzyme.Tuy nhiên, nhiều loài nấm chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotocin, như ancaloit và polyketit, là những chất độc đối với động vật lẫn con người

1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người

Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên

quan đến an toàn thực phẩm Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium,

Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm:

- Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B1, B2, G1, G2, M1, M2 ), ochratoxin

A, stermatocystin, axit cyclopianxoic

- Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và

axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon

- Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin

- Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether

alternarion

- Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin Chúng là độc tố vi nấm

do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên

một số hạt (như lạc) Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan Nếu mức

độ ô nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và về dài lâu sẽ gây ung thư

Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium

và Aspergillus tiết ra Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm

Fusarium tiết, độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết

1.1.3 Tác hại của nấm

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật

- Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm

Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng Chúng có

thể là nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,

Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số

loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma Bào tử nấm có thể

gây ra những chứng như hen suyễn , viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế

quản phổi và viêm phổi quá mẫn Ngộ độc do ăn phải nấm độc , có thể từ rối loạn tiêu hoá , ảo giác , hoặc trầm trọng có thể tử vong

- Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp

Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus,

Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis Chúng có thể gây ra các

bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,…cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm

Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm Pneumocystis carinii

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây ra cho thực vật

Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành

nông nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaria

và Cochliobolus Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa,

quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,…

1.1.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm

Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm

mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và

Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và

sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ,…

Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết Nhiều công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm

có thể gây ung thư, đạc biệt là ở gan Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà

đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép AND và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai

1.1.4.1 Chi Aspergillus

Hình 1.1.Nấm Aspergillus

Đã xác định trên 100 loài, phát triển rộng rãi trong thiên nhiên, nhất là những nơi có nguồn gốc thực vật bị hư hại, thối rữa Một số chủng thường gặp trong thực phẩm của con người, đặc biệt là hạt ngũ cốc và hạt đậu Nhiều loài thuộc chi

Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất trong tự nhiên, trong các sản phẩm

nông công nghiệp, ở nhiều vùng địa lí khác nhau trên thế giới

Một số loài, đặc biệt loài A.oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên

men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam (làm tương), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin, v.v…

Hiện nay công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài A.niger, A.oryzae trong công nghiệp sản xuất enzyme (α – amylaza,

glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic, …

Một số loài khác có khả năng tạo thành các chất kháng sinh như A.fumigatus tạo thành fumagilin có tác dụng trên Entamoebae histolyca, A.humicola, A.nidulans tạo

thành lần lượt humicolin, nidulin có tác dụng ức chế đối với một số loài vi nấm,

A.candidus tạo thành candidulin, A.oryzae, A.tamatii và một số loài khác tạo thành

acid kojic có tác dụng ức chế một số vi khuẩn, , trong đó được ứng dụng trong công

nghiệp dược phẩm chỉ có loài A.fumigatus để sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị

amip Nhiều loài thuộc chi nấm này có hoạt tính biến đổi sinh học, một số loài tạo

thành các độc tố (mycotoxin), đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố

gây ung thư gan như các loài A.flavus, A.parasiticus tạo thành aflatoxin,

A.versicolor tạo thành sterigmatocystin

Bảng 1.1.Một số loài nấm Aspergillus độc thường gặp trong thực phẩm và độc tố vi

nấm do chúng sinhra (Nguồn: Vi sinh vật thực phầm, 2003)

Loài nấm

mốc gây độc Độc tố vi nấm Tác động của

độc tố

Điều kiện phát triển và tiết độc tố

Sản sinh độc tố tại 12-400C, aw

= 0,85-0,99 (Tối ưu aw = 0,98-0,99) pH

= 3,0-8,0

Khả năng gây nhiễm rộng trong thực phẩm lạc, ngô, hạt bông, hạt có dầu và các loại quả sung,

vả

Acid cyclopiazonic

Gây thoái hóa hoại tử và tê liệt nhiều tổ chức cơ thể

A.parasiticus Aflatoxin B1,

B2, G1 và G2 Giống A.flavus Giống A.flavus

Không phổ biến tại châu

Á

A.ochraceus Ochratoxin A

Sản sinh độc tố tại nhiệt độ tối

ưu 25-300C

Hoại tử thận

Thực phẩm bảo quản tại các nước nhiệt đới, cà

(đặc biệt trong lợn), gây quái thai, ức chế miễn dịch

Thực phẩm bảo quản

Các loài nấm mốc gây độc ít quan trọng hơn

A.fumigatus Fumitremorgen

Verruculogen

Gây tê liệt (chuột bạch và chuột nhắt)

Phát triển tại 10-150C, tối thiểu aw 0,85

Thực phẩm nguồn gốc thực vật bị biến chất hƣ hỏng; phân hỗn hợp

A.terreus Territrem Gây tê liệt

(chuột nhắt)

Phát triển ƣa nhiệt, tối thiểu

aw 0,8

Trong hạt ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ vùng nhiệt đới

A.clavatus

Cytochalasin các chất khác gây tê liệt

Gây tê liệt Lúa mạch

Ƣa khô Trong hạt ngũ

cốc có dầu

1.1.4.2 Chi Fusarium

Hình 1.2.NấmFusarium

Tác động chính là làm cho thân rễ cây khô héo, thối rữa và mục, gặp nhiều

trên cây cà phê, thông, cọ dừa, lúa mỳ, ngô và cỏ… Fusarium có thể gây ô nhiễm

trên hạt ngũ cốc và quả chín khi có lượng nước hoạt tính aw cao và tiết độc tố trước hoặc sau ngày thu hoạch cây trồng Độc tố gây vụ ngộ độc lớn nhất năm 1942-1948

đã làm chết 100000 người thuộc Liên bang Xô Viết, do nguyên nhân ATA (bệnh giảm bạch cầu)

Fusarium đã tiết độc tố T-2 và trichothecenes Hiện đã biết trên 50 loại và gần

đây năm 1988 đã phát hiện fumonisin do 4 chủng tiết là F.sporotrichioides,

F.equiseti, F.graminearum và F.moniliforme Liều LD50 của T-2 toxin là 3-4mg/kg TLCT chuột và lợn Lượng độc tố fumonisin B2 trong ngô tại Nam Phi và Trung Quốc đã gây ung thư thực quản trên người

Bảng 1.2.Các loài nấm mốc Fusarium và độc tố (Nguồn: Vi sinh vật thực phẩm,

Bệnh không bạch cầu do ngộ độc ăn uống với nhiều triệu

Ngũ cốc vùng nhiệt đới

chứng khác nhau

F.equiseti

T-2 nivaleno, butenolid, diacetoxyscirpenol

và trichothecenes khác

Bệnh bạch cầu ức chế đáp ứng miễn

dịch

Phổ biến trong các loại cây trồng

F.graminearum Fumonisin

Lợn bỏ ăn rối loạn sinh sản, người rối loạn đường tiêu hóa

Ngô (cùi ngô bị thối rữa), lúa mì (thân bị thối rữa)

F.monoliforme

F.proliferatum

Bệnh của ngựa, phù phổi của lợn, ung thư thực quản trên người

Ngô (ở khắp mọi nơi) Phối hợp với một số bệnh trên người ở châu Phi, Trung Quốc, Iran

1.1.4.3 Chi Penicillium

Hình 1.3.Nấm Penicillium

Được phát hiện gây độc và sản sinh độc tố cáh đây 100 năm ở loại gạo không xay có màu vàng đã làm chết chó, thỏ và chuột với triệu chứng ngộ độc là tê liệt

thần kinh trung ương Năm 1910, Nhật Bản đã cấm không được bán lúa và gạo bị nhiễm mốc hoa vàng

ChiPenicillium là một quần thể lớn với trên 150 loài đã được xác định, Trong

đó có 50 loài hoặc hơn được coi là phổ biến Chúng có tính độc mạnh, độc tố quan trọng được tiết từ các chủng trên tích lũy trong thực phẩm là Penitrem A

(P.crustosum), Roquefortin, độc tố PR toxin (P.roqueforti) và ochretoxin A (P.verrucosum)

Gần đây các nhà khoa học đã thống kê có tới 32 loài đã tiết 27 độc tố vi nấm gây độc cho động vật và người, chủ yếu tác động lên gan và thần kinh gây tê liệt cơ thể dẫn đến chết

Bảng 1.3 Một số loàiPenicillium và độc tố của chúng (Nguồn: Vi sinh vật thực

phầm, 2003)

Loài Độc tố Tác động gây độc

tố

Thực phẩm dễ bị nhiễm

Loài gây nhiễm độc quan trọng nhất

Tác động gây liệt

và thần kinh (động vật nuôi trong nhà)

Trong thực phẩm chế biến, bảo quản

lạnh

P.roqueforti Roquefortin

PR toxin

Giống tác động độc strychnin (chó)

Phomat, thịt chế biến, bánh từ lúa mạch

P.verrucosum Ochratoxin A Gây bệnh thận

(lợn)

Ngũ cốc (đặc biệt

là đại mạch) tại vùng khí hậu ôn hòa, thịt chế biến

Loài gây nhiễm độc ít quan trọng hơn

P.citreonigrum Ctreoviridin Beri beri đau tim

cấp (Nhật)

Gạo bảo quản tại Nhật và Hàn Quốc

P.citrinum Citrinin Suy thận

Phổ b iến trong nhiều loại thực phẩm

P.islandicum

Islanditoxin Cyclochlorotin Luteokyrin Erythroskyrin

Tác dụng gây độc gan và thận

Gây bệnh gạo lúa vàng nhưng tác dụng gây độc chưa

rõ ràng

1.1.5 Các biện pháp chống nấm sau thu hoạch và hiện nay

Công nghệ sau thu hoạch ảnh hưởng đến chất lượng nông sản theo các mức

độ khác nhau ở các giai đoạn của quy trình công nghệ Để thực phẩm có thởi gian

sử dụng dài hơn và đảm bảo chất lượng tốt, các phương pháp bảo quản từ đơn giản nhất như ướp muối, phơi khô, đến các phương pháp hiện đại như chiếu xạ, thanh trùng, tiệt trùng…đã được sử dụng Chúng đều dựa trên một số nguyên lý bảo quản nông sản, thực phẩm như:

- Kích thích hoạt động của các vi sinh vật và enzyme đặt biệt

- Loại bỏ bớt các vi sinh vật và các chất gây nhiễm bẩn thực phẩm

- Ức chế hoạt động của các enzyme và vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm

- Tiêu diệt các vi sinh vật và làm mất hoạt tính của các enzyme

Do đó, để đảm bảo vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm cho người tiêu dùng, con người đã có những biện pháp cụ thể nhằm ngăn chặn các ngộ độc do nấm gây ra sau thu hoạch như sau:

- Đối với nông sản: Do nhiệt độ nông sản lúc thu hoạch cao là nguyên nhân làm cho trao đổi chất của nông sản tăng, làm giảm sút chất lượng nhanh chóng

Do đó, nên thu hái nông sản vào lúc có nhiệt độ thấp nhất trong ngày và nhanh chóng đưa chúng vào nơi râm mát Bên cạnh đó, nên thu hoạch nông sản đúng độ chín để đạt chất lượng cảm quan và dinh dưỡng tốt nhất Loại bỏ các thành phần không cần thiết bị hư thối, dập nát trên rau quả và đảm bảo sự

ổn định trong quá trình vận chuyển

- Với lượng thực như gạo, ngô, lúa mì: phải bảo quản và giữ ở nơi khô ráo, thoáng mát để không bị nhiễm mốc

- Với những thực phẩm thực vật như lạc, vứng, cà phê: đây là những thực phẩm

dễ hút ẩm và dễ mốc nên muốn bảo quản tốt, chúng cần được phơi khô, giữ nguyên vỏ và được đựng trong các dụng cụ sạch kín nếu để lâu, thỉnh thoảng phải đem phơi khô lại Yêu cầu độ ẩm của hạt dưới 15%

- Với nước chấm như xì dầu, tương: Cần kiểm tra vệ sinh các xí nghiệp sản xuất nước chấm và các cửa hàng mua bán (Kiểm tra vệ sinh môi trường (chủ yếu

là không khí) Kiểm tra vệ sinh nước chấm Ngoài các chỉ tiêu vệ sinh đã được qui định cho một mẫu nước chấm và một mẫu không khí, còn phải chú

ý phát hiện sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố như Aspergillus flavus,

- Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước trước khi sử dụng

- Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu, nông sản

- Bảo quản nguồn nguyên liệu nơi khô ráo

- Kiểm soát và khử trùng côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho: côn trùng hô hấp đốt chất dinh dưỡng sinh ra H2O làm hỏng nguyên liệu giúp nấm mốc phát triển, đồng thời khi di chuyển chúng đã mang theo bào tử nấm phát tán nhanh trong kho

- Sử dụng hóa chất chống nấm mốc: có nhiều hóa chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn Hiện nay có thể nói chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực cao ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid probionic và các muối của nó

- Vô hiệu hóa độc lực mycotoxin bằng phương pháp vật lý và hóa học: ngoài các biện pháp như xử lý nhiệt, ánh sáng, sử dụng ozone để oxi hóa mycotoxin và sử dụng chất kiềm NH3

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic

1.2.1.1 Giới thiệu chung

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà,…), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc

để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic 21 năm sau đó

(1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ

vi khuẩn lactic đã được hình thành

Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua Vi khuẩn lactic luôn được công nhận là an toàn để sử dụng trong quá

trình lên men thực phẩm truyền thống (Diop et al., 2007)

Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có một sự thống nhất

về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào

tử Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrat Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường monosaccarit và disacarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disacarit nào, một số không lên men được

saccaroza, một số không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men

được tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác

LAB có rất nhiều hình dạng khác nhau:dạng trực khuẩn ngắn hay dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có dạng hình que Đặc biệt khuẩn lạc

tỏ ra mùi chua của acid

Khuẩn lạcvi khuẩn lactic trên môi trường thạch thường nhỏ (đường kính 2 –

5 mm), có bờ đều, láng và lồi, mờ đục không có chất màu.Lactobacilli không tạo

mùi đặc trưng trên môi trường nuôi cấy thông thường Tuy nhiên, chúng góp phần tạo hương vị trong những thực phẩm lên men bằng cách sản xuất nhiều hợp chất dễ bay hơi như diacetyl và những dẫn xuất của nó, thậm chí chúng tạo H2S và các amin trong phô mai (Wood B.J.B and Holzapfel W.H 1995)

Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10 -15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl

Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 –

350C, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 450

C, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối thấp ( <= 50C) Khi gia nhiệt đến 60 – 800C thì hầu hết bị chết sau 10 – 30 phút

Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm Như vậy, ngoài khả năng tạo ra acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (Bacteriocin)

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp trong không khí, đất, nước, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (rau, quả, sữa, thịt,…) một số tìm thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật

Hầu hết các vi sinh vật sinh acid lactic đều thuộc họ Lactobacillaceae và

được xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc

Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc

giống Bifidobacterium

Theo bảng phân loại được sữa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20

giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium,

Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella Trong khóa phân loại

của Bergey 1957, giống Bifidobacterum cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic, trong đó chúng được xem như là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù

hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae - một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men khác với vi khuẩn lactic Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển

ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại

1.2.1.2 Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà ngưới ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 loài như: L.acidophilus, L.brevis,

L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus,…

Giống Lactobacillus (viết tắt Lb) là những trực khuẩn không sinh bào tử thuộc lớp vi khuần Gram dương Tế bào Lactobacilluscó dạng hình que thường dài

và thon, không di động, Gram dương, hiếm khí tạo sắc tố (màu gỉ sắc và màu đỏ gạch) (Makarova và cộng sự, 2006).Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài, sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ

Các loài Lactobacillus được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và

thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết

và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này

Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như: Lactobacillus

pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi

chất của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể chia thành 3 nhóm như bảng

1.4

- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng được gọi là Thermobacterium, có

fructose – 1,6 – diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, chúng phát triển ở 450C

- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng được gọi là Streptobacterium (có FDP

aldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic

- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

Bảng 1.4.Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)

L.casei L.curvatus L.plantarum L.sake

L.brevis L.buchneri L.fermentum L.reuteri

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus có vai trò hữu ích

trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng không dung nạp Lactose, bệnh về da như: bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp

Giống Streptococcus (viết tắt Sc.) (Billiroth, 1874) thuộc họ Streptococcaceae

(Trivisan, 1889) thuộc lớp vi khuẩn Gram dương (firmibacteria), có dạng hình tròn hoặc hình ovan, ít khi kéo dài thành dạng que Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn Chúng là loại vi khuẩn không nha bào, không di động và thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số loài

có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, đường kính cầu khuẩn 0.5-1μm

Các loài thuộc giống Streptococcus thường sống hoại sinh trong đất, bề mặt

cây, da người, ruột…

Giống Streptococcus bao gồm các loài: S agalactiae, S anginosus, S bovis,

S canis, S equi, S iniae, S mitis, …

Dựa vào nhóm kháng nguyên N mà được chia thành 2 nhóm:

- Nhóm có kháng nguyên N (Sc Mesophiles): Streptococcus Mesophiles bao gồm các loài chủ yếu Streptococcus lactis và Streptococcus cremoris

- Nhóm không có kháng nguyên N (Sc Thermophiles):

Streptococcus thermophiles khác với Streptococcus lactis ở chỗ chúng sinh

trưởng ở nhiệt độ tối ưu là 42-430C và có thể chịu được ở 600C trong 30 phút, các chủng này không có khả năng tạo kháng nguyên N, mẫn cảm với NaCl (Nguyễn Thành Đạt, 2001)

Trong năm 2002, nhiều vi sinh vật trước đây được coi là Treptococcus được tách ra thành các chi enterococcus (Facklam R October 2002) Hiện tại có hơn 20

loài ghi nhận trong chi này

- Bộ: Lactobacillales

- Họ: Leuconostocaceae

- Giống: Leuconostoc

Giống Leuconostoc (viết tắt là Ln.) (Van Thieghem, 1878) thuộc lớp cầu

khuẩn Gram dương.Chúng có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan đơn lẻ, cặp đôi hay dạng chuỗi ngắn, đường kính từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính acid, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que.Chúng là một loài kỵ khí không bắt buộc.Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung Phần lớn chúng lên men lactic dị hình theo con đường hexoso-monophosphat

Các vi khuẩn thuộc giống Leuconostoc không làm đông tụ sữa, chuyển hóa

fructose thành mannitol, được tìm thấy trong lên men sữa và rau quả

Giống Leuconostoc bao gồm các loài như: L carnosum, L citreum, L

durionis, L fallax, L fructosum, L garlicum, L gasicomitatum, L gelidum, L inhae, L kimchii, L lactis,…

Những cầu khuẩn lên men lactic dị hình ở đây được chia thành 4 nhóm theo phương pháp lai DNA-DNA Những loài thường gặp trong lên men lactic như:

Ln.mesenteroides subsp mesenteroides, Ln mesenteroides subsp dextrainicum, Ln mesenteroides subsp cremoris, Ln.lactis, Ln paramesenteroides, Ln oenos

(Nguyễn Thành Đạt, 2001)

 Giống Pediococcus

Hình 1.7.Hình dạng tế bào Pediococcus

Giống Pediococcus (viết tắt là Pc.) là những tứ cầu hoặc dạng song cầu

khuẩn, có khi đơn lẻ hoặc thậm chí chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, catalase âm, có hoạt tính thủy phân protein rất yếu Chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc

Giống Pediococcus bao gồm các loài như: P acidilactici, P cellicola, P

claussenii, L damnosus, P.ethanolidurans, P inopinatus, P parvulus, P pentosaceus, P.stilesii,…

Quá trình trao đổi chất chủ yếu là quá trình lên men đồng hình, không có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém, vì vậy chúng

có nhu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường

Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae (Balcke, 1884)

 Giống Bifidobacterium

Hình 1.8.Hình dạng tế bào Bifidobacterium

Giống Bifidobacterium (Orla Jensen, 1924) là những trực khuẩn kị khí không

sinh bào tử, Gram dương, bất động khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có thể phân nhánh dạng Y, V tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy chuyển chúng trở thành trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong Trước đây, người ta xếp giống này trong

Lactobacillus (ví dụ Lb.bifidus) nhưng theoBergey’s 1986 thì chúng được tách

thành giống riêng mang tên Bifidobacterium và xếp vào họ Actinomycetaceae

Chúng lên men lactic dị hình, sản phẩm chính là acid acetic và acid lactic (tỷ lệ 3:2) cùng với một lượng nhỏ acid formic, ethanol, acid succinic Nhưng khác với các vi khuẩn lên men dị hình khác là không sinh CO2 (Scardovi, 1986), catalase âm tính, nitrat dương tính, indole và galatine âm tính Chúng là những cơ thể ưa ấm, sinh thưởng ở nhiệt độ 31-410C, không chịu được pH 4.5-5 (Nguyễn Thành Đạt, 2001)

1.2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Để sinh trưởng bình thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như nguồn carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà chúng còn có nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

- Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccarit ( glucoza, fructoza, manoza ) và các disaccarit ( saccaroza, lactoza, maltoza ) Một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột (William và Wilkins, 1986)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

- Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn

vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ

Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất.Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

- Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của

tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

- Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập

và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

- Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan.Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

- Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí ((microaerophile), sinh trưởng trên

bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (Wood B.J.B and Holzapfel W.H 1995)

Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối

vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

1.2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004) Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này

 Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất

với môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS (Phụ lục A) để nuôi cấy vi

khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men

- Ảnh hưởng nguồn cacbon

Cacbon là yếu tố chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể của mọi loài sinh vật Các loại vi khuần khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau

Sự phát triển của vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào

có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau nên khả năng chống chịu sẽ khác nhau trước những áp lực của các quá trình xử lý sau này

- Ảnh hưởng nguồn nitơ

Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả các vi sinh vật Vật chất

cơ bản của tế bào (protein, acid nucleic,…) đều chứa nitơ Vì vậy, nitơ đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

- Ảnh hưởng từ nguồn vitamin

Vitamin giữ vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của của

Lactobacilli nên rất cần thiết cho hoạt động sống của các loài vi khuẩn lactic Tùy

vào từng loại vi khuẩn mà có những vitamin khác nhau Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào nồng độ các vitamin Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Nhiều loại acid amin được xem là không thể thay thế, mà bắt buộc phải có trong môi trường

- Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng

Các muối vô cơ và các chất khoáng chiếm một lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng rất lớn sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Chẳng hạn, đối với

Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic Hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzyme protease thủy phân một số protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic, nó giúp vi khuẩn lactic sử dụng các loại đường tốt hơn

Các chất chứa acid béo có trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn Chúng kích thích sinh trưởng và đóng vai trò trong quá trình lạnh đông.Ví dụ Tween 80 làm thay đổi một số acid béo trong tế bào vi khuẩn lactic, ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mặn của vi khuẩn lactic (Ho Phuong Ha và Michelle Cartherine Adems, 2007)

 Yếu tố môi trường

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh

Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 400C Một số có thể sinh trưởng dưới 150C và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 50

C (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995)

- Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người

ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3

- Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men

1.2.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic

 Quá trình trao đổi chất:

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm:

- Vi khuẩn lên men lactic đồng hình:

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl

Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hóa theo chu trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đến pyruvat Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic

- Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài các sản phẩm phụ như acid acetic, ethanol, acid succinic,CO2

Phương trình chung biễu diễn quá trình len men:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +

Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình

 Ứng dụng của vi khuẩn lactic:

Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y

dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm

Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng

về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007)

Vi khuẩn lactic còn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, được sử dụng trong bảo quản sinh học Ngoài ra, chúng còn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ có hoạt tính kháng nấm như reuretin, acid lactic,…

1.2.3 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng

khuẩn và các loại peptide kháng nấm LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995,; Hafidh và cộng sự,

2010).Loài Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá

bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao

và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001)

Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một

loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L

plantarum và L sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng

nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.) Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000;.Corcoran

và cộng sự, 2004.)

Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự năm 1998, (Bảng 1.5).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005)

Bảng 1.5.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men

Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất giống Tham khảo

buturic-, acetic-,

formic- and n-valeric

acid

Lactibacillus sanfranciscensis CB1

(Corsetti và cộng

sự, 1998)

Corsetti và cộng sự báo cáo về tác dụng ức chế nấm của LAB khác được phân

lập từ bộtnhàochua làLactobacillus sanfranciscensis CB1 ( Corsetti và cộng sự ,

1998) Họ phát hiện ra một hỗn hợp của acid hữu cơ là bổ trợ về tác dụng ức chế của dòng này (acetic , caproic , formic , propionic, butyric và acid n- valeric ), trong

đó acid caproic dường như quan trọng nhất Tất cả các chất này được xác định là những hợp chất có phân tử lượng thấp , nhưng cũng có những báo cáo của các hợp chất protein không xác định với hoạt động kháng nấm rộng ( Gourama và Bullerman ,1997; Magnusson và Schnürer , 2001) Một peptide giống như

bacteriocin có hiệu lực kìm nấm Candida albicans đã được báo cáo bởi Okkers và

cộng sự.( Okkers và cộng sự , 1999)

Ngoài các sản phẩm trên, cũng có một số báo cáo về các chủng kháng nấm LAB mà các hợp chất hoạt động chưa được đặc trưng (De MUYNCK và cộng sự, 2004; Florianowicz năm 2001; Laitila và cộng sự, 2002; Makanjuola, Tymon và Springham năm 1992; Roy và cộng sự, 1996; Schwenninger và cộng sự, 2005) Nghiên cứu về LAB chống nấm cho thấy việc sản xuất các chất ức chế nấm

xảy ra ở nhiều loài khác nhau.Loài thuộc chi Lactobacillus được báo cáo trong phần

lớn các nghiên cứu (Bảng 1.6)