Bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét plasmodium spp và hướng ứng dụng

Kết quả nghiên cứu: Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi đã thu thập được 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, tiến hành định danh 30 mẫ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Luận văn Thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Công nghệ TP HCM ngày 1 tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP HCM

TP HCM, ngày … tháng… năm 20 …

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TRẦN MINH QUÍ Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1991 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học MSHV: 1541880009

I- Tên đề tài:

Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét Plasmodium spp và hướng ứng dụng

II- Nhiệm vụ và nội dung:

 Thu thập và bảo tồn nguồn chủng KST SR bằng cách nuôi cấy chủng KST SR

và bảo quản chủng KST SR trong Nitơ lỏng

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được

III- Ngày giao nhiệm vụ: 15/02/2017

IV- Ngày hoàn thành nhiệm vụ:

V- Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS, NGUYỄN TIẾN THẮNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Bảo Tồn Chủng Ký Sinh Trùng Sốt Rét

Plasmodium spp và hướng ứng dụng” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

Đề tài được thực hiện tại khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh Các số liệu, kết quả, đánh giá đưa ra trong luận văn chưa được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Những kết quả nghiên cứu, số liệu của tác giả khác trích dẫn trong luận văn này điều được chú thích đầy đủ

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trường về cam đoan này

Học viên thực hiện Luận văn

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CÁM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

Trường Đại học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh; Ban lãnh đạo Viện Sốt rét –

Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh; Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng là người Thầy trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành luận văn

Các anh chị đồng nghiệp Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Nuôi cấy – Miễn dịch, cùng bạn bè, và gia đình đã động viên, giúp đỡ

em trong quá trình hoàn thành luận văn này

(Họ và tên của Tác giả Luận văn)

TÓM TẮT

Đặt vấn đề:

Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp gây ra, bệnh thường

gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới Bệnh truyền từ người bệnh qua người

lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là: Plasmodium

falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, và Plasmodium knowlesi Bệnh SR là vấn đề y tế ảnh hưởng đến sức khỏe, điều kiện

kinh tế của người dân sống trong vùng sốt rét lưu hành Trong những năm gần đây, tình hình KST SR có chiều hướng giảm mạnh, do đó việc bảo tồn chủng KST

SR Plasmodium spp là vấn đề quan trọng để phục vụ cho các nghiên cứu đến KST

Đề tài tập trung vào các nội dung sau:

 Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng + Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các

nguồn máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và

Plasmodium vivax đơn thuần được thu thập từ thực địa

+ Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử nghiệm,

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được

+ Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR

+ Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST SR

+ Giải trình tự đoạn Gene kháng thuốc artemisinin đối với chủng

Plasmodium falciparum

Phương pháp thực hiện đề tài:

Đề tài chúng tôi đã tiến hành thu thập mẫu tại tỉnh Bình Phước, đây là vùng dịch tể SR lưu hành nặng ở khu vực Nam bộ - Lâm Đồng cũng như cả nước

Với kích cỡ mẫu là 30 mẫu được khẳng định dương tính với KST SR bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa Chúng tôi sẽ định danh lại các chủng thu thập được bằng

kỹ thuật Nested – PCR, giải trình tự Các chủng được xác định nhiễm P

falciparum, P vivax đơn thuần bằng kỹ thuật Nested – PCR sẽ được tiến hành

nuôi cấy dài ngày chủng KST SR bằng phương pháp nuôi bình nến của Trager và Jensen (1976) với hồng cầu người, môi trường RPMI 1640, 10% huyết thanh AB trong điều kiện nồng độ 5% CO2 vàO2 thấp, ở nhiệt độ 37°C

Kết quả nghiên cứu:

Trong quá trình tiến hành đề tài, chúng tôi đã thu thập được 30 mẫu máu dương tính với ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật nhuộm Giêm – sa, tiến hành định danh 30 mẫu KST SR bằng kỹ thuật Nested – PCR và giải trình tự các mẫu thu thập được tại phòng thí nghiệm

Bên cạnh đó, với 14 chủng KST SR nhiễm P falciparum đơn thuần được phân lập, chúng tôi tiến hành giải trình tự phát hiện 9/14 chủng KST SR P falciparum

đơn thuần thu thập được tại Bình Phước có đột biến cánh quạt K13 liên quan đến

kháng artemisinin (chiếm 64,3% các chủng P falciparum đơn thuần)

Với tần suất xuất hiện các điểm đột biến K13 cánh quạt liên quan đến kháng artemisinin như sau: C447G có 1 chủng chiếm 7,1%; I543T có 1 chủng chiếm tỉ lệ 7,1%; P553L có 3 chủng chiếm 21,4%; C580Y có 4 chủng chiếm 28,6% Trong đó đột biến C580Y có tần suất xuất hiện cao ở Bình Phước, cũng như trong các nghiên cứu khác ở khu vực Cam-pu-chia, Myanmar đã được công bố

ABSTRACT Background:

Plasmodium spp is caused of malaria disease, a common disease in the tropical

countries Disease is spreaded from patient to person healthy by mosquito (Anopheles

spp.) Currently, there are five species of malaria parasites infecting human:

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale and Plasmodium knowlesi Malaria disease is the issues affecting health and

economic conditions of people living in malaria endemic areas In recent years, the

situation of malaria tends to decline, so conservation species malaria Plasmodium

spp is very important to help malaria researchers in the future

Study "Conservation of species Plasmodium spp and applications" was

conducted from February to August in 2017

The objective of this research is conservation malaria species, building initially the bank Gene malaria and applications Simultaneously, malaria species are cultured

in the Laboratory

The subject focuses on the following:

 Collecting, storing and conserving strains of Plasmodium spp in liquid

nitrogen

+ Culturing Plasmodium strains to produce pure strains on blood at

Labratory, such as: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax isolated from

patients

+ Plasmodium strains from this research are stored

 Analyzing the gene of malaria parasites from the samples collected

+ Using PCR method to identify Plasmodium spp

+ Anlayzing the gene translation to 18S Ribosomes for each species

Plasmodium

+ Anlayzing the resistant artemisinin gene of P Falciparum strains

Methods:

Our study collected samples in Binh Phuoc province, it is the endemic malaria epidemiology in the South Vietnam - Lam Dong

We found 30 samples positive with malaria by staining Giem - sa We will

identifize strains by Nested – PCR method And then, the strains of Plasmodium spp

are cultured at Labratory by candle jar method of Trager and Jensen (1976) with human erythrocytes, RPMI 1640 medium, 10% serum concentrations AB, in terms 5% of CO2 and O2 low, at a temperature 37°C Finally, storing on liquid nitrogen

Results:

In this study, we have collected 30 blood samples were positive for Plasmodium

spp by staining Giem – sa method, identification 30 samples of malaria by Nested - PCR method and analyzing DNA of samples at Labratory

With 14 cases injected P falciparum, we conducted to analyzing DNA to detected P falciparum malaria species on 9/14 samples collected in Binh Phuoc has

mutant K13 propeller involving artemisinin resistance (accounting for 64.3% of the

isolates of P falciparum samples)

With the point mutatant of K13 propeller involving artemisinin resistance as: C447G 1 strains accounted for 7.1%; 1 strains I543T proportion of 7.1%; P553L strains accounted for 21.4% 3; C580Y 4 strains of 28.6% C580Y have high frequency appearance in Binh Phuoc, as well as in other studies in Cambodia, Myanmar has been published

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CÁM ƠN II TÓM TẮT III ABSTRACT V MỤC LỤC VII DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT X DANH MỤC CÁC BẢNG XI DANH MỤC CÁC HÌNH XII

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

1.5 Ý nghĩa đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

1.6 Tổng quan về bệnh sốt rét 4

1.6.1 Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét 4

1.6.2 Định nghĩa bệnh sốt rét 5

1.6.3 Sơ lược về dịch tể học sốt rét 8

1.6.3.1 Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới 8

1.6.3.2 Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam 10

1.6.3.3 Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước 13

1.7 Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét 14

1.7.1 Giai đoạn phát triển trong cơ thể người 14

1.7.2 Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi 16

1.8 Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét 17

1.8.1 Định nghĩa kháng thuốc 17

1.8.2 Trên thế giới 18

1.8.3 Tại Việt Nam 20

1.9 Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới và Việt Nam 22

1.9.1 Trên thế giới 22

1.9.2 Việt Nam 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài 24

2.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.2 Thiết kế nghiên cứu 24

2.2.3 Phương pháp phân tích mẫu 24

2.2.3.1 Phát hiện KST Plasmodium spp bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 25

2.2.3.2 Xác định loài Plasmodium spp bằng kỹ thuật Nested – PCR 31

2.2.3.2.1 Giới thiệu khái quát về kỹ thuật PCR và phương pháp phát hiện KST SR bằng kỹ thuật PCR 31

2.2.3.2.2 Kỹ thuật tách chiết DNA KST SR Plasmodium spp 33

2.2.3.2.3 Kỹ thuật Nested – PCR phát hiện KST SR: 35

2.2.3.2.4 Kỹ thuật Nested – PCR để phát hiện điểm đột biến K13 liên quan đến kháng artemisinin 36

2.2.3.2.5 Đọc kết quả điện di: 37

2.2.3.3 Xác định loài Plasmodium spp bằng kỹ thuật giải trình tự 38

2.2.3.4 Kỹ thuật tinh sạch sản phẩm DNA để giải trình tự 39

2.2.3.4.1 Kỹ thuật PCR giải trinh tự 40

2.2.3.4.2 Phân tích kết quả giải trình tự: 41

2.2.4 Kỹ thuật cất đông chủng ký sinh trùng sốt rét 42

2.2.5 Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày để tạo chủng Plasmodium spp thuần 42

2.2.5.1 Kỹ thuật nuôi cấy chủng P falciparum thuần: 43

2.2.5.2 Kỹ thuật nuôi cấy chủng P vivax thuần 43

2.4.5.3 Môi trường nuôi cấy 43

2.4.5.4 Chuẩn bị hồng cầu lành 44

2.4.5.5 Chuẩn bị huyết thanh nuôi cấy 44

2.4.5.6 Phá đông chủng KST SR Plasmodium spp 45

2.2.6 Điều kiện nuôi cấy 45

2.2.6.1 Điều kiện nuôi cấy in vitro Plasmodium spp 45

2.2.6.2 Điều kiện trong lấy mẫu tại thực địa 46

2.3 Thống kê và xử lý số liệu 47

2.4 Y đức 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ, THẢO LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

3.1.Kết quả xác thu thập mẫu và xác định loài Plasmodium spp bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 48

3.2.Kết quả xác định loài Plasmodium spp bằng kỹ thuật Nested – PCR 50

3.3.Kết quả giải trình tự Plasmodium spp 53

3.4.Kết quả giải trình tự kháng K13 55

3.5.Kết quả nuôi cấy chủng Plasmodium spp thuần bằng phương pháp nuôi cấy trong phòng nuôi cấy tại phòng thí nghiệm 57

3.6.Kết quả bảo tồn chủng sốt rét Plasmodium spp và phát hiện kháng K13 liên quan đến kháng artemisinin 59

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

4.1.Kết luận 60

4.2.Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 70

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACD : Dung dịch chống đông máu

ATSH : An toàn sinh học

BNSR : Bệnh nhân sốt rét

Hồng cầu O : Hồng cầu của người nhóm máu O

Huyết thanh AB : Huyết thanh của người nhóm máu AB Huyết thanh O : Huyết thanh của người nhóm máu O

PRG : Plasmodium Genenomics Resource

RPMI 1640 : Môi trường nuôi cấy ký sinh trùng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân vùng dịch tễ sốt rét và can thiệp 2009 11

Bảng 1.2 Thời gian xuất hiện P falciparum kháng với các loại thuốc SR 19

Bảng 2.1 Trình tự mồi của phản ứng PCR – Nested 1, PCR – Nested 2. 35

Bảng 2.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested xác định loài Plasmodium spp 35

Bảng 2.3 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR – Nested 2 xác định loài 04 loài Plasmodium spp. 36

Bảng 2.4 Trình tự mồi khuếch đại đọan K13 36

Bảng 2.5 Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 1: 37

Bảng 2.6 Phản ứng Nested – PCR khếch đại K13 lần 2: 37

Bảng 2.7 Thành phần các hóa chất sử dụng trong PCR của giải trình tự 40

Bảng 2.8 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng control giải trình tự 40

Bảng 3.1 Kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa 49

Bảng 3.2 Kết quả xác định chủng bằng kỹ thuật Nested –PCR 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây phát sinh loài của Plasmodium spp gây bệnh cho người và

động vật 7

Hình 1.2 Bản đồ phân bố tỷ lệ tử vong bệnh sốt rét năm 2010 – 2013 10

Hình 1.3 Bản đồ tỷ lệ ký sinh trùng gây bệnh sốt rét tại Việt Nam 12

Hình 1.4 Biểu đồ thể hiện số ca nhập viện và tử vong do KST SR tại Việt Nam 13

Hình 1.5 Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi và người 17

Hình 1.6 Phân bố các vị trí đột biến dựa trên mô hình 3D của kháng K13 21

Hình 1.7 Sự phân bố đa kháng thuốc sốt rét 2016 21

Hình 2.1 Các bước tiến hành trong kỹ thuật nhuộm giêm – sa 26

Hình 2.2 Hình thể KST SR P falciparum soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 27

Hình 2.3 Hình thể KST SR P vivax soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 28

Hình 2.4 Hình thể KST SR P malariae soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 29

Hình 2.5 Hình thể KST SR P ovale soi bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 30

Hình 2.6 Hình minh họa các bước trong phản ứng PCR 33

Hình 2.9 Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng gel polyacrylamide. 39

Hình 3.1 Hình thể KST SR P falciparum bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa 48

Hình 3.2 Hình thể KST SR P vivax bằng kỹ thuật nhuộm giêm – sa. 49

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm DNA Plasmodium spp. 51

Hình 3.4 Biểu đồ sánh kết quả định danh KST SR bằng kỹ thuật giêm – sa và kỹ thuật Nested – PCR 52

Hình 3.5 Kết quả trình tự DNA P falciparum với NCBI 53

Hình 3.6 Sơ đồ cây P falciparum với NCBI 53

Hình 3.7 Kết quả trình tự DNA P vivax với NCBI 54

Hình 3.8 Sơ đồ cây P vivax với NCBI 54

Hình 3.9 Sơ đồ cây P falciparum và P vivax với NCBI 55

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm DNA kháng K13 của P falciparum 56

Hình 3.11 Kết quả trình tự aa K13 của P falciparum với PGR 57

Hình 3.12 KST SR Plasmodium spp được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm 58

Hình 3.13 Hình thể P falciparum được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm 58

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng Plasmodium spp gây ra, bệnh thường

gặp ở các nước thuộc khu vực nhiệt đới [12] [17] Bệnh truyền từ người bệnh qua

người lành nhờ vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi đòn xóc (muỗi Anopheles) [3] [5] [17] [45] [58] [74] Hiện nay, có 5 loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người là:

Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium

Ngày nay, tuy tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm so với những thập niên gần đây, nhưng nó vẫn một vấn đề liên quan đến sức khỏe con người và nhận được

sự quan tâm của toàn cầu, là bệnh truyền nhiễm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, kinh tế [4] [71] và gây nhiều thiệt hại, tổn thất cho nhân loại [35], đặc biệt là đối với phụ nữ mang thai và trẻ em [68] Hàng năm, trên toàn cầu có khoảng 350 -

500 triệu người mắc SR và hơn 1 triệu người chết do SR Đến năm 2010, trên thế giới có 216 triệu người mắc SR và 655.000 người chết do SR và có khoàng 3,3 tỷ người sống trong vùng dịch tể sốt rét và có nguy cơ mắc bệnh sốt rét [65]

Theo ước tính của WHO khoảng 40% dân số thế giới hiện nay đang sống trong vùng có nguy cơ mắc SR Dân số Việt Nam năm 2013 là 89,9 triệu người, với khoảng 14,4 triệu người sống ở những vùng có SR lưu hành (khoảng 16% dân số),

có 35.406 ca SR được ghi nhận, trong đó có 17.128 ca xác định có KST SR (60% số

ca xác nhận SR là do KST Plasmodium falciparum gây ra 6 ca tử vong do SR [1]

1.2 Tính cấp thiết của đề tài

Tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã liên tục giảm, từ 2,8 ca/1.000 dân năm 1991 xuống 0,87 ca/1.000 dân năm 2001 và năm 2013 chỉ còn 0,2 ca/1.000 dân [28] [66] Tỷ

lệ mắc sốt rét giảm là do áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật để hạn chế số lượng mắc và tử vong do KST SR, nhưng vẫn còn hơn 11 triệu người sống trong vùng dịch tể sốt rét [2] Theo một báo cáo khác về tình hình tử vong do sốt rét ở Việt Nam, được đăng trên tạp chí The Guardian năm 2012, số ca tử vong do sốt rét/1.000

dân ở các năm 1980, 1990, 2000 và 2010 lần lượt là: 57,5 ca; 36,2 ca; 15,0 ca; 1,4

ca [59]

Trước tình hình bệnh SR có chiều hướng giảm mạnh [7], áp lực điều trị thuốc

SR tăng, di biến động dân từ vùng dịch tể SR diễn biến phức tạp, làm cho tình trạng kháng thuốc sốt rét ngày càng tăng cao [62] [63] [69], gia tăng nguy cơ thành dịch

SR Do đó việc tìm kiếm KST SR để phục vụ nghiên cứu gặp nhiều khó khăn; trong khi đó các nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá đáp ứng thuốc điều trị bệnh sốt rét của KST SR có vai trò rất quan trọng việc loại trừ SR Từ các vấn đề trên, đòi hỏi phải

có sẵn nguồn chủng KST SR Với mong muốn tạo tiền đề cho việc thành lập thư viện Genenome, thư viện chủng KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu về các kỹ thuật chuyên sâu trong chuẩn đoán và điều trị bệnh SR và phát triển vaccine

kháng sốt rét sau này, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bảo tồn chủng Ký sinh trùng

sốt rét Plasmodium spp và hướng ứng dụng”

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

 Bảo tồn chủng KST SR các mẫu được thu thập ở thực địa, trong quá trình làm đề tài tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Thành phố Hồ Chí Minh

 Bước đầu xây dựng trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome từ các mẫu KST SR thu thập được trong quá trình thực đề tài

1.4 Nội dung nghiên cứu

 Thu thập, lưu trữ và bảo tồn nguồn chủng KST SR trong Nitơ lỏng – 196oC

+ Nuôi cấy chủng KST SR tạo chủng thuần tại phòng thí nghiệm các nguồn

máu nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax đơn

thuần được thu thập từ thực địa

+ Lưu trữ nguồn mẫu KST SR từ các mẫu thu thập được trong nghiên cứu, thử nghiệm,

 Giải trình tự đoạn gene KST SR của các mẫu thu thập được

+ Chạy PCR định danh những mẫu máu nhiễm KST SR [40] [46]

+ Giải trình tự đoạn gene mã hóa 18S Ribosome đặc trưng cho từng loài KST

Bên cạnh đó, việc bảo tồn chủng KST SR tại phòng thí nghiệm, cũng góp phần duy trì nguồn chủng KST, Gene trong điều kiện KST SR đang giảm mạnh như hiện nay

Việc bảo tồn chủng KST SR cũng có vai trò quan trọng trong việc cung cấp chứng dương cho các kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp mẫu cho công tác nghiên cứu tạo vaccine, kháng thuốc sốt rét, tiêu bản mẫu hình thể KST SR trong công tác đào tạo nguồn nhân lực y tế

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau từ các kỹ thuật truyền thống (Giêm – sa) cho đến áp dụng các kỹ thuật hiện đại (sinh học phân tử) trong chuẩn đoán ký sinh trùng sốt rét, đồng thời áp dụng kỹ thuật giải trình tự để xác định trình tự đoạn Gene đặc trưng của từng loài KST SR để phát hiện KST SR, đã góp phần vào việc chuẩn đoán chính xác các chủng KST SR gây bệnh SR để có phát đồ điều trị thích hợp

Góp phần bảo tồn và duy trì nguồn chủng KST SR, nguồn dữ liệu về Gene trong giai đoạn KST SR đang giảm dần, và tình hình kháng thuốc ngày càng gia tăng [40] [62] [69] [75], cũng như phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về sốt rét

và phát triển thuốc, vaccine sau này

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Bình Phước là vùng có sốt rét lưu hành, lưu hành nặng nhất là ở các xã vùng sâu, vùng xa, giáp ranh với rừng, biên giới Cam-pu-chia [18] Trước tình trạng dân di biến động, dân đi rừng, ngủ rẫy [24], thì việc chuẩn đoán nhanh và chính xác ca bệnh sốt rét sẽ giúp y bác sĩ đề ra những biện pháp phòng tránh, có phác đồ điều trị hiệu quả, kịp thời Góp phần cho công tác phòng chống sốt rét ở tỉnh Bình Phước riêng

và sự thành công của chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia nói chung

Bên cạnh đó việc bảo tồn được nguồn chủng, nguồn gene KST SR để phục vụ cho công tác nghiên cứu sau này như: đánh giá hiệu lực của các thuốc điều trị SR

thế hệ mới, cũng như nuôi cấy để thử nghiệm trong điều kiện in vitro, nghiên cứu về

đáp ứng miễn dịch, sinh học phân tử, phát triển vaccine chống sốt rét, là những đóng góp có ý nghĩa của luận văn này

1.6 Tổng quan về bệnh sốt rét

1.6.1 Lịch sử phát hiện bệnh sốt rét

Bệnh sốt rét được biết đến cách đây hơn 2000 năm, đã được Hipocrates (Hy Lạp) và bệnh sốt rét được ông mô tả chi tiết từ thế kỷ V trước Công nguyên Ông phân chia bệnh SR ra nhiều loại như sốt định kỳ mỗi ngày, sốt mỗi hai ngày hoặc mỗi bốn ngày [58] Nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu về bệnh này và đặt ra những tên gọi khác nhau như: ở Trung Quốc gọi là nghịch tật, Việt Nam gọi là sốt rét rừng hay sốt ngã nước, tuy nhiên mới chỉ nêu lên một số đặc điểm lâm sàng và vài yếu tố liên quan [10]

Từ những năm 1600, ở Pêru người da đỏ đã dùng vỏ cây Cinchona để chữa sốt rét, đến năm 1820 Pelletier và Caventou đã chiết xuất ra hoạt chất alkaloide quinine

và cinchonin từ vỏ cây Cinchona [21]

Đến thế kỷ XIX từ những hiểu biết khá đầy đủ về nguyên nhân gây bệnh sốt rét, tác nhân gây bệnh sốt rét, véc tơ truyền bệnh sốt rét, cơ chế lan truyền và chu kỳ phát triển của KST SR

Vào năm 1880, giáo sư Alphonse Laveran (Đại học Rome) lần đầu tiên phát hiện và mô tả KST SR trong máu người, đã mở ra một kỷ nguyên mới về quá trình

nghiên cứu sinh bệnh học và các yếu tố liên quan về bệnh sốt rét làm cơ sở cho việc tìm kiếm những chiến lược phòng chống quy mô góp phần giảm thiểu tối đa những thiệt hại do bệnh sốt rét gây nên

Năm 1885, nhà bệnh học Ettore Marchiafava (người Ý) tìm thấy những sinh

vật gây bệnh có trong hồng huyết cầu người bệnh và ông đặt tên là Plasmodium

Năm 1897, bác sĩ Sir Ronald Ross (người Anh), chứng minh có sự hiện diện

của Plasomodium trong muỗi Anopheles cái

Năm 1924, Schuleman (Đức) đã phát hiện ra thuốc Pamaquine (Plasmoquine) đến năm 1930 – 1952 hàng loạt thuốc chống sốt rét tổng hợp lần lượt ra đời như Chloroquine, Proguanil, Primaquine

Năm 1974 – 1982, Trung Quốc phát triển thuốc trị sốt rét từ cây Quing Hao

Su (Artemisia annua) [21]

Năm 1985 – 1990 Việt Nam đã chiết xuất thành công Artemisinine từ hoạt chất của cây Thanh Hao hoa vàng mọc hoang ở vùng núi phí Bắc làm giảm rõ rệt tử vong sốt rét và sốt rét ác tính [10]

Từ những nghiên cứu trên, các nhà khoa học đã đúc kết lại rằng nguyên nhân của bệnh sốt rét do ký sinh trùng sốt rét (mầm bệnh phát triển trong máu bệnh nhân) được muỗi Anopheles (trung gian truyền bệnh) đốt truyền từ người bệnh sang người lành (cơ thể cảm thụ)

1.6.2 Định nghĩa bệnh sốt rét

Bệnh sốt rét là bệnh do ký sinh trùng sốt rét ký sinh trong hồng cầu người bệnh và gây ra bệnh SR với các triệu chứng toàn thân Bệnh SR có thể gây ra tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, có thể gây ra tử vong (ở thể sốt rét ác tính) [3] [12]

Với các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: cơn sốt rét run, sốt, vã mồ hôi hoặc có kèm theo gan to, lách to hoặc thiếu máu [6] [17] [58]

Bệnh SR lưu hành chủ yếu vùng rừng, đồi, núi, ven biển nước lợ; bệnh xảy ra quanh năm, phát triển mạnh vào mùa mưa [6]

Bệnh sốt rét là bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp

 Giống: Plasmodium (Có 2 tiểu giống: Plasmodium, Laverania)

 Tiểu giống Plasmodium gồm 3 loài vivax, ovle, malariae (giao bào có

hình tròn hay bầu dục)

 Tiểu giống Laverania gồm loài falciparum (có giao bào hình liềm)

 Loài: Có khoảng 120 loài kí sinh trùng gây bệnh sốt rét cho người và các động vật có xương sống, một số loài tiêu biểu như sau:

 Kí sinh loài khỉ: Plasmodium cynomolgi, Plasmodium rhodhaini,

Plasmodium knowlesi, Plasmodium simii, Plasmodium inui,

 Kí sinh loài động vật gặm nhấm: Plasmodium berghei, Plasmodium

gonderi,

 Kí sinh loài chim: Plasmodium gallinaceum, Plasmodium lophurae,

Plasmodium relictum, Plasmodium cathemerium,

 Kí sinh loài bò sát: Plasmodium mexicanum

 Kí sinh loài lưỡng thê: Plasmodium bufonis, Plasmodium

catesbiana.

Hình 1.1 Cây phát sinh loài của Plasmodium spp gây bệnh cho người và

động vật [19]

 Kí sinh trùng sốt rét gây bệnh cho người thuộc giống Plasmodium spp Cho đến nay, kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,

Plasmodium malariae là những loài làm tăng gánh nặng mô hình bệnh tật, gây tốn

kém về mặt sức khỏe và kinh tế, bệnh cũng gây tai họa cho các nước châu Á, Mỹ la tinh, khu vực Trung Đông và thậm chí ở một vài vùng của châu Âu, đặc biệt là ở các vùng cận sa mạc Sahara châu Phi [4]

 Tùy theo loài KST SR mang trong người mà bệnh nhân sốt mỗi ngày một

cơn (P falciparum), hai ngày một cơn (P vivax), ba ngày một cơn (P malariae),

cơn sốt thường xuất hiện đúng giờ, có tính chu kỳ rõ rệt, trùng khớp với nhũng đợt phát triển của KST SR [9]

Chu kỳ sống của KST SR trong cơ thể người có hạn định Tùy theo loại KST

SR mà chúng tồn tại trong cơ thể người từ 6 tháng đến 3 năm, một số trường hợp có

thể tồn tại lâu hơn, trên 10 năm như P malariae [6]

 Người mang KST SR có thể có biểu hiên những triêu chứng lâm sàng điển hình như rét run, nóng, ra mồ hôi và khát nước [17] Cũng có thể biểu hiện những triệu chứng không điển hình như sốt cao, ớn lạnh, đau toàn thân Nhưng cũng có thể không biểu hiện gì cả , đó là trường hợp người mang KST lạnh (người mang ký sinh trùng sốt rét nhưng không có biểu hiện bênh sốt rét) [6] [9]

 Bệnh có thể chữa khỏi nếu được xác định và uống thuốc trong vòng 24 giờ [74] Phát hiện trễ, bệnh gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm có thể dẫn tới tử

vong (TVSR) do P falciparum gây ra [5] [9] [12]

1.6.3 Sơ lược về dịch tể học sốt rét

1.6.3.1 Tình hình dịch tể sốt rét trên thế giới

Trên thế giới, bệnh sốt rét phân bố rộng khắp từ vùng nhiệt đới đến ôn đới,

P falciparum phân bố chủ yếu các vùng khí hậu nhiệt đới và P vivax phân bố rộng

khắp các vùng ôn đới và nhiệt đới [7] Bệnh sốt rét đã gây ra nhiều vụ dịch lớn giết chết nhiều người như vụ dịch ở Pen Giáp ở Ấn Độ (1898) có 307.000 người tử vong, ở Sri Lanka và Ceylon (1934 -1935) làm 82.000 người tử vong; ở Brazil (1938) số người mắc bệnh sốt rét là 100.000 người, số chết do sốt rét là 14.000

WHO đã xếp bệnh sốt rét đứng hàng thứ 4 trong danh sách những căn bệnh nguy hiểm nhất của thế kỷ 21.Trong những năm qua, có rất nhiều phương pháp nhằm kiểm soát bệnh sốt rét như thực hiện tẩm màn, phun thuốc diệt muỗi trong nhà và điều trị phối hợp thuốc chống sốt rét

Cuối năm 2004, có 107 quốc gia và vùng lãnh thổ có nguy cơ lây lan dịch sốt rét Trong năm 2006, WHO ước tính rằng 3.3 tỷ người được có nguy cơ nhiễm bệnh sốt rét Trong số này, 247 triệu người nhiễm (86% ở châu Phi) và gần 1 triệu (chủ yếu là trẻ em châu Phi) đã chết vì nhiễm ký sinh trùng sốt rét

Trong năm 2008, bệnh sốt rét vẫn còn lưu hành hơn 109 quốc gia và vùng lãnh thổ Trong đó có 45 quốc gia và vùng lãnh thổ là ở châu Phi Theo WHO ước tính

có hơn 1 tỉ người chết vì sốt rét mỗi năm

Theo số liệu thống kê của WHO đến năm 2009, bệnh SR vẫn lưu hành ở 108 quốc gia Ước tính có khoảng 225 triệu người mắc và 781 nghìn người chết do sốt rét (SR) Mặc dù bệnh sốt rét đã được thanh toán ở nhiều nơi trên thế giới như Châu

Âu, Bắc Mỹ, một số nước Bắc Á và bệnh SR cũng đã giảm nhiều ở một số nước trong đó có cả Việt Nam

Theo WHO ước tính năm 2010 có khoảng 216 triệu người mắc sốt rét ở 106 nước và vùng lãnh thổ có dịch lưu hành trên thế giới Khoảng 81% số người mắc sốt rét và 91% các trường hợp tử vong là ở khu vực Châu Phi 86% bệnh nhân sốt rét trên toàn cầu là trẻ em dưới 5 tuổi Tuy vậy, theo Báo cáo sốt rét thế giới 2011, trong thập kỷ qua tỷ lệ mắc sốt rét ở tất cả các khu vực trên thế giới đã giảm [64]

Ở châu Á, sốt rét xảy ra nghiêm trọng ở các tiểu vùng sông Mê Kông gồm các nước: Trung Quốc, Myanmar, Việt Nam, Lào, Thái lan và Cam-pu-chia, với hơn 500.000 ca mắc bệnh mỗi năm Vùng biên giới các nước này ngày càng có nhiều nguy cơ mắc bệnh do các hoạt động kinh tế với tình hình bất ổn xã hội, và vấn đề KST SR kháng thuốc nghiêm trọng nhất trên thế giới [6]

Sốt rét là một trong những vấn đề sức khỏe tại khu vực Đông Nam Á, cùng với các bệnh tiêu chảy, nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính, lao và HIV/AIDS Sốt rét lưu hành hầu hết ở khu vực Đông Nam Á với hơn 88% dân số sống trong khu vực

Hình 1.2 Bản đồ phân bố tỷ lệ tử vong bệnh sốt rét năm 2010 – 2013 [67]

Theo WHO, năm 2016 bệnh sốt rét đã giảm đáng kể nhưng vẫn còn 91 quốc gia và vùng lãnh thổ chưa loại trừ sốt rét, với 109 quốc gia và vùng lãnh thổ năm

2008 Hầu hết sự thay đổi này có thể là do sự triển khai rộng rãi các biện pháp kiểm soát sốt rét ở các quốc gia [73]

1.6.3.2 Tình hình dịch tể sốt rét tại Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, là điều kiện tự nhiên thuận lợi cho bệnh sốt rét phát triển, từ 1958 – 1975 chương trình tiêu diệt sốt rét đã được tiến hành ở miền Bắc và diệt trừ sốt rét ở miền Nam, sau ngày miền Nam giải phóng chiến lược PCSR quốc gia xác định khu vực miền Trung – Tây Nguyên là trọng điểm sốt rét của cả nước Chỉ trong 2 năm (1976 – 1977) tình hình sốt rét tăng vọt:

số mắc sốt rét 699.000 người, số chết sốt rét 3.976 người và 58 vụ dịch sốt rét đã xảy ra do dân từ thành thị và các khu tập trung trở về làng cũ ở vùng sốt rét chưa có biện pháp phòng chống [10]

Trong khoảng 1978 – 1986, nhờ tiến hành các biện pháp thanh toán sốt rét tích cực đã làm số mắc sốt rét, chết sốt rét mỗi năm giảm xuống 4 lần so với năm 1977

Từ 1978 – 1990, nguồn lực bị cắt giảm do không còn viện trợ từ Liên Xô cũ,

di biến động dân lớn từ đồng bằng lên miền núi và các tỉnh Tây Nguyên cùng nhiều nguyên nhân khác làm cho bệnh sốt rét quay trở lại ngày càng nghiêm trọng mà

đỉnh cao vào năm 1991, con số mắc sốt rét vẫn lên tới 2 triệu người và có tới trên

Khu vực miền Trung – Tây Nguyên luôn được xác định là trọng điểm sốt rét, qua phân tích diễn biến sốt rét trong 5 năm (2001 – 2005) thì ghánh nặng sốt rét hầu như tập trung ở đây (số BNSR chiếm 42%, số ca SRAT chiếm 80%, số tử vong do sốt rét chiếm 82% và số ca nhiễm KST SR chiếm 77% cả nước hàng năm), do đó PCSR có hiệu quả ở khu vực này cũng có nghĩa là giải quyết được tình hình sốt rét trên cả nước [10]

Năm 2012, tỉ lệ mắc sốt rét/100.000 dân giảm còn 50,64 và tỉ lệ chết do sốt rét/100.000 dân giảm còn 0,01 đó là nổ lực lớn của ngành y tế nước ta khi đã kéo giảm tỉ lệ mắc và chết do sốt rét [8] Tuy nhiên, đến năm 2015, tại Việt Nam còn khoảng 11,7 triệu người sống trong vùng sốt rét lưu hành [1] [24]

Từ việc phân vùng dịch tể sốt rét, Việt Nam hiện tại có 05 vùng dịch tễ sốt rét khác nhau [13] Cả nước có gần 15,5 triệu người sống trong vùng sốt rét, chiếm 17,5% dân số toàn quốc [15]

Theo dự án quốc gia PCSR của Việt Nam định nghĩa dịch sốt rét: “Dịch sốt rét

là khi ở một nơi có mức bệnh sốt rét (ca mắc mới) tăng đột ngột so với diễn biến bình thường trong một quần thể dân cư (tối thiểu một thôn bản, cụm dân cư) và có lan truyền bệnh tại chỗ” [43]

Loài ký sinh trùng gây bệnh ở nước ta chủ yếu là Plasmodium falciparum (54%) và Plasmodium vivax (46%) [29], và chúng cũng là 02 loài gây ra bệnh sốt rét trên toàn cầu [25]

Theo báo cáo công tác phòng chống sốt rét năm 2016 của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh, số ca mắc sốt rét ở khu vực Nam bộ – Lâm Đồng có chiều hướng giảm mạnh (1.642 ca mắc sốt rét, trong đó có 9 ca SRAT và 1 ca TVSR trong năm 2016; so với năm 2013 số ca mắc SR 3.602 ca, trong đó có 35 ca SRAT và 2 ca TVSR)

Hình 1.4 Biểu đồ thể hiện số ca nhập viện và tử vong do KST SR

tại Việt Nam [29]

1.6.3.3 Tình hình dịch tể sốt rét tỉnh Bình Phước

Bình Phước là một tỉnh thuộc miền Đông Nam bộ, nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam với 260,433 km đường biên giới giáp với vương quốc Cam-pu-chia Tỉnh là cửa ngõ, cầu nối của vùng Đông Nam bộ với Tây Nguyên và Cam-pu-chia Cụ thể, phía Đông giáp tỉnh Lâm Đồng và Đồng Nai; phía Tây giáp tỉnh Tây Ninh và Cam-pu-chia; phía Nam giáp tỉnh Bình Dương; phía Bắc giáp tỉnh Đắk Lắk và Cam-pu-chia [18]

Tỉnh có diện tích 6.871,5 km², trong đó diện tích đất lâm nghiệp chiếm 51,3% tổng diện tích đất toàn tỉnh Dân số 905.300 người, mật độ dân số đạt 132 người/km² (theo số liệu thống kê năm 2011), gồm nhiều dân tộc khác nhau (đồng bào dân tộc thiểu số chiếm 17,9%) sinh sống trên địa bàn 111 xã, phường, thị trấn (92 xã, 14 phường và 5 thị trấn) thuộc 8 huyện, 3 thị xã [18]

Theo Báo cáo của các Viện Sốt rét – Ký Sinh Trùng – Côn Trùng tại Hội nghị tổng kết công tác phòng chống sốt rét và giun sán khu vực Nam Bộ – Lâm Đồng Năm 2015, toàn quốc có 19.252 bệnh nhân sốt rét (BNSR) giảm 30,92% so với năm

2014, trong đó miền Đông Nam Bộ BNSR tăng 4,33%; năm 2015 toàn quốc có 9.331 ký sinh trùng sốt rét (KST SR) giảm 40,76% so với năm 2014, trong đó miền Đông Nam Bộ tăng 9,07%; năm 2015 toàn quốc có 32 ca sốt rét ác tính (SRAT) giảm 56,16% so với năm 2014, trong đó miền Đông Nam bộ có 14 ca SRAT; năm

2015 toàn quốc có 3 trường hợp tử vong do sốt rét (TVSR), thì miền Đông Nam Bộ chiếm 1 ca [26]

Năm 2015 khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng các chỉ số sốt rét (BNSR, KST SR, SRAT) đều tăng kể cả TVSR và tập trung ở tỉnh Bình Phước do đó, có thể nói Bình Phước là “điểm nóng sốt rét” của Việt Nam Trong đó, số KST SR (tác nhân gây bệnh hay mầm bệnh) của tỉnh Bình Phước trong năm 2015 (1.799 trường hợp) chiếm 19,28% so với cả nước (9331 trường hợp) và tăng 18,28% so với năm 2014 (1.521 trường hợp), chính vì vậy Viện Sốt Rét – Ký Sinh Trùng – Côn Trùng Trung ương đã xếp Bình Phước là điểm nóng sốt rét, trong danh sách 10 tỉnh có tỷ lệ KST

SR cao nhất Việt Nam (Bình Phước, Gia lai, Ninh Thuận, Đắc Nông, Khánh Hòa, Phú Yên, Đắc Lắc, Quảng Bình, Kon Tum, Bình Thuận) [26]

Năm 2009 tại xã Đăk Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước ghi nhận hiệu

lực điều trị khỏi của artemisinin với P falciparum chỉ đạt 85,4% Sau khi công bố

kết quả về kháng thuốc tại Bình Phước, tổ chức Y tế Thế giới đã cử 2 đoàn chuyên gia đến khảo sát và đánh giá lại kết quả đã đưa ra kết luận về việc xuất hiện chủng

P falciparum kháng artemisinin tại xã Đăk Nhau, huyện Bù Đăng, tỉnh Bình

Phước Tháng 7 năm 2010, từ kết quả kiểm tra đánh giá về P falciparum kháng

Artemisinin tỉnh Bình Phước, WHO đã đưa ra khuyến nghị và đề xuất một số biện

pháp nhằm ngăn chặn chủng P falciparum kháng artemisinin tại tỉnh Bình Phước

để phòng, chống việc lan rộng ra các vùng khác ở Việt Nam [27]

Chính vì thế, Bình Phước là điểm nóng về sốt rét tại khu vực Nam bộ - Lâm Đồng, là nguồn KST SR để có thể thực hiện thu thập và bảo tồn chủng KST SR phục vụ cho các nghiên cứu về SR sau này

1.7 Chu kỳ và hình thể của ký sinh trùng sốt rét

Chu kỳ phát triển của KST SR gồm có 2 giai đoạn: vô tính (ở người), hữu tính (ở muỗi) [33]

1.7.1 Giai đoạn phát triển trong cơ thể người

Khi ký sinh trùng sốt rét được muỗi truyền vào người bị đốt [45], các mãnh thoa trùng SR đến gan và phát triển ở đây, các mãnh thoa trùng phát triển và được phóng

thích vào máu, hình thành chu kỳ vô tính ở người [45] [48] Trong hồng cầu, ký sinh trùng sốt rét phát triển qua các giai đoạn [42]

 Trophozoite (thể sinh dưỡng, tư dưỡng, dinh dưỡng, tự dưỡng)

 Trophozoite non (thể nhẫn – ring form)

Một merozoite ngay sau khi xâm nhập vào hồng cầu, phát triển và hình thành

 Trophozoite phát triển (thể tư dưỡng non)

Nguyên sinh chất bắt màu đậm hơn, có hạt sắc tố, có chân giả Khối nguyên sinh chất to dần lên, càng to càng có nhiều hạt sắc tố

KST SR ở giai đoạn này có nhiều hình thù kì dị, không nhất định, tùy thuộc vào sự cử động phóng chân giả của kí sinh trùng Nhân to dần lên, không bào lúc đầu to, nhưng sau khi nguyên sinh chất dày lên, thì không bào dần dần thu hẹp lại, hoặc chia ra thành nhiều không bào

Để phân loại kí sinh trùng sốt rét, các nhà nghiên cứu dựa vào hình thù đặc chân như: chân giả dài hay ngắn, không bào có một hoặc có nhiều Giai đoạn này tương đối dài hơn

 Trophozoite già (thể tư dưỡng già)

Đến giai đoạn này không bào không còn nữa Nguyên sinh chất là một khối đặc dày Nhân to ra để chuẩn bị phân chia Hạt sắc tố thường tụ lại thành đám

 Schizonte (còn gọi là thể phân liệt, thể liệt sinh)

 Schizonte non (thể phân liệt non)

Nhân đã phân chia thành nhiều mảnh, nhưng nguyên sinh chất chưa phân chia

 Schizonte già (thể phân liệt già)

Đến giai đoạn này nguyên sinh chất đã phân chia và chia đều cho các nhân

hình thành các merozoite Người ta thường dựa vào cách sắp xếp và số lượng của các merozoite trong hồng cầu để phân biệt các loại kí sinh trùng sốt rét

 Gametocyte (giao bào)

Từ các merozoite hình thành giao bào đực (microgametocyte) và giao bào cái

(macrogametocyte)

Hình thể giao bào đực và giao bào cái của mỗi loài KST SR khác nhau Giao bào đực nhân to, xốp, màu đỏ nhạt, nguyên sinh chất màu xanh nhạt, hạt sắc tố màu nâu Giao bào cái nhân đặc, nhỏ, gọn hơn, màu đỏ đậm hơn, hạt sắc tố nâu xẫm hoặc đen

Hình thể các loại giao bào ở mỗi loài kí sinh trùng sốt rét cũng khác nhau

1.7.2 Giai đoạn phát triển trong cơ thể muỗi

Giai đoạn kí sinh trùng sốt rét phát triển ở dạ dày, xoang cơ thể và tuyến nước bọt của muỗi (trên tiêu bản mổ muỗi)

 Gamete (thể giao tử)

Giao tử hình thành từ giao bào được muỗi hút vào dạ dày Giao tử đực

(microgamete) có roi và giao tử cái (macrogamete) hình cầu

 Zygote (thể hợp tử)

Zygote là sản phẩm của sự dung hợp giao tử đực và giao tử cái Hợp tử hình

cầu, không di động trong vòng 18 – 24 giờ đầu

 Ookinete (thể trứng di động)

Thể zygote chuyển dạng kéo dài hình sâu và di động được gọi là thể ookinete

Thể này di chuyển đến thành dạ dày muỗi và chui lọt qua lớp tế bào liên ra bên ngoài bề mặt dạ dày rồi định cư ở đó

hạt sắc tố và màu sắc của chúng là đặc điểm phân biệt từng chủng loại kí sinh trùng sốt rét

 Sporozoite (thoa trùng)

Nhân và nguyên sinh chất của noãn bào phân chia thành các thể dạng hình kim

gọi là thoa trùng (sporozoite) Thoa trùng hình thoi có nhân ở trung tâm Người ta

ước tính mỗi noãn bào sinh sản và giải phóng ra khoảng 1000 thoa trùng Thoa trùng có thể bắt gặp ở trong xoang cơ thể muỗi và đặc biệt có nhiều ở tuyến nước bọt của muỗi trưởng thành

1.8 Tình hình kháng thuốc hiện nay của ký sinh trùng sốt rét

1.8.1 Định nghĩa kháng thuốc

Theo WHO, kháng thuốc là “khả năng một chủng ký sinh trùng có thể sống sót và phát triển mặc dù bệnh nhân đã được điều trị và hấp thu một lượng thuốc, hoặc chính xác trong máu bệnh nhân đã có nồng độ thuốc mà trước đây vẫn ngăn cản và diệt được ký sinh trùng số rét đó” Sự kháng như vậy có thể là tương đối (với liều lượng cao hơn mà vật chủ dung nạp được vẫn diệt được ký sinh trùng) hoặc kháng hoàn toàn (với liều lượng tối đa mà vật chủ dung nạp được nhưng không tác động vào ký sinh trùng)

Kháng thuốc sốt rét có thể được chia làm hai nhóm:

- Đề kháng tự nhiên: Ký sinh trùng đã có tính kháng từ trước khi tiếp xúc với thuốc, do gen của ký sinh trùng biến dị tự nhiên, tính kháng thuốc được di truyền

qua trung gian nhiễm sắc thể Ký sinh trùng có thể kháng chéo như P falciparum

kháng cloroquin cũng có thể kháng với amodiaquin

- Đề kháng mắc phải: Ký sinh trùng nhạy cảm với thuốc, sau một thời gian tiếp xúc, trở thành không nhạy cảm nữa, do đột biến ở nhiễm sắc thể, tiếp nhận gen

đề kháng từ bên ngoài qua plasmid hoặc transposon (gen nhẩy) của ký sinh trùng

1.8.2 Trên thế giới

Đề kháng với thuốc chống sốt rét là một vấn đề khó khăn trong điều trị sốt rét

[22], theo đó đề kháng của P falciparum với các loại thuốc thế hệ cũ như

chloroquine và sulfadoxine - pyrimethamine (SP), trở nên phổ biến trong những năm 1970 và 1980, làm tan mọi nỗ lực phòng chống bệnh sốt rét

Theo WHO, đề kháng là “tình trạng KST có thể sống sót hoặc phát triển dù đã

có một lượng thuốc tương đương hoặc liều cao hơn liều thường dung nhưng trong giới hạn liều dùng được hấp thu” và thuốc cần phải “tiếp xúc với KST hoặc đến được tế bào hồng cầu nhiễm trong khoảng thời gian cần thiết” [62]

Một trong những khó khăn trong PCSR hiện nay là chủng P falciparum đã

kháng với hầu hết các thuốc chống sốt rét hiện hành Chloroquine, Sulfadoxine – Pyrimethamine (SP), Mefloquine ở nhiều nước trên thế giới như Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và các nước Đông Nam Á

Tại tiểu vùng sông Mê Kông, tỉ lệ thất bại điều trị cao khi có sự đề kháng của KST SR đối với thuốc phối hợp ARTs [70] Trong những năm gần đây, ký sinh trùng kháng artemisinin đã được phát hiện tại 5 quốc gia trong khu vực tiểu vùng sông Mekong: Cam-pu-chia, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam [73]

Trong khi có rất nhiều yếu tố gây ra sự xuất hiện và lây lan của ký sinh trùng kháng thuốc thì việc sử dụng artemisinin đơn liều để trị liệu bằng đường uống, được cho là một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến kháng thuốc [6] [17] Nếu ký sinh trùng đề kháng với artemisinin phát triển và lây truyền đến các khu vực địa lý

rộng lớn khác, thì nguy cơ dẫn đến dịch rất cao do ký sinh trùng đã đề kháng thuốc [5]

Theo kết quả nghiên cứu được tiến hành tại 16 quốc gia thời gian 2002 – 2010,

SR kháng thuốc bắt đầu có biểu hiện xuất hiện tại các quốc gia này, trong đó tại Rwanda, Papua New Guinea là 9,9%, tại Burkina Faso, Cam-pu-chia, Kenya, Mozambique, Uganda là 9,1 – 12% [62] KST SR Plasmodium falciparum kháng

Artemisinin làm hơn 584.000 người chết mỗi năm [67]

Trước tình hình KST kháng Artemisinin phát triển và lan rộng, WHO và các

tổ chức trong khu vực đã có những bước đi cần thiết nhằm ngăn chặn KST kháng thuốc Theo WHO, Việt Nam là một trong số 5 quốc gia Tiểu vùng sông Mê Kông (GMS) có tỷ lệ kháng Artemisinine ngày càng gia tăng bao gồm Việt Nam, Thái Lan, Myanma, Lào và Cam-pu-chia [74] [75]

Artemisinins 1972 2009 Cam-pu-chia, Thái Lan

1.8.3 Tại Việt Nam

Việt Nam là một trong những nước xuất hiện KST SR kháng thuốc sớm trên

thế giới; từ một trường hợp P falciparum kháng Chloroquine đầu tiên được phát

hiện ở Khánh Hòa năm 1961 đến nay đã lan rộng ra 100% vùng sốt rét ở các tỉnh miền nam và nhiều tỉnh miền bắc Tỷ lệ kháng cao với Chloroquine ở các tỉnh miền Trung – Tây Nguyên: 30 - 55% (1976 -1984), 55 - 90% (1985 - 1995); kháng

Amodiaquine 36,5% in vivo, 50% in vitro; kháng Fansidar in vivo 45 - 50% Đăk Lăk cũng là một trong những tỉnh có P falciparum đa kháng thuốc, các nghiên cứu

1976 - 1996 cho thấy tỷ lệ kháng R2/R3 in vivo với Chloroquine (60 - 80%) và

Fansidar là 45 - 75% [5] [10]

Tại Việt Nam, KST SR Plasmodium falciparum kháng thuốc Artemisinine

được phát hiện đầu tiên tại tỉnh Bình Phước năm 2009 [23] [71]

Từ năm 2010 đến 2015, tỉ lệ chậm làm sạch KST SR tăng lên và được WHO ghi nhận thêm 3 tỉnh: Gia Lai năm 2010, Đắk Nông năm 2011 và Quảng Nam năm

2012, Khánh Hòa năm 2014, Ninh Thuận năm 2015 [71] Việc phát hiện KST

SR Plasmodium falciparum đề kháng với artemisinin tại tỉnh Bình Phước làm cho

việc điều trị sốt rét trở nên khó khăn (với tỉ lệ điều trị thất bại hơn 10%) [71] trong điều trị sốt rét ác tính vì artemisinin là loại thuốc có hiệu lực cao

Sự xuất hiện KST SR Plasmodium falciparum kháng thuốc ở tỉnh Bình Phước,

Bộ Y tế đã điều chỉnh phác đồ điều trị sốt rét, sử dụng thuốc phối hợp có gốc Artemsinine (ACTs) thay thế, đồng thời với cấm sử dụng đơn liều để điều trị sốt rét Artemisinine/Artesunate bằng đường uống (dạng viên) [5] [6] [17]

Cuối năm 2013, các nhà nghiên cứu đã xác định được một dấu phân tử (maker): các đột biến Kelch 13 (K13) cánh quạt đã cho thấy có liên quan đến sự

chậm làm sạch ký sinh trùng sốt rét khi điều trị bằng artemisinin cả trong in vitro và

kháng K13 liên quan đến thông tin về các kiểu gen [22] [38] [39]

Hình 1.6 Phân bố các vị trí đột biến dựa trên mô hình 3D của kháng K13

Tuy nhiên, danh sách các đột biến liên quan đến kháng artemisinin vẫn còn đang được hoàn thiện, vì vậy định nghĩa của kháng artemisinin sẽ tiếp tục phát triển Định nghĩa hiện tại về kháng artemisinin được chia làm 2 hướng [69]:

 Nghi ngờ kháng artemisinin - được định nghĩa là tần số xuất hiện cao của kiểu hình làm chậm sự làm sạch ký sinh trùng sốt rét hoặc tần số cao của các đột biến K13

 Xác định kháng thuốc artemisinin - được định nghĩa là sự kết hợp của sự chậm làm sạch ký sinh trùng sốt rét và các đột biến điểm liên quan đến kháng K13 ở một bệnh nhân

Theo đó, WHO khuyến cáo giám sát thường xuyên tình trạng kháng thuốc sốt rét [62] [69] và hỗ trợ các nước nhằm tăng cường những nỗ lực của họ trong lĩnh vực nghiên cứu quan trọng này Các khuyến nghị toàn diện hơn có sẵn trong "Kế hoạch toàn cầu của WHO về kiềm chế kháng Artemisine" được phát hành vào năm 2011

khổ khu vực cho hành động mang tên "Đáp ứng khẩn cấp tới sự đề kháng artemisinin ở khu vực tiểu vùng sông Mê Kông" (Emergency response to artemisinin resistance in the Greater Mekong subregion) trong năm 2013 [5] [38]

1.9 Tình hình nghiên cứu, bảo tồn chủng ký sinh trùng sốt rét trên thế giới

và Việt Nam

1.9.1 Trên thế giới

Năm 1880, ở tỉnh Constantin (Angieri), Laveran (Bác sĩ người Pháp) lần đầu

tiên phát hiện ra mầm bệnh sốt rét ở người và đặt tên là Oscillaria malariae

Năm 1886, Golgi (người Italia) quan sát thấy kí sinh trùng phân chia vô giới

và cơn sốt trùng khớp với lúc phân chia của ký sinh trùng sốt rét

Năm 1890, hai tác giả Grassi và Feletti đã mô tả một cách riêng rẽ mầm bệnh

Plasmodium vivax và Plasmodium malariae

Năm 1891, Romanovski (người Nga) tìm được phương pháp nhuộm kí sinh trùng sốt rét đã giúp cho việc nghiên cứu mầm bệnh được dễ dàng

Từ năm 1895 – 1897, Ronald Ross (người Anh) đã nghiên cứu thực nghiệm sốt rét trên người và chim, đã chứng minh được muỗi chính là véc tơ truyền bệnh sốt rét

Năm 1897, Welch đặt tên cho mầm bệnh sốt rét nhiệt đới là Plasmodium

falciparum Sau đó nhiều tác giả đã công nhận phát minh của R.Ross, Ông đã được

nhận giải thưởng Nobel

Năm 1912, Bass và Johns đã tiến hành nuôi cấy với các chủng ký sinh trùng

Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax, môi trường nuôi cấy lúc này glucosa

nên kết quả nuôi cấy đạt được rất hạn chế, KST SR chỉ có khả năng phát triển được vài chục chu kỳ rồi chết

Năm 1922, Stephens đã mô tả mầm bệnh sốt rét thứ 4 gây bệnh cho người là

Năm 1945 Hawking thành công trong nuôi cấy Plasmodium gallinaceum là

KST SR trên gà Tới năm 1976, Trager và Jensen đã khám phá ra phương pháp bình

đốt nến nuôi cấy Plasmodium falciparum dài ngày Từ đó mở ra triển vọng cung cấp Plasmodium falciparum cho nhiều nghiên cứu miễn dịch, hóa sinh, thử thuốc

sốt rét và tạo các mẫu kháng thuốc trong ống nghiệm

Năm 1948 – 1953, Garnham, Shortt tìm ra và mô tả thể ngoài hồng cầu ở trong tế bào gan người của kí sinh trùng sốt rét

Năm 1976, hai tác giả Trager và Jensen (người Mỹ) đã nuôi cấy liên tục thành công KST SR trong ống nghiệm

Năm 1987 – 1992, một số vaccine phòng sốt rét đã được thử trên người (ở Colombia) và tại thực địa (ở Thái Lan); bước đầu đã đem lại kết quả nhất định Năm 2002, một nhóm gồm 150 nhà khoa học Mĩ và Anh đã lập được bản đồ

gen của kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum Bản đồ gen này cung cấp một

công cụ và một cách nhìn mới, đưa đến các đích mới đầy triển vọng cho các thuốc, vaccine và mang lại hy vọng tìm ra phương pháp điều trị mới