Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý

Và hướng nghiên cứu cộng đồng hệ enzyme cellulase nhằm đáp ứng một phần trong nghiên cứu phân giải cellulose từ biomasss định hướng cho sự phát triển nguồn nhiên liệu sinh học trong tươn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

CN.NGÔ ĐỨC DUY Sinh viên thực hiện: LƯU THÁI HÒA

hướng dẫn của TS Hoàng Quốc Khánh và CN Ngô Đức Duy, không sao chép của

ai Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của đồ án Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm và mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra

Sinh viên thực hiện

Lưu Thái Hòa

được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy Cô, các anh chị và các bạn, em đã hoàn thành tốt bài báo cáo này Em xin cảm ơn chân thành đến:

Thầy TS Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho

em được làm đồ án tốt nghiệp tại đây, nhiệt tình hướng dẫn và hỗ trợ để em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp

Thầy Ngô Đức Duy phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Ban giám hiệu Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM và toàn thể các Thầy

Cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường là những người đã tận tình dạy dỗ, đã tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua

Các anh chị trong phòng Thí Nghiệm Vi Sinh của Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã cung cấp cho em những số liệu mà em cần, khi em làm về qui trình thực nghiệm

Tất cả các bạn trong lớp 10DSH02 thân yêu đã an ủi động viên tôi hoàn thành tốt bài khóa luận này, cũng như những bạn đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ mọi thứ với tôi trong suốt thời sinh viên

Và con xin cám ơn Bố Mẹ, chị hai, em gái, những người thân đã luôn động viên con, giúp con có nghị lực để con có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ v

DANH MỤC SƠ ĐỒ vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của đề tài 1

2.Tình hình nghiên cứu 1

3.Mục đích nghiên cứu 2

4.Nhiệm vụ nghiên cứu 2

5.Phương pháp nghiên cứu 3

6.Các kết quả đạt được của đề tài 3

7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò 4

1.1.1 Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò 4

1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose ở dạ cỏ bò 8

1.1.3 Điều kiện vật lý trong dạ cỏ bò 9

1.2 Giới thiệu về hệ enzym cellulase 10

1.2.1 Định nghĩa 10

1.2.2 Phân loại 10

1.2.3 Cấu tạo của cellulase 11

1.2.4 Tính chất 11

1.2.5 Các chất ức chế 12

1.2.6 Cellulosome 12

1.3 Phân giải rơm qua xử lý 13

1.3.1 Thành phần của rơm 13

1.3.2 Cấu trúc của rơm trong tự nhiên 14

1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ 15

1.3.4 Con đường phân giải rơm 17

1.4 Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu 20

2.2 Thiết bị, hóa chất 21

2.2.1 Thiết bị 21

2.2.2 Hóa chất 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc 25

2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật 26

2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật 27

2.4 Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 28

2.4.1 Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC 28

2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford 28

2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 30 2.5 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp của hệ enzyme cellulase 31

2.5.1 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase 32

2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 32

2.6 Khảo sát quá trình enzyme cellulase thủy phân cellulose từ rơm rạ 32

2.6.1 Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS 33

2.6.2 Khả năng phân giải rơm rạ 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 35

3.1 Kết quả tăng sinh trên môi trường PCS 35

3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật 38

3.3 Kết quả khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật 39

3.4 Kết quả hàm lượng protein tổngtheo phương pháp Bradford 42

3.5 Kết quả đo hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper 43

3.5.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase 43

3.5.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 44

3.6 Kết quả đo lượng đường khử sau khi phân giải rơm theo phương pháp DNS 46

3.7 Kết quả phân giải rơm rạ 48

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

4.1.Kết luận 49

4.2.Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CMC carboxymethyl cellulose DNS Acid Dinitro – Salicylic

FP phương pháp filter paper

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Dung dịch đệm citrate 22

Bảng 2.2 Dung dịch đệm phosphate 22

Bảng 2.3 Thông số xây dựng đường chuẩn albumin 29

Bảng 2.4 Thông số xây dựng đường chuẩn glucose 30

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra ngày phân giải giấy lọc trong môi trường PCS và vòng phân giải trên đĩa thạch CMC tại 37℃, pH 7,0 35

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 37℃, pH 7,0 38

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 39℃, pH 7,0 38

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở 41℃, pH 7,0 39

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát sự phân hủy giấy lọc và CMC ở các pH khác nhau 40

Bảng 3.6 Nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò 42

Bảng 3.7 Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi pH từ 6,0 – 6,9 ở 39℃ 43

Bảng 3.8 Giá trị OD540nm của 9 mẫu khảo sát hoạt tính cellulase thay đổi nhiệt độ 37℃, 39℃, 41℃ ở pH tối ưu 44

Bảng 3.9 Kết quả hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp FP 45

Bảng 3.10 Kết quả hàm lượng glucose trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase 47

Bảng 3.11 Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase 48

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Nồng độ protein tổng của 9 mẫu vi sinh vật dạ cỏ bò 42

Biểu đồ 3.2 Hoạt tính cellulase tổng số của 9 mẫu enzyme cellulase 45

Biểu đồ 3.3 Hàm lượng glucose tạo thành trong dịch sau phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase 47

Biểu đồ 3.4 Khả năng phân giải rơm của 3 mẫu enzyme cellulase 48

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thu nhận enzyme cellulase 20

Sơ đồ 2.2 Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm 24

Sơ đồ 2.3 Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu 25

Sơ đồ 2.4 Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật 26

Sơ đồ 2.5 Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật 27

Sơ đồ 2.6 Quy trình phân giải rơm bằng hệ enzyme cellulase 32

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hệ tiêu hóa của trâu bò 4

Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm 5

Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens 6

Hình 1.4 Thành phần của lignocellulose 13

Hình 1.5 Cấu trúc hiển vi của lignocellulose 14

Hình 1.6 Cấu trúc của lignocellulose 15

Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson 17

Hình 3.1 Chín mẫu dạ cỏ bò tăng sinh ở 37℃, pH 7,0 36

Hình 3.2.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 07 ngày tăng sinh trong môi trường PCS 37

Hình 3.3.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 10 ngày tăng sinh trong môi trường PCS 37

Hình 3.4.Vòng phân giải trên đĩa thạch CMC của 9 mẫu dạ cò bò ở 37℃, pH 7,0 sau 13 ngày tăng sinh trong môi trường PCS 37

LỜI MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit.Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu thành công từ việc thu nhận dịch trong

dạ cỏ của động vật nhai lại và ứng dụng để tạo chế phẩm cellulase công nghiệp Ở Việt Nam, hiện nay các nghiên cứu về cộng đồng hệ enzyme cellulase chưa được quan tâm nhiều, đa phần chủ yếu nghiên cứu tính đơn lẻ trong phức hệ enzyme cellulase Và hướng nghiên cứu cộng đồng hệ enzyme cellulase nhằm đáp ứng một phần trong nghiên cứu phân giải cellulose từ biomasss định hướng cho sự phát triển nguồn nhiên liệu sinh học trong tương lai

Do vậy, đề tài: “ Khảo sát hệ enzyme cellulase thu nhận từ cộng đồng vi

khuẩn trong dạ cỏ bò để phân giải rơm qua xử lý” góp phần vào nghiên cứu và ứng

dụng sản xuất công nghiệp cho tương lai

2.Tình hình nghiên cứu

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng hệ vi sinh vật từ dạ cỏ của loài nhai lại có khả năng sinh enzyme celulase để phân giải rơm rạ, xử lý chất thải công nghiệp biomass Đó là nghiên cứu của Oyeleke.et.al (2008)[21], Faridha Begum.I.er.al (2013) [22]… Nghiên cứu để sản xuất nhiên liệu sạch, thân thiện với môi trường từ biomass và đặc biệt là thay thế được nguồn năng lượng hóa thạch

(dầu mỏ, khí thiên nhiên, than đá ) đang bị cạn kiệt, được các nước trên thế giới rất quan tâm, đặc biệt là những quốc gia có nền kinh tế phát triển mạnh, nghiên cứu của

Parameswaraan Binod.et.al (2010)[16]

Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu để xử lý rơm, rạ, trấu thành ethanol - nguồn nhiên liệu sinh học thân thiện môi trường thay thế cho xăng dầu (Nguyễn Hoàng Dũng, trường ĐH Bách Khoa TPHCM, 2012), nghiên cứu sản xuất giấy từ rơm rạ (Nguyễn Phúc Thanh), nghiên cứu “Quy trình lên men acid lactid từ rơm rạ” (Nguyễn Văn Tuyên- Trường Đại Học Đà Nẵng, 2011) [9], “Nghiên cứu việc sử dụng rơm rạ tạo ra các sản phẩm môi trường” như: làm phân hữu cơ, làm giấy, trồng nấm, rau sạch, làm nhiên liệu xây nhà, tạo ra điện, làm thủ công mỹ nghệ, làm chế phẩm sinh học (Nguyễn Thị Ngọc Yến, trường ĐH Công Nghệ TP HCM,

2012)[10], ứng dụng chế phẩm sinh học (nấm Trichoderma) để sản xuất phân rơm

rạ hữu cơ và cải thiện độ phì của đất canh tác lúa (Lưu Hồng Mẫn, 2012)…

3.Mục đích nghiên cứu

Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn từ dạ cỏ

bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase phân giải cellulose

Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme cellulase

Khảo sát khả năng thủy phân cellulose từ biomass của hệ enzyme cellulase

4.Nhiệm vụ nghiên cứu

Chọn lọc cộng đồng vi khuẩn sinh hệ enzyme cellulase từ dạ cỏ bò

Tối ưu hóa điều kiện phát triển của cộng đồng vi khuẩn dạ cỏ bò

Chọn lọc hệ enzyme cellulase tiềm năng

Tối ưu hóa nhiệt độ, pH và thời gian cho hoạt tính hệ enzyme cellulase cao Khảo sát khả năng phân giải rơm rạ của hệ enzyme cellulase

5.Phương pháp nghiên cứu

Tăng sinh, kiểm tra ngày phân giải giấy lọc và kiểm tra khả năng sản sinh endoglucanase phân giải CMC trên đĩa thạch của cộng đồng vi khuẩndạ cỏ bò

Phương pháp đo hàm lượng protein ngoại bào bằng phương pháp Bradford Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme cellulase tổng số bằng phương pháp Filter Paper

Phương pháp xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Acid Dinitro - Salicylic (DNS)

Phương pháp xác định trọng lượng khô của rơm rạ

Sử dụng các phần mền vi tính Microsoft Office Excel 2007, Statgraphics Centurion XV và Microsoft Office Excel 2007 để thống kê và tính toán

6.Các kết quả đạt được của đề tài

Thu nhận và tối ưu hóa nhiệt độ, pH phát triển của 9 cộng đồng vi sinh dạ cỏ

bò có khả năng sinh hệ enzyme cellulase

Thu nhận và tối ưu hóa điều kiện môi trường ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme của 9 hệ enzyme cellulase có khả năng phân giải cellulose

Thu nhận được 3 hệ enzyme cellulase có khả năng phân giải rơm qua xử lý

7.Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 4: Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cộng đồng vi khuẩn trong dạ cỏ bò

1.1.1 Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò

Hình 1.1.Hệ tiêu hóa của trâu bò [2]

Dạ cỏ to nhất, chiếm 2/3 dung tích của dạ dày, là túi đặc biệt nhất, tại đây hàng loạt phản ứng sinh hoá học được tiến hành liên tục để phân giải tiêu hoá và hấp thu thức ăn.[2]

Trong dạ cỏ có hàng tỷ vi sinh vật sống cộng sinh với nhau Hệ vi sinh vật này giúp bò tiêu hóa thức ăn, trong khi bò cung cấp cho chúng chỗ ở và chất dinh dưỡng Nếu không có hệ vi sinh vật này, dạ bò sẽ cần nhiều thời gian tiêu hóa chất

xơ, tinh bột và sản xuất axit béo hơn, cung cấp khoảng 60 đến 80% năng lượng Tóm lại, dạ bò có thể tiêu hóa nhiều loại thức ăn nhờ vào sự đa dạng của hệ vi sinh vật.[14]

Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò bao gồm vi khuẩn, protozoa và nấm Số lượng

vi khuẩn khoảng 109- 1010cfu trong 1ml chất chứa, có trên 60 loài vi khuẩn đã được xác định Số lượng vi khuẩn của từng loài phụ thuộc rất lớn vào khẩu phần ăn của bò.[2]

Ngoài ra còn có Mycoplasma, các loại virus và các thể thực khuẩn Mycoplasma, virus và thể thực khuẩn không đóng vai trò quan trọng trong tiêu hóa

thức ăn Quần thể vi sinh vật dạ cỏ có sự biến đổi theo thời gian và phụ thuộc vào tính chất của khẩu phần ăn Hệ vi sinh vật trong dạ cỏ sống chủ yếu bằng năng lượng sinh ra từ quá trình lên men các chất dinh dưỡng.[8]

Hình 1.2.Protazoa cùng với vi khuẩn và bào tử nấm.[33]

❖ Vi khuẩn: được chia thành nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, hemicellulose, tinh bột, đường, protein… Vi khuẩn xuất hiện trong

dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng Thông thường vi khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ Phân loại vi khuẩn dạ cỏ có thể được tiến hành dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng Một số nhóm vi khuẩn dạ

cỏ chính:

 Vi khuẩn phân giải cellulose: Đây là nhóm có số lượng lớn nhất trong dạ cỏ của gia súc sử dụng khẩu phần chính cellulose Những loài vi khuẩn phân

giải cellulose quan trọng là: Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio

Cillobacterium cellulosolven.[8]

Ruminococcus flavefaciens là một loại vi khuẩn gram dương sinh ra phức hệ

enzyme bám vào thành tế bào thực vật và xúc tác cho các hoạt động khác nhau.[14]

Hình 1.3.Ruminococcus flavefaciens.[33]

 Vi khuẩn phân giải hemicellulose: Nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose thì cũng có khả năng phân giải hemicellulose Tuy nhiên không phải tất cả các loài sử dụng hemicellulose đều có khả năng thủy phân

cellulose Một số sử dụng hemicelluloses là: Butyrivibrio fibrisolvens,

Lachnospira multiparus, Bacteroides ruminicola.[8]

 Vi khuẩn phân giải tinh bột: Trong dinh dưỡng carbonhydrate của các loài nhai lại, tinh bột đứng vị trí thứ hai sau cellulose Phần lớn tinh bột theo thức

ăn vào dạ cỏ được phân giải nhờ hoạt động của vi sinh vật Tinh bột được phân giải bởi nhiều loại vi khuẩn trong dạ cỏ bò trong đó có cả vi sinh vật phân giải cellulose Các loại vi khuẩn phân giải tinh bột quan trọng như là:

Bacteroides amylophilus, Bacteroides Ruminantium, Steptococcus bovis Prevotella bryantil là vi khuẩn gram âm có thể sử dụng polysaccharide hòa

tan, là xylans.[8]

 Vi khuẩn phân giải đường: Hầu hết các vi khuẩn sử dụng các loại polysacchride nói trên thì cũng sử dụng đường disacchride và

monosaccharide Các loại vi khuẩn thuộc loài Lachnospira multiparus,

Selenomanas ruminantium đều có khả năng sử dụng tốt cacbonhydrat hòa

tan.[8]

 Vi khuẩn sử dụng acid hữu cơ: Loài vi khuẩn đều có khả năng sử dụng axit lactic mặc dù lượng axit này trong dạ cỏ thường không đáng kể trừ trong

những trường hợp đặc biệt Những loài sử dụng lactic là Veillonella

gasogenes, Veillonella alacalescens, Peptostreptococuss elsdenii.[8]

 Vi khuẩn phân giải protein: Sự phân giải protein và acid amin để sản sinh ra như amoniac trong dạ cỏ bò có ý nghĩa quan trọng đặc biệt về cả phương tiện tiết kiệm nitơ cũng như nguy cơ dư thừa amoiniac Amoniac cần cho các loài

vi khuẩn dạ cỏ để tổng hợp nên sinh khối protein của bản thân chúng, đồng thời một số vi khuẩn đòi hỏi hay được kích thích bởi acid amin, peptid, isoacid có nguồn gốc từ valine, leucine và isoleucine Trong số những loài

sinh aminoac thì Peptostreptococus và Clostridium có khả năng lớn nhất.[8]

 Vi khuẩn tạo methan: Methanogens là những vi khuẩn sinh methan trong dạ

cỏ bò, sử dụng cacbon cho quá trình lên men Chúng dược chia làm 2 nhóm

chính: Methano sphaera stadtmanae và Methano brevibacter ruminatium Trong đó, Methano bacteriaceae (thuộc Methano sphaera stadtmanae) được tìm thấy nhiều nhất, Methano corpusculaceae và Methano spirillaceae phổ biến thứ hai trong dạ cỏ bò Nhóm Methano brevibacter ruminatium gồm:

Methano microbium, Methano bacterium và Methano sarcina, là những vi

khuẩn có khả năng sử dụng khí methan, hình que ngắn, không sinh nội bào

tử, nhiệt độ phát triển tối ưu là 40°C và pH 6,1 – 6,9.[14]

 Vi khuẩn tổng hợp vitamin: Nhiều loại vi sinh vật trong dạ cỏ bò có khả năng tổng hợp vitamin B và vitamin K.[8]

 Vi khuẩn lên men pectin: Nhóm vi khuẩn này phát triển ở pH khoảng 6.0

(ngoại trừ Bacterioides là pH 5,1) Có 32 chủng vi khuẩn lên men pectin đã được phân lập từ dạ cỏ bò, nhưng quy lại có 3 chủng chính: Lachnospira

Multiparous, Butyrivbrio fibrisolvens và Bacteroides ruminicola Chúng đều

là vi khuẩn kỵ khí, có đường kính từ 1,0 – 1,2 𝜇m Chúng thường lên men pectin tạo thành format và khí H2 Các sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men pectin được các vi khuẩn khác sử dụng, như succinate.[14]

❖ Protozoa: Protozoa hay còn gọi là động vật nguyên sinh, chúng có số lượng

ít hơn nhiều so với số lượng vi khuẩn, chúng chỉ có 106 trong 1ml chất chứa, nhưng vì có kích thước lớn hơn nên tổng sinh khối tương tự như vi khuẩn[2]

 Protozoa xuất hiện trong dạ cỏ là các loại ciliate thuộc hai họ khác nhau Họ

Isotrichidae, thường gọi là Holotrich, gồm những Protozoa có cơ thể rỗng được phủ bởi các tiêm mao (cilia) Chúng gồm các bộ Isotricha và

Dasytricha Họ kia là Ophryosocolecidae, hay Oligotrich, gồm nhiều loài

khác nhau về kích thước, hình thái và diện mạo Chúng gồm các bộ

Entodinium, Diplodinium, Epidinium và Ophryoscolex Protozoa có tác dụng

xé rách màng tế bào thực vật, làm tăng diện tích tiếp xúc, do đó thực vật dễ

kỳ sống có hai pha là pha bào tử (zoosore) và pha thực vật (sporangium)

Những loài nấm được phân lập từ dạ cỏ gồm: Neocallimastix frontalis,

Piramonas communis và Sphaeromonas commuis Sự có mặt của nấm giúp

làm tăng tốc độ tiêu hóa xơ Oyeleke và ctv (2008) [21] đã tiến hành phân lập và tuyển chọn các vi sinh vật phân giải cellulose trong dạ cỏ của ba động vật nhai lại khác nhau bò, cừu, dê Kết quả đã phân lập được các loài nấm:

Aspergillus, Mucor and Fusarium có khả năng phân giải cellulose

❖ Những vi sinh vật khác: Dạ cỏ là một nơi sống tối ưu cho vi sinh vật sống kỵ

khí Điều kiện bên trong dạ cỏ thay đổi liên tục (khoảng 30 - 40°C, pH 5.5 –

7.0) Những vi sinh vật bên trong dạ cỏ vừa cạnh tranh với nhau vừa sống cộng sinh với vi khuẩn.[14]

1.1.2.Vi khuẩn phân giải cellulose ở dạ cỏ bò

Có hàng trăm loại vi sinh vật khác nhau trong dạ cỏ bò hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình tiêu hóa thức ăn của chúng bao gồm nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh

Người ta nghiên cứu rằng sau 38 giờ sau khi các bò con được sinh ra thì các vi sinh vật đã phát triển trong dạ cỏ (Mc Allister TA.et.al, 1994) [26] Bên cạnh đó các nhà khoa học đều đồng ý rằng sự thủy giải cellulose trong dạ cỏ chủ yếu là do các hoạt động của vi khuẩn phân giải cellulose và chiếm đa số với mật độ 1011 cfu/ml Trong đó các vi khuẩn phân giải cellulose đã được phát hiện chiếm ít nhất là 0,3% tổng số

vi khuẩn trong dạ cỏ (Brulc.et.al, 2011) [27]

Vi khuẩn Fibrobacter succnigenes, Ruminococcus albus, Cillobacterium

cellulosolvens và Ruminococcus flavefaciens là các loài phân giải cellulose chiếm

ưu thế trong vi sinh vật dạ cỏ (Faridha.et.al, 2013) [22] So sánh với tất cả nghiên cứu hiện nay thì các loại vi khuẩn này có khả năng phân giải cellulose mạnh Chúng

sử dụng cellulose và các sản phẩm thủy phân của chúng như là một nguồn năng lượng cho sự phát triển

Đã có 8 loài được công nhận của giống Ruminococcus, kỵ khí, cầu khuẩn gram dương thích nghi tốt trong môi trường dạ cỏ Vi khuẩn Ruminococcus

flavefaciens đã được Kaars-Sijpesteijn (1951) mô tả như sau: Tế bào hình cầu,

gram dương, đường kính 0,8 – 0,9 µm, kỵ khí bắt buộc và tạo ra một sắc tố màu vàng đặc trưng đặc biệt khi phát triển trên cơ chất là cellulose, không có khả năng di động, catalase âm tính

Loài vi khuẩn Cellulomonas flavigena cũng có tế bào hình que, gram dương, thuộc giống Cellulomonas, ngành Actinobacteria, có khả năng sản sinh nhiều loại

enzyme cellulase và xylanase trên cơ chất bã mía và nguồn cơ chất cellulose khác [27]

1.1.3 Điều kiện vật lý trong dạ cỏ bò

Dạ cỏ bò có pH khoảng 6.5–7.2 Nhiệt độ của bò khỏe mạnh dao động từ 37,8°C đến 40°C và nhiệt độ của dạ cỏ là khoảng 40°C Những điều kiện này cho thấy các vi khuẩn trong dạ cỏ là kỵ khí bắt buộc và chúng chỉ phát triển trong điều kiện không khắc nghiệt [14]

Các sản phẩm của mỗi hệ vi sinh vật tạo ra một loại môi trường nhờ đó tất cả chúng cùng tồn tại và góp phần vào tạo nguồn năng lượng cho bò

Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài

1.2 Giới thiệu về hệ enzym cellulase

(IUBMB-❖ Endoglucanase EC 3.2.1.4

Tên thường gọi là cellulase1,4-β –glucanase

Tên hệ thống: 1,2-(1,3:1,4)- β-D-glucan-4- glucanohydrolase

Người ta gọi enzym này bằng những tên khác : endo-1,4- D-glucanase; 1,4- glucanase; cellulase A… Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và các β-D-glucan của ngũ cốc

β-❖ Exoglucanase EC.3.2.1.91

Tên thường gọi là cellulase 1,4-β-cellobiosidase

Tên hệ thống: 1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase

Các tên khác: exo- cellobiohydrolase; exoglucanase; CBH1… Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucosid trong cellulose và cellotetraose từ đầu không khử

❖ β-glucosidase EC 3.2.1.21

Tên thường gọi là β-glucosidase

Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase

Các tên khác: cellobiase; β-glucosid glucohydrolase; β-1,6-glucosidase… Enzym này thủy phân các gốc β-D-glucosid, một số trường hợp cũng thủy phân β-D-galactosidase, β-D-fucoside, β-D-xyloside, α-L- arabinoside

1.2.3 Cấu tạo của cellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid –(CO – NH)– và gắn những phần phụ khác Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym.[11]

Trọng lượng của enzym cellulase thay đổi từ 30-110 KDal.Cấu trúc không gian khoảng 280 - 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300-450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin

Bằng cách bẽ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzym cellulase đã thủy phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose Trong đó exoglucanase là enzyme chính trong quá trình thủy phân cellulose

1.2.4 Tính chất

❖ Tính đặc hiệu

Enzyme exocellulase thủy phân đặc hiệu liên kết -1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin Enzyme endocellulase thủy phân liên kết -1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose -glucosidase thủy phân đặc hiệu gốc β-D-glucan của rơm rạ.[6]

❖ Đặc tính hóa lý và hóa sinh

Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt

tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 0°C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể

phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp.[13]

Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà có pH trung tính, kiềm hoặc acid.Hoạt tính của một enzyme bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường sống.Enzyme làm thay đổi tốc độ phản ứng Trong tự nhiên, khi cần thiết, các vi sinh vật sẽ điều chỉnh các điều kiện enzyme để tạo ra một mức phản ứng enzyme tối

ưu hoặc chúng có thể tạo ra hệ enzyme để thích nghi với chức năng sống trong điều kiện khắc nghiệt

khuẩn Clostridium thermocellum mã hóa cho cellulosome Cellulosome của

C.thermocellum chứa hệ enzyme cellulase, ngoài ra còn chứa: xylanase,

xyloglucanases, pectinases, glycosidases, protein cấu trúc và ít nhất một thành phần protein không xúc tác, thành phần này đang được nghiên cứu Những thành phần của cellulosome thường không được phân bố đồng đều trong phức hợp liên enzyme này và không phải gen nào cũng được biểu hiện ra Hệ enzyme này nằm trên bề mặt

tế bào nên giúp giảm thiểu sự khuyếch tán enzyme và sản phẩm từ sự thủy phân, từ đó đảm bảo sản phẩm thuỷ phân được hấp thu hoàn toàn vào sự chuyển hóa của tế bào.[28]

Các bằng chứng cho thấy bộ máy enzyme phân giải cellulose của

C.thermocellum có hiệu quả gấp 50 đến 100 lần so với enzyme của nấm, trong mỗi

gam protein Tuy nhiên việc sản sinh cellulosome bởi thermophilic hiện nay là rất

thấp Người ta sẽ cải thiện bằng cách đột biến chọn lọc hoặc dùng kỹ thuật chuyển đổi gen giữa các loài vi khuẩn.[28]

Điều đáng chú ý là cellulosome chỉ mới được sản xuất từ loài vi khuần

Clostridiaceae và Lachnospiraceae (những vi khuẩn kỵ khí trong dạ cỏ) Phức hợp

enzyme của cellulosome đang là mô hình nghiên cứu thú vị cho kỹ thuật sinh học in vitro

1.3 Phân giải rơm qua xử lý

1.3.1 Thành phần của rơm

Lignocellulose là thành phần chính của rơm rạ, bao gồm ba thành phần là cellulose, hemicellulose và lignin Trong đó, cellulose chiếm 32-47%, hemicellulose

chiếm 19-27% và lignin chiếm 5-24%.[16]

Trong hemicellulose các pentoses chiếm ưu thế, trong đó xylose là đường quan trọng nhất chiếm 14,8 – 20,2%.[16]

Thành phần phần trăm các chất trong rơm rạ được thể hiện trong hình 1.4

Hình 1.4 Thành phần của lignocellulose.[25]

1.3.2 Cấu trúc của rơm trong tự nhiên

Hình 1.5 Cấu trúc hiển vi của lignocellulose.[24]

Thành phần chính của lignocellulose là cellulose, gồm những phân tử glucose nối với nhau bằng liên kết 𝛽1,4-glucoside Hemicellulose là thành phần phổ biến thứ hai trong lignocellulose, gồm các đường 5-6 cacbon như arabinose, galactose, glucose, mannose and xylose Nó tồn tại ở những phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu…Lignin bao gồm 3 thành phần chính có vòng phenol là: p-coumaryl alcohol (H), coniferyl alcohol (G) and sinapyl alcohol (S) Lignin được tổng hợp bởi các phản ứng trùng ngưng của các thành phần này.Tỷ lệ các thành phần này là khác nhau trong các cây, mô gỗ và các lớp tế bào khác nhau.Hình thức

cấu trúc của cellulose, hemicellulose and lignin được gọi là microfibrils, chúng ổn định cấu trúc trung gian cho tế bào thực vật [24].Cấu trúc hiển vi của lignocellulose được thể hiện trong hình 1.5

Hình 1.6.Cấu trúc của lignocellulose.[35]

Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi

sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:[36]

 Vùng kết tinh: các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch khác Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài Enzyme cellulase chỉ có tác động ở bề mặt hệ sợi của vùng này

 Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals ở vùng này cellulose có cấu trúc không chặc chẽ và dễ bị tác động bởi các yếu

tố bên ngoài

1.3.3 Các phương pháp tiền xử lý rơm rạ

Rơm rạ được tạo bởi những sợi polymer cacbonhydrat phức tạp và không đồng nhất.Cellulose và hemicellulose được bao phủ bởi những lớp lignin dày đặc chống lại sự thủy phân của enzyme.Vì vậy, cần phải có một bước tiền xử lý để phá

vỡ lignin để lộ cellulose và hemicellulose cho quá trình thủy phân của enzyme được

dễ dàng.Mục đích của tiền xử lý là để giảm cellulose kết tinh, tăng diện tích bề mặt biomass, loại bỏ hemicellulose và phá vỡ lớp lignin.Tiền xử lý làm cho cellulose dễ tiếp cận hơn với enzyme để chuyển đổi polymer carbohydrate thành đường lên men

có thể nhanh hơn và với số lượng cao hơn.[16]

Tiền xử lý bao gồm các phương pháp hóa học, vật lý, nhiệt và sự kết hợp giữa chúng Tiền xử lý đã được xem là một trong những bước quan trọng xử lý các bước trong việc chuyển đổi đường cellulose để lên men

a Tiền xử lí vật lý: Phương pháp này sẽ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và

khe rỗng bên trong vật liệu, giảm độ kết tinh và độ polyme hóa của cellulose, thường được sử dụng để làm giảm dư lượng lignocellulosic Phương pháp này gồm: Hấp, nghiền và xay, chiếu xạ, nhiệt độ và áp suất

b Tiền xử lý hóa học: Các phương pháp hóa học đầy hứa hẹn bao gồm:

 Tiền xử lý với kiềm

 Tiền xử lý với ammonia

 Tiền xử lý với acid

 Tiền xử lý với các tác nhân oxy hóa

 Tiền xử lý với dung môi hữu cơ

c Tiền xử lý sinh học: Tiền xử lý sinh học đưa ra một số tiến bộ quan trọng

như sử dụng năng lượng và hóa chất ít., nhưng vẫn chưa có một hệ thống có thể điều khiển và thích hợp nhanh chóng,là một phương pháp an toàn và thân thiện với môi trường cho việc loại bỏ lignin từ lignocellulose.Các vi sinh vật đầy hứa hẹn nhất trong tiền xử lý sinh học là nấm trắng thối thuộc về lớp Basidiomycetes được đánh giá trên cơ sở những thay đổi về số lượng và cơ cấu trong thành phần của rơm đã qua xử lý cũng như tính nhạy cảm thủy phân enzym

Hiệu quả thủy phân lignocellulosic biomass tăng lên khi kết hợp nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinases Nhưng chi phí của phương pháp cũng tăng lên nghiêm trọng mặc dù từ góc độ sinh thái, đây là phương pháp đáng kỳ vọng cao

d Tiền xử lý kết hợp

Kun.et.al (2009) báo cáo tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm có xúc tác H2O2 với sự

hỗ trợ của tiền xử lý vi sóng làm thay đổi tính chất vật lý và vi cấu trúc của rơm, Zhu.et.al (2006) báo cáo một số kết hợp tiền xử lý vi sóng của rơm rạ cùng với axit và kiềm trong đó loại bỏ hemicellulose và lignin.[16]

1.3.4 Con đường phân giải rơm

❖ Cơ chế phản ứng theo công nghệ sinh học hiện đại

Endocellulase xúc tác cắt liên kết 1,4 glucoside trong cellulose, lignin và 𝛼

-D - glucan ngẫu nhiên Sản phẩm là cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.[6]

Exocellulase : cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose

Cellobiase: tham gia phân giải disaccharide và cellotetrose thành glucose

Cơ chế này được thể hiện qua hình 1.7

Hình 1.7.Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase theo Erikson [1]

Thủy phân bởi enzyme liên quan đến quá trình bẻ gãy các polyme của cellulose và hemicellulose nhờ vào sử dụng enzyme Polyme của cellulose thường chỉ chứa glucans, trong khi polyme của hemicellulose chứa nhiều loại đường như mannan, xylan, glucan, galactan và arabinan Do đó, sản phẩm thủy phân chính của cellulose là glucose, trong khi hemicellulose còn sản sinh ra một số pentoses và hexoses Tuy nhiên, hàm lượng lignin cao trong rơm gây cản trở sự tiếp xúc của enzyme, gây ra sự ức chế sản phẩm cuối cùng, làm giảm tốc độ và năng suất thủy phân Ngoài lignin, cellobiose và glucose cũng ức chế mạnh mẽ quá trình thủy phân của cellulases.[16]

Thủy phân bởi enzyme thường được tiến hành trong điều kiện nhẹ, tức là áp suất thấp kết hợp với thời gian lưu giữ lâu dài để thủy phân hemicellulose

Aspergillus niger đã được nghiên cứu để sản xuất glucose từ rơm rạ, cho thấy năng

suất glucose tăng từ 43% đến 87% và kích thước rơm giảm từ 425 đến 75 µm khi nhiệt độ tối ưu trong khoảng 45 - 50°C và pH tối ưu khoảng 4.5 – 5.0 Nghiên cứu cho thấy nồng độ và tỉ lệ của sản phẩm glucose phụ thuộc vào giai đoạn tiền xử lý rơm, nồng độ cơ chất và tế bào Hiệu quả thuỷ phân lignocellulosic trong biomass gia tăng khi có sự kết hợp của nhiều loại enzyme như cellulase, xylanases và pectinaza nhiều hơn là chỉ dùng cellulase [16]

1.4 Hiện trạng sử dụng rơm rạ tại Việt Nam và các nước trên thế giới

❖ Tại Việt Nam:

Cho đến nay, rơm rạ vẫn là chất đốt chủ yếu dùng để đun nấu ở nhiều vùng nông thôn, là nguyên liệu để sản xuất ra những vật dụng sinh hoạt như: chổi rơm

quét nhà, mũ rơm đội đầu, làm giấy và làm nhà [10]

Trong sản xuất nông nghiệp: Rơm là nguồn thức ăn cho gia súc, làm phân bón hữu cơ, trồng và sản xuất nấm rơm, nấm bào ngư, nấm sò và rau sạch, giữ ẩm, giữ ấm cho cây Việc ứng dụng các giải pháp kỹ thuật, nâng cao giá trị dinh dưỡng, sử dụng rơm mang lại hiệu quả trong chăn nuôi gia súc nhai lại

Trong công nghiệp: Ngày nay, với công nghệ hiện đại, rơm rạ được chế biến làm ván ép để sản xuất đồ nội thất, làm tường ngăn thay thế cho gỗ, làm phụ gia trong sản xuất xi măng…

Rơm mang lại nhiều ưu điểm thân thiện với môi trường, sản xuất công nghiệp, nông nghiệp tạo công ăn việc làm cho người lao động, nâng cao đời sống tinh thần cho xã hội Đồng thời, tận dụng nguồn rơm rạ được coi là phế phẩm tạo nên giá trị nghệ thuật, cũng như các vật dụng cần thiết trong đời sống hàng ngày

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu

Rơm đã qua tiền xử lý và chưa qua xử lý từ trường Đại Học Bách Khoa TPHCMtheo dự án JICA (Japan International Cooperation Agency)

Enzyme thu nhận từ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò, lấy từ một lò mổ tại huyện

Trảng Bom, tỉnh Đồng Nai Mẫu dạ cỏ bò được thu thập từ tháng 2/2014

Sơ đồ 2.1.Quy trình thu nhận enzyme cellulase

Môi trường PCS có pH đạt chuẩn Hấp khử trùng 121°C, 15 phút

50 ml môi trường PCS có pH phù hợp với từng cộng đồng vi sinh vật

Lên men trong 14 ngày

Mẫu thức ăn dạ cỏ

bò

Ly tâm 6000 vòng trong 5 phút,

nhiệt độ phòng

Thu enzyme cellulase thô

Bảo quản trong tủ lạnh

1 ml dịch mẫu dạ

cỏ bò Đồng nhất mẫu

2.2 Thiết bị, hóa chất

2.2.1 Thiết bị

 Máy so màu OD 1100RS Spectrophotometer

 Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng Hirayama HVE-50; Cân điện tử Excell; Tủ ấm Memmert; máy ly tâm Hettich…

2.2.2 Hóa chất

A Hóa chất trong phản ứng xác định hoạt tính enzyme Cellulase

➢ Agar CMC 1% (Carboxymethylcellelose Sodium Salt):

➢ Thuốc nhuộm Congo red 0.1%:

➢ Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid):

Hòa tan 7,486 g DNS và 6,92 g NaOH trong 1000 ml nước cất Sau khi hòa tan hoàn toàn, cho thêm 216 g muối sodium potassium tartrate (KNaC4H4O6) và 5,36 ml phenol ở 50oC, 5,86 g Na2S2O5 Lưu trữ trong chai sẫm màu và bảo quản lạnh

➢ Dung dịch đường chuẩn 1mg/ml: cân 10mg đường để chuẩn độ bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh

➢ Thuốc thử Bradford:

Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1g được làm tan trong 50ml Ethanol 99%, pha loãng với nước cất thành 500ml để được dung dịch (1) đựng trong chai màu tối 100ml H3PO4 85% pha loãng thành 500ml được dung dịch (2) Khi cần sử dụng, hòa 1V(1) với 1V(2) lấy dịch trong

➢ Dung dịch protein chuẩn 1mg/ml: cân 10mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 10ml nước cất, lắc đều và giữ lạnh

B Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

• Môi trường PCS medium (Peptone cellulosic solution):

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ 2.2.Tóm tắt toàn bộ thí nghiệm

Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tính cellulase bằng pp Filter

paper:

- Nhiệt độ: 37oC, 39oC, 41oC

- pH 6.0, 6.1, 6.3, 6.5, 6.7, 6.9 Thu dịch enzyme cellulase thô

Phân giải rơm qua xử lý Chọn lọc hệ enzyme cellulase tối ưu

Khảo sát lượng đường khử sinh ra

bằng pp DNS:

- Nhiệt độ, pH: tùy mẫu

- Thời gian: 2, 3, 4, 5 ngày

Hệ enzyme cellulase

Khảo sát khả năng sử dụng rơm rạ

Chọn lọc mẫu

Tăng sinh trong PCS có kèm theo

miếng giấy lọc để làm chất chỉ thị,

37°C, pH 7.0

Thử CMC và kiểm tra sự phân giải

giấy lọc sau 4, 7, 10, 13 ngày

Mẫu thức ăn từ dạ

cỏ bò

Chọn lọc mẫu

Thử CMC và kiểm tra sự phân giải

giấy lọc sau 7, 10, 13 ngày

Khảo sát điều kiện phát triển của hệ

vi sinh vật:

- Nhiệt độ: 37oC, 39oC, 41oC

- pH 5.5, 6.0, 6.5

Ly tâm 6000 vòng, 5 phút

2.3.1 Quy trình tăng sinh chọn lọc

Mục đích của việc tăng sinh nhằm phát triển mạnh mẽ hệ vsv mong muốn trong môi trường nuôi cấy thích hợp Việc tăng sinh được tiến hành lặp lại nhiều lần nhằm đảm bảo về sự ổn định.[3]

➢ Quy trình tăng sinh lần 1 được thể hiện theo các bước ở sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3 Quy trình tăng sinh chọn lọc mẫu

Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát

khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng

Đồng nhất mẫu và hút 1 ml dịch và gắp khoảng 0,1 g mẫu rơm dạ cỏ bò

phân phối vào các bình chứa môi trường

Mẫu được ủ ở nhiệt độ 37°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng trong 13 ngày

Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ

thị khả năng phân giải cellulose

Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc

Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13mm) và ngày

phân giải giấy lọc ngắn (≤7ngày)

2.3.2 Quy trình tăng sinh khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật

➢ Quy trình tăng sinh lần 2: Khảo sát nhiệt độphát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.4

Sơ đồ 2.4.Quy trình khảo sát nhiệt độ phát triển của hệ vi sinh vật

Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát

khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng

Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 1

Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào

bình môi trường PCS

Mẫu được ủ ở 2 nhiệt độ 39°C và 41°C, pH 7.0, kèm mẫu đối chứng

Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ

thị khả năng phân giải cellulose

Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc

Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày

phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày)

2.3.3 Quy trình tăng sinh khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật

➢ Quy trình tăng sinh lần 3: Khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật được thể hiện theo sơ đồ 2.5

Sơ đồ 2.5.Quy trình khảo sát pH phát triển của hệ vi sinh vật

Hấp khử trùng 121°C trong 15 phút và để nguội qua đêm để quan sát

khả năng bị nhiễm sau khi khử trùng

Lựa chọn các mẫu đã phân hủy hết giấy lọc trong đợt tăng sinh lần 2

Lắc mạnh, trộn đều các mẫu được chọn, hút 1 ml dịch nuôi cấy cho vào

bình môi trường PCS

Tùy từng mẫu được ủ ở các nhiệt độ thích hợp, thay đổi pH

5.5 – 6.0 – 6.5, kèm mẫu đối chứng

Chuẩn bị môi trường PCS pH 7.0 có kèm miếng giấy lọc 1x4 cm làm chỉ

thị khả năng phân giải cellulose

Kiểm tra CMC và ngày phân giải giấy lọc

Chọn lọc các bình nuôi cấy có vòng CMC vượt trội (≥13 mm) và ngày

phân giải giấy lọc ngắn (≤7 ngày)

2.4 Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase

2.4.1 Quy trình phát hiện sinh tổng hợp enzyme endoglucanase trên thạch đĩa CMC

Sau quá trình tăng sinh, kiểm tra sinh tổng hợp enzyme endoglucanase bằng thuốc thử Congo red 0,1% trên thạch đĩa CMC

Cho 5 ml dung dịch thuốc thử Congo red 0,1% vào các đĩa thạch đã ủ 24 giờ

ở nhiệt độ khảo sát Sau 30 phút, loại bỏ dung dich thuốc thử và thực hiện bước giải nhuộm với 5ml NaCl 1M Sau 15 phút, loại bỏ NaCl và đọc kết quả Mẫu nào có sự phân giải CMC sẽ tạo vùng phân giải nhạt màu hơn so với màu của thuốc thử Congo red

2.4.2 Định lượng hàm lượng protein tổng trong dịch nuôi cấy theo phương pháp Bradford

➢ Nguyên tắc: Các Protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian

➢ Ý nghĩa: Phương pháp giúp xác định những hệ vi sinh vật sinh ra hàm lượng enzyme cellulase cao trong quá trình khảo sát các điều kiện lên men tối ưu

➢ Hóa chất

 Thuốc thử Coomasie Brilliant Blue

 Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml

 Dịch enzyme thô được pha loãng 50 lần

➢ Tính toán:

Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở mẫu phân tích

Tổng hàm lượng protein trong 1ml dịch enzyme thô được tính theo công thức:

Protein (𝜇g/ml) = 𝑋∗𝑛∗𝑉𝑚

Với: X: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml)

n: hệ số pha loãng (50 lần)

m: khối lượng mẫu (500 𝜇l=0.5 ml)

V: thể tích mẫu hút đi đo OD (1 ml)

2.4.3 Định lượng hoạt tính cellulase tổng số theo phương pháp Filter Paper

➢ Nguyên lý phương pháp Filter Paper:

FPA là phương pháp phổ biến nhất dùng trong kiểm tra hoạt tính của enzyme cellulase tổng thể được khuyên dùng bởi IUPAC Phương pháp này dựa trên sự chuyển đổi lượng cơ chất, của tổng cơ chất cố định ban đầu (2mg) đường (dựa trên

sự giảm của nồng độ đường được đo bởi phương pháp DNS) tạo ra từ 50 mg giấy lọc (cả hai dạng của cơ chất không kết tinh và kết tinh bị thủy phân) trong một thời gian cố định (60 phút) Hoạt tính của cellulase tổng được thể hiện bằng đơn vị của giấy lọc (FPU) trên thể tích (ml) của dung dịch enzyme ban đầu (chưa pha loãng)

Ưu điểm của phương pháp này là cơ chất được sử dụng rộng rãi, bên cạnh đó cơ chất trong phương pháp này dễ bị tác động bởi hoạt tính của cellulase.Tuy nhiên, nhược điểm là cần thời gian cho việc phản ứng và dễ bị ảnh hưởng bởi sai số của thiết bị

➢ Hóa chất:

 Thuốc thử DNS

 Dung dịch đường glucose chuẩn 1mg/ml

 Dịch enzyme: dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PCS sau 14 ngày

Bảng 2.4.Thông số xây dựng đường chuẩn glucose

Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Dung dịch glucose chuẩn(ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Dung dịch đệm photphate pH 6.3 (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6