Thiết lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn serratia marcescens SH1

Serratia marcescens được biết đến là một loài vi khuẩn cơ hội, nhưng bên cạnh đó nó cũng được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học như khả năng diệt sâu, và khả

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Ts Nguyễn Hoài Hương

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan cuốn đồ án này là kết quả nghiên cứu của em, được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học thuộc khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Các kết quả, số liệu trong đồ án là hoàn toàn trung thực, chưa từng có ai công bố

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Tâm

Để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các quý Thầy cô Trường Đại Học Công Nghệ TpHCM, đặc biệt là các Thầy cô trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học đã tận tình dạy bảo cho em bao năm qua, trang bị cho em những kiến thức quý giá và tạo dựng cho em nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Hoài Hương, Cô đã luôn bên cạnh giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn cho em trong suốt quá trình triển khai nghiên cứu và hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy trong phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện và cung cấp hóa chất để em có thể thực hiện được các thí nghiệm

Và cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân

đã luôn ở bên em động viên, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua

Kiến thức còn nhiều hạn chế, chắc chắn sẽ không tránh khỏi những sai sót, em rất mong được sự thông cảm và góp ý chân thành của thầy cô và các bạn

Xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Tâm

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của để tài 3

1.3 Mục tiêu, nhiệm vụ của đề tài 3

1.4 Nội dung của đề tài 3

1.5 Phương pháp xử lí số liệu 3

1.6 Các kết quả đạt được của đề tài 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về thuốc bảo vệ thực vật sinh học 5

2.1.1 Khái niệm và phân loại 5

2.1.2 Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu 6

2.1.3 Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu 7

2.2 Mối quan hệ giữa vi khuẩn và tuyến trùng EPN 9

2.2.1 Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn 10

2.2.2 Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố diệt côn trùng 11

2.3 Giới thiệu về Serratia marcescens 12

2.3.1 Lịch sử phát hiện Serratia marcescens 12

2.3.2 Phân loại Serratia marcescens 13

2.3.3 Đặc điểm sinh lí 13

2.3.4 Đặc điểm sinh hóa 14

2.3.5 Đặc điểm phân bố 17

2.3.6 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 19

2.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens 20

2.4.1 Sắc tố 20

2.4.2 Enzyme 21

2.4.3 Biosurfactants 22

2.5 Khả năng diệt sâu của Serratia marcescens 23

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thu sinh khối 25

2.6.1 Quá trình lên men 25

2.6.2 Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện lên men 27

Trang

2.6.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 29

2.6.2.2 Ảnh hưởng của điều kiện lên men 30

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32

3.2 Vật liệu – môi trường – thiết bị sử dụng nghiên cứu 32

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

3.2.2 Môi trường 32

3.2.3 Hóa chất 32

3.2.4 Dụng cụ 33

3.2.5 Thiết bị 33

3.3 Phương pháp luận 34

3.4 Bố trí thí nghiệm 34

3.5 Phương pháp khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh chủng SH1 38

3.5.1 Phương pháp quan sát hình thái sinh lý 38

3.5.2 Thử nghiệm sinh hóa và định danh chủng SH1 bằng bộ Kit API 20E 39

3.5.3 Thử nghiệm hoạt tính enzyme 42

3.6 Phương pháp khảo sát môi trường nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 42

3.6.1 Xây dựng đường cong tăng trưởng trên môi trường cơ bản Nutrient broth 43

3.6.2 Xác định nguồn Nitơ tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescen SH1 44

3.6.3 Xác định nguồn Cacbon tốt nhất sự phát triển của Serratia marcescens SH1 45

3.7 Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy S marcescens SH1 46

3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của S marcescensSH1 47

3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện oxy lên sự phát triển của S marcescens SH1 47

3.7.3 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S marcescens SH1 47

3.7.4 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S

marcescens SH1 48

3.7.5 Xây dựng đường cong tăng trưởng của S marcescens SH1 trên môi trường mớivà điều kiện nuôi cấy mới 49

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BỆNH LUẬN 4.1 Kết quả quan sát hình thái sinh lý và các thử nghiệm hóa sinh 50

4.1.1 Quan sát hình thái, sinh lý 50

4.1.2 Kết quả hóa sinh với bộ Kit API 20E 51

4.1.3 Kết quả thử nghiệm enzyme 53

4.2 Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy S marcescens SH1 56

4.2.1 Đường cong tăng trưởng trên môi trường Nutrient broth 56

4.2.2 Ảnh hưởng của nguồn Nito lên sự phát triển của S marcescens SH1 57

4.2.3 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon lên sự phát triển của S marcescens SH1 58

4.3 Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy S marcescens SH1 59

4.3.1 Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của S marcescens SH1 59

4.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện Oxy sự phát triển của S marcescens SH1 61

4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ cấy giống lên sự phát triển của S marcescens SH1 62

4.3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung đệm lên sự phát triển của S marcescens SH1 63

4.3.5 Xây dựng đường cong tăng trưởng của S marcescens SH1 trên môi trường mới và điều kiện nuôi cấy mới 65

CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết quả 69

5.2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG

PHỤ LỤC B: XỬ LÝ THỐNG KÊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens 15

Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia 16

Bảng 2.3 Tỉ lệ các loài Serratia phân lập được từ các môi trường khác nhau 18

Bảng 2.4 Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập được từ các môi trường khác nhau 18

Bảng 3.1 Các chỉ tiêu định danh S marcescens SH1 bằng bộ Kit API 20E 40

Bảng 3.2 Hàm lượng % nitơ tổng của các nguồn nitơ 44

Bảng 3.3 Thành phần môi trường và các nguồn nitơ khảo sát 44

Bảng 3.4 Thành phần môi trường và các nguồn cacbon khảo sát 45

Bảng 3.5 Tỉ lệ và mật độ giống khảo sát 48

Bảng 4.1 Kết quả sinh hóa của bộ Kit API đối với chủng S marcescens SH1 52

Bảng 4.2 Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn nitơ 57

Bảng 4.3 Mật độ tế bào (cfu/ml) khi sử dụng các nguồn Cacbon 59

Bảng 4.4 Mật độ tế bào (cfu/ml) với các độ pH 60

Bảng 4.5 Mật độ tế bào (cfu/ml) với các điều kiện lắc 61

Bảng 4.6 Mật độ tế bào (cfu/ml) với các tỉ lệ cấy giống 63

Bảng 4.7 Mật độ tế bào (cfu/ml) với các nồng độ đệm của môi trường nuôi cấy 64

Bảng 4.8 Các thông số động học nuôi cấy S marcescens SH1 trên 2 môi trường 66

Bảng 4.9 Tính toán giá thành của 2 môi trường 67

Bảng 4.10 Chi phí sản xuất sinh khối của 2 môi trường 67

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Serratia marcescens dưới kính hiển vi 13

Hình 2.2 Khuẩn lạc của S.marcescens trên môi trường XLD 17

Hình 2.3 Khuẩn lạc của S marcescens trên NA 17

Hình 2.4 Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối 24

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S marcescens SH1 35

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát, chọn các thành phần cho môi trường tốt nhất cho sự phát triển của S marcescen SH1 36

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm, khảo sát các điều kiện nuôi cấy 37

Hình 4.1 Khuẩn lạc của S marcescens SH1 trên môi trường NA 50

Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram 51

Hình 4.3 Kết quả sinh hóa bằng bộ Kit API 20E 52

Hình 4.4 Thử nghiệm hoạt tính lipase của SH1 trên Tween 20 54

Hình 4.5 Thử nghiệm hoạt tính protease 54

Hình 4.6 Khả năng phân giải chitin 55

Hình 4.7 Đường cong tăng trưởng của S marcesces SH1 trên môi trường NB 56

Hình 4.8 Ảnh hưởng của các nguồn Nitơ lên sự phát triển của S marcescens SH1

57

Hình 4.9 Ảnh hưởng của các nguồn Cacbon lên sự phát triển của S marcescens SH1 58

Hình 4.10 Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của S marcescens SH1 60

Hình 4.11 Ảnh hưởng của Oxy lên sự phát triển của S marcescens SH1 61

Hình 4.12 Ảnh hưởng của tỉ lệ cấy giống lên sự phát triển của S marcescens SH1 62

Hình 4.13 Ảnh hưởng của việc bổ sung đệm lên quá trình lên men và phát triển của S marcescens SH1 64

Hình 4.14 Đường cong tăng trưởng của S marcescens SH1 môi trường NB và môi trường mới 65

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Từ xa xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong đời sống hằng ngày Các quá trình làm rượu, làm giấm, làm tương, muối chua… đều ứng dụng các đặc tính sinh học của các nhóm vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò của

vi sinh vật thì việc ứng dụng nó trong sản xuất và đời sống ngày càng rộng rãi và có hiệu quả hơn Ví dụ như việc chế vắc xin phòng bệnh, sản xuất kháng sinh Sử dụng

vi sinh vật trong việc tạo phân bón sinh học, thuốc bảo vệ thực vật không gây hại môi trường, làm cân bằng sinh thái

Trong tự nhiên, ngoài những vi sinh vật có lợi còn có những vi sinh vật gây hại, ví dụ như các nhóm vi sinh vật gây bệnh cho con người, động vật và thực vật, các loài gây ô nhiễm nước, thực phẩm Nhưng nếu ta nắm vững được các mặt lợi hay hại của nó, ta sẽ đưa ra được các biện pháp khoa học để phát huy những mặt lợi

và hạn chế những mặt hại do chúng gây ra

Serratia marcescens được biết đến là một loài vi khuẩn cơ hội, nhưng bên

cạnh đó nó cũng được biết đến với nhiều khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học như khả năng diệt sâu, và khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất thứ cấp do nó sinh ra…

Ngày nay để tăng năng suất và sản lượng trong trồng trọt thì người dân thường

sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng này chỉ đem lại lợi ích trước mắt mà không đảm bảo thâm canh bền vững, bên cạnh đó, những sản phẩm này làm cho đất đai ngày càng bị ô nhiễm, diệt trừ nhiều loài thiên địch có lợi cho cây trồng, mất cân bằng sinh thái trong đất và một số vi sinh vật trong đất có thể bị tiêu diệt Các thuốc trừ sâu hóa học này tồn dư rất lâu, chúng không dễ dàng bị phân hủy dẫn đến tình trạng tồn dư và tích đọng lại, ngấm sâu vào trong lòng đất và nước sẽ gây hại không những cho động vật, cây trồng mà

cả con người sống sống gần đó Nếu con người hoăc các loài động vật ăn những loại

cây trồng còn tồn đọng một lượng không nhỏ thuốc trừ sâu hóa học thì lâu dần sẽ ảnh hưởng rất tai hại đến sức khỏe của chính họ

Các ngành hoá học và công nghiệp hoá chất không ngừng phát triển và ngày càng sản xuất ra nhiều loại sản phẩm với mục đích diệt sâu – bệnh hại cây trồng Nhưng hiệu quả chỉ được trong một thời gian ngắn Sau đó, liều lượng do con người pha ngày càng tăng, các loại sâu bệnh thì ngày càng thích nghi được và lại có một cuộc tìm kiếm loại thuốc mới để diệt chúng Vòng tuần hoàn này cứ tiếp tục, lâu dần, hệ sinh thái nông nghiệp sẽ bị phá hủy và giết chết các loai thiên địch có ích và làm ô nhiễm môi trường sống của con người cũng như các loài động vật khác Trước tình hình đó, các biện pháp phòng trừ bệnh hại cây trồng bằng phương pháp sinh học “thân thiện với con người và môi trường” được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và cũng đã sản xuất được các loại sản phẩm xuất phát từ sinh học Việc sử dụng các tác nhân sinh học trong bảo vệ thực vật có tác dụng tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm thiểu bênh hại cho cây trồng, cân bằng hệ sinh thái (các loài thiên địch, vi sinh vật có lợi, dinh dưỡng…) trong môi trường đất nói riêng và trong môi trường sống nói chung mà không làm ảnh hưởng đến môi trường như các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học khác Không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người và cây trồng về trước mắt và cả lâu dài

Do đó việc ứng dụng Serratia marcescens trong bảo vệ thực vật là một triển

vọng to lớn đối với nền nông nghiệp

Bên canh đó vi khuẩn Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng sản

xuất sắc tố tự nhiên (prodigiosin) Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút được nhiều quan tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật cũng như hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992;

Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997) Ngoài ra, prodigiosin còn có thể sử dụng để tạo mùa tự nhiên trong nghành dệt may (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

Dựa trên cơ sở những lợi ích quan trọng của chủng Serratia marcescens cũng như các sản phẩm trao đổi chất của Serratia marcescens mà em chọn đề tài: “Thiết

lập môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy sản xuất sinh khối vi khuẩn

Serratia marcescens SH1”

Xác định môi trường và điều kiện nuôi cấy chủng Serratia marcescens SH1 để

thu sinh khối cực đại

- Định danh và khảo sát một số hoạt tính enzyme của chủng SH1

- Khảo sát các nguồn cacbon và nitơ phù hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1

- Khảo sát các điều kiện lên men (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống, thời

gian thu sinh khối) thích hợp với sự phát triển của Serratia marcescens SH1

- Sử dụng phần mềm excel để tính toán và biểu diễn đồ thị

- Sử dụng phần mềm staghaphics để xử lí số liệu

- Chọn được môi trường tốt nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1

- Khảo sát được điều kiện nuôi cấy (pH, điều kiện Oxy, mật độ cấy giống) tốt

nhất cho sự phát triển của Serratia marcescens SH1

 Chương 4: Kết quả và thảo luận

 Chương 5: Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1.1 Khái niệm và phân loại

Khái niệm: Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học sản xuất ra từ các loại thảo dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ các loại sâu bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra, các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật) Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành hai nhóm chính là:

- Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus

- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu thực vật

Như chúng ta đã biết, các thuốc trừ sâu hóa học có ưu điểm rõ rệt là hiệu quả diệt sâu nhanh nhưng có nhược điểm quan trọng là có độ độc cao với người và các động vật có ích (trong đó có các loài thiên địch), gây ô nhiễm môi trường Vì vậy,

do yêu cầu bảo vệ sức khỏe con người và sự trong sạch của môi trường, các thuốc trừ sâu hóa học cần được hạn chế sử dụng dần và thay vào đó là các thuốc trừ sâu sinh học

Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi trường Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu và dầu thực vật hầu như không độc với người và các sinh vật có ích Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại Do thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn

có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật sinh học

2.1.2 Ứng dụng của tuyến trùng trong diệt sâu

Tuyến trùng sống trong đất có thể ký sinh trên côn trùng đất, nên chúng là nguyên liệu tuyệt vời để sản xuất các thuốc trừ sâu vi sinh Sau khi vào đất, tuyến trùng phân tán và tấn công ngay côn trùng

Tuyến trùng xâm nhập vào cơ thể côn trùng hoặc cùng thức ăn hoặc qua lỗ thở

và hậu môn côn trùng Ở trong ruột côn trùng, tuyến trùng chui qua vách ruột đi vào

hệ tuần hoàn Ở đây, tuyến trùng sinh trưởng và phát triển khá nhanh, gây chết cho côn trùng trong 1-2 ngày

Trừ một số ít tuyến trùng sống được trong điều kiện khô dưới dạng bào nang, còn hầu hết tuyến trùng hoạt động trong điều kiện có màng nước bao quanh Vì thế, tuyến trùng chỉ tác động đến các loài côn trùng sống trong đất, nơi chúng sống lâu hơn

Trong số hàng nghìn loài tuyến trùng ký sinh ở côn trùng thì chỉ có nhóm Entomopathogenic nematodes (EPN) có khả năng vừa ký sinh vừa gây bệnh cho côn trùng, do vậy được gọi là tuyến trình ký sinh gây bệnh côn trùng Bao gồm 2

giống là Steinernema và Heterorhabditis Bình thường thì EPN sống tự do trong đất

và mang theo vi khuẩn cộng sinh Khi tìm được vật chủ (sâu hại), tuyến trùng sẽ thâm nhập vào xoang máu qua các lỗ mở tự nhiên hoặc trực tiếp qua lớp vỏ và giải phóng vi khuẩn Vi khuẩn sinh sôi, tiết protein độc, giết chết vật chủ trong vòng 24

- 48 giờ Do vậy, những tuyến trùng này được sử dụng làm tác nhân sinh học để sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng Hiện đã có 17 loài tuyến trùng thuộc giống

Steinernema và 7 loài thuộc giống Heterorhabditis thuộc bộ Rhabditida có khả

năng này Sau khi xâm nhập, chúng có khả năng gây bệnh và làm chết vật chủ trong

48 giờ Các EPN có khả năng ký sinh trên 200 loài côn trùng thí nghiệm (có một phần đời sống trong đất)

2.1.3 Ứng dụng của vi khuẩn trong diệt sâu

Côn trùng chết trong tự nhiên chiếm khoảng 80-90%, trong đó hầu hết là chết

do vi sinh vật mà vi khuẩn là loài vi sinh vật chiếm đa số Do đó, trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có tác dụng không nhỏ trong việc điều chỉnh số lượng quần thể sâu hại Trong đó một số quần thể vi khuẩn đã được sản xuất thành chế phẩm dùng để phòng trừ sâu hại rừng

Người ta đã phát hiện hàng trăm loài vi khuẩn có quan hệ với côn trùng, trong

đó có 90 loài gây bệnh cho côn trùng

Trong tự nhiên, những loài vi khuẩn gây bệnh không phải đều có thể tạo thành chế phẩm trừ sâu và cần có một số tính chất cơ bản về độ độc, tính ổn định, khả năng lây lan, tác dụng nhanh, chọn lọc tốt, có thể sản xuất hàng loạt, kinh tế và an toàn

 Một số loài vi khuẩn sinh bào tử điển hình có khả năng diệt sâu hại

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) : Phân lập lần đầu năm 1870 và trừ côn

trùng năm 1915 Đến 1971, đã có hơn 30 chủng Bt, chia thành 20 serotyp khác nhau gây hại cho 400 loài côn trùng Sản phẩm Bt diệt côn trùng có trên thị trường

từ đầu những năm 60 của thế kỷ 20 Bt là nhóm vi khuẩn háo khí, gram dương, bào tử hình que, kích thước 3-6 x 0,8-13µ, đơn hay xếp chuỗi Vi khuẩn di chuyển nhờ roi dài 6 - 8µ Bào tử hình trứng, chịu nhiệt, có kích thước 1-1,5 x 0,8 - 0,9µ

Trong môi trường, bào tử sinh tế bào dinh dưỡng hình que Hầu hết các chủng

Bt trong thời gian hình thành bào tử, đều sản sinh ra tinh thể độc delta-endotoxin ( tiền độc tố) và độc tố này được hoạt hoá trong ruột giữa do các men phân giải protein Ngoài ra, delta-endotoxin còn gây rối màng biểu mô ruột giữa, làm mất cân bằng tính thấm của tế bào, côn trùng bị liệt và chết

Delta-endotoxin còn tương tác với các liposome của màng tế bào biểu mô, làm tăng sự rối loạn màng biểu mô ruột giữa Delta-endotoxin có hiệu lực trừ sâu non cánh phấn Lepidoptera và một số loài của Diptera và Coleoptera Các thuốc thương

phẩm của Bacillus thuringiensis đều chứa bào tử và delta-endotoxin có hiệu lực trừ

nhiều loài dịch hại trong nông và lâm nghiệp

Phương thức tác động: Bacillus thuringiensis sản sinh bào tử bên, các protein

kết tinh và tạo bào tử ra trong quá trình bào tử nảy mầm Khi vào bụng côn trùng, vi khuẩn thể hiện hoạt tính trừ sâu với sâu non và trưởng thành bộ cánh vảy Lepidoptera và một số loài thuộc bộ cánh cứng Coleoptera Trong cơ thể côn trùng, tinh thể protein bị hoà tan và men protease trong ruột côn trùng biến tinh thể độc(tiền độc tố) thành 4 chất độc nhỏ hơn Các chất độc bị thuỷ phân bao vây tế bào ruột giữa côn trùng, đặc biệt phía chất nhận, nơi tạo các amino axit Quá trình này phụ thuộc vào hàm lượng của ion kali Sự tác động này tạo lỗ hổng, cho phép lựa chọn cation, làm tăng tính thấm của màng tế bào Tính thấm nước tăng, tế bào bị phồng lên thậm chí bị vỡ, phá vỡ thành ruột giữa Tính chọn lọc đặc trưng của các chủng Bt với các loài côn trùng phụ thuộc vào cường độ các chất độc bao vây các chất nhận Ngoài ra, các bào tử của Bt trong ruột côn trùng cũng tiếp tục phát triển

và sản sinh ra tinh thể độc và bào tử mới, làm tăng hiệu lực của Bt

Bt là thuốc trừ sâu có tác động đường ruột; không có tác động tiếp xúc, xông hơi và nội hấp Vào trong cơ thể côn trùng, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan, huỷ hoại các tế bào biểu mô (epithelial cell) ruột côn trùng, côn trùng chán hay ngừng

ăn và tử vong

2.2 Mối quan hệ giữa vi khuẩn cộng sinh và tuyến trùng

Theo Gouge và Snyder (2006), EPN (Entomopathogenic nematodes) là những động vật không xương sống, thuộc ngành giun tròn (Nematoda), thường được gọi là “roundworms” EPN có khả năng ký sinh gây chết côn trùng đặc biệt là côn trùng sống trong môi trường đất (do đó được gọi là tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng), đúng như tên gọi chúng chỉ gây bệnh cho côn trùng, vô hại với con người, cây trồng và vật nuôi EPN sống bên trong cơ thể vật chủ nên được gọi là “nội ký sinh” Chúng lây nhiễm cho rất nhiều loại côn trùng khác nhau sống trong đất, bao gồm cả những dạng ấu trùng của bướm, ngài, bọ cánh cứng, ruồi, dế trũi và châu chấu trưởng thành, ngay cả một số ấu trùng côn trùng có kích thước nhỏ, có vòng đời ngắn như ấu trùng muỗi, rầy nâu hại lúa Tiêu biểu là hai

họ Steinernematidae và Heterorhabditidae hiện được sử dụng như một nhóm tác

nhân phòng trừ sinh học sâu hại rất có hiệu quả trên thế giới (Poinar, 1966) Cả 2

họ này được đánh giá lây nhiễm cao, đa dạng ký chủ (Gaugler và Kaya, 1990) và với vi khuẩn cộng sinh trong ruột của chúng có khả năng gây ra nhiễm trùng huyết

cho ký chủ Các vi khuẩn cộng sinh của chi Steinernema và Heterorhabditis tương ứng thuộc chi Xenorhabdus và Photorhabdus (Boemare và cộng sự, 1997)

Ở giai đoạn IJs (infective juveniles) tuyến trùng xâm nhập vào xoang máu côn trùng và giải phóng vi khuẩn cộng sinh gây nhiễm trùng huyết ký chủ Vi khuẩn sẽ phân hủy ký chủ tạo ra thức ăn cho tuyến trùng và sản xuất các kháng sinh chống lại

sự xâm nhập của các vi sinh vật khác Các kháng sinh của vi khuẩn cộng sinh sản

xuất như xenorhabdins, xenocoumacins, hydroxystilbens và antraquinons (Li và

cộng sự, 1998; Fodor và cộng sự, 2010)

Mặc dù mối quan hệ rất cụ thể và phụ thuộc lẫn nhau giữa tuyến trùng EPN

và vi khuẩn cộng sinh của nó nhưng một số vi khuẩn phụ thuộc đã được báo cáo có liên quan đến tuyến trùng và ký chủ bị nhiễm tuyến trùng EPN Poinar (1966) đã

phân lập được Achromobacter nematophilus từ Galleria mellonella bị lây nhiễm bởi S.(Neoplectana) carpocapsae và cũng tìm thấy trong đó Alcaligenes

sp., Aerobacter sp., Proteus sp và Pseudomonas aeruginosa Thêm Alcaligenes dorans, Pseudomonas fluorescens, P maltophilia, P alcaligenes và Acinetobacter sp cũng được phân lập từ loài tuyến trùng này (Lysenko và Weiser, 1974) Các vi khuẩn khác như Escherichia coli, Ochrobactrum anthropi, Paracoccus denitrificans, Pseudomonas aureofaciens, P fluorescens Biovar B và Xanthomonas maltophilia đã được tìm thấy liên quan đến S scapterisci

(Aguilera và Smart, 1993; Aguilera và cộng sự, 1993) Ngoài ra, với chi

Heterorhadibditis đã được tìm thấy có vi khuẩn khác cộng sinh với nó, bao gồm Providencia rettgeri (Jackson và cộng sự, 1995), Ochrobactrum anthropi và O Intermedium (Babic và cộng sự, 2000)

Một loài vi khuẩn không cộng sinh từ chi Serratia, như S liquefaciens, cũng được phát hiện liên quan đến Steinernema spp và Heterorhabditis spp (Boemare

và cộng sự, 1997) Ngoài S proteomaculans thì S marcescens cũng được tìm thấy trong các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006)

Mặc dù tất cả các nghiên cứu, báo cáo sự kết hợp của vi khuẩn không cộng sinh với tuyến trùng EPN không có mô tả độc lực của các vi khuẩn liên quan, sự vận chuyển vi khuẩn của tuyến trùng vào bên trong côn trùng, làm thế nào chúng được vận chuyển hoặc mức độ liên kết giữa tuyến trùng và vi khuẩn Trong báo cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữa

Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae

2.2.1 Vai trò của vi khuẩn cộng sinh trong tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn

Trong tổ hợp cộng sinh vi khuẩn có vai trò rất lớn đối với tuyến trùng, thể hiện qua các mặt sau:

- Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Độc tố do vi khuẩn cộng sinh tiết ra một số protein độc có khả năng nhiễm xoang máu côn trùng vật chủ và làm cho côn trùng chết một cách nhanh chóng trong vòng 24 - 48 giờ Như vậy, thời gian chết của côn trùng vật chủ khác nhau còn tùy loại tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn

thuộc và cũng phụ thuộc vào loại côn trùng vật chủ nhưng thường không chậm hơn

48 giờ

- Cung cấp nguồn thức ăn cho tuyến trùng: Tuyến trùng sử dụng vi khuẩn cộng sinh vừa được giải phóng từ cơ thể chúng và sinh sôi trông xoang máu côn trùng như nguồn dinh dưỡng của chúng Nhờ đó mà IJs cũng nhanh chóng phát triển sang tuổi 4 và đạt đến tuổi trưởng thành Từ thế hệ 2, tuyến trùng chuyển sang dinh dưỡng hoạt hóa xác chết con trùng Nhờ các enzyme do vi khuẩn tiết ra mà các

mô cơ thể côn trùng trở thành nguồn thức ăn thích hợp cho tuyến trùng Từ đó thế

hệ thứ 2 của tuyến trùng tiếp tục phát triển, sinh khối các thế hệ tiếp theo Thông thường trong cơ thể công trùng, tuyến trùng có thể phát triển 2 đến 4 thế hệ, phụ thuộc vào sinh khối côn trùng làm nguồn thức ăn cho chúng

- Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: vi khuẩn cộng sinh có khả năng sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn cản tác nhân sinh học khác như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển trên xác côn trùng Nhờ vậy mà chúng bảo vệ nguyên vẹn nguồn thức ăn giành cho tuyến trùng cộng sinh của chúng

2.2.2 Vi khuẩn cộng sinh tạo ra các độc tố giết chết côn trùng

Mỗi tổ hợp tuyến trùng vi khuẩn có thể tiêu diệt một phổ khá lớn các loài côn trùng vật chủ do chúng có khả năng vượt qua các hệ thống bảo vệ của côn trùng và sản xuất các chất độc tố (toxin) để giết côn trùng bị nhiễm

Cũng giống như các vi khuẩn gram âm khác các loài Xenorhabdus spp và Photorhabdus spp có khả năng sản sinh ra nội độc tố Nội độc tố do X poinarii sinh

ra là các hợp chất lipopolisacharide của thành tế bào, các chất này gây độc đối với huyết cầu (haemocytes) của côn trùng Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa rõ ràng là chỉ một mình nội độc tố có hiệu lực giết chết côn trùng vật chủ hay còn nhiều yếu tố

khác nữa Sự gây nhiễm huyết cầu vật chủ cho phép X enorhabdus nhân nhanh số

lượng và sản sinh ra ngoại độc tố (exotoxin), các ngoại độc tố được chứng minh

trong P Luminescens (Bowen và cộng sự, 1998) và X Nematiphilus bằng cách tiêm

các dịch nuôi cấy vi khuẩn vào cơ thể côn trùng thì côn trùng sẽ chết nhanh chóng

Các vi khuẩn này sản sinh các enzyme ra ngoài tế bào, các chất này chủ yếu là

protease, lipase, chitinase

2.3.1 Lịch sử phát hiện Serratia marcescens

Serratia marcescens bắt nguồn từ sắc tố màu đỏ trên thực phẩm được nhìn

thấy đầu tiên ở thế kỷ thứ 6 trước công nguyên, khi Pythagoras báo cáo về

“máu” đôi khi xuất hiện trên bánh mì Sau đó, năm 332 trước công nguyên, những người lính của quân đội Macedonian của Alexander thấy rằng bánh mì của họ đôi khi xuất hiện máu trên đó

Năm 1800, Christian Gottfried Ehrenberg (1795–1876) phát hiện gần 100 tài liệu trong lịch sử nói đến sự xuất hiện kỳ diệu của “máu” trên thực phẩm Nhà sử học và vi sinh vật học ERL Gaughran (1969) đã phát hiện hơn 35 báo cáo lịch sử về “máu” từ bánh Thánh, trong đó sự việc như vậy ghi nhận lần đầu vào năm 1169 tại Đan Mạch

Trong bong tối và sự ẩm ướt của nhà thờ thời Trung Cổ, miếng bánh Thánh

được sử dụng trong thánh lễ thường xuyên bị nhiễm Serratia Tuy nhiên điều này

lại khiến nhiều người nghĩ rằng đó là máu của Chúa Christ và cho đó là một phép lạ (Gillen và Gibbs, 2011) Bartholomeo Bizio, một dược sĩ ở Padua (Italya) là

người đầu tiên phát hiện và đặt tên là Serratia marcescens cho nguyên nhân của

sự đổi màu kỳ lạ của bột ngô sang màu đỏ máu

Ban đầu Bizio mô tả S marcescens như là một loại nấm do ông nhìn thấy

những đốm đỏ dưới kính hiển vi Sau đó vào những năm 1850, các nhà khoa học đã

phân loại lại S marcescens là vi khuẩn

Từ những năm 1906, các bác sĩ dùng Serratia marcescens như là một điểm

đánh dấu sinh học để nghiên cứu về sự di truyền của vi sinh vật vì cho đến những

năm 1950 thì S marcescens vẫn được xem là một mầm vô hại và cũng vì màu hồng đặc trưng của S marcescens

Đến năm 1960 thì Serratia marcescens được công nhận là tác nhân gây

bệnh cơ hội ở người bởi giáo sư Scheurlen của trường đại học Strasbourg

2.3.2 Phân loại Serratia marcescens

Theo Bizio (1823), Serratia marcescens được phân loại như sau:

Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, có đường kính

khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 – 2,0 μm (David R.C., 2012)

Hình 2.1 Serratia marcescens dưới kính hiển vi (Gillen và Gibbs, 2011)

Serratia marcescens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 5 - 400C

và trong ngưỡng pH từ 5 - 9

Serratia marcescens có thể dễ dàng tìm thấy trong nước, đất, trên thực vật,

trong côn trùng, trong cơ thể người và động vật Được tìm thấy nhiều trong thực

phẩm, nhất là trong tinh bột biến tính vì đây là môi trường rất thuận lợi cho sự tăng

trưởng của S marcescens

S marcescens có thể dễ dàng di động bằng tiên mao và tiêm mao Chúng có

thể bám dính với nhau trên môi thạch thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 - 0,8%) Các cụm tế bào có chiều dài từ 5 – 30µm S marcescens cũng có thể tạo thành

một màng sinh học S marcescens có thể phát triển trong sự hiện của oxy hoặc

trong trường hợp không có oxy Chủ yếu sử dụng quá trình lên men để lấy năng lượng, có các enzyme (superoxide dismutase, calatase và peroxides) bảo vệ

nó khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi trường oxy hóa

2.3.4 Đặc điểm sinh hóa

Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNase, lipase, chitinase và gelatinase (Giri và cộng sự, 2004) Bên cạnh đó, các đặc điểm khác để xác định Serratia marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào như nuclease, protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997)

Thủy phân casein là một đặc điểm chung của S marcescens Casein là một protein kết tủa trong sữa và là cơ sở cho sản xuất phomat và một số chất dẻo S marcescens sử dụng enzyme protease ngoại bào để phá vỡ liên kết peptide (CO-NH) trong casein Ngoài ra, S marcescens còn có enzyme gelatinase ngoại

bào phân hủy gelatine

Các sắc tố màu đỏ được sản xuất bởi S marcescens được biết đến như là một

yếu tố đặc biệt mà điển hình là prodigiosin, nhưng chỉ xuất hiện trong một

số chủng

Prodigiosin có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế

bào T), vì vậy có thể S marcescens sống trong cơ thể người sẽ không tổng hợp

prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997)

Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và John,

12 Triple sugar iron Môi trường chuyển

sang acid, không sinh khí

và không sinh H2S

13 Hydrogen sulphide peoduction -

15 Ornithine decarboxylase +

Bảng 2.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Serratia (F Grimont and P.A.D Grimont,

decarboxylase

+ + + + + - + - V - - + + +

L-arabinose - + + + + + + + + + - + + - D-Dulcitol - - - + - - - - ND ND ND Lactose - V V V V V + + + + - ND + - D-Sobitol + + + V V + + - + V - + + + Sucrose + + + + + + V + V + + - + +

Trong đó: ND: không xác định; V: phản ứng thay đổi

kỳ sinh học của kim loại, thông qua việc khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng như hòa tan vàng và đồng (Pares, 1964)

- Trong côn trùng:

Sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn trùng cho thấy Serratia marcescens chiếm ưu thế (Grimont và cộng sự, 1979) Serratia marcescens được coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối với côn

trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006)

Bên cạnh đó, cũng có thể tìm thấy Serratia marcescens trong ống tiêu hóa của

người và động vật có xương sống, cũng như trong thực vật

Bảng 2.3 Tỉ lệ các loài Serratia phân lập được từ các môi trường khác nhau

(F.Grimont và P.A.D.Grimont, 2006)

Động vật

có vú

Khu vực ở của động vật

Nước

Thực vật

Bệnh nhân nhập viện

Bảng 2.4 Tỉ lệ các chủng Serratia marcescens phân lập được từ các môi

trường khác nhau (F.Grimont và P.A.D.Grimont, 2006)

Thực vật và động vật gặm nhấm

Bệnh nhân nhập viện

2.3.6 Tình hình nghiên cứu về Serratia marcescens

Năm 1997, Hejazi, A., và Falkiner đã nghiên cứu khả năng sinh enzyme

ngoại bào của Serratia marcescens Một số enzyme này đã được chứng minh là có

khả năng làm suy giảm chitin, vách tế bào chủ yếu của các loại nấm

Năm 2005, R Krausse và cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy rằng Serratia marcescens NCTC 10211 có thể làm việc như là một probiotic trong ức chế sự tăng trưởng của H.pylori, tác nhân gây viêm loét dạ dày

Năm 2006, Brigida và Itamar đã tiến hành nghiên cứu về sự đối kháng

của Serratia marcescens với Phytophthora paeasitica, cũng như ảnh hưởng của

S marcescens lên thúc đẩy tăng trưởng của cây thuộc chi cam chanh

Năm 2007, Jaiganesh và cộng sự đã thực hiện thử nghiệm kiểm soát nấm gây

bệnh trên cây lúa Pyricularia oryzae bằng cách sử dụng Serratia marcescens

2.4.1 Sắc tố (prodigiosin)

Sắc tố Prodigiosin là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp, được hình thành bởi các enzyme 2-methyl-3-amylpyrrole và 4-methoxy-2, 2’-methyl-3-amyl-6-methoxyprdigiosene (Williams và Qadri, 1980)

Prodigiosin được tổng hợp từ vi khuẩn Serratia marcescens (Han và cộng sự,

1998), được biết đến như là một yếu tố đặc biệt, nhưng chỉ xuất hiện trong một số chủng Các sắc tố thuộc nhóm này bao gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCI), uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin Trong đó khả năng ức chế miễn dịch có trong uncedylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG-HCI) (Krishna, 2008)

Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin được sản xuất bởi biogroup

A1 và A2/6, nó không được sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8 Hoặc TCT (Grimont, 1997) Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6

thường gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont,1997;Wiliams và Qadri, 1980) Prodigiosin được biết đến là có khả năng

kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thê người, có thể chúng sẽ không tổng hợp prodigiosin và

do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch (Hejazi và Falkiner, 1997) Bên cạnh đó, một sắc tố màu vàng là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic semialdehyde axit, được sản xuất nhờ sự phân cắt 3, 4 - dihydroxy axit (3,4-DHP)

do enzyme 3, 4-DHP 2, 3-dioxygenase (Trias và cộng sự,1988) Enzyme này được

kích thích bởi tyrosine trong tất cả các chủng S marcescens Tuy nhiên, hiện nay chỉ S marcescens chủng dạng sinh học A8a đã bị mất khả năng phát triển trên các

hợp chất thơm có thể sản xuất sắc tố màu vàng (Francine và Patrick, 2006)

Hoạt tính sinh học của prodogiosin:

 Hoạt tính kháng khuẩn

Prdigiosin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của một số loài vi khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006) Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là do khả năng thấm qua màng tế bảo và khả năng ức chế các enzyme như DNA gryase, topoisomerase IV… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trưởng của tế bào vi khuẩn (Ramina và Samira, 2009)

Nhiều nghiên cứu đã thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể kháng

được nhiều vi khuẩn như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes, Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự,

2012)

 Hoạt tính chống tế bào ung thư

Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng

tế bào ung thư ở người, nhưng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng sự, 2009; Perez- Tomas, 2010) Vì khả năng gây độc chọn lọc này, prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thư

Các hoạt động chống ung thư trong cơ thể của prodigiosin được chứng minh lần đầu tiên bằng những tác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7 hepatocarcinoma xenografted Một mô hình khối u ác tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thư phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thư thông qua nhiều cơ chế

Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng

tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở người, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận, buồng trứng, ung thư não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu Ức chế tăng sinh tế bào cũng như cảm ứng cho tế bào tự hủy đã được quan sát trong các dòng tế bào này (Chidambaram và Perumalsamy, 2009)

 Hoạt động ức chế miễn dịch

Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên được mô tả bởi Nakamura và cộng sự Họ cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và

metacycloprodigiosin trong canh trường nuôi cấy Serratia và quan sát sự ức chế

chọn lọc sự phát triển của các tế bào T đa giá so với các tế bào B (Han và cộng sự, 2001) Sau đó hoạt động ức chế miễn dịch đã được chứng minh cho các chất tương tự prodigiosin khác như undecylprodigiosin, cPrG, MAMPDM, nonylprodigiosin và tổng hợp tương tự PNU156804.cPrG.HCl, MAMPDM và prodigiosin thấy sự ức chế tăng sinh tế bào T đa giá so với các tế bào B in vitro trong tế bào lá lách chuột Prodigiosin ức chế sự tăng sinh của tế bào lympho kích thích với concanacalin A, chống CD3 và chống CD28, hoặc phorbol myrisate

và ionomycin Những kết quả này cho thấy prodigiosin ức chế cả thụ thể tế bào

T phụ thuộc và tăng sinh độc lập với các tế bào (Pandey và cộng sự, 2007)

2.4.2 Enzyme

Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme như protease, chitinase, lipase, DNase, gelatinase phytase…

Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải

có chứa chitin trong quá trình sản xuất thủy sản đóng gói, cũng như kiểm soát sinh

học đối với sâu và nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nước…(Joshi và cộng sự,

1989)

Enzyme chitinase

Chitinases có tiềm năng to lớn cho công nghệ sinh học ứng dụng và có thể được sử dụng như tác nhân kiểm soát sinh học chống lại nấm bệnh cũng sâu bệnh trong nông nghiệp (Jones và cộng sự, 1986; Kobayashi và cộng sự, 2002; Pan và cộng sự, 2006) Một số chi của vi khuẩn bao gồm Serratia (Suzuki và cộng sự,

2002, Enterobacter ( Chernin và cộng sự, 1995) có thể sản xuất enzymes

chitinolytic ở mức cao Serratia marcescens là một trong những yếu tố làm suy giảm chitin Nhiều chitinases đã báo cáo là được sản xuất từ S marcescens, chẳng

hạn như chiA, ChiB, và ChiC (Watanabe và cộng sự, 1997), và một loại protein chitin ( CBP21 ), CBP21 tìm thấy là cần thiết cho việc phân giải chitin (Vaaje - Kolstad và cộng sự, 2005 ) Chitinases từ vi khuẩn đã được sử dụng trong việc kháng nấm bệnh như Rhizoctonia solaniand Aspergillus parasiticus (Chernin và cộng sự, 1995)

Enzyme phytase

Phytase là một enzym ngoại bào có thể xúc tác cho quá trình thủy phân acid

phytic và monophosphate vô cơ làm giảm phhosphate myoinositol Serratia marcescens là một vi sinh vật có thể tiết phytase được phân lập từ đất cây họ đậu và

có thể sản xuất phytase Phytases có thể phân hủy phytate, đó là dạng tồn tại của phosphate trong các nhà máy Ứng dụng phytase có thể giảm phốt pho thải lên đến 50%, một ứng dụng mà sẽ góp phần đáng kể đối với bảo vệ môi trường Một loạt các phytases được phát hiện và đặc trưng trong 10 năm qua Phytase cũng đã được

phát hiện trong nhiều vi khuẩn như Aerobacter aerogens, Pseudomonas sp., E.coli, Bacillus subtilis, Serratia marcescnes

2.4.3 Biosurfactants

Biosurfactants là một nhóm cấu trúc đa dạng của amphipathic hoạt động bề mặt các phân tử với cả hai vùng ưa nước và kỵ nước Hầu hết các bề mặt của vi sinh

vật là các phân tử phức tạp, bao gồm các cấu trúc khác nhau như: lipopeptides, glycolipid, khu phức hợp polysaccharide-protein, axit béo và phospholipid

Trong vài thập kỷ qua, biosurfactants đã được sự chú ý bởi vì chúng thể hiện một số lợi thế qua tổng hợp hóa học bề mặt Lợi thế như vậy bao gồm phân hủy sinh học, độc tính thấp, cân bằng sinh thái và khả năng được sản xuất từ chất tái tạo rẻ

hơn (Mohan và cộng sự, 2006) và hiệu quả tại các giá trị nhiệt độ và pH cực đoan

(Cameotra và Makkar, 1998) Phạm vi ứng dụng công nghiệp của biosurfactants bao gồm tăng cường thu hồi dầu, khoan dầu thô, dầu phế thải, xử lý sinh học của các chất ô nhiễm, chăm sóc sức khỏe và chế biến thực phẩm (Hickey và cộng

sự, 2007; Ghojavand và cộng sự, 2008)

Hầu như các chủng S marcescens, từ các chủng sinh sắc tố và các chủng không sinh sắc tố đều có thể sản xuất biosurfactants Biosurfactants được S marcescens sản xuất với số lượng lớn ở nhiệt độ 300C, nhưng không sản xuất được

ở 370C trong pha cân bằng của quá trình tăng trưởng Ba aminolipids, từ W1 đến W3 có các hoạt động làm ướt và đã được phân cách bởi sắc ký lớp mỏng (Matsuyama và cộng sự, 1986) Trong đó, W1 được xác định là serratamolide, một cyclodepsipeptide trước đó phát hiện bởi Wasserma và các cộng sự (1961)

S marcescens đã được khảo sát cho sự tăng trưởng và khả năng gây bệnh của

nó trong các ấu trùng sâu bướm sáp (Galleria mellonella) Tất cả các chủng gây bệnh cho ấu trùng của G mellonella dẫn đến tử vong trong vòng 48 giờ Chủng đã được chứng minh có một gen mã hóa protein metalloprotease serralysin Gen mã hóa protein metalloprotease được xác định là góp phần vào quá trình gây chết côn

trùng (Tambong., J.T, và cộng sự, 2014)

S marcescens được biết đến với khả năng tiết nhiều enzyme ngoại bào như chitinase, lecthinase, hemolysin, lipase, protease, nuclease Mặc dù S marcescens

có thể sản xuất nhiều protease khác nhau, trong đó có metalloprotease kẽm,

serralysin Meada và cộng sự năm 1995 báo cáo rằng serralysin đóng một vai trò

quan trọng trong sinh bệnh học của sinh vật này Nghiên cứu đã chứng minh serralysin nhanh chóng làm suy giảm một loạt cấu trúc protein và huyết thanh Theo

đó, protease vi khuẩn như serralysin đóng một vai trò quan trọng như một yếu tố

độc lực (Yutaka Kida và cộng sự, 2007)

Serratia marcescens còn được biết đến với khả năng lây nhiễm cho trứng, ấu trùng, nhộng và sâu trưởng thành của loài heliothines-thuộc chi bướm đêm gây hại

cho nông nghiệp (Sikorowski và Lawrence, 2009)

Ấu trùng lớn tuổi bị nhiễm vi khuẩn thường bộc lộ phản ứng là giảm các kích thích bên ngoài, và cái chết xảy ra một hoặc hai ngày sau đó Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào trong đường máu của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng huyết và gây tử vong

Theo kết quả nghiên cứu của Estrada và cộng sự năm 2012 thì ấu trùng bị nhiễm trở thành màu đỏ sau khi chết, và tỉ lệ sống sót của những ấu trùng bị nhiễm

là rất ít Một số ấu trùng bị nhiễm trong giai đoạn cuối của ấu trùng thì sau khi hóa nhộng nó cũng sẽ bị chết do nhiễm khuẩn và khi chết nó cũng xuất huyết có màu đỏ

của S marcescens Đến giai đoạn sâu trưởng thành, nó có thể được lấy nhiễm bằng

cách cho ăn thực phẩm bị ô nhiễm, các vi khuẩn sẽ xâm nhập vào các mô của côn

trùng và gây chết Serratia marcescens có khả năng lây nhiễm và loại bỏ cao đối với bộ H Zea và H virescens

Serratia marcescens còn có thể kết hợp với một số loại tuyến trùng hay giun tròn để gây bệnh cho côn trùng ví dụ như: O Carolinensis kết hợp với Serratia marcescens gây bệnh côn trùng trên lớp biểu bì bên ngoài của nó

Ngoài ra cũng có thể tạo được mối quan hệ nhân tạo giữa vi khuẩn và các tuyến trùng, bằng cách trộn chung tuyến trùng với vi khuẩn và nuôi chúng trong

một khoảng thời gian Cũng trong nghiên cứu của Estrada và cộng sự, năm 2012 thì khi Steinernema carpocapsae kết hợp với S marcescens mang đến hiệu quả diệt

100% ấu trùng Galleria mellonella chỉ sau 48 giờ Mặc dù vậy sự tồn tại của S marcescens cũng không ảnh hưởng đến vi khuẩn cộng sinh X Nematophila

2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thu sinh khối

2.6.1 Quá trình lên men thu sinh khối

Hình 2.4 Quy trình công nghệ lên men thu sinh khối

Thuyết minh quy trình:

 Chuẩn bị môi trường:

Nuôi cấy vi sinh vật ở bất cứ quy mô nào (phòng thí nghiệm, nhân giống cấp

1, 2, 3 hay trong nồi lên men) đều phải đảm bảo đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động nhân sinh khối cũng như tạo sản phẩm Tính chất và thành phần của môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào nhu cầu của vi sinh vật cũng như thích hợp cho việc thu hồi sản phẩm sau lên men

 Nhân giống

Trong sản xuất, việc hoạt hóa giống và thường xuyên kiển tra chất lượng của giống là điều hết sức cần thiết và không thể thiếu Muốn làm tốt khâu này cần phải tiến hành các việc sau:

- Kiểm tra độ thuần khiết của giống trong lên men

- Kiểm tra khả năng biến đổi của giống

- Hoạt hóa giống sau một thời gian sử dụng

Để hoạt hóa giống người ta thường sử dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất kích thích sinh trưởng như cao nấm men, hỗn hợp vitamin, acid béo

Thu hồi sản phẩm

Giống vi sinh vật

Nhân giống cấp 1,2,3 Lên men

Khử trùng môi trường Chuẩn bị môi trường

- Giữ giống bằng phương pháp thích hợp để có thể duy trì những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hóa giống, mất hoạt tính

Mục đích của việc nhân giống là để tăng sồ lượng tế bào vi sinh vật Trong quy trình lên men, thì tùy chủng giống vi sinh vật khác nhau mà cần nhân theo cơ chất và môi trường nhân khác nhau

Trong công nghiệp, người ta thường nhân với lượng lớn sinh khối vi sinh vật như sau:

- Giai đoạn trong phòng thí nghiệm (nhân giốn cấp I)

Đây là giai đoạn cấy giống vi sinh vật thuần khiết từ ống giống, đem nhân ở môi trường sinh dưỡng chuyên tính vô trùng, nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ lượng giống cần thiết cho bước tiếp theo

- Giai đoạn ở xưởng (nhân giống sản xuất)

Đây là giai đoạn cần nhân một lượng giống lớn để đáp ứng cho khâu giống trong sản xuất Từ giống cấp 1,2,3 nhân trong nồi lên men hay trong cơ chất đặc (chất mang)

 Khử trùng môi trường

Môi trường trước khi đưa vào cấy giống phải được khử trùng để diệt hết các vi sinh vật cũng như các mầm sống nhằm đảm bảo trong khi nuôi cấy vi sinh vật sẽ không bị tạp nhiễm các chủng loài khác Quá trình thanh trùng sẽ diễn ra trong các nồi áp suất cao Môi trường trong các bình nhỏ như bình tam giác hay bình thủy tinh được thanh trung trong nồi áp suất riêng, còn môi trường lớn sẽ thanh trùng trong nồi lên men

 Lên men

Phương pháp lên men phụ thuộc vào các đặc điểm sinh lý của vi sinh vật nuôi cấy đối với oxy, người ta coi quá trình đó là hiếu khí, kị khí hay kị khí không bắt buộc Để phù hợp với các đặc điểm sinh lý đó sẽ có các phương pháp lên men phù hợp

- Phương pháp lên men bề mặt: Thường vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (hay là phát triển trên môi trường dịch thể trong bình nuôi) Phương pháp này thì oxy sẽ được cung cấp trực tiếp từ không khí

- Phương pháp lên men chìm

Trong phương pháp nuôi cấy này, các vi sinh vật phát triển trong môi trường dịch thể, đối với các vi sinh vật kị khí thì người ta không cấp khí, còn đối với các vi sinh vật hiếu khí người ta cấp oxy cho vi sinh vật phát triển Tùy theo nhu cầu oxy của từng loại vi sinh vật mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường, ví dụ như tăng cường lượng khí cấp, sử dụng cánh khuấy với các tốc độ khác nhau

Trong quá trình lên men ta sẽ điều chỉnh nhiệt độ, pH và điều kiện oxy phù hợp với sự phát triển của chủng vi sinh vật

2.6.2 Ảnh hưởng của môi trường và điều kiện lên men

Quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn được chia thành 4 giai đoạn: pha tiềm phát (pha lag), pha tăng tốc (pha log), pha cân bằng và pha suy vong

- Pha Lag (tiềm phát): Pha này được tính từ khi bắt đầu cấy đến khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh Trong thời gian này vi khuẩn dần dần làm quen với môi trường và thích nghi với môi trường Ở giai đoạn này vi khuẩn mới bắt đầu sinh sản với tốc độ chậm Thời gian của pha này phụ thuộc vào sự thích nghi của vi khuẩn đối với môi trường

- Pha Log (tăng tốc): Pha này là pha tăng trưởng mạnh nhất Tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh nhất và sinh khối tế bào được tạo thành theo cấp độ lũy thừa Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao Tế bào sinh ra nhanh, lượng cơ chất giảm mạnh và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra

- Pha cân bằng: việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần Trong pha cân bằng, quần thế vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, ở pha này thì lượng tế bào sinh ra bằng lượng tế bào chết đi, sinh khối sinh ra không tăng lên

và cũng không giảm.Vì vậy khi nồng độ cơ chất giảm thì tốc độsinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm

Nguyên nhân tồn tại pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất (như axit hữu cơ) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng trong môi trường Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và sốlượng các chất dinh dưỡng sử dụng vào điều kiện nuôi cấy Đó là sự sai khác giữa sốlượng vi khuẩn cực đại và khối lượng

vi khuẩn ban đầu

- Pha suy vong: Trong pha này lượng tế bào ngày càng già và chết đi, sự cân bằng bị phá vỡ, ngoài sự biến đổi về số lượng tế bào còn có sự biến đổi về kích thước

Từ việc đánh giá được sự phát triển của các pha, ta có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Nhìn vào đường cong sinh trưởng của vi khuẩn ta có thể thấy rõ vi khuẩn phát triển mạnh nhất ở giai đoạn nào và thời điểm nào là thu được số lượng sinh khối lớn nhất

Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy (như các chất dinh dưỡng cần thiết) và các điều kiện nuôi cấy như nhiệt

độ, pH, điều kiện thông khí, thời gian nuôi cấy…

Vấn đề đặt ra ở đây đó là nên thu sinh khối ở giai đoạn nào là tốt nhất và chất lượng nhất, bởi chọn thời điểm lấy sinh khối nhằm tạo điều kiện cho quá trình phát triển sau này Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng thì sẽ có nhiều tế bào già và chết Theo một số tài liệu nghiên cứu thì sinh khối nên được lấy ra ở thời điểm đầu pha cân bằng là tốt nhất

2.6.2.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của S marcescens

Môi trường nuôi cấy là nguyên liệu cung cấp nguồn dinh dưỡng cho các quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào và các quá trình trao đổi năng lượng của vi sinh vật

Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật đó Vi khuẩn muốn sinh trưởng và phát triển tốt thì trong môi trường phải có đầy đủ các thành phần chủ yếu như C, H, N,

và O

Ảnh hưởng của nguồn cacbon:

Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các hợp chất chứa cacbon Trong cơ thể vi sinh vật cacbon chứa 50% khối lượng khô,

và nó được tổng hợp từ các hợp chất hữu cơ hoặc CO2, vì vậy vấn đề chuyển hóa các nguồn thức ăn cacbon thành các thành phần hữu cơ của tế bào vi sinh vật chiếm

vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Serratia marcescens có thể sử dụng được nhiều loại hydrocacbon như sucrose,

manitose, maltose, glucose…

Ảnh hưởng của nguồn nitơ:

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần Nitơ trong quá trình sống để xây dựng tế bào Trong cơ thể vi sinh vật nitơ chiếm khoảng 14 % khối lượng khô của tế bào Nó góp phần vào việc tạo thành các axit amin, nucleotit của axit nucleic và coenzyme, vì vậy nitơ có vai trò không thể thiếu được trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Lựa chọn một nguồn nitơ thích hợp sẽ góp phần thúc đẩy quá trình phát triển

của S marcescens

2.6.2.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của Serratia marcescens

Ảnh hưởng của pH:

Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn Nếu

pH không thích hợp, vi khuẩn có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt

S marcescens có thể phát triển trong khoảng pH rộng từ 5-9, nhưng ứng với

các môi trường thì S marcescens sẽ phát triển tốt ở các ngưỡng pH nhất định

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, sản phẩm của quá trình lên men sinh ra cũng làm giảm pH môi trường Do đó, nó cũng gây ức chế tới sự phát triển của vi khuẩn

Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ môi trường với vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, vì nhiệt độ không chỉ đơn thuần ảnh hưởng đến cường độ phát triển của từng loại vi sinh vật

mà chính là khả năng sinh trưởng của chúng ở nhiệt độ đó Mỗi loại vi sinh vật đều

có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tối thích và tối đa mà chúng có thể chịu được khác nhau

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật

Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

S marcescens có thể phát triển ở ngưỡng nhiệt độ khá rộng từ 5 - 400C

Ảnh hưởng của Oxy:

S marcescens là vi khuẩn kị khí tùy nghi nên nó có thể sống được cả trong môi

trường hiếu khí và kị khí Nhưng nó phát triển tốt nhất trong môi trường hiếu khí

Trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn cần hô hấp

để sinh trưởng và phát triển Vì thế trong nuôi cấy, ta cần kiểm tra khả năng sử dụng oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp

Ảnh hưởng của mật độ cấy giống:

Mật độ cấy giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn Nếu mật độ cấy giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp Nếu mật độ cấy giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng Vì vậy chọn mật độ cấy giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men