Tinh sạch sắc tố prodigiosin do vi khuẩn serratia marcescens tổng hợp trên môi trường đậu phộng và khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm tinh sạch

Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để th c hiện th nghiệm trong các chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể h u ích đối v i việc nghiên cứu một hệ thống mô hình các cơ chế bi

i MỤC LỤC i

Ắ v

vi

.vii

1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 ục đích của nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ của nghiên cứu 2

4 c ế u đ đ c của đề 2

Ư 1 ỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan prodigiosin 3

1.1.1 Nguồn gốc prodigiosin 3

1.1.2 Cấu trúc và đặc đ ểm của prodigiosin 4

1.2 Tiềm năng s n xuất prodigiosin của Serratia marcescens 6

1.2.1 ơ chế tổng h p prodigiosin 6

1.2.2 Yếu tố nh h ởng đến tổng h p prodigiosin 12

1.2.3 Thu nhận, tinh s ch và định l ng prodigiosin 13

1 3 Ho t tính sinh học của prodigiosin 17

1.3.1 Ho t tính kháng khuẩn 17

ii 1 ín ng nấ 18

1 ín ệ u 18

1.3.4 Ho t tính chống tế bào ung 18

1.3.5 Ho t tính ức chế miễn dịch 21

1.4 Tình hình nghiên cứu prodigiosin ở Việ a n ế g 22

Ư Ư - Ư 24

2.1 Thờ g an địa đ ểm nghiên cứu 24

2.1.1 Thời gian 24

1 ịa đ ểm 24

2.2 Vật liệu – thiết bị - hoá chất 24

1 ậ ệu a c ấ n ậ ng ệ 24

2.2.6 Dụng cụ và thiết bị 25

ơng p p 26

2.3.1 Mục đíc 26

2.3.2 Nội dung 27

2.3.3 Bố trí thí nghiệm 27

4 ơng p p ng n cứu 28

4 1 íc ng ng 28

4 ơng p p ắc cộ 30

4 ắc g ấ n a a g ap 31

4 X c định phổ hấp thụ của ắc ố 33

4 4 ể a n an p c ấ c ng ắc ố 33

iii 4 6 ơng p p / / 33

4 ể a u ắc uang p ổ ấp ụ c c đ 34

2.4.8 Xây d ng đ ờng c uẩn sắc tố 34

2.4.9 Kh o sát ho t tính kháng khuẩn của STSTLLL và STSSKC 35

2.4.10 Ho t tính kháng nấm 37

2.4.11 Ho t tính diệt sâu 39

2.4.12 Ho ín ng ế 40

Ư T QU ẬN 41

3.1 Trích ly l ng l ng 41

3.1.1 Quy trình trích ly l ng l ng 41

3.1.2 Quang phổ hấp thụ của STSTLLL 43

3.1.3 Các thành phần hóa học c và sau trích ly l ng l ng 43

3.1.4 Kh o sát phổ LC/MS/MS của STT và STSTLLL 48

3.2 Sắc cộ 52

3.2.2 Các thành phần hóa học c và sau sắc ký cột 58

3.8 Xây d ng đ ờng c uẩn sắc tố 60

3.9 Kh o sát ho t tính kháng khuẩn của STSTLLL và STSSKC 61

3.11 Ho t tính diệt sâu 69

3.11 1 ệu c ệ u 69

11 ố ng u 73

3.12 Ho ín ng ế 73

1 ể a u ắc uang p ổ ấp ụ c c đ 74

iv Ậ 77

79

Ệ 80

Ư 1

3

Ư Ắ 14

STSTLLL 14

STSSKC 15

X Ệ 16

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ồ n ố ng ệp

HPLC: High-performance liquid chromatography

LC/MS: Liquid chromatography–mass spectrometry

PG: prodigiosin

ắc ố thô

ắc ố au íc ng ng

STSSKC ắc ố au ắc cộ

vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Xác định cấu trúc của một số chất đ i diện prodigiosin 5

Bảng 1.2 nh h ởng của prodigiosin đến kh năng tồn t i của các tế bào miễn dịch 22 Bả 2.1: ố í í ng ệ ố u ung íc 30

Bảng 2.2 ã p a ãng để d ng đ ờng chuẩn STSTLLL 35

Bảng 2.3 ã p a ãng để d ng đ ờng chuẩn STSSKC 35

Bả 3.1: ị của tỉ lệ P u n c uố ã a n năng thu nhận sắc tố bằng trích ly l ng l ng 42

Bả 3.2: ịnh tính các p c ấ trong STT và STSTLLL 43

Bả 3.3 n íc c c p n n p n p g n ị n a p n íc ố p ổ E -MS 52

Bảng 3.4 Tóm tắ c c p n đ n sau sắc ký cột 54

Bả 3.5: ế u c c ng ệ p c ấ c ng STSSKC 59

Bả 3.6: K năng ng uẩn của 61

Bả 3.7 năng ng Neoscytalidium dimidiatum của 66

Bả 3.8: ế u ệ g độc ế n ng ế ung - ở nồng độ 1 µg/ml 74

Bả 3.9: u uang p ổ ấp ụ c c đ của ắc ố ờ g an 74

vii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các chất đ i diện prodigiosin 4

Hình 1.2 Cấu trúc của prodigiosin 5

Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng h p prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC 39.006, Sma 274 và các cụm sinh tổng h p undecylprodigiosin (cụ u đ từ Streptomyces coelicolor A3(2) 8

Hình 1.4 Con đ ờng đ c đề xuất cho quá trình sinh tổng h p p g n ề xuất n cũng ơng n đề xuấ đối v i undecylprodigiosin 11

Hình 1.5 ơ chế kháng tế bào ung của prodigiosin 19

H 2.1 ơ đồ thí nghiệm kh o sát ho t tính sinh học h p chất thứ cấp màu 28

H 2.2: ơ đồ íc p g n ừ can ờng nu cấ 29

Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy ch y sắc ký 32

Hình 2.4 c đục các giếng th ch của thí nghiệm kháng khuẩn 37

H 3.1 ế u u uang p ổ ấp thụ UV/VIS cho STT 42

Hình 3.2 ố p ổ E - u ừ - a u của ẫu 48

Hình 3.3 ắc đồ ẫu STSTLLL 49

Hình 3.4 ố p ổ E - của ẫu 50

Hình 3.5 n íc ố p ổ E -MS prodigiosin 51

H 3.6: c p n đ n u n ận au c ắc cộ 53

H 3 n ắc c ng ung n-hexan ac a 1 ; c khi phun thuốc th Dragendorff, B) sau khi phun thuốc th Dragendorff 55

H 3 ế u c c p n đ n au ắc cộ ằng ung u :

Acetone (7 :3 ; v :v) 56

Hình 3.9 ế u ắc n ng g a ắc ố ở ệ ung 57

Hình 3.10 ố p ổ E - u ừ - a u của ẫu 58

viii H 3.11: ờng c uẩn 60

H 3.12 ờng c uẩn STSSKC 61

H 3.13 ế u đố ng của ắc ố c ủng uẩn c ỉ ị 62

H 3.14 năng ng E coli của ắc ố c au n c 63

H 3.15 năng ng S aureus của ắc ố c au n c 64

H 3.16 ế u ng nấ Neoscytalidium dimidiatum của ắc ố 66

H 3.17 ế u ng nấ Colletotrichum p của ắc ố; 67

Hình 3.18 ệ c ế của u an a ng Spodoptera exigua uổ c ăn của ờ g an 69

Hình 3.19 ệ c ế của u an a ng Spodoptera exigua uổ c ăn STSSKC ờ g an 71

Hình 3.20 ệ g ố ng của u ng í ng ệ ờ g an73

ộ c ấ c năng u c c c ín n ọc n ức c ế ăng tr ởng của mộ số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng s , 2006), gây độc tế bào và có thể

c ống l ộ các dòng tế ung ở ng ờ nh ng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng s ,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 201 ng nấ ( an n cộng 1 ệ u gu ễn ếu n 1 ếu đ c u n n xuấ

íc p c ể ứng ụng ắc ố này vào ệc s n xuất các s n phẩm phục vụ cho

ĩn v c nông nghiệp ọc Ngoài ra, v ệc ứng dụng quá trình sinh tổng p các chấ màu vào ngành dệ may đang ngày mộ thu hút trong nh ng năm gần đây (Chidambaram và Perumalsamy, 2009), tiềm năng s ụng ắc ố đ này làm màu nhuộm cũng rấ đ c quan tâm

P g n đ c kh o sát chủ yếu khi lên men Serratia marcescens trên môi ờng peptone glycerol n ng S.marcescens lên men n ờng huyền p ù đậu

phộng ăng nồng độ prodigiosin tổng h p đ ng ể theo báo cáo của ần Quyên (2014) Tuy nhiên quy trình tinh s ch h p chất này từ can ờng huyền phù đậu phộng c a đ c mô t chi tiết Vì vậy ệc a u n n xuấ íc p

ẫn đ c c ín n ọc của p g n đang ấn đề cần đ c uan

a n cơ ở đ ng ờ c ện đề đã c ọn ng c đồ n ố ng ệp

Ti s c s c t pr di i si d vi u Serratia marcescens tổ p tr i

trườ đ u p và ả s t t tí si c của c c sả p ti s c

2

2 Mục đíc của i cứu

u n ận p g n do vi khuẩn Serratia marcescens tổng h p n ờng

đậu phộng n c kh o sát n ho t tính sinh học của các s n phẩm tinh

Prodigiosin là một tripyrrole đ c phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn l c đặc tr ng

của vi khuẩn Serratia marcescens Tên gọi “p gi n” c nguồn gốc từ

“p g u ” c nghĩa là một đ ều gì đ kỳ diệu Prodigiosin đ c tìm thấy ở d ng túi bên ngoài tế bào cũng n các tế bào liên kết, và d ng h t ở bên trong tế bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991)

Prodigiosin đ c hình thành qua hai giai đo n: 2-methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), t o nên dẫn xuất tripyrrole, đ c gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene Có rất ít thông tin về con đ ờng sinh tổng h p ở giai đo n MAP hoặc MBC, ngo i trừ việc mô t về phân t proline kết h p nguyên vẹn thành một trong nh ng nhóm pyrrole của MBC Quá trình tổng h p sắc tố này cần có không khí và phân t oxy (Williams và Qadri, 1980)

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, đ c s n xuất bởi các vi khuẩn

n Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous, Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các x khuẩn Gram d ơng chẳng h n Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces longisporus (Khanafari và cộng s , 2006)

4

Hình 1.1 Các chất đ i diện prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

1.1.2 Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin

Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của p g n đ c tổng h p bởi

Serrattia marcescens m i đ c biết đến (Rapoport và Holden, 1962) Do s tiến bộ

nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở nh ng năm tiếp theo, mà cấu trúc của prodigiosin dần đ c nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000)

Prodigiosin v i tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-ylidene)-

methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân t C20H25N3O và trọng

l ng phân t là 323,44 Da (Harris và cộng s , 2004; Song và cộng s , 2006; Williamson và cộng s , 2006)

Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, v i ba vòng pyrrole t o thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đ hai vòng đầu liên kết tr c tiếp v i nhau, còn vòng thứ ba đ c gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và Williams,

5

1972; Gerber, 1975) Cấu trúc của prodigiosin có b y liên kết đôi và đ c miêu t là

t o sắc tố m nh (Krishna, 2008)

Hình 1.2 Cấu trúc của prodigiosin (Krishna, 2008)

Prodigiosin nh y c m v i ánh sáng và không tan đ c trong n c Prodigiosin có thể tan t ơng đối trong alcohol và ether; bên c nh đ nó dễ tan trong chloroform, methanol, acetoneitrile và DMSO (Grimont và cộng s , 1977; Khanafari và cộng s , 2006)

Bảng 1.1 Xác định cấu trúc của một số chất đ i diện prodigiosin (Williams, 1973)

2-(2-pyrryl)-4,6- dimethoxypy- prodigiosene

2,10-Nonano-6- melhoxy-prodigiosene

265,5 Da

C23H33N3O

2,10-Nonano-6- Methoxy-prodigiosene

2-Undecyl-6- Rnethoxy- prodigiosene

2,4-(9-Ethylnonano) -6-methoxy- prodigiosene

274) đã đ c báo cáo (Cerdeno và cộng s , 2001)

Nhiều chủng Serratia marcescens s n xuất sắc tố thông qua hai giai đo n: 2-

methyl-3-amylpyrrole (MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), t o nên dẫn xuất tripyrrole, đ c gọi là 2-methyl-3-amyl-6- methoxyprodigiosene hoặc prodigiosin (Williams và Qadri, 1980) Dauenhauer và

cộng s (1984) đã phân lập đ c một chủng Serratia marcescens có kh năng t o

MAP và MBC, để hình thành prodigiosin Tuy nhiên, không có tài liệu nào về trình t

của dòng Serratia marcescens này đ c báo cáo

Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để th c hiện th nghiệm trong các chất

chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể h u ích đối v i việc nghiên cứu một hệ

thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi khuẩn Tách các phân t tái tổ h p mã hóa cho quá trình tổng h p prodigiosin sẽ là một cách tiếp cận để xác định s n phẩm gene và s hiểu biết về enzymology và di truyền học của

7

quá trình sinh tổng h p prodigiosin Việc tách trình t của DNA mã hóa một phần trong quá trình tổng h p prodigiosin bằng cách s dụng hệ thống nhân b n vector ở

Escherichia coli cosmid đã đ c báo cáo (Dauenhauer và cộng s , 1984)

Một cosmid có chứa ít ơn 35 kb nhiễm sắc thể của Serratia nhằm mã hóa tổng h p các sắc tố đ c biểu hiện trong Erwinia carotovora là cơ sở đầu tiên để chứng minh

rằng cụm gene sinh tổng h p prodigiosin hoàn chỉnh đã đ c nhân b n vô tính và các chức năng của nó đã đ c biểu hiện (Thomson và cộng s , 2000) Tr c nghiên cứu này, nhóm sinh tổng h p các sắc tố undecylprodigiosin (đ ), đ c s n xuất bởi

Streptomyces coelicolour A3(2), cũng đã đ c nhân b n vô tính (Tsao và cộng s , 1985) Vì Streptomyces coelicolour A3(2) Red2 đột biến đã đ c đối chiết v i prodigiosin của Serratia marcescens đột biến (Feitelson và Hopwood, 1983), việc s n

xuất undecylprodigiosin đ c cho là có con đ ờng sinh tổng h p t ơng t n con

đ ờng sinh tổng h p prodigiosin bởi Serratia marcescens Các chất sinh tổng h p màu đ của Streptomyces coelicolour A3 (2) đã đ c nhân b n d a vào nhiễm sắc thể

cosmid trên 35,7 kb nhiễm sắc thể (Malpartida và cộng s , 1990.) đ c cho là sẽ chiếm ít nhất 18 gene (Coco và cộng s , 1991; Narva và Feitelson, 1990)

Cụm gene tổng h p sắc tố của Serratia spp ATCC 39.006 đ c biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp carotovora (25 chủng trong số 36 chủng th nghiệm), mặc

dù nó đã không đ c biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc

Enterobacteriaceae, bao gồm c Escherichia coli (Thomson và cộng s , 2000) Trong Serratia ATCC 39.006 tổng h p prodigiosin đ c quy định bởi nhiều yếu tố, bao gồm

hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR (Thomson

và cộng s , 2000; Slater và cộng s , 2003) iều thú vị là việc s n xuất prodigiosin

t o thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc vào s biểu

hiện trong Erwinia carotovora sub sp carotovora, mặc dù sau này, việc s n xuất một phân t tín hiệu khác đã đ c th c hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson và cộng s ,

2000)

gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và 14 protein thể hiện kích th c

và trình t amino acid khác nhau gi a các loài (Cerdeno và cộng s , 2001)

Hình 1.3 So sánh các cụm sinh tổng h p prodigiosin (cụm pig) từ Serratia ATCC

39.006, Sma 274 và các cụm sinh tổng h p undecylprodigiosin (cụ u đ từ

Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng s , 2001)

Các cụm gene gi a Streptomyces coelicolor và Serratia có nh ng vị trí t ơng đồng

Gene quy định của các cụm màu đ đ c hiển thị trong màu đ n chịu trách nhiệm tổng h p phân n a bipyrrole là màu đ và chịu trách nhiệm tổng h p phân n a monopyrrole là màu xanh lam Các gene không có chức năng tổng h p đ c thể hiện qua màu trắng và nh ng gene không nằm trong cụm gene sinh tổng h p đ c thể hiện qua màu xám Các mũi tên đen chỉ đơn ị phiên mã của các cụm m u đ

9

Cụm pig gene trong Serratia ATCC 39.006 có chứa thêm một gene bổ sung là PigO RT-PCR v i primer extension sẽ nhận thấy có s phiên mã qua l i gi a hai

gene pigN và pigO (Slater và cộng s , 2 điều này phù h p v i pigO là một pig

operon trong chủng Cụm pig (pigA-O) trong Serratia ATCC 39.006 đ c sao chép

d i d ng polycistronic thông tin từ một promoter upstream của pigA (Slater và cộng

s , 2003) và cụm sắc tố (pigA-pigN) của Sma 247 cũng đ c sao chép d i d ng

polycistronic thông tin Có một kho ng c c đ ng kể gi a hai cụm sắc tố pigC và

pigD Kho ng cách 184 bp gi a pigC và pigD trong Serratia ATCC 39.006 cho thấy

kh năng chứa hai đơn vị phiên mã Tuy nhiên, mức độ phiên mã của các gene ở hai

bên của kho ng cách nà đã chứng minh là t ơng t n trong nghiên cứu dùng lacZ

h p v i pigA và pigH (Crow, 2001) Cụm pig trong Sma 274 có kho ng cách 64 bp

gi a pigC và pigD, nh ơn so v i Serratia ATCC 39.006, kho ng cách này không có

ý ng ĩa Cụm m u đ (gồm 23 gene) l n hơn cụm pig (14 – 15 gene), có thể ph n ánh

s phức t p hơn về các s n phẩm undecylprodigiosin đ c tổng h p bởi

Streptomyces coelicolor (Harris và cộng s , 2004)

M ời hai gene đ c l u gi gi a ba cụm, có thể mong đ i con đ ờng tổng h p cho

ra các s n phẩm t ơng t Tuy nhiên, định h ng và đ ều tiết của nó có s tha đổi rõ rệt (Slater và cộng s , 2003) Việc bố trí không giống nhau của các gene t ơng đồng trong cụm s n xuất các s n phẩm hóa học t ơng t đặt ra câu h i về nguồn gốc

và s tiến hóa prodigiosin trong cụm gene sinh tổng h p ở c vi khuẩn Gram d ơng

và Gram âm Vẫn ch a rõ liệu các loài trong cùng một họ có vai trò quan trọng nh

h ởng đến s sắp xếp không giống nhau của các gene hay s khác biệt đã phát sinh một cách ngẫu nhiên (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

S khác biệt ở các gene hiện diện trong nh ng operon có thể gi i thích s khác biệt trong ph ơng thức s n xuất và con đ ờng tổng h p sinh hóa PigD và pigE là hai pig gene không có s t ơng đồng trong cụm màu đ T ơng t n vậy, pdtorfL và pdtorfM thuộc một phần nhóm gene mã hóa tổng h p các chất kh clo (carbon

10

tetrachloride) n pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) bởi Pseudomonas stutzeri

(Lewis và cộng s , 2000) PdtorfL và pdtorfM nằm c nh nhau, giống n pigD và pigE trong cụm pig PigE t ơng t aminotransferase (SC6A5.18, 461 aa) từ

Streptomyces coelicolor A3(2), đ c mã hóa bởi một gene không liên kết v i cụm màu đ (38% giống v i PigE từ Serratia ATCC 39.600 và 39% giống v i PigE từ Sma

274; c hai đều là 50% t ơng đ ơng 460 aa) Thật vậy, nó có thể là gene mã hóa protein tham gia vào quá trình tổng h p prodigiosin và undecylprodigiosin có thể không đ c liên kết v i các cụm gene RedR, RedQ và RedP không đ c mã hóa

t ơng đồng bởi cụm pig, nh ng chúng đ c cho là chỉ đ o tổng h p acetate từ ba nguyên t carbon của vòng pyrrole và chuỗi bên undecyl của undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng s , 2001) Các gene mã hóa t ơng đồng t ơng ứng có thể có mặt t i

một vị trí trên nhiễm sắc thể Serratia hoặc các enzyme khác có thể th c hiện vai trò xúc tác cần thiết trong sinh tổng h p prodigiosin trong Serratia Tuy nhiên, prodigiosin có thể tổng h p trong s tái tổ h p gi a Escherichia coli và Erwinia đ ều này đ h i ho t động chức năng t ơng ứng của Escherichia coli và enzyme Erwinia

để bổ sung cho các ho t động của enzyme đ c mã hóa bởi các nhóm sắc tố (Harris

và cộng s , 2004)

11

Hình 1.4 Con đ ờng đ c đề xuất cho quá trình sinh tổng h p p g n ề xuất

n cũng ơng n đề xuấ đối v i undecylprodigiosin (Cerdeno và cộng s , 2001)

ời hai Red protein v i s mã hóa trong cụm pig “ õ ” là enzyme prodigiosin) có kích th c t ơng t nhau trong b n sao của Pig Một ngo i lệ là PigB (670 aa) t ơng đồng v i RedS (Sc3f7.05c), là một protein nh ơn nhiều (146 aa) và t ơng t gắn vào cuối đầu N của PigB Phần còn l i của PigB gắn v i các amine oxidase Các protein PigI và PigJ đều nh hơn RedM và t ơng đồng v i RedX (Harris và cộng

s , 2004)

PigA là trình t tổng h p một lo t các acyl-CoA dehydrogenases Chuỗi liên kết

v i human isovaleryl-CoA dehydrogenases, cấu trúc tinh thể trong đ đã đ c xác định, cho thấy rằng phần l n các acid amin xung quanh flavin và phosphopantetheinyl moiety của CoA đ c b o vệ nh ng các acid amin tham gia vào kiên kết các nhóm

12

adenisyl của CoA không đ c b o vệ (Tiffany và cộng s , 1997) ều này hỗ tr cho ý kiến cho rằng PigA là một PCP prolyl ơn là prolyl- CoA

1.2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin

Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai đo n phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng s , 2004) B n chất màu đ t ơ của prodigiosin giúp việc nghiên cứu h p chất thứ cấp này dễ dàng ơn (Chidambaram và Perumalsamy, 2009) Nhiều yếu tố, chẳng h n nh : nhiệt độ, pH, độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi tr ờng nh h ởng đến quá trình s n xuất prodigiosin (Heinemann và cộng s , 1970; Sole và cộng s , 1994; Rjazantseva và cộng

s , 1995; Williamson và cộng s , 2005)

Quá trình s n xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nh y c m v i nhiệ độ

và bị ức chế đ ng kể ở nhiệt độ cao ơn 37°C (Giri và cộng s , 4 ơn n a, môi

tr ờng thông th ờng đ c s dụng để sinh tổng h p prodigiosin bởi các chủng

Serratia marcescens là môi tr ờng phức t p và rất giàu dinh d ỡng (Yamashita và

cộng s , 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng s , 2004) Một số chất dinh d ỡng n thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng đối v i s n xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng s , 1977), adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) l i có tác dụng ức chế s n l ng prodigiosin

Giri và cộng s (2004), đã so sánh s phát triển của Serratia marcescens trên các

môi tr ờng khác nhau nh : môi tr ờng h t mè, nutrient broth và peptone glycerol broth, Các môi tr ờng cũng đ c so sánh tốc độ ăng tr ởng và kh năng xuất prodigiosin ở các nhiệ độ khác nhau Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò của các acid béo trong việc s n xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần trong h t có thể kích thích ăng mật độ tế bào và sinh tổng h p nhiều prodigiosin ơn Trên môi tr ờng peanut broth thì prodigiosin có thể tổng h p ở nhiệt độ 37oC trong khi trên các môi tr ờng n nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không có

13

bổ sung đ ờng cũng không thể làm đ c đ ều này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Quá trình s n xuất prodigiosin ở Serratia marcescens gi m bởi glucose và các

lo i đ ờng metabolizable khác do s gi m pH trong canh tr ờng nuôi cấy (Khanafari và cộng s , 2006) Bên c nh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình s n xuất sắc tố ểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ b n là môi

tr ờng này không có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose là ăng

c ờng việc s n xuất sắc tố, trong tr ờng h p s dụng môi tr ờng sesame broth thì nguồn carbon ở d ng các acid béo Maltose và glucose đ c thêm vào nutrient broth làm ăng gấp đ năng suất so v i chỉ s dụng môi tr ờng nutrient broth hoặc peptone glycerol broth iểm thứ hai là s s n xuất sắc tố đ c tăng c ờng trong trong môi

tr ờng peptone glycerol broth ở 30oC và trong nutrient broth ở 28oC, điều này có thể

là do s hiện diện của glycerol n là một nguồn carbon Rõ ràng trong th c tế nguồn carbon giúp hỗ tr ăng tr ởng tế bào và s n xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi tr ờng

l ng của Serratia marcescens cũng dẫn đến s ăng tr ởng tế bào, s n xuất

prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng s , 2001) ơn n a, prodigiosin

th ờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất ho t động bề mặt chẳng h n n SDS vào môi tr ờng nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu qu s n xuất prodigiosin (Feng và cộng s , 1982; Wei và Chen, 2005)

1.2.3 Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin

1.2.3.1 Thu nhận và tinh sạch

Các sắc tố không tan trong n c mà tan trong dầu th ờng đ c chiết xuất bằng dung môi h u cơ pha n c nh : acetonee, methanol, ethanol, hoặc các hỗn h p của các dung môi, để giúp các dung môi này ho t động tốt ơn Chiết xuất th ờng có chứa một l ng n c đ ng kể, do đó, có thể đ c lo i b bằng cách phân l p nhờ hexane,

14

petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn h p các dung môi Sắc

ký, quang phổ hấp thụ ở vùng kh kiến là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các chất màu Quang phổ sẽ đ c th c hiện, l u gi và sau đ tiến hành so sánh v i các phổ chuẩn (Amaya 2001)

Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đâ đ c đề xuất là nên th c hiện để xác định một h p chất ch a biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng s , 1994)

- ổ ến max)

- Sắc ký l p m ng (Rf)

- Sắc ký l ng cao áp (thời gian l u mẫu)

- Ph ơng pháp phổ khối (khối l ng phân t )

- NMR (chuyển hóa về mặt hóa học)

Các nhà khoa học đã th c hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh s ch prodigiosin n sau:

- Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đ c chiết xuất từ

môi tr ờng nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, v i ethanol và

petroleum ether, tiếp theo lo i b dung môi trong một cốc n c sôi (hay trong một bể cách thủy) và hòa tan phần còn l i vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980)

- Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất đ c chiết xuất

bằng acetonee, hòa v i một ít ethyl acetate, và đ c sấy khô bằng natri sulfat Các chất chiết xuất đ c hòa tan và đ c th c hiện quét từ b c sóng 200 – 700 nm Hỗn h p dung môi dichloromethane, chloroform và acetonee v i t lệ 2,5: 2,5: 0,5

đã đ c s dụng để tách một cách hiệu qu các t p chất từ chiết xuất cùng v i các sắc tố bằng sắc ký l p m ng Cột silica có kích th c từ 80 – 100 đã đ c s dụng để phân tách các t p chất không màu từ các sắc tố Mẫu tinh khiết cho thấy c độ hấp thụ cao duy nhất t i 535 nm trong quang phổ UV Nó đ c tiếp tục phân tíc để xác định trọng l ng phân t bằng việc s dụng máy quang phổ khối Các sắc tố

15

prodigiosin tinh khiết đ c đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng

l ng phân t là 324 Da (Giri và cộng s , 2004)

- Prodigiosin đ c chiết xuất bằng cách lắc môi tr ờng nuôi cấy tế bào

Serratia marcescens 2170 v i methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24ml

methanol) và dịch trong suốt đ c làm cho bay ơ trong chân không Sắc ký l ng cao

áp của các chiết xuất đ c th c hiện trên silica gel v i dung môi chloroform và methanol Các sắc tố thu đ c sẽ đ c r a gi i trong methanol và phân tích bởi

ph ơng pháp phổ khối (ESI-MS) Sau đ các sắc tố ch a tinh khiết đã thu đ c sẽ tiếp tục đ c th c hiện ph ơng pháp HPLC Một cột đ o pha Nucleosil C18 (250 x 4

1 µ đã đ c s dụng v i một gradient tuyến ín đến 100% trong 30 phút (A: 10mM amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetoneitrile) Việc r a gi đ c theo dõi bằng cách s dụng c hai máy dò UV diode-array và ESI-MS (Montaner

và Perez-Tomas, 2001; Tomas và Montaner, 2003)

- Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh tr ờng đ c lấy từ

nh ng chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đ 1 lít ethanol 95% (v:v) đã ac hóa (pH 3,0) đ c thêm vào IAB Các sắc tố đ c chiết xuất bằng cách s dụng một vòng tròn gi i hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem c đặc và

ly tâm Sau đ nó đ c thu bằng cách s dụng n c và chloroform để tách pha Prodigiosin màu đ đ vào chiếm hết chỗ ở phía d i của pha chlorof đ c cô đặc bằng cách cho bốc ơ g n đ c phân tách bằng sắc ký cột silica gel (2,5

× c đ c r a v i một hỗn h p hexane: ethyl acetate (2: 1, v:v) Các sắc tố cô đặc đã đ c tách ra bởi việc s dụng hỗn h p chloroform:methanol 95:5 (v:v) trong

au đ u đ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đ c thu nhận

và hòa tan trong acetonee Các sắc tố ch a tinh khiết sẽ tiếp tục đ c th c hiên

ph ơng pháp TLC (v i t lệ dung môi chloroform:methanol: diethyl ether là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (v i cột C18 ×1 c au đ n đ c tách r a v i hỗn h p an n c / đã đ c đ ều chỉnh pH= 3,0 bằng 0,1N

96 ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968) Khố ng phân t của chất màu tinh khiế đ c c định bằng việc s dụng quang phổ khối Các 1H- và 13C-NMR của các mẫu u đ c ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3 Các dịch chuyển a đã

đ c đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu Phổ FT-IR của các sắc tố đ c ghi nhận (Song và cộng s , 2006)

- Prodigiosin trong các môi tr ờng phân lập 2170 đ c chiết xuất từ huyền phù sắc tố v i methanol có tính acid (1 ml 1N HCl: 24 ml methanol) và sau đ ly tâm (6800 vòng trong 15 phút) Các dung môi của dịch huyền phù sau đ đã đ c bốc ơ trong điều kiện chân không Sắc ký l ng cao áp của các chiết xuất đ c th c hiện trên silica gel v i chloroform và methanol là dung môi Các phân đo n r a gi i

đ c gộp chung và chiết xuất bằng chlorofonn/ methanol bay ơ trong chân không, r a gi i v i n c đ ng khô (Montaner và cộng s , 2000) Các sắc tố đã tách

ra đ c r a gi i trong methanol và phân tích bởi phân tích bởi ph ơng pháp phổ khối (ESI-MS) s dụng một VGQuattro gấp ba lần quadrupol phổ khối Các sắc tố đã tách ra

ch a tinh s ch sẽ đ c tiếp tục s dụng HPLC Một cột đ o ng c pha Nucleosil C18

đã đ c s dụng v i một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10 mM

amoni acetate, pH 7,0, B: 100% acetoneitrile) Prodigiosin đ c thu từ S marcescens

2170 bằng cách chiết xuất methanol/ HCI đ c th c hiện sắc ký trên silica gel và tiếp tục s dụng HPLC ESI-MS đã đ a ra trọng l ng phân t là 323,4 Da, phù h p v i giá trị d kiến cho prodigiosin (C20H25N3O) Cấu trúc của prodigiosin đ c xác nhận thêm bởi quang phổ 3H-NMR (Montaner và cộng s , 2000)

- Các sắc tố đ c s n xuất bởi Serratia marcescens ∆ đã đ c tinh s ch th c hiện

NMR và phổ khố để c định cấu trúc hóa học của nó (Wei và Chen, 2005) Các sắc

17

tố đ c chiết xuất từ canh tr ờng lên men bằng methanol và sau đ n chế bằng cách s dụng một cột silica gel hexane-balanced để thu các s n phẩm mục tiêu trong cột (Cang và cộng s , 2000; Montaner và cộng s , 2000) Sau đó cộ đ c r a v i 10M ethyl acetate để gi i phóng các s n phẩm hấp thụ Màu cam sau khi r a gi i đã

đ c thu và làm khô trong máy sấy chân không ở 450o

C để có đ c nh ng s n phẩm tinh khiết (bột màu đ ) Các sắc tố thu đ c trong nghiên cứu đã đ c báo cáo là undecylprodigiosin d a trên phân tích NMR và MS, còn đ c gọi là prodigiosin

25oC, là một trong nh ng sắc tố đ đ c s n xuất bởi Serratia sp và Streptomyces sp

Nó có ho động ức chế miễn dịch và quá trình apoptosis-inducing t ơng t n prodigiosin, nh ng í đ c nghiên cứu ơn (Tomas và cộng s , 2003)

1.2.3.2 ịnh lượng

Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất t i

b c sóng 535 nm trong quang phổ UV (Giri và cộng s , 2004) Chính vì vậy, nồng

độ của các prodigiosin đ s n xuất ra đ c thu nhận trong ethanol đã acid hóa (v i 0,01 N HCI 4 ml và 96 ml methanol) sẽ đ c c tính bằng cách đ độ hấp thụ ở b c sóng 535 nm và s dụng quang phổ UV kh kiến (Goldschmidt và Williams, 1968) Tổng số các sắc tố đ c c tính theo công thức sau (Chen và cộng s , 2006; Williams và cộng s , 1960):

18

Prodigiosin có kh năng ức chế s ăng tr ởng của một số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng s , 2006) Ho t tính kháng khuẩn của prodigiosin là do kh năng thấm qua màng tế bào và kh năng ức chế các enzyme nh DNA gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế s ăng tr ởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009)

Nhiều nghiên cứu đã đ c th c hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng

một số vi khuẩn nh : Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Tuy nhiên, ho t động kháng khuẩn của prodigio n đối v i các vi

khuẩn Gram d ơng l i cao hơn so v i các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng s , 2012)

oạt t n n nấm

Theo nghiên cứu của an n cộng (2012) về kh năng ng nấm của

h p chất màu thu nhận từ chủng vi khuẩn Serratia marcescens cho thấy h p chất màu

có kh năng ng ột số loài nấ n n Candida albicans, Candida parapsilosis

và Cryptococcus sp

Tuy nhiên, prodigiosin gần n ng ức c ế đố a nấ Phytophthora

sp và Fusarium sp theo gu ễn ếu n (2013)

oạt t n i t s u

g n đ c đ a cơ ể u ẽ ấ ế ức c ế u n

p ển của ế ừ đ ẫn đến ng của u Spodoptera litura gu ễn

ếu n 1

1.3.4 Hoạt tính chống tế bào ung t ư

Prodigiosin có kh năng gây độc tế bào và có thể chống l i một lo t các dòng tế bào ung ở ng ời, nh ng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng

s ,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010) Vì kh năng gây độc chọn lọc này,

19

prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc s n xuất thuốc chống ung th Các

ho t động chống ung trong cơ thể của prodigiosin đ c chứng minh lần đầu tiên bằng nh ng tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng s , 1999) Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có kh năng ức chế s di căn bằng cách nó đã gi m s di căn trên tế bào ung phổi (Zhang và cộng s , 2005), đ ều nà đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thông ua n ều cơ c ế Các kh năng gây độc dẫn đến s t hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin chủ yếu

là do nh h ởng từ proapoptotic của chúng chống l i các tế bào ác tính Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng t con đ ờng prodigiosin gây s t hủy của các tế bào (Chia-Che

và cộng s , 2011) ơ chế kháng tế bào ung của prodigiosin đ c mô t cụ thể

n n 1 :

Hình 1.5 ơ chế kháng tế bào ung của prodigiosin (Chia-Che và cộng s , 2011)

20

Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích ho t quan trọng của quá trình t hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng s , 2004) Acid hóa nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình t hủy trong tế bào HL-60 (Yamamoto và cộng s , 2000), cũng t ơng t n prodigiosin gây ra s t hủy ở tế bào ung t ruột (Castillo-Avila và cộng s , 2005)

Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành c n đ ờng t hủy của

ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài ăng tính thấm của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c, nhằm kích ho t caspase-9 bắt đầu caspase để t o ra quá trình t hủy Prodigiosin đ c biết là tác nhân gây ra s kích thích quá trình t hủy của protein BCL-2 BAX trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng s , 2004) T ơng t n vậy, các nghiên cứu cũng

đã chứng minh tr c đó undecylprodigiosin gi m s ngăn chặn t hủy BCL-XL

nh ng nâng kích thích t hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và cộng s , 2007) Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase Survivin hoặc XIAP cao

sẽ t o ra s đề kháng, đ ều này rất phổ biến trong các tế bào ung c immer và cộng s , 2006; Altieri, 2008) Một nghiên cứu tr c đ của các tác gi thấy rằng c survivin và XIAP đều đ c gi m đ bởi s có mặt của undecylprodigiosin trong tế bào MCF-7 (Ho và cộng s , 2007)

Ngừng chu kỳ tế bào: bên c nh việc gây s t hủy của các tế bào ung th , prodigiosin cũng ngăn chặn s phát triển ung bằng cách gây ra quá trình ngừng chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào ể làm đ ều này, undecylprodigiosin làm gi m s phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế CDK4 và CDK2 (Songia và cộng s , 1997) T ơng t n vậy, prodigiosin gây ra ngừng ăng tr ởng của các tế bào Jurkat t i quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách

gi m phosphoryl hóa Rb thông qua s ức chế ho t động của kinase cyclin E-CDK2 và cyclin A-CDK2, cũng n bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003) Một nghiên cứu gần đây của Soto-Cerrato và cộng s

21

(Soto-Cerrato và cộng s , 2007) đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào cách prodigiosin

đ ều chỉnh p21CIP1/WAF1

Chống s xâm nhập và chống s di căn căn một nguyên nhân hàng đầu dẫn

đế s t vong do bệnh ung và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di căn Nh ng l i ích ch a bệnh của prodigio n đã đ c chứng minh trong một mô hình khối u ác tính

ở chuột, bằng cách gi m s di căn phổi (Zhang và cộng s , 2005) Cơ c ế ho động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng s , 2005)

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở ng ời, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung não, các khối u ác tính và bệnh b ch cầu c chế ăng sinh tế cũng n c m ứng cho tế bào t hủ đã đ c quan sát trong các dòng tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Ngoài ra, prodigiosin cũng đ c tìm thấy gây độc tế bào ung phổi và các tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng thuốc (Llagostera và cộng s , 2005)

1.3.5 Hoạt tính ức chế miễn dịch

Ho t động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên đ c mô t bởi Nakamura và cộng s , họ đã cho thấy s hiện diện của prodigiosin và

metacycloprodigiosin trong canh tr ờng nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát s ức

chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so v i các tế bào lympho B (Han và cộng s , 2001) au đó, ho động ức chế miễn dịc đã đ c chứng minh cho các chất t ơng t prodigiosin khác nh : undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprod g n …

Bảng 1.2 nh h ởng của prodigiosin đến kh năng tồn t i của các tế bào miễn dịch

(Hwanmook và cộng s , 2003)

22

Prodigiosin (nM)

p g n u n ận đ c c năng ng B.subtilis S aureus n ng ng

Sundaramoorthy và cộng s (2009), th c hiện nghiên cứu để sàng lọc nh ng

chủng Serratia có hiệu qu s n xuất prodigiosin và đã phân lập đ c chủng Serratia marcescens NY1 từ đất

Helvia và cộng s (2010), đã tối u hóa quá trình s n xuất proodigiosin bởi

Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc s dụng 6% n c th i từ công nghiệp chế

biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28oC và pH =7 trong 48 giờ Kết qu cho thấy

Serratia marcescens s n xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l

23

Antony và cộng s (2011), đã th c hiện quá trình tối u hóa s n xuất prodigiosin

bởi Serratia marcescens SU-10 và đ n giá các ho t tính sinh học của prodigiosin

Kết qu cho thấy điều kiện tối u cho việc s n xuất prodigiosin trong môi tr ờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28oC, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ Và quá trình chiết xuất prodigiosin đ c th c hiện bằng ethanol: hydrochloric acid (9,5: 0,5) hoặc acetonee: ethyl acetate (1:1) Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đ c có tác dụng ức chế tốt ở c vi khuẩn Gram d ơng và vi khuẩn Gram âm

Chandni và cộng s (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có kh năng kháng

khuẩn n Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh n Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp., ơn n a, prodigiosin có

kh năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng nhuộm, cùng v i việc không bị nh h ởng bởi acid, kiềm , chất tẩy r a, mà có thể ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu

Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành c i tiến quá trình s n xuất prodigiosin

trong Serratia marcescens Họ nhận thấy rằng trong số các môi tr ờng dầu khác nhau

thì dầu đậu phộng s n xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có thể s dụng để nhuộm bông t o ra màu đẹp

San và cộng s (2012) đã s dụng chất th i chế biến thủy s n n một nguồn

carbon và ni ơ để s n xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011 Hơn n a,

nghiên cứu của các tác gi này cũng cho thấy prodigiosin có kh năng diệt côn trùng

Nghiên cứu của Ananda và cộng s (2013) đã s dụng prodigiosin thu nhận từ

chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống l i các vi khuẩn nh Alteromonas

sp và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là kho ng 6,75 μg/ml và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu là kho ng 12,5 μg/ml Bên c nh đ Ananda và cộng s

cũng đã s dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50

kho ng 50 μg/ml

24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 T ời ia và địa điể i cứu

2.2.1.2 Sinh vật thử nghi m

Nguồn vi khuẩn chỉ thị bao gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli, do c

ỗ ị u ến ện n ọc ệ đ cung cấp

Nấm bệnh cây Neoscytalidium dimidiatum do gu ễn ị a cung cấp

ấ ện Colletotrichum sp n p ẩ đồ n ố ng ệp của uỳn p

- ũa ủy tinh;

- Chai thủy tinh 100ml;

- Erlen;

- ng nghiệm;

- ng đ ng

- ng falcon;

27

u n ận p g n do vi khuẩn Serratia marcescens tổng h p n ờng đậu

phộng n c và kh o sát ho t tính sinh học của các s n phẩm tinh s ch

Ho t tính kháng nấm

(Neoscytalidium dimidiatum , Colletotrichum sp.)

4 ng/p

ng 1 p

dịc tr

31

c c p n đ n có cùng số vệt và Rf trên b n m ng cũng n c cùng c sóng hấp thụ c c đ i

Cô quay chân không ở nhiệ độ 60oC

S n phẩm cuối cùng thể hiện tính chất sắc tố p g n đ c gọi là ắc ố au

n-Dung dịch phun phát hiện sắc ký

Dragendorff cho vế u ca đ v i alkaloid

Coomasie brillant blue G-250

ung c ắc đ c p a n ng n ắc ậ nắp n để

n ấ ung ng u n c ắc n n ởng đến ức ung au n ắc ắc đều c ờ ng p c c ắc

để ung ã a ng n ẽ c ế u ắc ố ơn

Chuẩn bị bản sắc ký

ùng c c kẻ v c đ ờng xuấ p để chấm mẫu c c p i 1cm và v ch kết thúc cách mép trên b n sắc ký 0,5 cm (Hình 2.3 u ng c m tay lên b n silicagel Dùng bút chì v ch và chấm nhẹ lên b n silicagel tránh trầ c

l p silica gel

32

Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy ch y sắc ký

Mẫu sắc tố đ c chấm lên b n sắc ký theo vị í đã đ c c định trên v ch xuấ

p ùng u n để chấm mẫu Mẫu chấm ph i gọn, không lan rộng Sau mỗi lần chấm dùng máy sấy khô vết chấ c a ơ ết dm rồi m i chấm tiếp ẫu chấm

Giấy sắc đ c để khô t nhiên trong tủ hút Tính hằng số phân bố Rf

Rf = A/B

c uấ p

1 cm