Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng và đánh giá hoạt tính sinh học của nấm cordyceps cicadae phân lập tại việt nam

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Dương Nghĩa Bình NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Cordyceps cicadaePHÂN LẬP TẠI VIỆT

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Dương Nghĩa Bình

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG VÀ ĐÁNH

GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM

Cordyceps cicadaePHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Dương Nghĩa Bình

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG VÀ ĐÁNH

GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM

Cordyceps cicadaePHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Hồng Điệp

Hà Nội, 2017

3

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành

và sâu sắc nhất tới TS Lê Hồng Điệp, Trưởng bộ môn Sinh lý thực vật và Hoá sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - người đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo bộ môn Sinh lý thực vật

và Hoá sinh, Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ cũng như tạo mọi điền kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Thầy thuốc nhân dân TS.BS Nguyễn Đình Dũng - Giám đốc Bệnh viện Dệt May, tập thể cán bộ Khoa Sinh hóa Bệnh viện Dệt May, NCS Vũ Xuân Tạo - Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Sinh học (CBRTT) và Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã hỗ trợ em trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khuyến khích em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017

Dương Nghĩa Bình

4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 2

Chương 1 TỔNG QUAN 13

1.1 Tổng quan về chi nấm ký sinh côn trùng Cordyceps 13

1.1.1 Lịch sử phát hiện nấm Cordyceps 13

1.1.2 Phân bố của nấm Cordyceps 14

1.1.3 Đặc điểm sự xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 14

1.1.4 Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps 16

1.2 Giới thiệu chung về nấm C cicadae 18

1.2.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của nấm C cicadae 18

1.2.2 Thành phần hoạt chất chính trong nấm C cicadae 20

1.2.3 Hoạt tính sinh học của nấm C cicadae 23

1.3 Sơ lược tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps 25

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps trên thế giới 25

1.3.2 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps tại Việt Nam 27

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Phân lập nấm C.cicadae 34

2.2.2 Phương pháp định danh nấm 34

5

2.2.2.1 Chuẩn bị dịch bào tử nấm 34

2.2.2.2 Xác định hình thái nấm dưới kính hiển vi 34

2.2.2.3 Định danh nấm bằng giải trình tự vùng ITS 35

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình nuôi trồng quả thể nấm C.cicadae 37

2.2.3.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong giai đoạn nhân giống 37

2.2.3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong giai đoạn ươm sợi 38

2.2.3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới sự hình thành và sinh trưởng của quả thể nấm C.cicadae 39

2.2.4 Xác định một số hoạt chất quan trọng trong quả thể nấm C.cicadae 40

2.2.5 Nghiên cứu tác động của dịch chiết quả thể nấm lên chuột thí nghiệm 40

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Phân lập và định danh nấm C.cicadae 42

3.1.1 Phân lập chủng nấm C.cicadae 42

3.1.2 Định danh chủng Cordycepssp.bằng giải trình tự vùng ITS 43

3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong nuôi trồng quả thể nấm C.cicadae BG01 45 3.2.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong giai đoạn nhân giống 45

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm 45

3.2.1.2 Ảnh hưởng của chế độ lắc trong tạo giống dịch thể 46

3.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong giai đoạn ươm sợi 47

3.2.2.1 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng lên sự sinh trưởng hệ sợi nấm 47

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử dịch giống lên sự sinh trưởng hệ sợi nấm 48

6

3.2.2.3 Ảnh hưởng của lượng giống cấy lên sự sinh trưởng hệ sợi nấm 49 3.2.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới sự hình thành và sinh trưởng của quả thể nấm 51 3.2.3.1 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng môi trường tới sự hình thành

và sinh trưởng của quả thể nấm 51 3.2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành và sinh trưởng của quả thể nấm 52 3.2.3.3 Ảnh hưởng của độ ẩm tới sự hình thành và sinh trưởng của quả thể nấm 54 3.2.3.4 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới sự hình thành và sinh trưởng của quả thể nấm 55 3.3 Hàm lượng một số hoạt chất quan trọng trong quả thể nấm 57 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết quả thể nấm lên chuột nhắt trắng Swiss 59 3.4.1 Ảnh hưởng của dịch chiết quả thể nấm lên sức sống và sự tăng trọng của chuột 59 3.4.2 Ảnh hưởng của dịch chiết quả thể nấm lên thể lực của chuột 61 3.4.4 Kết quả giải phẫu chuột nhắt trắng Swiss sau 4 tuần thí nghiệm 62 3.4.5 Ảnh hưởng của dịch chiết quả thể nấm lên các chỉ số sinh hóa máu chuột 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 69

7

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

C cicadae : Cordyceps cicadae

C jiangxiensis : Cordyceps jiangxiensis

C militaris : Cordyceps militaris

C nutans : Cordycepsnutans

C sinensis : Cordyceps sinensis

C oxycephala : Cordyceps oxycephala

C takaomontana : Cordyceps takaomontana

GOT : Enzyme glutamic oxaloacetic transaminase

HPLC : High performance liquid chromatography

(sắc ký lỏng hiệu năng cao) PDA : Potato dextrose agar

8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Một số chỉ số sinh hóa máu của chuột thí nghiệm 54 Bảng 3.2 Một số chỉ số sinh hóa gan và thận của chuột thí nghiệm 54

9

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm C sinensis tự nhiên tại Tây Tạng - Trung Quốc 3

Hình 1.3 Nấm C militaris nuôi trồng nhân tạo tại Trung Quốc 17

Hình 1.4 Nấm C militaris hình thành và phát triển quả thể trong nuôi trồng

nhân tạo tại Việt Nam

18

Hình 1.5 Nấm C nutans và Isaria tenuipes nuôi cấy tại Viện Khoa học Lâm

nghiệp Việt Nam

20

Hình 3.3 Sinh trưởng của hệ sợi nấm C cicadaeBG01 ở các điều kiện nhiệt

Hình 3.7 Thời gian hệ sợi nấm C cicadaeBG01 lan kín môi trường với các

nồng độ bào tử dịch giống cấy khác nhau

40

Hình 3.8 Sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng môi trường lên sự hình

thành và phát triển quả thể nấm C cicadae BG01

Hình 3.13 Hàm lượng adenosine và cordycepin trong quả thể nấm C cicadae

BG01và cơ chất sau 50 ngày nuôi trồng

48

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian thu hoạch tới hàm lượng adenosine và

cordycepin trong quả thể nấm C cicadaeBG01

48

Hình 3.15 Sức sống của chuột sau 4 tuần thí nghiệm 50

Hình 3.17 Sự tăng trọng của chuột sau 4 tuần thí nghiệm 51 Hình 3.18 Thời gian bơi của chuột sau 4 tuần thínghiệm 52 Hình 3.19 Hình ảnh giải phẫu chuột ở các nhóm thí nghiệm 53

nấm Cordyceps Chi nàycó hơn 450 loài khác nhau, phân bố trên toàn thế giới, đặc

biệt ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Đông Nam Á và Đông Á Nhiều

loài trong chi nấm Cordyceps bao gồm Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris,

Cordyceps cicadae…có các hợp chất có hoạt tính sinh học quý

Nấm C cicadae đã được sử dụng trong y học Trung Quốc hơn 1500 năm qua, lâu hơn so với C sinensis Nấm C cicadae được coi như một nguồn dược liệu thay thế cho nấm C sinensis Nấm C cicadae có rất nhiều tác dụng đã được chứng

minh như: điều trị co giật ở trẻ em, kháng khối u, giảm đau và an thần, cải thiện

chức năng thận, chống mệt mỏi, điều hòa miễn dịch, … Loài nấm nàyphân bố ở

nhiều khu vực trên thế giới vì điều kiện sống của nó được xem như ít nghiêm ngặt

hơn so vớiC sinensis Nấm C cicadae đã được ghi nhận phân bố nhiều tại Trung

Quốc, ngoài ra còn ở Nam Á, Châu Âu, Bắc Mỹ và đảoJeju ở Hàn Quốc

Tại Việt Nam, 5 năm trở lại đây việc nghiên cứu và nuôi trồng nấm

Cordyceps phát triển rất mạnh Tuy nhiên loài nấm được nuôi trồng là loài C militaris và chủ yếu các chủng đang được sản xuất đều được nhập từ nước ngoài

Chưa ghi nhận nghiên cứu chính thức nào về nghiên cứu điều kiện nuôi trồng và

đánh giá tiềm năng ứng dụng trong y dược của loài C cicadae được phân lập từ tự nhiên Việt Nam Gần đây, nhóm nghiên cứu đã tìm được một chủng nấm ký sinh ở

vùng rừng núi huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang Phân tích hình thái sơ bộ cho thấy

12

đây có thể là chủng nấm thuộc loài C cicadae Việc định danh chính xác mẫu vật

này, khảo nghiệm khả năng nuôi trồng nhân tạo, đánh giá hàm lượng dược chất và hoạt tính sinh học của mẫu nấm là việc làm cần thiết để đánh giá, khai thác nguồn gen quý của nước ta Từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều kiện nuôi trồng và đánh giá hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps cicadae phân lập tại Việt Nam” với những nội

dung chính như sau:

- Phân lập định danh nấm C.cicadae dùng cho nghiên cứu từ mẫu nấm thu thập từ

tự nhiên dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự vùng ITS của rDNA

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình nuôi trồng quả thể nấm

C.cicadae trên môi trường nhân tạo

- Phân tích một số thành phần hóa học quan trọng trong quả thể nấm C.cicadae

- Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết quả thể nấm lên chuột nhắt trắng Swiss thông qua các chỉ tiêu sức sống, tăng trọng, thể lực và sinh hóa máu

Hình 1.1 Nấm C sinensis tự nhiên tại Tây Tạng - Trung Quốc [31]

Những câu truyện mang tính thần thoại và truyền thuyết liên quan đến loài nấm này được lưu truyền trong nhiều thiên niên kỷ Hiện nay, các ghi nhận về thời gian phát hiện đầu tiên loài nấm này chưa được thống nhất Theo Das (2009) thì

nấm Cordyceps được biết đến từ những năm 2000 trước công nguyên [62] Nhưng

theo Holliday và cộng sự (2004) tổng hợp từ nhiều nguồn tài liệu ghi nhận đầu tiên

về nấm Cordyceps được thực hiện tại Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên Tiếp sau đó có nhiều công trình được xuất bản với nội dung về loài nấm Cordyceps

của các học giả xứ Tây Tạng từ thế kỷ 15 đến thế kỷ 18, trong đó có công trình đầu

tiên được cho là có cơ sở khoa học tin cậy nhất mô tả về nấm Cordyceps của Yiluo năm 1757, trong cuốn sách Dược điển, dưới triều Đại Thanh Theo sau các học giả xứ Tây Tạng, việc phát hiện ra giá trị của nấm Cordyceps thuộc về những

Wu-14

người chăn bò trên núi Hymalaya ở Tây Tạng cũ và Nepal, họ thấy rằng những chú

bò gặm cỏ ăn phải cây nấm này vào mùa xuân đã trở nên cuồng nhiệt, bò đực luôn

tìm và theo sát bò cái.Loài nấm C sinensis được ghi nhận lần đầu tiên trong văn

hóa y học cổ truyền của Trung Quốc là trong bản “Trích yếu về y dược” của Wang

Ang vào năm 1694 Năm 1757, C sinensis có tên “Bei Cao Cong Xin” được đặt bởi

Yiluo Wu Năm 1765, Xueming Zhao gọi là “Ben Cao Gang Mu Shi Yi” [90] Hiện

nay, rất nhiều loài Cordyceps mới đã được phát hiện và nghiên cứu, kết quả nghiên

cứu cho thấy các loài này sở hữu các hoạt tính dược học không thua kém gì so với

C sinensis

1.1.2 Phân bố của nấm Cordyceps

Nấm Cordyceps thườngđượcphát hiện vào mùa hè ở một số cao nguyên có độ

cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt biển, đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên,

Cam Túc, Vân Nam Đây chính là nguồn nấm Cordyceps tự nhiên Ngoài ra còn

phát hiện tại các vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan Hiện nay, khoảng hơn

400 loài đã được tìm thấy, trong đó có khoảng 90 loài được phát hiện ở Trung Quốc [89]

Tại Việt Nam, nấm Cordyceps cũng đã được phát hiện tại nhiều địa điểm khác nhau Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự đã phát hiện 3 chủng là C nutans Pat, tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang [11], C gunni Berk, tại vườn Quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc [9], C militaris Link, tại vườn

Quốcgia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai [8] Năm 2010, Phạm Thị Thùy phát hiện được 2

loài là C nutans ở Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và C militaris ở Vũ

Quang (Hà Tĩnh) [13]

1.1.3 Đặc điểm sự xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ cuticun của chúng Bản chất là hiện tượng bào tử nấm ký sinh vào ấu trùng hoặc nhộng của bọ cánh phấn, côn trùng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và

15

bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp cuticun.Quá trình xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng bao gồm 3 giai đoạn chính:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn xâm nhập

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzym ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N-axetylglucosaminidase, cenlulase… Các enzyme này được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài.Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticun) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzym có vai trò quan trọng, nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzym phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzym này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm

16

 Giai đoạn 3: Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Xác côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Sau khi nấm ký sinh côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử.Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng các enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học Sau đó các bào tử được hình thành trên

bề mặt cơ thể vật chủ [36].Cơ thể côn trùng bị chết do nấm ký sinh không bị tan nát,

mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu chết Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác

1.1.4 Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps

Trên thế giới, các nghiên cứu về tác dụng của Cordyceps rất được các nhà khoa học quan tâm Rất nhiều nghiên cứu đã được công bố chứng minh Cordyceps

có hoạt tính kháng oxy rất cao, kháng ung thư, kháng một số virus, vi khuẩn và nấm

Hoạt tính kháng oxy hóa của nấm Cordyceps là một trong những vấn đề

được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Yu và cộng sự (2006) đã so sánh về hiệu quả

bảo vệ giữa C militaris nuôi cấy và C sinensis tự nhiên chống lại quá trình oxy hóa Kết quả nghiên cứucho thấy ở C militaris, khả năng ức chế sự oxy hóa ở liposom thì cao hơn nhưng ởprotein thì thấp hơn C sinensis, hàm lượng polyphenol

và các hoạt chất sinh học như cordycepin và adenosin thì cao hơn C sinensis Tiếp

tục nghiên cứu trên polysaccharid và polyphenol, kết quả chothấy mặc dù polyphenol có hoạt tính kháng oxy hóa nhưng hiệu quả bảo vệ thìkhông thể chỉ

được tạo ra bởi chúng vì hàm lượng quá thấp Hơn nữa, hàm lượngpolyphenol ở C

militaris cao hơn C sinenis nhưng hiệu quả bảo vệ tránh khỏi sựoxy hóa protein và

LDL ở C militaris lại thấp hơn, chứng tỏ các hợp chấtpolyphenol không phải là hợp

17

chất duy nhất tạo ra khả năng kháng oxy hóa ở Cordyceps Khảo sát hoạt tính kháng

oxy hóa của polysaccharid lấy từ 2 chủng trênbằng phương pháp TEAC, kết quả cho thấy các polysaccharid này có hoạt tính, nêncó thể kết luận hoạt tính kháng oxy hóa ở 2 chủng trên một phần có từpolysaccharid [84] Xiao và cộng sự (2011) đã

nghiên cứu tiềm năng kháng oxy hóa trên các phân đoạn polysaccharid từ C

jiangxiensis, còn được gọi là “Cao Mu Wang” Kết quả cho thấy C jiangxiensis

biểu hiện hoạt tính bắt các gốc tự do DPPH, hydroxyl, superoxid, năng lực khử và tạo phức với các ion Fe2+ Tác giả khẳng định rằng các phân đoạn polysaccharid của

C jiangxiensis đều có hoạt tính kháng oxy hóa cao, trong đó, các phân đoạn có

trọng lượng phân tử khác nhau biểu hiện hoạt tính kháng oxy hóa khác nhau, chứng

tỏ trọng lượng phân tử có ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính sinh học của polysaccharid [80] Cũng nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa trên các phân đoạn polysaccharid, Wu và cộng sự (2011) đã chỉ ra phân đoạn polysaccharid tinh sạch từ

C militaris cho hoạt tính kháng oxy hóa cao, điều này có thể liên quan đến khả

năng chuyển electron hoặc nhường hydrogen [78] Zhang và cộng sự (2010) cho

rằng các chất khử có trong Cordyceps biểu hiện hoạt tính kháng oxy hóa bằng cách

bẻ gãy phản ứng chuỗi điện tử tự do bằng cách nhường hydrogen [88] Khả năng

kháng oxy hóa cao là tiềm năng ứng dụng trong y dược của nấmCordyceps Dịch chiết từ nấm C sinensis có khả năng làm giảm hiện tượng thiếu máu não cục bộ

thông qua hoạt tính kháng oxy hóa [52]

Tác dụng kháng ung thư, chống rối loạn, kháng virus, vi khuẩn và nấm của

Cordyceps cũng được đề cập tới rất nhiều trong các công bố của các nhà khoa học

trên thế giới Adenosin và 6,7,2',4',5'- pentamethoxyflavon ly trích từ C militaris có khả năng ức chế HIV-1 protease [37] Nấm C militaris được chứng minh có tác

dụng chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan hiệu quả [57] Tác dụng chống ung thư được đề cập đến trong nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia

trên thế giới Dịch chiết từ thể quả nấm C militariscó tác dụng chống ung thư, hiệu

quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của

18

bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình này Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát

triển của tế bào ung thư [83] C militariscó tác dụng kìm hãm sự phát triển của

dòng tế bào ung thư máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt hóa enzym caspase-3 [47]

So với thế giới, các nghiên cứu về tác dụng của của nấm Cordyceps ở Việt

Nam chưa được công bố nhiều Phần lớn những gì mà các nhà nghiên cứu Việt Nam có được về nguồn dược liệu quý hiếm này đều chỉ dừng lại ở việc phát hiện các chủng sẵn có trong tự nhiên Một trong số ít các nghiên cứu về tác dụng của

nấm Cordyceps ở Việt Nam là nghiên cứu của Đái Duy Ban và cộng sự (2009) Theo nghiên cứu của tác giả thì nấm Cordyceps là một loại dược liệu quý hiếm, có

tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh virus, ung thư, HIV/AIDS, đái tháo đường và suy giảm tình dục [1]

1.2 Giới thiệu chung về nấm C cicadae

1.2.1 Đặc điểm sinh học và phân bố của nấm C cicadae

Nấm C cicadae ngoài tự nhiên có quả thể với hình dạng như bông hoa, chúng thuộc họ Clavicipitaceae, chi Cordyceps Loài nấm này thường ký sinh trên xác hoặc ấu trùng của loài Cicada flammate, Platypleura kaempferi, Cryptotympana

pustulata và Patylomia pieli Xác hoặc ấu trùng của các loài côn trùng được nấm C cicadae sử dụng như một nguồn cung cấp dinh dưỡng, khi gặp điều kiện thuận lợi

chúng sẽ hình thành thể quả ở phần đầu hoặc phần cuối của ấu trùng Dạng vô tính

của nấm C cicadae còn được gọi là Isaria cidadae Sau này nấm C cicadae được gọi với nhiều tên khoa học khác như Isaria basili, Sphaeria sinclairi và

Paecilomyces cicadae[67] Năm 2017 hệ gen nấm C cicadae đã được giải trình tự

toàn bộ, đây là một yếu tố thuận lợi cho việc nghiên cứu loài nấm này Nấm C

cicadae hình thành quả thể dạng vô tính Hệ gen của nấm chỉ có cấu trúc gen MAT

1-2-1 và có 1 cấu trúc được nhận dạng là khá giống gen MAT 1-1-1 ở các loài như

C militaris, tuy nhiên cấu trúc này đã bị mất đi một phần [54]

Nấm C cicadae thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, với nhiệt

độ 18 oC - 24˚C và có độ ẩm tương đối lớn hơn 80% C cicadae thường phát triển

theo chiều dọc, tại các sườn núi đón nắng ở độ cao 700 - 900 m Ở Trung Quốc, chúng thường tìm thấy tại các tỉnh Phúc Kiến, Chiết Giang, Vân Nam, Tứ Xuyên, Giang Tô và thung lũng của Cao nguyên Vân Nam-Tây Tạng [20] Ở Nhật Bản,

nấm C cicadae chủ yếuphân bố ở vùng rừng núi ở độ cao thấp, phía namFukushima Ở Hàn Quốc, C cicadae được tìm thấy trên đảo Jeju Tại Đài Loan,

20

C cicadaephát hiện trong rừng phía Bắc Đài Loan Hơn nữa,chúng cũng được thấy

tại Thái Lan, Đông Nam Á, Bắc Mỹ và Châu Âu [59]

1.2.2 Thành phần hoạt chất chính trong nấm C cicadae

Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, C cicadae đã được coi như một vị thuốc quý hiếm có giá trị tương tự như C sinensis với các thành phần chính như: các axit

amin, polysaccharide, nucleoside, polysaccharide, ergosterol và mannitol Hàm lượng của các thành phần này được sử dụng làm chỉ số quan trọng để đánh giá chất

lượng của nguồn nấm Cordyceps Các thành phần hoạt chất chính đã được xác định trong nấmC cicadae như: ISP-1 (myriocin), adenosine, cordycepin,N6- (2-

hydroxyethyl) adenosine (HEA), ergosterol, peroxit, cyclic heptapeptide ,polysaccharides [33]

* ISP-1

Myriocin được phát hiện trong dịch lên men nấm C cicadae[27] Đây là một

trong những chất ức chế miễn dịch mạnh được sử dụng trong việc cấy ghép các cơ quan, điều trị các bệnh tự miễn do có ít tác dụng phụ lên thận FTY720 là một dược phẩm có nguồn gốc từ myriocin được phát triển ở Nhật Bản và chuyển giao cho Novartis (Basel, Thụy Sĩ) FTY720 có tác dụng trong điều hòa miễn dịch [56], giảm

xơ vữa động mạch [30]

* Adenosine

Adenosine là một chất chuyển hóa của các nucleotide adenine và là một thành phần có mặt trong thuốc đã được tổ chức FDA của Mỹ (Food and Drug Administration) chấp thuận và được sử dụng rộng rãi trong kiểm soát rối loạn nhịp tim Adenosine được coi như một chất chỉ thị để đánh giá chất lượng nấm

Cordyceps Hàm lượng adenosine có trong hệ sợi và quả thể nấm C cicadae là

1,90mg/g và 3,437 mg/g, cao hơn so với trong nấm C sinensis(0,48mg/g)[53, 73]

Các nghiên cứu dược lý cho thấy, adenosine tác dụng có lợi cho hệ thống thần kinh trung ương, chống rối loạn tim mạch[51], chống ngưng kết tiểu cầu, kháng bức xạ

và tác dụng chống khối u [85]

21

* Cordycepin

Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng của nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đường ribose Cordycepin được

tách chiết lần đầu vào năm 1950 từ nấm Cordyceps Cordycepin có công thức

C10H13N5O3 và có phân tử lượng 251, điểm nóng chảy tại 230-231˚C, độ hấp thu cực đại tại 259 nm Có thể hoà tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhưng không hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu tách chiết cordycepin đã sử dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung môi[90].Theo Li và cộng sự (2007) đã cho thấy hàm lượng

cordycepin trong sợi nấm của C cicadae là 2,77mg/g, cao hơn so với trong sợi nấm

C.sinensis và tương đương với sợi nấm C militaris[48]

* N6- (2-hydroxyethyl) adenosine (HEA)

Các nucleoside và các chất tương tự chúng có thể tham gia vào việc điều trị

giảm đau [61] Hàm lượng HEA trong quả thể nấm C cicadae là 7,025mg/g [53] HEA được coi là chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng của loài nấm C cicadae

HEA có thể liên kết với thụ thểɑdo đó có tác dụng giảm đau bằng cách kiềm chế sự giải phóng các chất dẫn truyền xung thần kinh Cơ chế điều tiết giảm đau của HEA khác với các thuốc giảm đau thuộc nhóm opioid, vì vậy không có sự phụ thuộc thuốc sau khi điều trị bằng HEA và an toàn hơn khi sử dụng cho các ứng dụng lâm sàng Các nghiên cứu khác cho thấy HEA có liên quan tới các ion canxi và sự co cơ tim, điều này có tiềm năng trong điều trị các bệnh rối loạn tim mạch [28] Ngoài ra, HEA còn có tác dụng đối với các chứng bệnh nhồi máu cơ tim[58]

* Ergosterol và peroxit

Ergosterol và peroxit được tách chiết từ hệ sợi nấm C cicadae Ergosterol có

khả năng chống oxy hóa và là một tiền chất của vitamin D2 [45].Chúng có nhiều hoạt tính sinh học như chống khối u, chống viêm, chống virus và chống xơ vữa động mạch Chúng cũng ức chế sự hoạt hóa và tăng sinh tế bào T và hoạt động như một chất ức chế miễn dịch [46]

22

* Cyclic heptapeptide

Duarte và cộng sự (2007) thu được 5 hoạt chất thuộc nhóm cyclic

heptapeptide từ nấm C cicadae, bao gồm bassintin,bassintin A, beauvericin,

beauvericin A và beauvericin B[26] Bassintin và bassintin A có tác dụng ức chế đáng kể sự kết tập tiểu cầu [41] Beauvericins có thể chống lại sự co giật, khối u và ảnh hưởng đến nhịp tim và an thần [49]

* Polysaccharide

Cordyceps chứa một lượng lớn polysaccharide, khoảng 3-8% khối lượng, đây

là một trong những hợp chất sinh học chính Các hợp chất polysaccharide ở

Cordyceps là một galactomannan nhiều nhánh Các hợp chất này bao gồm

D-mannose và D-galactose với tỷ lệ 3:5, thường chứa một tỷ lệ nhỏ protein Nó là một cấu trúc phân nhánh gồm các liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các gốc α-D-mannopyranosyl ở mạch chính, có các liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng nhỏ Tuy nhiên, một mannoglucan với trọng lượng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol được phân tách gần đây chỉ chứa các đơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9 Các phân tích cho thấy nó có một khung sườn α-D-glucan với các liên kết (1-4) và (1-3); và các mạch nhánh của α-D-(1-6)-mannopyranose (Manp) được gắn vào khung sườn qua vị trí O-6 của gốc α-(1-3)-glucopyranosyl (Glcp) Dược tính của polysaccharid là từ các đặc tính của nó như trọng lượng phân tử, ví dụ như các polyglucan có trọng lượng phân tử lớn hơn (10-

1000 kDa) có xu hướng tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu quả hơn Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do sự tăng cường miễn dịch cho cơ thể hơn là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp.Polysaccharide có trong loài

nấm C cicadae có khả năng tăng cường miễn dịch đáng kể bằng sự tăng cường hoạt động thực bào của các tế bào nội mô[22] Polysaccharide được tìm thấy trong C

cicadaeđược chứng minh không gây độc Kim và cộng sự (2011) đã chứng minh

rằng polysaccharides có nguồn gốc từ sợi nấm C cicadae thúc đẩy sự trưởng thành

23

của các tế bào đuôi gai, do đó C cicadae có thể cảm ứng chống khối u và đáp ứng

miễn dịch[43]

1.2.3 Hoạt tính sinh học của nấm C cicadae

Nấm C cicadae được quan tâm bởi chúng có nhiều hoạt tính sinh học tiềm

năng, đồng thời chúng không gây độc với ngưỡng rộng [31] Trong thử nghiệm độc

tính cấp tính trên chuột thí nghiệm, chiết xuất của nấm C cicadae (60g/kg) không

gây ảnh hưởng tới tỷ lệ tử vong trong 72 giờ sau khi tác động[19] Theo Song và

cộng sự (2004) đã chứng minh rằng liều dung nạp tối đa đối vớiC cicadae là

80g/kg trong thử nghiệm độc tính cấp, cao hơn so với liều khuyến cáo lâm sàng 444 lần [50]

Nấm C cicadae có rất nhiều tác dụng đã được chứng minh như: kháng khối u

[68], cải thiện chức năng thận [91], chống mệt mỏi [71], điều hòa miễn dịch [74]…

Một trong những hoạt tính được quan tâm nhiều nhất của nấm C cicadae đó

là tác dụng trong việc cải thiện chức năng của thận NấmC cicadaeđã được thử

nghiệm lâm sàng cho thấy tác dụng mạnh trong việc cải thiện chức năng của thận ở

các bệnh nhân suy thận mạn tính NấmC cicadaecó hiệu quả trong việc làm giảm

hàm lượng protein trong nước tiểu, dẫn tới làm giảm các tổn thương ống niệu quản

thận và bảo vệ chức năng ống thận [39] Năm 2011, lần đầu tiên nấm C cicadae được chứng minh vai trò ức chế sự xơ hóa nang thận Như vậy việc sử dụng nấm C

cicadae được coi là biện pháp hiệu quả để chống xơ hóa thận[91] Các nghiên cứu

khác cũng đã phát hiện ra các hoạt chất từ loài nấm C.cicadae trong việc bảo vệ thận Zhu và cộng sự (2014) đã báo cáo rằng 12,5mg/ml peroxit ergosterol từ C

cicadae có thể cải thiện TGF-β1 gây ra sự tăng sinh nguyên bào sợi ở thận và biểu

hiện fibrtonectin, do đó chống sự tiến triển của xơ thận[92] Polysaccharide chiết từ

nấm C.cicadae được chứng minh có vai trò tăng cường chức năng miễn dịch của thận C cicadaegiúp cải thiện tình trạng thiếu máu thận tốt hơn so với C sinensis

C cicadaelàm tăng đáng kể hàm lượng hemoglobin, số hồng cầu và dung tích hồng

cầu [65]

24

Hoạt tính kháng ung thư của nấm C cicadae cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Galactomannan (CI-P và CI-A) tách chiết từ nấm C cicadae thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào khối u sarcoma 180 [42] Dịch chiết từ nấm C cicadae

kết hợp với adriamycin có tác dụng ức chế và giảm hình thành khối u tuyến phổi

trong điều kiện in vitro[16] Một nghiên cứu khác về dịch chiết của nấm C cicadae

cho thấy dịch chiết của nấm này trong nước có khả năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư gan MHCC97H bằng việc làm dừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G2/M, tuy nhiên chưa thấy bằng chứng về quá trình chết theo chu trình (apoptosis) [69] Nghiên cứu thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư của động vật cho thấy nấm

C cicadae có khả năng ức chế khối u đối với dòng tế bào trứng chuột CHO Hai

thành phần hoạt chất có khả năng chống khối u được tách chiết và tinh sạch, trong

đó có một thành phần đã biết là cordycepin Thành phần thứ hai có thể ức chế rõ ràng sự phát triển của tế bào CHO, và ở nồng độ 50μg/ml, tỷ lệ ức chế tăng trưởng

miễn dịch của cơ thể đã được chứng minh do có sự tác động của nấm C

cicadaeđến việc điều chỉnh interleukin-2 (IL-2) và sản xuất interferon-gamma

(IFN-gamma) trong tế bào đơn nhân [74] Các polysaccharide từ nấm C cicadae giúp

tăng cường chức năng thực bào và chức năng miễn dịch, từ đó chức năng miễn dịch

của cơ thể được cải thiện dần [82] Các polysaccharide từ nấm C cicadae còn có

vai trò như tác nhân chống lão hóa, đây là một hoạt tính sinh học quý của loài nấm này có tiềm năng ứng dụng phục vụ nâng cao sức khỏe con người [82]

Ngoài các hoạt tính sinh học trên, nấm C cicadae còn có tác dụng tăng cường thể lực chống mệt mỏi Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy nấm C cicadae

giúp tăng cường thể lực cho chuột thông qua việc giúp kéo dài thời gian bơi, kéo dài thời gian tồn tại ở điều kiện áp suất và nhiệt độ cao [71] Nấm giúp cơ thể chống lại

25

bức xạ tia cực tím (UV) [18], giúp tăng sinh tế bào tạo xương ứng dụng trong việc điều trị các bệnh loãng xương [72]

1.3 Sơ lược tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps

1.3.1 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps trên thế giới

Các nghiên cứu trên thế giới đã hoàn toàn chứng minh được công dụng vượt

trội của nấm Cordyceps là một nguồn dược liệu quý Vì vậy, việc nuôi trồng các

loài nấm quý hiếm này đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ quy

mô phòng thí nghiệm thu sinh khối sợi nấm, tới quy mô lớn hơn thu quả thể nấm

Hầu hết các loài Cordyceps ký sinh trên ấu trùng côn trùng hoặc các loài chân đốt Loài nấm Cordyceps có giá tri ̣kinh tế cao nhất là C sinensis(Berk.), là loài ký

sinh trên sâu bướm, phân bố ở cao nguyên Tây Tạng của Trung Quốc và đồng cỏ

trên cao của Nepal, Bhutan và Ấn Độ[64] C sinensis là một loại nấm dược liệu có

giátrị cao, đươc ̣ thu hái và giao dịch từ lâu đờ i Do bị khai thác triệt để, số lượng

của C sinensis trong tự nhiên giảm mạnh Hiện nay loài này chưa được nuôi trồng

nhân tạo thành công, mà loài nấm này chỉ được khai thác ngoài tự nhiên

Xiaolan (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa cho

13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc [79] Sung (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnh của 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Hàn

Quốc [66]

Không phân bố ở các điều kiên ̣đia ̣ lý nghiêm ngăt ̣ như C sinensis, loài nấm

C.militaris có phân bố rộng trên toàn thế giới Tuy nhiên, mật độ trong tự nhiên của

nấm lại không đáng kể, và sản lượng quả thể nấm này trong tự nhiên rất thấp, do đó trong những năm gần đây đãcó nhi ều nghiên cứu trên việc nuôi cấy quy mô lớnqu ả thể và tơ nấm này cho ứng dụng trong dươc ̣liêu ̣[29]

Nuôi trồng quả thể nấm C militaris được tiến hành ở nhiều nước trên thế

giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại

26

Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100000 kg sản phẩm Sản phẩm

nấm C militaris từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả

các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm [10]

Tại Thái Lan, Wongsa (2005) đã nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi và sự

hình thành bào tử chồi của nấm C unilateralis ký sinh kiến Môi trường PDA

(Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract Agar) được dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi [77]

Tại Hàn Quốc, Kim và cộng sự (2006) đã sử dụng nhộng tằm để nuôi trồng

thể quả nấm C militaris Nhộng tằm được đựng trong các lọ nuôi cấy, khử trùng ở

121oC trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn kín toàn bộ giá thể, trong điều kiện nhiệt độ 20-25˚C, cường độ ánh sáng 500-700 lux

đã hình thành mầm thể quả Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0,5 g/lít KH2PO4, 0,5 g/lít K2HPO4.3H2O, và 0,5 g/lít MgSO4.7H2O [44] Cho và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng

của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO-7846 của loài C

militaris trên môi trường dinh dưỡng và quá trình hình thành thể quả nấm C militaris với giá thể là sâu non loài Allomyrina dichotoma Linnaeus Kết quả cho

thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thuần khiết Chỉ có 2 chủng CHO-7208 và CHO-7846 hình thành thể quả khi sử

dụng sâu non Allomyrina dichotoma Linnaeus làm giá thể Chiều dài của thể quả đạt

51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy [23]

27

Hình 1.3 Nấm C militaris nuôi trồng nhân tạo tại Trung Quốc [89]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps tại Việt Nam

Các nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps ở Việt Nam chưa nhiều và chưa có hệ

thống Một số ít các nghiên cứu được tiến hành nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu về sự sinh trưởng của hệ sợi hoặc nghiên cứu tạo quả thể ở mức độ thử

nghiệm.Tại Việt Nam, loài nấm thuộc chi Cordyceps được quan tâm nghiên cứu và

nuôi trồng nhiều nhất là C militaris

Phạm Quang Thu và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết các chủng nấm Đông trùng hạ thảo C

militaris (L.:Fr) Link Đặc điểm sinh học của nấm C militaris bao gồm đặc điểm

sinh trưởng, loại môi trường dinh dưỡng, pH của môi trường, nhiệt độ và độ ẩm không khí tối ưu cho sự phát triển của nấm đã được nghiên cứu Kết quả chỉ ra rằng

8 chủng nấm C militaris gồm 4 chủng thu thập ở Việt Nam, 3 chủng sưu tầm từ

Nhật và 1 chủng ở Trung Quốc, tất cả đều sinh trưởng bình thường trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong đó 4 chủng sinh trưởng nhanh bao gồm chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 và chủng F1080 với tốc độ lần lượt là 104,66; 122,02; 107,64; 105,08 μm/giờ, 4/8 chủng nấm sinh trưởng chậm là chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 và chủng F1012 với tốc độ sinh trưởng đạt 69,95; 71,92; 79,37

và 80,36 μm/giờ Các đặc điểm nuôi cấy cho sự phát triển tối ưu của hệ sợi được xác định là môi trường dinh dưỡng là PDA có bổ sung thêm 10% nhộng tằm, nhiệt

28

độ không khí thích hợp nhất là từ 20 - 25˚C, một số chủng như HL2 và chủng F1012 cho sinh trưởng nhanh ở cả nhiệt độ thấp 15oC Độ ẩm trong không khí trong khoảng 80 - 85%, và môi trường pH là axit từ 4,5 - 6,5 [7]

Nguyễn Thị Mi và cộng sự (2015) đã đưa ra điều kiện tối ưu cho sự phát

triển của hê ̣ sợi nấm C militarisTS06 Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng của hê ̣ sợi nấm C militaris là môi trường PDA có bổ

sung 5% nhộng tằm, 5% nước dừa,pH = 6,5, nhiệt độ 20˚C và độ ẩm 80% [5] Quả

thể của chủng nấm C militarisTS06 hình thành và phát triển tốt nhất trênmôi

trường phối trộn gạo, nhộng tằm và nước dừa, nhiệt độ 20-25˚C với cường độ chiếu sáng 500 lux Với các điều kiện trên quả thể nấm hình thành sau khoảng 34,12 ngày

kể từ ngày cấy giống, kích thước quả thể sau 60 ngày nuôi đạt trung bình 49,62mm Quả thể to, dài và ít phân nhánh Đã bước đầu xác định được chất lượng quả thể

nấm C militaris thông qua hàm lượng adenosine và cordycepin Trong quả thể nấm,

hàm lượng adenosine trung bình đạt 0,18 mg/g và hàm lượng cordycepin trung bình đạt 11,23 mg/g[6]

Hình 1.4 Nấm C militaris hình thành và phát triển quả thể trong nuôi trồng nhân

tạo tại Việt Nam [6]

Cũng trên loài C militaris, khi nuôi trên các môitrường khác nhau s ẽ có các

hı̀nh thái khác nhau Các số liệu nghiên cứu tại Đại học ThủDầu Một cho thấy trên môi trường rắn bổ sung đaṃhữu cơ từ bột nhộng, nấm tạo quả thể dạng sợi, chiều dài 5-6 cm sau 9 tuần Trên môi trường l ỏng tĩnh sử dụng môi trường SDAY và thạch agar không thấy hiên ̣ tượng sinh quả thể[12]

29

Nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Tây Bắc nghiên cứu trên chủng nấm

C militaris NBRC 100741 cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển,

hình thành thể quả và hàm lượng cordycepin trên nhộng tằm là 25oC Ngoài ra, loại ánh sáng từ đèn compact (công suất 20W, tương đương 350 lux) và thời gian chiếu sáng (12 giờ sáng: 12 giờ tối) cho hiệu suất hình thành thể quả (số lượng vàkích cỡ)

và hàm lượng cordycepin cao hơn so với ánh sáng từ nguồn đèn LED màu xanh dương, màu đỏ(750 bóng, mỗi bóng có công suất 0,05W, 716 lux) Hàm lượng cordycepin trong thể quả từ loại ánh sáng của đèn compact là 4,54 mg/g [4]

Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành thu mẫu Cordyceps tại

một số vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên Giám định mẫu được dựa trên các

khóa phân loại, chuyên khảo về Cordyceps Tổng số có 24 loài nấm được giám định Các loài nấm được xác định là: Aschersonia badia Patouillard, Beauveria

bassiana (Bals.-Criv.) Vuill., Beauveria brongniartii (Saccardo) Petch, Cordyceps annullata Kobayasi & Shimizu, C cardinalis G.H Sung & Spatafora, Cordyceps crinalis Ellis ex Lloyd, C formicarum Kobayasi, C formosana Kobayasi &

Shimizu, Cordyceps gunnii Berk, C militaris (L.:Fr.) Link., Cordyceps

myrmecophilla Cesati, C nutans Pat., C oxycephala Penz & Sacc., C pseudomilitaris Hywel-Jones & Sivichai, Cordyceps sphecocephala (Klotzsch ex

Berk.) Berk & M.A Curtis, C stylophora Berk & Br., C takaomontana Yakush

& Kumaz, C tuberculata (Lebert) Maire, Isaria cateniannulatus (Z.Q Liang) Samson & Hywel-Jones, Isaria farinosa (Holmsk.) Fr., Isaria japonica Yasuda,

Isaria takamizusanensis Kobayasi, Isaria ternuipes Peck và Metarrhizium anisopliae (Metch.) Sorokin Nguồn gen các loài nấm này đang được lưu trữ tại

Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Trên cơ

sở nguồn gen thu thập được và sưu tập từ Trung Quốc và Nhật Bản, Trung tâm Nghiên cứu bảo vệ rừng, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo trên giá thể nhân tạo đối với một số loại như

Đông trùng hạ thảo bông tuyết (Isaria tenuipes) và Đông trùng hạ thảo bọ xít (C

nutans) [10]

30

Hình 1.5 Nấm C nutansvà Isaria tenuipes nuôi cấy tại Viện Khoa học Lâm nghiệp

Việt Nam

Ngoài ra , nghiên cƣ́u về nấm Cordyceps đã đƣợc tiến hành tại Trung tâm

Nghiên cứu thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng thuộc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên từ năm 2006 bao gồm thu thập nguồn nấm tự nhiên, phân lập, định danh và nuôi cấy thử trên vật chủ côn trùng để sản xuất nấm Đến nay đã xây dựng đƣợc các quy trình công nghệ để sản xuất nấm Đông trùng hạ

thảo tằm dâu (hay Đông trùng hạ thảo hoa tuyết), Paecilomyces tenuipes

(C.takaomontana) trên tằm dâu và nhộng tằm dâu Bombyx mori[14]

31

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu nấm ký sinh được thu thập tại vùng rừng núi huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc

Giang dùng cho phân lập nấm C.cicadae Mẫu nấm được bảo quản riêng biệt trong

hộp nhựa và chuyển về phòng thí nghiệm phân lập

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, 4 tuần tuổi do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQG Hà Nội; Khoa Sinh hóa Bệnh viện Dệt May, Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Sinh học - Công ty Cổ phần Ứng dụng Khoa học Kỹ thuật Việt Nam, sử dụng các hóa chất và thiết bị chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn

Cặp mồi đặc hiệu cho vùng ITS của rDNA[75]:

ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

Các hóa chất và thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê tại Bảng 2.1 và Bảng 2.2:

Bảng 2.1.Các hóa chất chính dùng cho nghiên cứu

Tên hóa chất Hãng sản xuất

1 Hóa chất trong nuôi cấy VSV

32

Tên hóa chất Hãng sản xuất

2 Hóa chất trong tách chiết DNA

Ethanol, Isopropanol Thermo Scientific (Mỹ)

3 Hóa chất cho PCR

Phusion DNA polymerase Thermo Scientific ( Mỹ)

Water, nuclease- free Thermo Scientific (Mỹ)

4 Hóa chất trong điện di và soi gel

Thang chuẩn DNA (1kb) Thermo Scientific (Mỹ)

Kit tinh sạch DNA từ gel agarose Promega (Mỹ)

33

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Tên thiết bị Hãng sản xuất

Box cấy vi sinh an toàn cấp 2 Nuaire Mỹ / Singapore

Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản)

Máy cô quay chân không Thermo Scientific (Mỹ)

Bước 2: Ủ đĩa ở 25˚C trong tối, 5 ngày

Bước 3: Sơ bộ chọn lọc các chủng nấm dựa vào hình thái và màu sắc bên ngoài

2.2.2 Phương pháp định danh nấm

2.2.2.1 Chuẩn bị dịch bào tử nấm

Chủng nấm được nuôi trên môi trường PDA 5 ngày ở 25˚C Sau đó bổ sung nước cất vô trùng lên bề mặt đĩa nuôi và bào tử được tách khỏi hệ sợi nấm bằng que cấy gạt vô trùng Hệ sợi nấm được loại bỏ bằng cách lọc qua màng Miracloth và dịch thu được lọc ly tâm ở 5000 vòng trong 10 phút Phần cặn chứa bào tử được rửa hai lần bằng nước cất vô trùng Sau đó cho nước cất vô trùng và bảo quản trong tủ lạnh ở 4˚C

2.2.2.2 Xác định hình thái nấm dưới kính hiển vi

Chủng nấm C.cicadae được nuôi trên môi trường PDA và làm tiêu bản, quan

sát những đặc điểm sau:

-Sắc tố

- Cấu tạo hệ sợi (quan sát bằng kính hiển vi)

35

- Cấu tạo nhánh khi sinh bào tử (quan sát bằng kính hiển vi)

2.2.2.3 Định danh nấm bằng giải trình tự vùng ITS

Quá trình thu hệ sợi và tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm được tiến hành theo Nguyễn Thị Khuyến và cộng sự (2015) [3]

 Nuôi cấy và thu hệ sợi nấm:

Chủng nấm sau khi xác định dựa vào hình thái bên ngoài đem tiến hành nuôi lắc trong môi trường PDB (potato dextrose broth) ở nhiệt độ 25˚C, 200 vòng/phút Sau 3 ngày dịch nuôi được lọc qua màng Miracloth (Calbiochem, Đức) Hệ sợi nấm trên màng được loại bỏ nước bằng giấy thấm sạch Sau đó sợi được chia ra ống eppendorf 2ml (khoảng 200mg/ống) Hệ sợi được sử dụng cho thí nghiệm tách chiết DNA tổng số

 Tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm:

Bước 1: Mỗi ống chứa sợi được giã nhỏ bằng đũa thủy tinh trong 1 phút rồi

bổ sung 600µl đệm tách (SDS 2,5%, 200mM Tris-HCl pH 8, NaCl 250mM, EDTA 25mM, β-mercaptoethanol 0,2%) + 2µlproteinase K, trộn và ủ ở 60oC, 15 phút

Bước 2: Bổ sung thêm 300µl natri acetat 3M (pH=5,2) Ly tâm lạnh ở 4oC,

13000 vòng/ phút trong 20 phút

Bước 3: Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới bằng pipet và bổ sung một thể tích tương ứng bằng isopropanol lạnh để kết tủa DNA Ống được ly tâm lạnh với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút để thu tủa

Bước 4: Bổ sung từ 0,7-1ml ethanol 70% để rửa tủa Ly tâm lạnh ở 13000 vòng/phút trong 5 phút để thu tủa

Bước 5: Bỏ dịch nổi Sử dụng máy cô quay chân không để làm khô mẫu sau

đó bổ sung 50µl đệm TE 1X (Tris-EDTA) và 2µl RNase ủ ở 60oC, 30 phút để loại

bỏ ARN

Bước 6: Mẫu DNA tách chiết được bảo quản trong tủ lạnh

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, 90V trong 30 phút

 Tinh sạch sản phẩm PCR chuẩn bị cho giải trình tự

Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 0,8% Băng DNA có kích thước khoảng hơn 500 bp là sản phẩm tương ứng với vùng ITS của rDNA ở nấm Băng này được cắt khỏi bản gel agarose và được tinh sạch bằng kít tinh sạch của hãng Promega

 Giải trình tự sản phẩm PCR và phân tích dữ liệu

30 chu kỳ

37

Mẫu DNA tinh sạch từ sản phẩm PCR được giải trình tự theo phương pháp Sanger bởi công ty 1st Base, Singapore Các trình tự DNA sau đó được phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.2 và so sánh với dữ liệu có sẵn trong Ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở định dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại

Phân tích mối quan hệ loài dựa trên trình tự ITS với phần mềm MEGA6 Các trình tự DNA của các chủng nấm nghiên cứu và các trình tự liên quan trích xuất từ GenBank được nạp vào MEGA6 và được so sánh với nhau sử dụng tính năng ClustalW tích hợp sẵn trong phần mềm Cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên phương pháp Neigbor-joining với độ tin cậy sử dụng mô hình sao chép mẫu (bootstrap) 1000 lần Hình cây phân loại được hoàn thiện với phần mềm xử lý ảnh Adobe Illustrator CS6

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình nuôi trồng quả

thể nấm C.cicadae

2.2.3.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong giai đoạn nhân giống

- Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của hệ sợi nấm C.cicadae

Thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang nhiệt độ: 15, 20, 25 và 30˚C trên

môi trường PDA Tiến hành cấy 10 μl dịch bào tử nấm C cicadae ở nồng độ 106

bào tử/ml, đem nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau, cùng điều kiện ánh sáng Xác định sự sinh trưởng của hệ sợi thông qua việc đo đường kính sinh trưởng của khuẩn lạc sau 4, 6, 8, 10 ngày

- Ảnh hưởng của chế độ lắc lên sự sinh trưởng của nấm C.cicadaetrong tạo

giống dịch thể

Môi trường giống dịch thể được lựa chọn là môi trưởng PDB (potato dextrose broth), 100ml môi trường cấy 1 cm2 khuẩn lạc, đem nuôi trên máy lắc ở các chế độ lắc 100, 150, 200 vòng/phút ở cùng điều kiện nhiệt độ, không có ánh sáng, trong

38

thời gian 7 ngày Tiến hành lọc qua gạc hoặc vỉ lọc vô trùng rồi tiến hành xác định nồng độ bào tử nấm bằng buồng đếm hồng cầu

2.2.3.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố trong giai đoạn ươm sợi

- Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng môi trường

Thí nghiệm thực hiện với 4 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau

MT1: 20g gạo trắng, 5g bột nhộng tằm tươi

MT2: 20g gạo lứt, 5g bột nhộng tằm tươi

MT3: 20g gạo trắng, 5g bột sâu chít tươi

MT4: 20g gạo lứt, 5g bột sâu chít tươi

Mỗi lọ môi trường nuôi nấm được bổ sung 50 ml dịch dinh dưỡng Thành phần 1lít dịch dinh dưỡng gồm dịch chiết từ 200g khoai tây, 20g glucose, 1g pepton

Các thành phần trên được phối trộn đều và tiến hành chia đều ra các lọ thủy tinh trong hình trụ, đường kính 8,5 cm, thể tích 500 ml, rồi đưa vào hấp khử trùng ở 121˚C trong 30 phút Môi trường sau khi hấp sẽ được làm nguội tự nhiên trước khi đem cấy giống

Tiến hành cấy 1ml giống cho mỗi lọ Dịch giống có nồng độ bào tử là 106bào tử/ml Nuôi ở nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80% và không chiếu sáng Xác định thời gian hệ sợi phát triển kín cơ chất

- Ảnh hưởng của lượng giống cấy

Thí nghiệm được tiến hành với 3 liều lượng giống cấy khác nhau: 0,5, 1 và 1,5 ml Tiến hành cấy nấm đều trên bề mặt môi trường với các lượng giống cấy nêu trên, cùng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng Xác định sự ảnh hưởng của lượng dịch giống tới sự phát triển của hệ sợi thông qua việc xác định thời gian hệ sợi nấm lan kín cơ chất Đồng thời xác định tỉ lệ lọ cấy giống bị nhiễm

- Ảnh hưởng của nồng độ bào tử dịch giống

39

Thí nghiệm được tiến hành với 3 nồng độ bào tử của dịch giống cấy: 104, 105

và 106bào tử/ml Tiến hành cấy nấm đều trên bề mặt môi trường ở các nồng độ bào

tử khác nhau, cùng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ bào tử giống tới sự phát triển của hệ sợi thông qua việc xác định thời gian

hệ sợi nấm lan kín cơ chất và tỉ lệ lọ cấy giống bị nhiễm

2.2.3.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới sự hình thành và sinh trưởng của quả

thể nấm C.cicadae

Đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố thông qua thời gian hình thành quả thể, chiều dài quả thể và năng suất sinh học Năng suất sinh học (Biological efficiency - BE) được tính theo phương pháp của Shrestha (2012): Năng suất sinh học BE (%) = (khối lượng quả thể khô/ khối lượng cơ chất) x 100 [63]

- Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng môi trường

Nấm cấy trên 4 môi trường ở trên trải qua giai đoạn ươm sợi sẽ được đưa vào nuôi ở điều kiện nhiệt độ 20˚C, độ ẩm 80%, cường độ chiếu sáng 500lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Xác định yếu tố nhiệt độ là yếu tố quan trong ảnh hưởng tới việc hình thành

và phát triển quả thể Thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 20, 25 và 30˚C Nấm cấy trên môi trường hỗn hợp trải qua giai đoạn ươm sợi (sợi nấm lan kín cơ chất) sẽ được đưa vào các điều kiện nhiệt độ nuôi khác nhau, độ

ẩm 80%, cường độ chiếu sáng 500lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày

- Ảnh hưởng của độ ẩm

Thí nghiệm được tiến hành ở các điều kiện độ ẩm khác nhau: 70, 80 và 90% Nấm cấy trên môi trường hỗn hợp trải qua giai đoạn ươm sợi (sợi nấm lan kín cơ chất) sẽ được đưa vào các điều kiện độ ẩm nuôi khác nhau, cùng nhiệt độ, cường độ chiếu sáng 500lux, chiếu sáng 12 giờ/ngày

- Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng