Phân lập nấm paecilomyces spp và xác định một số đặc điểm sinh học, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brasil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng, tuyến trùng tron

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Phùng Lê Kim Yến MSSV: 1051110195 Lớp: 10DSH02

TP Hồ Chí Minh, 7/2014

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các nội dung nghiên cứu

và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào trước đây Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Phùng Lê Kim Yến

Lời cám ơn đầu tiên em xin chân thành gửi đến tập thể Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố

Hồ Chí Minh đã giảng dạy kiến thức và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt 4 năm đại học

Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô Nguyễn Thị Hai người đã tận tình dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ, hướng dẫn em có những hiểu biết nhiều hơn về kiến thức chuyên ngành để em có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Em xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người đã nhiệt tình hỗ trợ về thiết bị, vật tư giúp đỡ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Em xin cám ơn anh Ngô Văn Bình đã tạo điều kiện, giúp đỡ em có thể thực hiện các thí nghiệm để hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Em cũng cám ơn các bạn ở phòng thí nghiệm và đặc biệt là những người bạn trong nhóm ESS đã động viên, giúp đỡ tôi

Và lời cám ơn chân thành, sâu sắc nhất con xin dành cho Ba Mẹ, người đã theo dõi, ủng hộ và nuôi con khôn lớn đến ngày hôm nay Cám ơn gia đình đã luôn chia sẻ và tạo mọi điều kiện để con hoàn thành từng chặng đường học vấn của mình

MỤC LỤC

DANH M ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH M ỤC CÁC BẢNG

DANH M ỤC CÁC HÌNH

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1 1 Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp 3

1.1.1 Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 3

1.1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái 3

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái 4

1.1.1.4 Độc tố của nấm Paecilomyces spp 6

1.1.1.5 Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp đối với ký chủ 7

1.1.2 Các chủng nấm Paecilomyces spp đã được phân lập 11

1.1.3 M ột số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp vào thực tiễn đời sống 13

1.1.3.1 S ản xuất enzyme 13

1.1.3.2 Sản xuất kháng sinh và hợp chất thứ cấp 14

1.1.3.3 Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật 15

1.1.3.4 Xứ lý môi trường 15

1.1.4 Một số sản phẩm của Paecilomyces spp 16

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp 17

1.3 Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp trong phòng trừ bọ phấn và tuyến trùng gây hại 20

1.3.1 Tổng quan về bọ phấn trắng 20

1.3.1.1 Phân loại khoa học 20

1.3.1.2 Đặc điểm sinh thái 21

1.3.1.3 Đặc điểm hình thái 22

1.3.1.4 Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra 23

1.3.2 Tổng quan về tuyến trùng 24

1.3.2.1 Phân loại khoa học 25

1.3.3 Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu 34

2.2 Thi ết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 34

2.2.1 Thiết bị - hóa chất 34

2.2.1.1 Thi ết bị 34

2.2.1.2 Hóa ch ất 34

2.2.2 Vật liệu 35

2.2.3 Các môi trường sử dụng 35

2.2.3.1 Môi trường phân lập ban đầu PDA (Potato D - Glucose Agar) 35

2.2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất 35

2.2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất 36

2.2.3.4 Môi trường Czapeck - Dox 36

2.2.3.5 Môi trường Malt agar 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3.1 Phân lập nấm Paecilomyces spp 37

2.3.1.1 Phân lập nấm Paecilomyces spp từ chế phẩm 37

2.3.1.2 Phân lập nấm Paecilomyces spp từ bọ phấn trắng 37

2.3.2 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của Peacilomyces spp 38

2.3.2.1 Xác định hoạt tính enzyme chitinase 38

2.3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme protease 38

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của của nấm 39

2.3.3.1 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces 39

2.3.3.2 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces spp trong các môi trường khác nhau 40

2.3.3.3 Kh ảo sát ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp 41

2.3.4 Đánh giá khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1 và sp2 41

2.3.5 Đánh giá khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp. 42

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 42

3.1 Phân lập nấm 44

3.1.1 Phân lập nấm có nguồn gốc từ chế phẩm xử lý đất 44

3.1.2 Phân l ập nấm Paecilomyces sp2 45

3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Paecilomyces phân lập được 46

3.3 Định tính hệ enzyme ngoại bào có khả năng đối kháng tuyến trùng và bọ phấn 50

3.3.1 Khả năng tổng hợp enzyme protease của 2 chủng nấm Paecilomyces50 3.3.2 Khả năng tổng hợp enzyme chitinase của 2 chủng nấm Paecilomyces sp1 và sp2 52

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sự phát triển của nấm 54 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển nấm của chủng nấm Paecilomyces spp 54

3.4.1.1 Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1 54

3.4.1.2 Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp2 56

3.4.2 Kh ảo sát sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp 58

3.4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp1 58

3.4.2.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển c ủa nấm Paecilomyces sp2 61

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm 64

3.4.3.1 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp1 64

3.4.3.2 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp2 66

3.5 Khả năng ký sinh bọ phấn của 2 chủng Paecilomyces sp1 và sp2 68

3.6 Khả năng ký sinh con cái và tuyến trùng Meloidogyne spp của 2 chủng nấm Paecilomyces 70

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72

4.1 K ết luận 72

4.2 Đề nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

STT BẢNG NỘI DUNG TRANG

Paecilomyces spp đối với tuyến trùng hại thực vật

29 - 31

2 3.1 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp1 45 - 46

3 3.2 So sánh hình thái của chủng nấm Paecilomyces sp2 47 - 48

4 3.3 Kết quả sinh tổng hợp enzyme protease của 2 chủng

6 3.5 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm

Paecilomyces sp1 qua các ngày

54

7 3.6 Sự ảnh hưởng của pH đến đường kính nấm

Paecilomyces sp2 qua các ngày

56

8 3.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát

triển đường kính nấm Paecilomyces sp1 qua các

ngày

58

9 3.8 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát

triển đường kính nấm Paecilomyces sp2 qua các

ngày

61

10 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự phát

triển đường kính của Paecilomyces sp1

63

11 3.10 Số liệu sự phát triển của nấm dưới các điều kiện 66

Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp

6

4 1.4 Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả

6 1.6 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát

7 1.7 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng 21

8 1.8 Đặc điểm tuyến trùng hại rễ được quan sát dưới kính

9 1.9 Vòng đời của tuyến trùng hại rễ

27

11 2.2 Các lọ thủy tinh dùng để bố trí thí nghiệm 38

12 3.1

Dịch chế phẩm được trang ra đĩa PDA ở nồng độpha

13 3.2 Nấm nghi ngờ mọc lên từ bọ phấn trên môi trường

14 3.3 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp1 50

15 3.4 Sự phân giải casein của chủng Paecilomyces sp2 50

16 3.5 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp1 52

17 3.6 Sự phân giải chitin của chủng Paecilomyces sp2 52

18 3.7 Sự phát triển của Paecilomyces sp1 trên môi trường có

19 3.8 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp1 ở các

pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy 54

20 3.9 Nấm Paecilomyces sp2 ở pH 5,6,7,8 14 ngày sau cấy 55

21 3.10 Đường kính tản nấm chủng Paecilomyces sp2 ở các

pH môi trường 5, 6 ,7, 8 qua các ngày nuôi cấy 56

22 3.11

Nấm Paecilomyces sp1 ở ngày thứ 14 sau khi cấy

57

23 3.12

Sự phát triển của Paecilomyces sp1 trên các môi

trường khác nhau qua các ngày 59

24 3.13 Nấm Paecilomyces sp2 ở ngày thứ 14 sau khi cấy 60

25 3.14 Sự phát triển của Paecilomyces sp2 trên các môi

26 3.15 Tản nấm Paecilomyces sp1 ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 63

27

3.16

Sự phát triển của Paecilomyces sp1 ở các điều kiện

28 3.17 Tản nấm Paecilomyces sp2 ở ngày thứ 14 sau nuôi cấy 65

29 3.18 Sự phát triển của Paecilomyces sp2 ở các điều kiện

Tuyến trùng được soi bằng kính hiển vi sau khi bị gây

nhiễm bởi nấm Paecilomyces sp2 70

L ỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là đất nước của nền nông nghiệp và nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên thích hợp cho nhiều mầm bệnh sinh sôi nảy nở Trong số đó có bệnh héo lá

do bọ phấn trắng và bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra Hai mầm bệnh ấy đang mang lại những tổn thất nặng nề về sản lượng nông nghiệp hiện nay Vì vậy, việc tìm ra giải pháp để kiểm soát hai tác nhân gây bệnh này rất quan trọng Đa số người nông dân hiện nay thường dùng các loại thuốc hóa học để phòng trừ các loài gây hại này Tuy nhiên, thuốc hóa học không những để lại tồn lưu cao trong nông san3anh3 hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, đến môi trường sống mà còn tăng tính kháng thuốc của sâu hại, làm cho việc phòng trừ ngay càng khó khăn hơn Vì vậy, hiện nay người ta đang tìm kiếm các tác nhân sinh học để sử dụng thay thế một phần hoặc hoàn toàn thuốc hóa học trong quản lý các loài sâu bệnh và tuyến trùng gây

hại

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như

Úc, Brasil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm

ký sinh côn trùng, tuyến trùng trong phòng trừ các loài gây hại đã mang lại hiệu quả cao (Burges H D., 1998; Butt T M and Copping L., 2000) Trong đó, Paecilomyces

là một trong những loài nấm tiềm năng đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này

vẫn còn khá hạn chế Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên quyết định chọn nghiên

cứu đề tài: "Phân lập nấm Paecilomyces spp và xác định một số đặc điểm sinh

h ọc, khả năng phòng trừ bọ phấn trắng, tuyến trùng của các chủng thu nhận được"

2 M ục đích nghiên cứu

Phân lập được các chủng Paecilomyces spp và bước đầu đánh giá khả năng

ký sinh của các chủng Paecilomyces spp phân lập được trên bọ phấn trắng, tuyến

trùng nhằm phòng trừ bệnh hại thực vật

3 Nội dung nghiên cứu

− Phân lập các chủng Paecilomyces từ chế phẩm và bọ phấn trắng thu thập

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1 1 Phân lập và tuyển chọn nấm Paecilomyces spp

1.1.1 Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces

1.1.1.1 Phân loại khoa học

Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa (mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu khác Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng

1.1.1.2 Đặc điểm sinh thái

Nấm Paecilomyces spp có rất nhiều loài, có phổ ký sinh côn trùng rất rộng,

cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002) Ngoài ra, có thể tìm thấy loài

nấm này ở các loại đất nông nghiệp (Brand et al., 2010) Chúng hiện diện ở những

nơi khá ẩm ướt, trong đất, không khí, trong phòng thí nghiệm hay ngoài tự nhiên

Ký chủ của nấm bao gồm hơn 25 họ côn trùng và nhiều loại ve khác nhau Trong

đó, những loài ký chủ là côn trùng dễ bị nhiễm nấm đó là: bọ phấn trắng, rệp, bướm đêm ; còn những loài ký chủ là ve thì có: ve nâu, ve đỏ châu Âu Còn đối với ký

chủ là tuyến trùng thì thường phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus,

một loài có trong đất và thảm thực vật (Jatala, 1986) Trong nghiên cứu của Eng (2001), có 82,9% trong số 41 nông trại được khảo sát ở Sarawalk có sự hiện diện

của P.lilacinus, mặc dù người ta đã sử dụng các loại thuốc diệt nấm Từ đó có thể nhận thấy P.lilacinus có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống, có phạm vi

thích ứng rộng và có khả năng phát triển tốt ở 26 – 300

C

Chi Paecilomyces có nhiều loài nhưng chủ yếu là hai loài Paecilomyces lilacinus và Paecilomyce variotii Một vài loài Paecilomyces spp có khả năng chịu nhiệt như: nhiệt độ tối ưu của Paecilomyces fulvus là 450

C, Paecilomyces crustaceous là dưới 550C (Samson, 1974) Hai loài nấm chịu nhiệt trên có khả năng làm hư hỏng thực phẩm nhưng cũng là loài quan trọng ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các enzyme chịu nhiệt Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài

Paecilomyces đem lại nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hữu ích (Liang et al.,

2003) Một số loài Paecilomyces spp phổ biến:

− Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng

− Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất

− Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, côn trùng

− Paecilomyces lilacinus phân lập được từ xác bã hữu cơ, trứng tuyến trùng và đôi khi còn ở côn trùng chết, rừng cao su (Crop Protection Compennium,

mọc theo hình tròn đồng tâm Có thể phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces

thông qua hình thái đại thể và vi thể

Hình 1.1 Đặc điểm đại thể của Paecilomyces spp

(Nguồn: www.pf.chiba-u.ac.jp)

b Đặc điểm vi thể

Cuống bào tử đính thường phân nhánh và mức độ phân nhánh của nấm

Paecilomyces spp thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium spp Cuống bào tử hình thành từ phần gốc hay giữa sợi nấm, dài 400 - 600 µm Paecilomyces spp có

thể bình trên đầu của cuống với kích thước 3 - 4 × 400 - 600 µm Thể bình nhỏ, phồng lên ở phần gốc, thon dài, nhỏ và uốn cong ở phần đầu Thường phần gốc chụm lại thành nhóm như cây chổi tương tự như cấu trúc ở phần đuôi của cuống bào tử đính Bào tử phân sinh đơn bào, có dạng hình oval đến hình thoi, trong suốt đến nâu, có hình thành dạng chuỗi, bề mặt nhẵn hoặc có gai (Trần Văn Mão, 2002)

Giá bào tử trần, đơn độc hoặc bó thành giá, phân nhánh không đều hoặc thành vòng Nhánh mang ở đỉnh thể bình mọc thành vòng Thể bình đôi khi đơn độc trên các sợi nấm không phân hóa Thể bình gồm phần gốc hình trụ hoặc hình gần trứng và phần ngọn thon nhỏ đột ngột thành một cổ dài Bào tử trần thuộc tip phialoconidi (tip cơ bản euconidi), không ngăn vách, không màu hoặc màu nhạt,

nhẵn hoặc có gai, thành chuỗi gốc non Các chuỗi bào tử trần tách xa nhau, ít khi tụ họp thành khối

Hình 1.2 Đặc điểm vi thể của Paecilomyces spp

(Nguồn: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012_06_01_archive.html) 1.1.1.4 Độc tố của nấm Paecilomyces spp

Độc tố chính của nấm Paecilomyces spp là paecilotoxin (leucinostatins), là

một trong các tác nhân gây ra cái chết cho kí chủ Paecilotoxin có cấu trúc cực kỳ phức tạp, là một chuỗi peptide thẳng gồm nhiều acid béo chưa bão hòa ở đầu N và amine ở đầu C Paecilotoxin có pháp danh hóa học là (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[2[2-(3-arbamoylpropylcarbomoyl)propan-2-ylcarbamoyl] propan-2-ylcarbamoy]-3-methylbutyl] carbomoyl]-3-methyl-butyl]carbomoyl]propan-2-ycarbomoyl]-2-hydroxy-3-methyl-butul] carbomyl]-5-hydroxy-3-methyl-7-oxo-nonyl]-4-methyl-1-[(E,4S)-4-methylhex-2-enoyl] pyrrolidin-2-carboxamide (Nevalainen Helena, 1977)

Sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng, nhưng khá giống nhau ở mỗi chủng, thường thì độc tố chính là Paecilotoxin A hoặc Paecilotoxin B Tùy từng loài khác nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriubin, viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin Các hợp chất chuyển hoá thứ cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng

Hình 1.3 Cấu tạo hóa học của độc tố paecilotoxin

1.1.1.5 Chu kỳ sống và cơ chế tác động của Paecilomyces spp đối với ký chủ

a Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp đối với bọ phấn trắng

Chu kỳ sống của Paecilomyces spp có thể chia làm 3 giai đoạn: đầu tiên các

bào tử sẽ tiếp xúc với côn trùng qua lớp vỏ và lớp chân lông Các bào tử bám váo lớp vỏ của côn trùng, nảy mầm và phát triển một ống mầm trong 8 - 16 giờ Ống mầm phát triển dưới dạng một vòi bám xuyên qua biểu bì côn trùng và đi vào trong xoang máu Vòi bám là một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy

để bám vào vỏ côn trùng Sự xâm nhập của nấm đạt được bằng cách tiết ra hỗn hợp enzyme bao gồm chitinase, protease và áp lực cơ học Sau khi tế bào đơn nảy mầm, bào tử sẽ xâm nhập và lưu thông trong xoang máu của côn trùng, nhân lên, và sử dụng chất dự trữ trong cơ thể côn trùng để sinh trưởng và sinh sản Các sợi nấm phân nhánh tạo thành một mạng lưới chằng chịt trong cơ thể côn trùng

Paecilomyces spp sản sinh ra các hợp chất, phá bỏ hệ thống miễn dịch của côn trùng, cạnh tranh với các vi sinh vật tiềm tàng, giết chết vật chủ trong 7 - 14 ngày Cuối cùng sau khi ký chủ chết, nấm sẽ lan ra khỏi biểu bì rồi bao lấy cơ thể của côn trùng và phát triển thành đảm bào tử Khi gặp điều kiện phù hợp sẽ sản sinh

ra bào tử, bào tử sẽ được phát tán rồi lây nhiễm cho các vi sinh vật khác Tuy nhiên,

chu kỳ sống được hoàn thành trong điều kiện phải thích hợp, trong khoảng 48 - 72 giờ và không có sự có mặt của vi sinh vật hoại sinh

Thông thường đối với các loại bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn hay do virus thì chúng lây truyền thông qua đường ruột hay đường thức ăn, nhưng đối với nguồn bệnh là vi nấm thì chủ yếu là do sự tiếp xúc trực tiếp hay qua trung gian truyền

bệnh Trung gian đó có thể là những loài ký sinh hay côn trùng ăn thịt

Nấm Paecilomyces spp tấn công vào xoang máu của bọ phấn thông qua lớp

biểu bì hoặc đường miệng Bọ phấn chết là sự kết hợp của nhiều yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do

nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng

Quá trình bám của bào tử nấm vào cơ thể của côn trùng là một quá trình thụ động nhờ gió và nước Đầu tiên bào tử của nấm sẽ bám lên thành biểu bì Bào tử

của nấm có một lớp bên ngoài là bó sợi đan xen là các đuôi kị nước Độ bám dính của bào tử trên bề mặt biểu bì một phần là nhờ các đuôi kị nước Lectins, một loại cacborhydrate glycoprotein được phát hiện có trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì côn trùng dễ hơn Khi đạt tới điều kiện thích hợp bào tử sẽ nảy mầm và tăng trưởng nhanh chóng với sự tác động của các điều kiện sẵn có của nước, chất dinh dưỡng, oxy cũng như pH, nhiệt độ và bởi sự tác động của hợp chất độc tố trên

bề mặt côn trùng Nấm nảy mầm trong phạm vi có đủ nguồn Carbon và Nitơ

Nấm xâm nhập vào côn trùng bằng quá trình lây nhiễm, xâm nhập qua lớp biểu bì hay tạo áp lực cơ học nhờ giác bám Lớp biểu bì của côn trùng có hai lớp: ngoài là epicuticle và trong là procuticle Epicuticle có cấu trúc phức tạp là một lớp mỏng không có chitin nhưng chứa protein, phenol ổn định và được bao phủ bởi một lớp sáp có chứa acid béo, lipid, sterol.Các procuticle phần lớn có các sợi chitin bên trong hỗn hợp protein, lipid, quinon Nấm cần xuyên qua lớp biểu bì vào cơ thể côn trùng để có thể lấy được chất dinh dưỡng cần cho sự tăng trưởng và sinh sản Sự xâm nhập vào cơ thể côn trùng bao gồm cả sự phân hủy của enzyme do nấm tiết ra

và nhờ áp lực cơ học

Khởi đầu cho quá trình xâm nhiễm, nấm xâm nhập tại những vị trí dễ bị tổn thương trên lớp biểu bì Nấm sẽ xuyên qua lớp biểu bì ngoài nhờ áp lực cơ học Bào

tử nảy mầm và hình thành các giác bám trên bề mặt biểu bì Giác bám là đầu tận cùng của ống mầm phát sinh từ bào tử Giác bám gắn vào biểu bì côn trùng là nhờ tương tác kị nước giữa các thành bào tử và các lipid nằm trong lớp biểu bì trên Sau

đó, ống mầm xuyên qua lớp biểu bì dưới, nội bì rồi vào xoang máu Các nghiên cứu còn cho thấy có sự tham gia của các chất truyền tin nội bào như Ca2+

và cAMP (cyclicadenosine monophosphate) trong sự hình thành giác bám trong trường hợp khi lớp biểu bì cứng khó xuyên qua Sau khi xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng, nấm thường tạo ra rất nhiều sợi nấm ngắn Những sợi nấm này được phân tán khắp

cơ thể theo dịch máu, chúng tiêu diệt dần các tế bào bạch huyết

Sau đó, sợi nấm xâm nhập mô, phá hủy tất cả các tế bào bạch huyết rồi làm chết vật chủ Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hóa khử lympo trong máu Do nấm sinh sản nhiều sẽ làm tắc hệ tuần hoàn của côn trùng, làm côn trùng biếng ăn; đồng thời chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hóa của cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đó làm rối loạn và mất chức năng sinh lý Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục hoại sinh cơ thể côn trùng rồi phát triển sợi nấm ra toàn bộ cơ thể côn trùng và hình thành bào tử

Quá trình xâm nhập vào cơ thể côn trùng còn nhờ vào sự hỗ trợ mạnh mẽ của các enzyme và hệ enzyme Một loạt các loại enzyme ngoại bào có thể thủy phân các thành phần chính của lớp biểu bì côn trùng như chitinase, lipase, esterase, lipoxygenase và ít nhất bốn loại protease khác nhau đã được ghi nhận có vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm Do cấu trúc phức tạp của lớp biểu bì côn trùng nên cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme khác nhau Trong đó, chitanase

và endoprotease là hai enzyme giữ vai trò quan trọng nhất

b Chu kỳ sống và tác động của nấm Paecilomyces spp tác động đối với tuyến

trùng

Thuật ngữ “nematophagous fungi – nấm kí sinh tuyến trùng” được dùng để

mô tả một nhóm đa dạng các loài nấm có khả năng xâm nhiễm và ký sinh tuyến trùng

Nhiều loại vi nấm đã được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và West, 1991) Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus, có thể kí sinh

cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood,1996)

Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng Có rất nhiều loài Paecilomyces có khả năng

ký sinh tuyến trùng, trong đó có Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chlamydosporia được xem là nấm kí sinh trứng tuyến trùng hiệu quả Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm là enzyme protease và chitinase, bởi vì vỏ trứng được cấu tạo bởi ba lớp riêng biệt: một lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin và một lớp lipoprotein bên trong Các thí nghiệm đã cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh

tiếp xúc với vỏ trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng (Llorca và Claugher, 1990) dẫn đến sự tan rã của lớp vitelline, phân hủy của lớp chitin và

lipoprotein (Morton et al., 2004) Các loại nấm có sự khác nhau về khả năng phân

hủy vỏ trứng tuyến trùng, và quá trình xâm nhiễm được tìm thấy bị ảnh hưởng bởi

kí chủ tuyến trùng (Segers et al., 1998)

Sự xâm nhiễm tuyến trùng và trứng của chúng bởi các nấm khác nhau thì có

thể theo các phương thức khác nhau

Ban đầu, các bào tử và sợi nấm sẽ tiếp xúc với vỏ trứng Khi bào tử nấm bám trên bề mặt kí chủ, bào tử sẽ mọc mầm xuyên qua lớp vỏ trứng Như trong các cách xâm nhập bề mặt kí chủ của các nấm kí sinh côn trùng khác, nấm kí sinh trứng tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (enzyme) và cơ học Nấm tiết ra các enzyme làm mềm lớp vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm

rồi thông qua lớp lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009)

Vỏ trứng tuyến trùng có chứa chitin và protein được tổ chức thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980), do đó chitinase và protease giữ một

vị trí quan trọng trong quá trình xâm nhập tuyến trùng (Tikhonov et al., 2002) Để

chứng minh tầm quan trọng của enzyme trong quá trình phân hủy các polymer trong

trứng tuyến trùng, một nghiên cứu về các enzyme ngoại bào phân hủy các polymer này đã được thực hiện trên một chất ngoại bào (ECM - extracellular material chứa protease P32) hoặc chất kết dính được tiết ra từ nấm P.rubescens có liên quan đến

lectin Concanavalin A (Con A) Trong nghiên cứu đó, protein serine 32 kDa đã

được ly trích từ P rubescens kí sinh trứng Sự tham gia của enzyme trong quá trình này đã được kiểm tra trên các protein vỏ trứng Globodera pallid (Llorca, 1990)

Người ta cho rằng mặc dù quá trình gây bệnh phức tạp và liên quan tới nhiều yếu tố, nhưng ức chế P32 bằng hóa chất và kháng thể đa dòng làm giảm sự nhiễm trùng và xâm nhập trứng (Llorca et al., 2002) Các loài tương tự P chlamydosporia cũng tiết

ra enzyme protease ngoại bào (VcP1) liên quan với P32 và các enzyme tương tự từ

nấm nội kí sinh (Segers et al., 1994) Trứng được xử lý với VcP1 bị xâm nhiễm dễ

hơn trứng chưa được xử lý, điều này cho thấy vai trò của enzyme trong quá trình kí sinh vỏ trứng bởi nấm kí sinh trứng

1.1.2 Các chủng nấm Paecilomyces đã được phân lập

Nấm Paecilomyces spp có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 83 loài phân

bố trên diện rộng, trong đó có thể kế đến là Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseu, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces variotii, Paecilomyces lilacinus (Dilip

K.Arora, P.D.Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004)

Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:

- Paecilomyces lilacinus

Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này

được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru

Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn

trùng Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt độ phòng 270

C ± 20C Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồng khi sinh bào tử Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượng lớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài Các thể bình phình ra ở phần gốc và thon nhỏ lại ở cổ Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975)

- Paecilomyces variotii Bainier

Paecilomyces variotii Bainier là loài thường gặp nhất ở không khí, đất và trên các sản phẩm công nông nghiệp ở nước ta (D.H.Miên, 1960), có khả năng sinh

ra kháng sinh variotin (kháng sinh chống nấm), ngoài ra còn tạo thành mycotoxin là acid byssochlamic và một số sản phẩm trao đổi chất khác Thường sống hoại sinh trên các loại gỗ, đồ thuộc da, sách, đồ bằng sợi nilon hay sợi đay Nhưng loài nấm này có khả năng gây bệnh trên người và thực vật

- Paecilomyces inflatus

Khuẩn lạc trên môi trường MEA (Malt extract agar) phát triển chậm, đường kính từ 33 - 35mm ở 14 ngày và ở nhiệt độ 280C Khuẩn lạc mịn, mềm như bông khi mới phân lập Phát triển thành sợi nấm trong suốt và mịn vài ngày sau đó

Khuẩn lạc trên PDA cũng phát triển chậm, khoảng 33 - 35mm ở 14 ngày và

ở nhiệt độ 250C Khuẩn lạc có màu trắng hơi vàng nhạt Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm là ở 250

1.1.3 M ột số ứng dụng của nấm Paecilomyces spp vào thực tiễn đời sống

kẹo Protease kiềm thì ứng dụng trong công nghiệp thuộc da

Paecilomyces spp thuộc nhóm nấm Ascomycetes có mặt trong đất, nước, không khí, gỗ, tàn dư thực vật, đất… Paecilomyces spp còn gọi là nấm thối mềm,

vì chúng có khả năng phân hủy cellulose

Dextranase (α -1,6-D-glucan, 6 glucanohydrolase; EC: 3.2.1.11) có nhiều ứng dụng trong y học và nền công nghiệp vì nó thủy phân dextran Sự hiện diện của dextran có nhiều tác động tiêu cực ở mức độ chế biến như mất sucrose, tăng độ nhớt của quá trình siro và phục hồi kém của sucrose Sử dụng dextran sẽ giải quyết được các vấn đề này Dextranase có thể thủy phân hay ức chế quá trình tổng hợp glucans,

có thể được sử dụng trong điều trị mảng bám răng Nó cũng được sử dụng để tạo ra các dextran có trọng lượng phân tử thấp và gây độc cho tế bào Hơn nữa, dextranase

có ảnh hưởng tiêu cực đến sự tổng hợp isomaltooligosaccharides, chất ức chế hoạt động của các cơ chất có lợi cho vi khuẩn đường ruột probiotic Và loại enzyme này

cũng đã được tiết ra bởi nhiều loài nấm trong đó có nấm Paecilomyces spp

cứu Tetsuro Fujita ở Đại học Kyoto (1992) ISP-I được thu nhận từ P cicadae

Fingolimod có tiềm năng được sử dụng trong liệu pháp ghép cơ quan Các nhà khoa học cho rằng nó có thể ngăn ngừa mạnh các phản ứng miễn dịch thông qua trung gian lympo bào để đáp ứng việc cấy ghép cơ quan mới Ngoài ra, fingolimod còn được cho rắng làm tăng tế bào nội mô và bảo vệ chức năng của chúng

Một chất tương tự như anarcadic acid được tách chiết từ P variotii Hợp chất

này lần đầu tiên được cô lập từ nguồn tự nhiên và được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh cho người bao gồm cả các chủng đa kháng thuốc MDR (Multidrugresistan)

Paecilomyces farinosus B05 đã được nghiên cứu để tách chiết các thành phần polysaccharide ngoại bào từ môi trường lên men và sản xuất để ứng dụng vào sản xuất các chất chống oxy hóa Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các

polysaccharide được chiết xuất từ P farinosus có hoạt tính chống oxy hóa cao, chỉ

thấp hơn vitamin C một ít

1.1.3.3 Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

Việc sử dụng các vi sinh vật tự nhiên để phòng trừ các dịch hại là một công việc quan trọng hiện nay trong ngành nông nghiệp vì sự an toàn, thân thiện với môi trường và hiệu quả cao

Ở Ai Cập đã sản xuất Priority - một sản phẩm từ P fumosoroseus để diệt trừ

các loại côn trùng Đây là thuốc trừ sâu sinh học giúp diệt trừ bướm trắng để bảo vệ cây cà chua, dưa leo, cây cảnh Sản phẩm chứa bào tử của chủng nấm

P.fumosoroseus, và được xem là có khả năng lây nhiễm ở tất cả giai đoạn (trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành) Ngoài ra trên thị trường còn có một số sản phẩm

như Pelicide, Bio - Nematon, PL Plus chứa bào tử nấm P.lilacinus nhằm phòng trừ

tuyến trùng gây hại cho cây nằm trong đất

1.1.3.4 Xứ lý môi trường

Nấm là đối tượng thường được sử dụng trong hệ thống lọc khí sinh học để xử

lý ô nhiễm không khí thông qua việc sử dụng khả năng của nấm để biến đổi các chất ô nhiễm hữu cơ và vô cơ thành hợp chất ít độc hại hơn

Formaldehyde là một chất phổ biến và nó là sản phẩm của các nguồn sinh học và từ môi trường (sinh ra từ nhà máy công nghiệp) Formaldehyde có độc tính cao do phản ứng không đặc hiệu với protein và nucleic acid, vì thế nó là chất gây ô nhiễm môi trường

P variotii đã được thử nghiệm xử lý formaldehyde do chủng nấm này có enzyme S - hydroxymethylglutathione dehydrogenase Enzyme này có tính đặc hiệu

cơ chất rất cao với cơ chất là formaldehyde Ngoài ra, enzyme alcohol oxidase từ P variotii có khả năng làm giảm lượng formaldehyde đáng kể và là tiềm năng cho việc ứng dụng xử lý formaldehyde

Ngoài ra, có một số ứng dụng quan trọng của chi Cordyceps trong việc làm thuốc và thực phẩm có lợi cho sức khỏe của con người là chi Paecilomyces (Liang

et al., 2003)

1.1.4 Một số sản phẩm của Paecilomyces spp

Bio - Nematon là thuốc trừ tuyến trùng sinh học chứa chủng nấm

Paecilomyces lilacinus được chọn lọc trong tự nhiên Sản phầm bao gồm những bào

tử và sợi nấm của P.lilacinus, dạng lỏng chứa 1x109

CFU/ml và dạng bột chứa 1x108 CFU's/gm Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của nó sẽ phá hủy vỏ trứng,

ấu trùng và con nhỏ của hấu hết các loại tuyến trùng gây hại ở thực vật Khi mà bảo

tử tìm thấy những giai đoạn khác nhau của tuyến trùng, chúng sẽ nảy mầm và phát triển, nảy nở trong cơ thể ký chủ, thậm chí làm tê liệt dẫn đến chết

Hình 1.4 Bio Nematon - Sản phẩm của công ty T.Stanes có khả năng trừ tuyến

trùng

(Nguồn: www.tstanes.com)

NoFly WP là thuốc trừ sâu sinh học chứa chủng nấm Paecilomyces

fumosoroseus nhằm kiểm soát bọ trĩ và bọ phấn trắng trên thực vật ở nhiều giai đoạn sống của chúng như: trứng, ấu trùng và con trưởng thành

Khi sản phẩm được sử dụng, bào tử của P.fumosoroseus sẽ bám vào côn

trùng, nảy mầm và xâm nhập qua lớp cutin Khi ký sinh được ký chủ, chúng sẽ phát triển nhanh chóng, phá vỡ tế bào dẫn đến bị mất chức năng sống Côn trùng sẽ chết trong vòng từ 3 - 10 ngày, phụ thuộc vào nhiệt độ Khi côn trùng chết, bào tử của

cơ thể côn trùng bị phủ một lớp tơ xám trắng ra bên ngoài Trong điều kiện bất lợi,

sẽ không có sự hình thành bào tử tuy nhiên ta có thể nhận thấy sự ký sinh của nấm qua màu sắc của cơ thể côn trùng khi chết, đó là màu nâu Hay qua sự méo mó của

cơ thể côn trùng

Hình 1.5 Sản phẩm trừ bọ phấn

(Nguồn:www.plantprod.com)

1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces spp

Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm côn trùng là ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ pH trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy Quá trình tác động đến đất như sử dụng phân bón hữu cơ, thuốc trừ sâu hóa học đều có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của một số chủng vi nấm sống trong đất

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát tiển của nấm:

- Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của nấm Nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc và sẽ hạn chế khả năng gây bệnh đối với côn trùng Trong quá trình hình thành bào tử,

nấm cần các nguồn C, N Các nguồn Carbon đã được nghiên cứu ảnh hưởng là: glucose, sucrose, arabinose, mannose và acid citric đều ảnh hưởng đến sự phát

triển của Paecilomyces spp (Bharati et al., 2007) Kết quả cuối cùng thu được:

sucrose là cơ chất tốt nhất (87,25 cm) cho sự tăng trưởng; tiếp theo là glucose (56,25 cm) Mannose có khả năng thấp nhất, các cơ chất khác có tác dụng vừa

phải Còn đối với nguồn Ni-tơ, Bharati et al (2007) đã sử dụng các nguồn Nitơ thử

nghiệm: ammonium photphase, sodium nitrate, glycin, calcium nitrate, ammonium

nitrate để nghiên cứu khả năng sử dụng Nitơ của Paecilomyces spp Kết quả thu

được Calcium nitrate là nguồn Nitơ tốt nhất rồi đến glycin, natri nitrate, ammonium nitrate Ammonium phosphate được vi nấm sử dụng ít nhất

- Ảnh hưởng của các loại môi trường: Theo Sung Mi Shim (2003) nghiên cứu rằng có sự chênh lệch về sự phát triển của nấm trên hai môi trường PDA (6,73

cm sau 14 ngày nuôi cấy) và Czapeck - Dox (6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy)

- Ảnh hưởng của ẩm độ và nhiệt độ là yếu tố cần cho sự hình thành và phát

triển của bào tử nấm Paecilomyces spp

Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 - 250

phát triển của nấm Paecilomyces spp và xác định loài này thích hợp ở nhiệt độ

280C (Phạm Thị Thùy, 2004) Nếu nhiệt độ quá cao thì bào tử dễ bị chết hoặc không

hình thành Julio J.D et al (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử

nấm được tạo nên ở các nhiệt độ 12, 16 và 300C Các nhà khoa học cũng cho biết

rằng nấm Paecilomyces spp khi tấn công vào cơ thể côn trùng nếu gặp điều kiện

không thích hợp về nhiệt và ẩm độ hay ánh sáng thì sẽ tạo nên những thể chịu đựng

để đối phó lại môi trường (Penland, 1982)

Hình 1.6 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự phát triển của tản

nấm Paecilomyces

Ẩm độ thích hợp trong phạm vi 80 - 90% (Phạm Thị Thùy, 2004) Độ ẩm cao sẽ có lợi cho sự sinh trưởng của sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử Tuy nhiên,

độ ẩm thấp sẽ duy trì sự sống của nấm Bào tử phân sinh của nấm có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn là khi ẩm độ 75% (Trần Văn Mão, 2002)

- Ảnh hưởng của ánh sáng: Nấm côn trùng phát triển tốt trong điều kiện phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 - 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát triển Ánh sáng cũng rất cần thiết cho

quá trình sinh bào tử của nấm Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces spp sẽ không tạo nhiều bào tử Theo như nghiên cứu của Li Gao et al (2009) thì thời gian

chiếu sáng có ảnh hưởng đến sự phát triển nấm và hình thành bào tử đối với

Paecilomyces lilicinus IPC - P, cụ thể như sau: nấm phát triển tốt nhất ở điều kiện tối hoàn toàn (49,96 mg/cm2), còn ở điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn rất nhiều (29,75 mg/cm2) Tương tự cho sự hình thành bào tử, ở điều kiện tối hoàn toàn thì bào tử tạo thành nhiều nhất 91,7.105 bào tử/cm2; trong điều kiện 12h sáng/12h tối thì thấp hơn (46,79 bào tử/cm2) Đối với chủng P.lilacinus M-14 thì trong điều

kiện tối hoàn toàn nấm phát triển tốt (56,58 mg/cm2); còn điều kiện 12h sáng/12h tối nấm đạt giá trị 55,05 mg/cm2 Đối với sự hình thành bào tử thì lượng bào tử tạo

thành nhiều ở điều kiện 12h sáng/ 12 tối (121,57.105 bào tử/cm2); còn ở điều kiện tối hoàn toàn thì lượng bào tử tạo thành thấp hơn (55,91 105 bào tử/cm2

1.3 Các nghiên cứu về sử dụng Paecilomyces spp trong phòng trừ bọ phấn và

tuyến trùng gây hại

Hình 1.7 Các giai đoạn trong vòng đời của bọ phấn trắng

(Ngu ồn: organicsoiltechnology.com) 1.3.1.2 Đặc điểm sinh thái

Bọ phấn là một trong những dịch hại nguy hiểm đối với nhiều loài cây trồng

Ký chủ ọ phấn chủ yếu là thực vật hạt kín hai lá mầm, trong đó cây họ cam quýt (Rutaceae) là ký chủ của hơn 60 loài, cây họ dâu tằm (Moracea) là ký chủ của

hơn 80 loài Ở các nước ôn đới, bọ phấn Trialeurodes vaporariorum gây hại nặng

cho cây trồng trong nhà kính và ngoài đồng ruộ Aleyrodes proletella gây

hại nặng cho rau họ thập tự Ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, các loài

Aleurodicus dispersus, Trialeurodes vaporariorum và Bemisia tabaci gây hại thiệt nghiêm trọng cho bông và nhiều loại cây trồng khác có giá trị kinh tế cao

Cho đến nay trên thế giới đã ghi nhận 1556 loài bọ phấn Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (BVTV) các năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 -

1998, ở nước ta có 7 loài bọ phấn có tên khoa học là: Aleurocanthus spiniferus, Aleurocanthus woglumi, Aleurocanthus spp gây h ại trên cam quýt; Aleurocybotus indicus gây h ại trên lúa; Dialeurodes citri gây hại trên na; Parabemisia myricae gây

hại trên đậu tương, thuốc lá, đậu đỗ, dưa chuột, cà chua, cà tím Theo kết quả điều tra mới đây của các tác giả Nguyễn Thị Thu Cúc, Lê Thị Tuyết Nhung, Lê Quang

Khải, thành phần bọ phấn nước ta đã được bổ sung thêm 4 loài: Aleurodicus dispersus gây h ại trên ổi; Aleyrodes proletella gây hại trên súp lơ xanh; Dialeurolonga rusotigmoides, Ochamoplatus citri gây hại trên cam, quýt

Trứng có hình quả lê hoặc quả trứng, có cuống gắn chặt cố định trên các mô

lá và thời gian pha trứng từ 8-31 ngày Phần mở rộng của cuống óc dính này

là phương tiện để thụ tinh Mỗi con cái có thể đẻ 80 trứng, số lượng trứng thay đổi theo mùa

Ấu trùng tuổi 1 - 3 có thể di chuyển và gây hại trong phạm vi ngắn; T

Ấu trùng mới nở có màu kem nhạt và dần dần chuyển sang một màu đen bóng Chúng hình thành các tua sáp và phủ một lớp sáp trên cơ thể Ngay sau khi nở, các ấu trùng di chuyển tìm vị trí thích hợp để định cư gây hại Thời gian phát dục của tuổi 1: 4 - 7 ngày, tuổi 2: 3 - 7 ngày và tuổi 3: 3 - 8 ngày Mỗi lần lột xác là có sự thay đổi màu sắc từ màu nhạt chuyển sang hơi đen

Hầu hết tuổi 2, 3 của ấu trùng có hình bầu dục hoặc thuôn dài và có những khe (nếp gấp) thở cạn ở thành bụng và lưng Đó là các lỗ thở và có thể hỗ trợ cho việc dẫn truyền không khí

Giai đoạn nhộng (ấu trùng tuổi 4)

trong giai đoạn đầu, kéo dài 9-14 ngày sau đó vũ hóa thông qua khe hình chữ 'T' trên lưng vào buổi sáng

Cả ấu trùng và trưởng thành đều chích vào mô cây trồng và hút dịch nhưng giai đoạn ấu trùng gây thiệt hại nặng nhất cho cây mía

Khi ấu trùng phát triển, chúng phủ một lớp bọc bằng sáp trắng giúp bảo

vệ khỏi các tác động bên ngoài, nhất là thuốc trừ sâu, đây là đặc điểm riêng biệt của bọ phấn trắng ở các pha phát dục, trừ pha trứng

1.3.1 4 Tổng quan về bệnh vàng lá do bọ phấn trắng gây ra

Bọ phấn trắng non và bọ phấn trưởng thành thường tập trung ở mặt dưới lá

cà chua, ổi, ớt chích hút dịch cây Khi mật độ bọ phấn cao làm cây suy yếu, có thể

bị héo, vàng lá, thậm chí có thể chết Chất bài tiết của bọ phấn trắng có đường tạo điều kiện cho nấm bồ hóng phát triển hại cây

Bọ phấn thường gây hại trong mùa khô, chúng có phân tán trên phạm vi rộng

nhờ gió

Ngoài ra, bọ phấn còn là vật trung gian truyền bệnh xoăn lá do virus gây ra

và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có nhóm cây rau thực phẩm

bị hại nghiêm trọng nhất là cà chua, ớt Bệnh xoăn lá có thể xuất hiện ngay từ khi cây còn nhỏ trong vườn ươm cho đến khi trồng ra ruộng và thu hoạch, phổ biến nhất là cây bắt đầu ra hoa Bệnh xuất hiện càng sớm thì mức độ thiệt hại càng nặng Cây bị bệnh còi cọc, lá biến màu vàng nhạt, trong khi gân lá còn xanh tạo thành những vết xanh vàng loang lổ, lá nhỏ lại, nhăn nheo và thô cứng, các lá ngọn bị xoăn, cây sinh trưởng kém, thấp nhỏ, phân nhiều nhánh cằn không phát triển được Đốt thân hoặc các đốt ngắn lại và hơi uốn cong Cây bị bệnh sớm và nặng có thể

chết Nếu bị muộn và nhẹ thì những lá non ra sau mới bị xoăn, cây có thể ra hoa và trái nhưng rụng nhiều Nếu có trái thì trái nhỏ, méo mó, cứng, chất lượng kém

Virus lây lan bằng dịch cây, bằng tiếp xúc cơ giới và chủ yếu là do bọ phấn

chích hút từ cây bệnh rồi truyền sang cây khỏe Bọ phấn Bemisia tabaci là côn trùng

môi giới truyền bệnh Virus lan truyền rất nhanh, khi bọ phấn bắt đầu ăn cây cà chua, virus được truyền đi trong vòng 15 - 30 phút Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ

lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều Bệnh không tồn tại lan truyền qua hạt giống và qua đất Hàng năm, bệnh thường phát sinh mạnh từ tháng 10 đến đầu tháng 11 và gây hại nặng vụ cà chua xuân - hè tháng 3 - 4, đặc biệt khi trời ấm và nắng, ít mưa Mức độ bị bệnh ở các giống cũng khác nhau: giống cà chua lai dễ nhiễm bệnh hơn các giống cà chua thuần; các giống mới nhập nội dễ nhiễm hơn các giống trồng qua nhiều năm; các giống cà chua địa phương có khả năng kháng bệnh virus cao

1.3.2 Tổng quan về tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những

vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997) Tổn hại

về mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự

tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997) Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra Thiệt

hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972)

Tuyến trùng hại rễ là một loài sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp gây tổn hại 20% - 50%

sản lượng cà chua (Nilsson, 1972) Chúng tồn tại trong đất ở những vùng có khí hậu nóng bức hay có mùa đông ngắn Có khoảng 2000 loài thực vật có thể bị nhiễm

tuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên toàn cầu mỗi năm Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ, đồng thời chúng làm mất khoáng chất của cây và khả năng quang hợp Khi chúng xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đó sẽ chết, còn nếu nhiễm vào cây

đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đó

1.3.2.1 Phân lo ại khoa học

1.3.2.2 Đặc điểm sinh thái

Meloidogyne thuộc nhóm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế

giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao Chúng sống và sinh sản trong các

tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người

ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ Chúng có khả năng sinh sản và phát triển rất nhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề

Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne

spp có các đặc điểm như sau:

Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn hay quả lê, màu trắng, ít vận động, không có giai đoạn u nang Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15

µm Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngoài

Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ Có kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18

- 25µm Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 - 33µm, ống dẫn dài từ 7 - 11µm Có một tinh hoàn

Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một

bọc gelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ

1.3.2.3 Tổng quan về bệnh sần rễ do tuyến trùng gây ra

Tuyến ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết

thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997) Tổn hại về mặt

kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry, 1997) Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra Thiệt

hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt năm trong nhà kính Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường được quan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972) Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne

spp gây t ổn hại 20%- 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972)

Trong khi ở Việt Nam thì tiêu có lượng xuất khẩu tiêu lớn nhất thế giới Do

đó, cây tiêu đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế của đất nước Nhưng hiện nay, có nhiều loại bệnh hại làm giảm năng suất của tiêu đó là bệnh sần rễ do tuyến

trùng Meloidogyne gây ra Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi nấm, vi khuẩn có hại xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn Do đó, việc tìm

hiểu và phòng trừ bệnh hại cho tiêu rất quan trọng

Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn

cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được

Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn:

− Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa

bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu sáng

− Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng

bị ảnh hưởng Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gây nhiều bệnh khác cho cây

− Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn

Có 29 loài thuộc các họ khác nhau có mặt trên các vùng trồng tiêu của Việt

Nam Trong đó, chủ yếu và phổ biến nhất là chi Meloidogyne (Trịnh Thị Thu Thủy

và cộng sự, 2007)

Hình 1.9 Vòng đời của tuyến trùng hại rễ

Meloidogyne spp được phát hiện đầu tiên ở cây sắn do Neal vào năm 1889 Rau màu được trồng ở những vùng có khí hậu ấm áp thường trải qua những mùa bị thiệt

hại nghiêm trọng do tuyến trùng gây ra, và thường người ta dùng chất hóa học gọi

là nematicide để ngăn chặn điều này Rễ bị tuyến trùng ký sinh sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bình thường Hậu quả bởi tuyến trùng gây ra cho thực

vật là làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất của cây trồng, từ đó kéo theo

sự suy giảm sức đề kháng của cây trồng với các yếu tố ngoại cảnh (như là: hạn hán,

dịch bệnh, ) và tình huống xấu nhất là có thể sẽ mất trắng mùa màng

1.3.3 Đánh giá khả năng ký sinh của chủng Paecilomyces spp

Kiểm soát sinh học được định nghĩa là các hoạt động kí sinh, ăn thịt hay gây

bệnh trong việc duy trì mật độ sinh vật khác tại một số nơi thấp hơn trung bình (Bach, 1964) Tuy nhiên, kiểm soát sinh học là sự giảm mật độ quần thể tuyến trùng thông qua hoạt động của các sinh vật sống khác so với cây chủ có thể kháng lại tuyến trùng, xảy ra trong tự nhiên hay thông qua các thao tác môi trường (Stirling, 1991)

Trước đây, việc kiểm soát tuyến trùng hại thực vật chủ yếu dựa vào các hóa

chất diệt tuyến trùng, sức đề kháng của kí chủ thực vật và luân canh cây trồng Mặc

dù có nhiều thành công trong nghiên cứu kiểm soát tuyến trùng bằng phương pháp sinh học trong suốt 20 năm qua, đến nay nó vẫn ít được áp dụng Hầu hết các sản