Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm a h7n9 dùng cho người bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm A/H7N9 dùng cho người bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi” là công trình ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ TUYẾT

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮC XIN CÚM A/H7N9 DÙNG CHO NGƯỜI BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI

CẤY TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VẮC XIN CÚM A/H7N9 DÙNG CHO NGƯỜI BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI

CẤY TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

PGS TS NGUYỄN VĂN DUY

Phòng đào tạo sau đại học:

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc

xin cúm A/H7N9 dùng cho người bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi” là

công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Khánh Hòa, ngày tháng năm

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Tuyết

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn: Thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học và môi trường – Trường Đại học Nha Trang đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ sở, chuyên ngành quý giá để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này và Ban giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Trưởng khoa sau Đại học và lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học và môi trường lời cảm ơn, niềm kính trọng, sự tự hào được học tập trong những năm qua

Xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy PGS.TS BS Lê Văn Bé Viện Trưởng Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế, Thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn Hội đồng khoa học kỹ thuật và đạo đức Viện vắc xin và sinh phẩm y tế đã chia sẽ và đóng góp ý kiến quý báu nhằm giúp đỡ và động viên tôi

Xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các bạn phòng vắc xin cúm, phòng Kiểm định, phòng Đảm Bảo Chất Lượng và các anh chị em đồng nghiệp Viện Vắc xin và sinh phẩm y tế đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn đến các bạn học viên cao học đã chia sẻ, trao đổi kiến thức

và đóng góp ý kiến quý báu nhằm giúp đỡ động viên tôi hoàn thành nghiên cứu

Xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, chia sẻ kịp thời cùng tôi trong quá trình nghiên cứu

Nha Trang, ngày… Tháng….năm

Học viên thực hiện

Nguyễn Thị Tuyết

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG x

DANH MỤC HÌNH xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh cúm 3

1.2 Tình hình mắc bệnh cúm A/H7N9 ở người trên thế giới và Việt Nam 3

1.2.1 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người trên thế giới 3

1.2.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người tại Việt Nam 6

1.3 Tổng quan về Vi rút cúm A/H7N9 7

1.3.1 Cấu trúc vi rút cúm A/H7N9 7

1.3.2 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên HA (Haemagglutinin) 9

1.3.3 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên NA (neuraminidase) 10

1.3.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên 11

1.3.5 Cơ chế xâm nhiễm vào tế bào vật chủ 12

1.3.6 Khả năng gây bệnh 14

1.4 Tổng quan về vắc xin cúm 14

1.4.1 Các loại vắc xin cúm 15

1.5 Tổng quan về công nghệ sản xuất vắc xin cúm 19

1.5.1 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi 19

1.5.2 Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác 21

1.6 Tổng quan về Nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong và ngoài nước 21

1.6.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin H7N9 ở ngoài nước 21

1.6.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong nước 23

1.7 Tổng quan Công nghệ sản xuất vắc xin cúm tại IVAC 23

1.7.1 Cơ sở sản xuất vắc xin cúm tại IVAC 23

1.8 Kiểm định vắc xin cúm A/H7N9 32

1.8.1 Kiểm định nước cốt vắc xin cúm 32

1.8.2 Kiểm định thành phẩm 32

1.8.3 Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm thành phẩm 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 35

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 35

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 35

2.2 Vật liệu 35

2.2.1 Chủng sản xuất 35

2.2.2 Trứng gà nguyên liệu 35

2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm chuẩn, dung dịch đệm 35

2.2.4 Thiết bị, dụng cụ chính 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 37

2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát tối ưu hóa quy trình nuôi cấy vi rút 37

2.3.3 Nghiên cứu thẩm định quy trình bất hoạt vắc xin cúm A/H7N9 41

2.3.4 Thiết lập các thông số đã nghiên cứu vào quy trình 42

2.3.5 Phương pháp kiểm định đánh giá kết quả 43

2.4 Phương pháp nghiên cứu đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch: 46

2.4.1 Nghiên cứu tính an toàn 46

2.4.2 Nghiên cứu tính sinh miễn dịch 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 Kết quả thiết lập các thông số sản xuất 51

3.1.1 Xác định độ pha loãng chủng vi rút và xác định nhiệt độ, thời gian nuôi cấy vi rút tối ưu trên trứng gà có phôi 51

3.1.2 Thông số thẩm định quy trình bất hoạt vi rút 55

3.1.3 Thiết lập thông số sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 57

3.2 Kết quả áp dụng thông số đã thiết lập vào sản xuất 58

3.2.1 Sản xuất lô nước cốt kháng nguyên 58

3.2.2 Kết quả áp dụng thông số bất hoạt vào quy trình sản xuất: 59

3.2.3 Kết quả kiểm tra chất lượng 5 lô kháng nguyên cúm A/H7N9 cô đặc 59

3.2.4 Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin 3 lô vắc xin thành phẩm 61

3.3 Kết quả nghiên cứu tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên động vật 62

3.3.1 Nghiên cứu tính an toàn 62

3.3.2 Nghiên cứu về tính sinh miễn dịch 64

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Hoa kỳ) DĐVN Dược điển Việt Nam

EU Endotoxin Unit (đơn vị nội độc tố)

EID50 Egg Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50 % phôi gà)

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

FDA Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm, Hoa kỳ) GMP Good manufacturing Practice

(Thực hành sản xuất tốt)

HA Haemagglutinin (Kháng nguyên bề mặt vi rút cúm )

HI (HAI) Haemagglutinin Inhibition (Ức chế ngưng kết hồng cầu)

IVAC Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

MSL Master seed lot (Loạt chủng gốc giống)

NA Neuraminidase (enzyme bề mặt vi rút cúm)

NIBSC National Institute for Biological Standards and Control

(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh)

PBS Phosphate Buffer Saline (dung dịch đệm photphat)

RIV Residual Infectious Virus (vi rút sống tồn lưu)

SPF Specific Pathogen Free

(Không có tác nhân gây bệnh đặc hiệu) SRID Single radial immuno diffusion

(Khuếch tán miễn dịch vòng đơn)

TCCL Tiêu chuẩn chất lượng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tiêu chuẩn chất lượng nước cốt vắc xin cúm A/H7N9 (Ph Eur, 2008; WHO,

Technical Report Series 927, 2005; Bộ Y tế, 2009) 33

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm IVACFLU-A/H7N9 thành phẩm (WHO, Technical Report Series 927, 2005; Bộ Y tế, 2009) 33

Bảng 2.1 Sơ đồ miễn dịch trong nghiên cứu tính sinh miễn dịch 48

Bảng 3.1 Kết quả trung bình EID50/ml, Hiệu giá HA, Hàm lượng HA và tỉ lệ trứng sống sau gây nhiễm theo độ pha loãng của chủng vi rút gây nhiễm 51

Bảng 3.2 Kết quả trung bình EID50/ml, Hiệu giá HA, Hàm lượng HA theo nhiệt độ và thời gian nuôi cấy vi rút 53

Bảng 3.3 EID50 và RIV theo các thông số bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 55

Bảng 3.4 Kết quả sản xuất 5 lô kháng nguyên cúm A/H7N9 thô 58

Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi kháng nguyên HA trong giai đoạn tinh chế 59

Bảng 3.6 Kết quả bất hoạt vi rút cúm bằng formalin 0,02%, nhiệt độ 20-24 o C, thời gian 24 giờ 59

Bảng 3.7 Kết quả sản xuất 5 lô kháng nguyên cúm A/H7N9 nước cốt cô đặc 60

Bảng 3.8 Kết quả 3 lô vắc xin thành phẩm 61

Bảng 3.9 Kết quả thử an toàn đặc hiệu vắc xin cúm IVACFLU-A/H7N9 62

Bảng 3.10 Trọng lượng chuột trong thử nghiệm an toàn chung 63

Bảng 3.11 Kết quả thử chất gây sốt trên thỏ 64

Bảng 3.12 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân với liều kháng nguyên 3µgHA/chuột, 64

Bảng 3.13 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân với liều kháng nguyên 1,5µgHA/chuột 64

Bảng 3.14 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân với liều kháng nguyên 0,75µgHA/chuột 65

Bảng 3.15 Tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân so với máu nền (M0) 66

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phân bố các trường hợp mắc bệnh do cúm A/H7N9 (Animal production and

health, 2017) 4

Hình 1.3 Cấu trúc vi rút cúm A (H7N9) (Davidson MW, 2015) 9

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A ở tế bào (Bernd Sebastian Kamps, Christian Hoffmann, Wolfgang Preiser, 2006) 13

Hình 1.5 Các thế hệ vắc xin cúm 17

Hình 1.7 Hình ảnh nhận dạng trứng đạt và không đạt sau khi nuôi cấy 28

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 38

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cụ thể tối ưu hóa độ pha loãng chủng vi rút 39

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm cụ thể tối ưu hóa nhiệt độ và thời gian nuôi cấy 40

Hình 3.1 Ảnh hưởng của độ pha loãng chủng vi rút cúm đến tỷ lệ trứng sống sau gây nhiễm và hàm lượng HA 52

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy vi rút đến hàm lượng HA và Log EID50 ở nhiệt độ 35,5oC ± 0,5oC 54

Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ và nồng độ formalin đến hiệu suất thu hồi hàm lượng HA sau bất hoạt vi rút cúm A/H7N9 56

Hình 3.4 Quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 tại IVAC 57

Hình 3.5 Biều đồ tăng trưởng của chuột nhắt và chuột lang 63

Hình 3.6 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân trên chuột nhắt 66

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Trước tình hình xuất hiện biến thể vi rút cúm A/H7N9 gây dịch ở Trung Quốc, tỷ

lệ tử vong cao nguy cơ bùng phát dịch và khả năng lan tràn sang các quốc gia, nhằm mục tiêu sản xuất vắc xin cúm ứng phó nguy cơ dịch và đại dịch cúm A/H7N9 Chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm A/H7N9 dùng cho người bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi”

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục đích hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi: Nghiên cứu ảnh hưởng độ pha loãng chủng vi rút gây nhiễm trên trứng gà có phôi đến quá trình phát triển của vi rút và khả năng sống của trứng Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy vi rút đến khả năng nhân lên của vi rút trên trứng đạt hiệu suất mong đợi Nghiên cứu thẩm định quy trình bất hoạt vi rút bằng formalin trong sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 dựa trên khảo sát các thông số: Nồng độ formalin (0,01%, 0,02% và 0,04%), nhiệt độ (2 - 80C, 20 - 240C và 36 - 380C) và thời gian bất hoạt (0, 6, 12, 18 và

24 giờ) Sản xuất 5 lô nước cốt cô đặc liên tiếp với các thông số đã nghiên cứu, Sản xuất 3 lô vắc xin cúm A/H7N9 thành phẩm liên tiếp đạt chất lượng TCCS theo khuyến cáo của WHO; Nghiên cứu đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên động vật

thí nghiệm

Phương pháp nghiên cứu:

Quy trình lõi sản xuất vắc xin cúm bao gồm các giai đoạn: gây nhiễm 0,2 ml chủng vi rút với độ pha loãng thích hợp trong dịch niệu của trứng gà có phôi 11 ngày tuổi và nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Dịch trứng sau khi thu hoạch được lọc tách và tinh chế được bất hoạt bằng formalin với nồng độ, nhiệt độ và thời gian bất hoạt thích hợp, lọc vô trùng Tóm tắt quy trình sản xuất: Gây nhiễm →Nuôi cấy→Gặt→Ly tâm trong→ Siêu ly tâm → Bất hoạt → Ly giải → lọc vô trùng→ Pha vắc xin→ vắc xin thành phẩm

Kết quả nghiên cứu:

1 Kết quả thiết lập thông số quy trình sản xuất và thẩm định quy trình bất hoạt:

Xác định độ pha loãng chủng vi rút gây nhiễm trên trứng gà có phôi: Kết

quả cho thấy độ pha loãng chủng là 10-4

định, hàm lượng HA đạt trung bình 8,9 µg/mL và tỷ lệ thuận với nồng độ vi rút thu được ở mức 8,8, điều này phù hợp với khuyến cáo của nhà cung cấp (NIBSC) là nồng

độ gây nhiễm tốt nhất nằm trong khoảng pha loãng ở nồng độ 10-4 đến 10-5

Xác định nhiệt độ, thời gian nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi đã được gây nhiễm vi rút: Kết quả cho thấy vi rút phát triển tốt nhất ở điều kiện 35,5oC ± 0,5

oC trong thời gian 72 - 96 giờ, với đỉnh của hàm lượng HA và hiệu giá vi rút ở 72h nuôi cấy sau đó có xu hướng giảm dần phù hợp với khuyến cáo của NIBSC về nhiệt

độ nuôi cấy các chủng vi rút cúm từ 34 oC đến 37oC trong thời gian từ 48 đến 72 giờ

Thẩm định quy trình bất hoạt: Kết quả thẩm định cho thấy với nồng độ

formalin 0,02% ở điều kiện nuôi cấy 20-24oC trong 24 giờ thích hợp bất hoạt hoàn toàn vi rút , hàm lượng HA sau bất hoạt đạt trung bình 186,0 ± 19,4 µg/ml, với hiệu suất bảo toàn hàm lượng HA trong sản phẩm thu được sau giai đoạn bất hoạt hiệu suất trung bình đạt 94,4±1,2% đảm bảo giữ ổn định thành phần kháng nguyên

2 Sản xuất 3 lô vắc xin cúm A/H7N9 thành phẩm:

Đã sản xuất thử nghiệm thành công 5 lô nước cốt cô đặc toàn hạt vi rút, tinh khiết bất hoạt bằng formalin và 3 lô vắc xin cúm A/H7N9 dùng cho người từ chủng NIBRG- 267 nhận từ NIBSC, Hertfordshire, Vương Quốc Anh bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi Tất cả các lô đạt chất lượng tiêu chuẩn cơ sở theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO)

3 Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch:

Kết quả cho thấy đánh giá tính an toàn được thực hiện trên trứng gà có phôi

10-11 ngày tuổi có tỷ lệ trứng sống 100% và có phản ứng HA âm tính sau 2 lần cấy truyền, đánh giá trên chuột tất cả chuột trong nghiên cứu được tiêm vắc xin đều sống, khỏe mạnh, lên cân so với ngày đầu tiên, đánh giá trên thỏ kết quả tổng của 3 thỏ ≤ 1,3ºC Kết luận 3 lô vắc xin cúm thành phẩm đạt tính an toàn

Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H7N9 thành phẩm trên chuột nhắt cho thấy vắc xin tạo được đáp ứng kháng thể HAI sau 2 mũi tiêm ở cả

3 liều miễn dịch là 0,75 µgHA, 1,5 µgHA và 3µgHA đạt yêu cầu hiệu giá HAI ≥ 40 và

tỷ số hiệu giá kháng thể trung bình nhân so với máu nền tăng ≥ 4 lần

Từ khóa: Vi rút A/H7N9, formalin, trứng gà có phôi, vắc xin cúm,

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh cúm là một vấn đề y tế nghiêm trọng trong cộng đồng trên toàn cầu, là bệnh nhiễm vi rút cấp tính, dễ gây thành dịch và đại dịch do vi rút cúm gây nên Bệnh gây ảnh hưởng lên đường hô hấp trên và dưới, thông thường bệnh diễn biến tự khỏi song có thể gây nhiều biến chứng nặng hay gặp, nguy hiểm nhất là viêm phổi do vi khuẩn và suy đa tạng

Tháng 2/2013, vi rút cúm A/H7N9 xuất hiện gây bệnh trên người ở Trung Quốc

và lan ra nhiều địa phương tại Trung Quốc Từ đó đến nay, số ca mắc và tử vong ở người vẫn tiếp tục tăng lên, nhất là thời điểm mùa đông xuân (từ tháng 1 đến tháng 4) các năm 2013 đến 2017 Thống kê của WHO cho thấy, đến tháng 11/2017 đã có 1623 trường hợp mắc cúm A/H7N9, trong đó có 620 người đã tử vong (Animal production and health, 2017)

WHO đã nhận định vi rút A/H7N9 là “một trong những vi rút cúm gây nguy hiểm chết người đáng chú ý nhất” Nguồn gốc vi rút A/H7N9 được xác định từ gia cầm gây bệnh cho người, mặc dù cho đến nay chưa có bằng chứng vi rút có thể lây lan

từ người sang người nhưng nguy cơ bùng phát dịch và khả năng lan tràn sang các quốc gia là rất lớn (Executive office of the President – US, 2010)

Việt Nam là một nước tiếp giáp với Trung Quốc, có sự trao đổi thương mại, dịch

vụ và du dịch rất phát triển, có sự tương đồng về điều kiện địa lý và khí hậu Do vậy, Chính phủ, Bộ Y tế và các Bộ ngành liên quan đã đánh giá nguy cơ xâm nhập vi rút cúm A/H7N9 vào nước ta là rất lớn Chính phủ Việt Nam và Bộ Y tế đã chủ động chỉ đạo, lập kế hoạch và triển khai nhiều biện pháp nhằm phát hiện, ngăn chặn và phòng chống bệnh cúm này nếu có xuất hiện ở Việt Nam

Trong các biện pháp phòng chống dịch cúm A/H7N9, việc chủ động nghiên cứu phát triển vắc xin cúm A/H7N9 dự tuyển cũng được WHO và các quốc gia đặc biệt quan tâm Đến ngày 3/5/2013, Văn phòng WHO thông báo đã có chủng dự tuyển cho sản xuất vắc xin cúm A/H7N9, sẵn sàng cung cấp miễn phí cho các nhà sản xuất

Để phòng chống đại dịch Bộ y tế chỉ đạo các biện pháp đối phó trong đó có sản xuất vắc xin Việc sử dụng vắc xin là cách phòng chống hiệu quả nhất bảo vệ cộng đồng , làm giảm tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết Khi đại dịch xảy ra, IVAC đã lựa chọn công nghệ sản xuất trên trứng gà có phôi vì đây là công nghệ truyền thống, an toàn tin cậy được thế giới áp dụng từ những năm 1950 và phổ biến hiện nay với khoảng 90% sản lượng vắc xin cúm toàn cầu đang được lưu hành, sản xuất theo công nghệ này và được

sử dụng an toàn

Trước tình hình xuất hiện biến thể vi rút cúm A/H7N9 gây dịch ở Trung Quốc, tỷ

lệ tử vong cao nguy cơ bùng phát dịch và khả năng lan tràn sang các quốc gia, nhằm mục tiêu sản xuất vắc xin cúm ứng phó nguy cơ dịch và đại dịch cúm A/H7N9 Chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm

A/H7N9 dùng cho người bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi”

2 Mục tiêu của đề tài

2.1 Hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi

2.2 Sản xuất 3 lô vắc xin cúm A/H7N9 đạt TCCS theo khuyến cáo của WHO

3 Nội dung chính của đề tài

3.1 Thiết lập các thông số sản xuất chính của quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi

3.2 Áp dụng các thông số đã thiết lập vào sản xuất 5 lô nước cốt cô đặc và 3 lô vắc xin cúm IVACFLU- A/H7N9 liên tiếp đạt chất lượng TCCS theo khuyến cáo của WHO 3.3 Nghiên cứu đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này xác lập các thông số kỹ thuật chủ yếu phù hợp

cho sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 ở quy mô lớn

Ý nghĩa thực tiễn: Chủ động đáp ứng nhanh sản xuất vắc xin khi có dịch và đại dịch

xãy ra Kết quả của đề tài này là tiền đề cho các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh cúm

Bệnh cúm là một vấn đề y tế nghiêm trọng trong cộng đồng trên toàn cầu, là bệnh nhiễm vi rút cấp tính, dễ gây thành dịch và đại dịch do vi rút cúm gây nên Bệnh gây ảnh hưởng lên đường hô hấp trên và dưới, thông thường bệnh diễn biến tự khỏi song có thể gây nhiều biến chứng nặng hay gặp, nguy hiểm nhất là viêm phổi do vi khuẩn và suy đa tạng Các vụ dịch cúm gần như được ghi nhận hàng năm, mặc dù mức

độ lan rộng và độ nguy hiểm của chúng thay đổi Vi rút cúm B gây những đợt bùng phát nói chung ít lan rộng và nhẹ hơn so với bệnh do vi rút cúm A gây ra Những vụ dịch lan rộng và nghiêm trọng đều do vi rút cúm A gây ra Sự ưu thế này là kết quả sự biến đổi đáng chú ý của kháng nguyên H và N, được gọi là chuyển đổi kháng nguyên (

Lê Văn Hiệp và cs, 2013)

1.2 Tình hình mắc bệnh cúm A/H7N9 ở người trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người trên thế giới

Tháng 2/2013, chủng vi rút cúm A/H7N9 xuất hiện ở Thượng Hải (Trung Quốc), gây bệnh cho người và nhanh chóng lan tràn đến nhiều địa phương ở phía đông Trung Quốc Thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho thấy, từ ngày 29/3/2013 đến ngày 4/4/2013, Trung Quốc đã phát hiện 11 trường hợp nhiễm cúm A/H7N9, trong đó có 5 trường hợp tử vong tại TP Thượng Hải (3/2), An Huy (1/0), Giang Tô (4/0) và Chiết Giang (3/2) Các trường hợp mắc đều có triệu chứng viêm đường hô hấp tiến tới viêm phổi và suy hô hấp Phòng xét nghiệm CDC Trung Quốc xác định các trường hợp trên dương tính với cúm A/H7N9 có gen từ nguồn gốc gia cầm Đây là những trường hợp đầu tiên nhiễm vi rút cúm A/H7N9 gây bệnh nặng trên người và chưa có bằng chứng bệnh lây từ người sang người Nguồn bệnh và phương thức lây truyền chưa rõ, WHO đang tích cực triển khai điều tra để xác định WHO chưa khuyến cáo hạn chế giao lưu qua lại giữa các quốc gia trên thế giới (Riedmann EM, 2013) Đến ngày 30/5/2013 đã có 132 người mắc và 37 trường hợp tử vong do cúm A/H7N9 được xác nhận bao gồm 131 ca ở các tỉnh phía đông Trung Quốc và 1 ca ở Đài Loan Hầu hết các trường hợp được xác nhận dương tính với vi rút cúm A/H7N9

đều có biểu hiện viêm phổi trầm trọng và hội chứng viêm đường hô hấp cấp tính có thể dẫn đến tử vong do suy hô hấp, nhiễm trùng hoặc biến chứng và cần chế độ điều trị,

hồi sức tích cực Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định “vi rút cúm A/H7N9 là một trong những vi rút cúm gây nguy hiểm chết người đáng chú ý nhất” Đến ngày

12/8/2013, WHO xác nhận 135 ca mắc cúm A/H7N9, trong đó có 44 người đã tử vong Đây là lần đầu tiên chủng vi rút cúm A/H7N9 được xác nhận gây bệnh trên người Các báo cáo cho thấy vi rút cúm A phân nhóm H7 có thể gây bệnh và lan truyền trong đàn gia cầm nhưng thường xảy ra ở quy mô nhỏ, mức độ nhẹ và chỉ gặp đối với chủng H7N2, H7N3 và H7N7 Kết quả điều tra dịch tễ cho thấy bệnh cúm A/H7N9 xảy ra do lây lan từ gia cầm sang người, tất cả bệnh nhân đều có thời gian tiếp xúc với gia cầm hoặc sinh hoạt trong môi trường chăn nuôi, buôn bán gia cầm trước đó từ 7 đến 10 ngày Mặc dù chưa có bằng chứng bệnh cúm A/H7N9 lây lan từ người sang người nhưng các nhà khoa học đã cảnh báo nguy cơ bệnh có thể truyền từ người sang người, đây là vấn đề có thể dẫn đến bùng phát dịch và khả năng lan tràn sang các quốc gia là rất lớn trong đó có Việt Nam vì có nhiều điểm tương đồng về điều kiện khí hậu, tập quán và giao lưu thương mại lớn (Uyeki TM, Cox NJ, 2013)

Hình 1.1 Phân bố các trường hợp mắc bệnh do cúm A/H7N9 (Animal production

and health, 2017)

Trong các năm tiếp theo, bệnh cúm A/H7N9 tiếp tục xuất hiện ở Trung Quốc tạo nên các chùm ca bệnh mới với đỉnh là mùa đông xuân các năm 2014 và 2015 Ngày 10/4/2015, Ủy ban Kế hoạch hóa gia đình và Y tế quốc gia Trung Quốc xác nhận thêm

20 trường hợp nhiễm cúm A (H7N9) trên người, trong đó 04 trường hợp tử vong Các trường hợp này có thời gian khởi phát triệu chứng nhiễm bệnh khoảng từ ngày 14/02

đến 21/3/2015, đều là nam giới, tuổi từ 32 tuổi đến 80 tuổi và 90% trong số đó có tiền

sử tiếp xúc với gia cầm sống Tính đến ngày 24/11/2015, toàn thế giới ghi nhận tổng

số 683 trường hợp nhiễm cúm A(H7N9) trên người, trong đó 271 trường hợp tử vong (tỷ lệ 39,7%) Trong tổng số 683 người nhiễm bệnh do cúm A/H7N9 thì Trung Quốc

680 người (bao gồm cả Đài Loan 04, Hồng Kông 13), Malaysia 01 người, Canada 02 người (WHO, 2013; WHO, 2015)

Các chuyên gia thuộc Tổ chức y tế thế giới WHO ngày 01/5/2015 trong một cuộc

họp báo tại London, Anh đã đưa ra tuyên bố: “Biến thể mới của vi rút Cúm gia cầm A/H7N9, bùng phát tại Trung Quốc trong thời gian vừa qua, là mối đe dọa nghiêm trọng đối với con người”, vi rút cúm A/H7N9 là chủng có nguy cơ gây tử vong cao, và

có thể là nguyên nhân dẫn đến một đại dịch Hiện nay, đã xác định con người có khả năng bị nhiễm vi rút cúm A/H7N9 từ gia cầm, nhưng chưa tìm thấy bẳng chứng cho thấy vi rút lây từ người sang người Tuy nhiên, vi rút cúm A/H7N9 có hai kiểu đột biến gene, điều đó làm tăng khả năng lây lan từ người sang người, nếu khả năng này xảy ra, đây sẽ là điều kiện gây đại dịch Cúm H7N9 ở người Trong khi đó, Peter Openshaw - Giám đốc Trung tâm nghiên cứu các bệnh về đường hô hấp thuộc Trường

Cao đẳng Hoàng gia London nói rằng: “Bệnh dịch này đang diễn biến khá phức tạp Nếu vi rút cúm A/H7N9 lây lan rộng rãi hơn, sự bùng phát dịch bệnh này sẽ trở nên hết sức nguy hiểm” Các chuyên gia cũng ghi nhận rằng các bệnh nhân nhiễm cúm

A/H7N9 ở mọi lứa tuổi khác nhau, điều đó cho thấy không lứa tuổi nào có thể miễn dịch với chủng cúm này (WHO, 2013)

Từ tháng 10/2016 tới nay, chủng vi rút cúm A/H7N9 xuất hiện đang có chiều hướng gia tăng cả về quy mô và số lượng mắc Tốc độ lây lan của bệnh tạo thành đợt

Hình 1.2 Số trường hợp mắc cúm A/H7N9 theo thời gian (Animal production

and health, 2017)

dịch thứ 5 Chỉ tính riêng 2 tháng đầu năm 2017 tại Trung Quốc đã ghi nhận thêm 449 trường hợp mắc cúm A(H7N9), trong đó có 96 trường hợp tử vong Đáng chú ý, dịch cúm A(H7N9) đang xảy ra tại tỉnh Vân Nam và Quảng Tây (Trung Quốc) là 2 tỉnh có chung đường biên giới với 7 tỉnh của Việt Nam (gồm: Điện Biên, Lai Châu, Lào Cai,

Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh) Từ đó đến nay, số ca mắc và tử vong

ở người vẫn tiếp tục tăng lên, nhất là thời điểm mùa đông xuân (từ tháng 1 đến tháng 4) các năm 2013 đến 2017 được thể hiện Hình 1.2

Tính đến ngày 25/10/2017, tại Trung Quốc đã phát hiện 54 mẫu bệnh phẩm cúm A(H7N9) độc lực cao ở môi trường hoặc gia cầm và 25 mẫu bệnh phẩm trên người Việc chuyển từ chủng độc lực thấp sang chủng độc lực cao của vi rút cúm A(H7N9) làm tăng nguy cơ lây lan vi rút cúm A(H7N9) lây truyền từ gia cầm sang người do việc đào thải vi rút cúm A(H7N9) từ gia cầm vào môi trường cao hơn từ hàng chục đến hàng trăm lần so với chủng vi rút độc lực thấp Kết quả nghiên cứu này cho thấy chủng vi rút cúm A(H7N9) độc lực cao có thể tiềm ẩn nguy cơ gây đại dịch

và cần được theo dõi một cách chặt chẽ

1.2.2 Tình hình mắc bệnh Cúm A/H7N9 ở người tại Việt Nam

Theo Cục Y tế Dự phòng - Bộ Y tế, từ năm 2013 đến nay chưa ghi nhận ca nào mắc cúm A/H7N9 tại Việt Nam Trung tâm kiểm soát bệnh truyền nhiễm Hoa Kỳ nhận định nguy cơ xâm nhập các trường hợp nhiễm cúm gia cầm vào Việt Nam ở mức trung bình, tuy nhiên nếu không kiểm soát chặt việc nhập lậu gia cầm thì nguy cơ là rất lớn Căn cứ vào tình hình và đặc điểm dịch tễ của bệnh, nguy cơ dịch cúm A/H7N9 xâm nhập vào Việt Nam cũng như có khả năng bùng phát thành dịch tại cộng đồng là rất lớn nếu không chủ động triển khai các biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H7N9

do nhiễm chủng vi rút này từ gia cầm Nguồn lây bệnh chưa được xác định rõ ràng, chưa xác định được các yếu tố dịch tễ liên quan giữa các trường hợp mắc bệnh Đặc tính của vi rút cúm A là thường xuyên biến đổi thành chủng mới có thể lây truyền dễ dàng hơn từ gia cầm sang người Lịch sử thế giới đã ghi nhận các dịch cúm A (H7) với nhiều trường hợp mắc, thậm chí là tử vong ở người

Hiện nay chưa có vắc xin phòng bệnh và thuốc điều trị đặc hiệu với bệnh cúm nói chung và bệnh cúm A/H7N9 nói riêng Để tăng cường phòng chống cúm, Bộ Y tế khuyến cáo người dân các biện pháp phòng bệnh không đặc hiệu như thường xuyên

rửa tay với xà phòng; không sử dụng gia cầm, sản phẩm của gia cầm không rõ nguồn gốc Khi phát hiện có gia cầm ốm, chết, người dân phải báo ngay cho chính quyền địa phương và đơn vị thú y trên địa bàn Người trở về nước từ các quốc gia hoặc khu vực

có bệnh phải áp dụng các biện pháp phòng bệnh, khai báo tình trạng sức khỏe cho cơ quan y tế địa phương để được theo dõi sức khỏe

1.3 Tổng quan về Vi rút cúm A/H7N9

1.3.1 Cấu trúc vi rút cúm A/H7N9

Vi rút cúm A có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ

Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung Các hạt vi rút cúm A (virion) có

hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm Thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8%

là carbonhydrate Hạt vi rút có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm

Vỏ vi rút có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của vi rút, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của vi rút Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân

bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ vi rút, bản chất cấu tạo là glycoprotein gồm:

HA(Haemagglutinin), NA Neuraminidase), MA (matrix) và các thành phần khác của

vi rút Vật chất di truyền của vi rút cúm A là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, Pa, Pb1 và Pb2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ vi rút Đây là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng vi rút mới (Lê Văn Hiệp và cs, 2008)

Kháng nguyên HA có 16 loại HA (từ H1 đến H16) và 9 loại NA (từ N1 đến N9) tạo nên tổ hợp nhiều chủng vi rút có khả năng gây bệnh cho người và động vật Tên gọi chủng cúm A/H7N9 dựa trên cấu trúc của hai loại kháng nguyên bề mặt này và là điểm khác biệt trong cấu trúc vi rút cúm A/H7N9 với các chủng vi rút cúm khác (Lê Văn Hiệp và cs, 2008; Bosch et al,1981)

Trong cấu trúc phân tử vi rút cúm A/H7N9, phân tử Haemagglutinin là loại phân

tử số 7 Hemagglutinin bình thường là một protein có hình gai nhú trên bề mặt vi rút

Chúng có chức năng giúp vi rút bám dính vào tế bào vật chủ Chúng có cấu trúc là dưới 3 đơn vị, mỗi dưới đơn vị có hai chuỗi protein nhỏ, một loại có tính năng giúp vi rút bám vào màng với phân tử glycoprotein, một loại giúp vi rút cắm sâu vào màng Loại H7 có biến đổi cấu trúc không gian khác với các loại khác, khác một số cấu trúc hóa học và có tính năng ưa với tế bào kết mạc gia cầm như gà, có cả người Tất nhiên, chúng vẫn có ái tính với tế bào đường hô hấp trên Trong khi đó, H1-H3 lại

có ái tính mạnh với tế bào đường hô hấp trên của người và H5 có ái tính mạnh với tế bào đường ruột của chim Tính năng bám dính và xâm nhập của H7 kém xa so với H1-H3, thi thoảng mới có tính sinh bệnh cao cho vật chủ Đây là sự khác biệt thứ nhất của H7N9 (Lê Văn Hiệp và cs, 2008; Bosch et al,1981)

Neuraminidase trong vi rút H7N9 là loại N9 Bản chất Neuraminidase có cấu trúc

là dưới 4 đơn vị sắp xếp dưới dạng hình vuông, mỗi dưới đơn vị nằm một góc phần tư của hình vuông Mỗi dưới đơn vị có cấu trúc là 2 chuỗi protein riêng biệt trong đó có một protein hình gai nhú và một protein là trung tâm hoạt động của enzym Phân tử này có tác dụng giúp vi rút thoát khỏi tế bào chủ sau khi đã được nhân bản Hay nói một cách khác, nó giúp vi rút giải phóng khỏi tế bào chủ bằng cách cắt cầu nối của axit neuraminic với phân tử glycoprotein trên màng tế bào và tách vi rút khỏi tế bào N9 có cấu trúc sinh học không gian khác với các loại khác, khác ở một số phân tử hóa học và tính năng phân cắt vi rút khỏi tế bào chủ Loại N9 có khả năng kép, Neuraminidase có tính năng như của phân tử sinh học Hemagglutinin, tức là chúng không những có khả năng lan tràn mạnh mà khả năng thâm nhập cũng rất mạnh Khi phân tử sinh học Hemagglutinin bị ức chế bởi thuốc thì ngay lập tức phân tử sinh học Neuraminidase sẽ hoạt động thay thế và giúp vi rút xâm nhập vào tế bào Đây là điểm khác biệt thứ 2 Tuy nhiên, cụ thể khả năng này trong phân tử vi rút H7N9 đến đâu thì người ta chưa kiểm định được do biến thể này mới xuất hiện

Hình 1.3 Cấu trúc vi rút cúm A (H7N9) (Davidson MW, 2015)

1.3.2 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên HA (Haemagglutinin)

Kháng nguyên HA là một glycoprotein thuộc protein màng nhóm I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu

với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn ngưng kết hồng

cầu HI (hemgglutination inhibition) Phân tử protein HA được mã hóa bởi phân đoạn 4

(gen HA) có dạng hình trụ, dài khoảng 130 Angstron, cấu tạo gồm 3 đơn phân

(monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các đơn phân được glycosyl hóa và gắn

HA2 vào mặt ngoài capsid, phần tự do HA1 chứa vị trí gắn với thụ thể thích hợp trên bề mặt màng tế bào đích (Phạm Văn Ty, 2005)

Một vi rút có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt, đóng vai trò quan trọng trong nhận diện, phân loại vi rút và quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủ, bắt đầu bằng sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng tế bào sau đó là hòa màng, giải phóng RNA và nhân lên trong tế bào cảm nhiễm Quá trình xâm nhập này phụ thuộc vào sự phù hợp giữa thụ thể của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử

HA của vi rút cúm Khả năng gắn vào thụ thể của tế bào chủ cùa HA phụ thuộc vào hai yếu tố:

Hai dạng phân tử SA (sialic acid) trên thụ thể của tế bào chủ:

N-acetylneuraminic acid và N-glycolylneuraminic acid

Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết α-2,6 Gal hay liên kết α-2,3 Gal trên bề mặt của tế bào chủ (Murphy BR, Webster RG, 1996)

Ở chim, phân tử HA của vi rút cúm A chủ yếu liên kết với phân tử SA α-2,3 Gal

có nhiều ở các tế bào biểu mô của ruột Ở người, HA liên kết với phân tử SA α-2,6 Gal nằm chủ yếu ở tế bào biểu mô khí quản Ở heo, các tế bào biểu mô của khí quản mang

cả hai loại SA và hai loại liên kết nêu trên nên heo có thể bị nhiễm cả hai loại vi rút cúm gây nhiễm cho chim và cho người Điều này làm tăng nguy cơ tái tổ hợp, tạo biến chủng vi rút cúm mới có độc tính cao và lan truyền mạnh trong cộng đồng Trong lịch

sử, 3 phân nhóm H1, H2 và H3 đã xảy ra đại dịch ở người Các phân nhóm H5, H7 và H9 cũng được cho là có khả năng gây bệnh trên người

Trình tự mã hóa, thành phần chuỗi nối trên protein HA và vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể đích Đây là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA Protein HA còn kích thích được cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA và tham gia vào phản ứng trung hòa

vi rút HA quyết định tính kháng nguyên và độc lực của vi rút, là đích miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi rút và là cơ sở điều chế các vắc xin phòng cúm

1.3.3 Cấu trúc, chức năng của kháng nguyên NA (neuraminidase)

Neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt của vi rút cúm Đầu tự do của phân tử NA chứa vùng hoạt động gồm 4 đơn phân và phần gốc là một vùng kị nước gắn vào màng vi rút Có khoảng 100 phân tử NA trên bề mặt một vi rút Phân tử NA mang bản chất enzyme, có khả năng phân cắt sialic acid ở liên kết glycoside nối nhóm keto của acid sialic với D-galactose hoặc D-galactosamine trong giai đoạn hòa màng, giúp cho vi rút xâm nhập vào trong bào tương tế bào (Riedmann EM, 2013)

Phân tử NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Những tác động trên của NA làm gia tăng độc lực gây bệnh của vi rút

Do đó NA là đích tác động của thuốc kháng vi rút Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu)

có tác dụng ức chế enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt vi rút mới khỏi các tế bào

đích, bảo vệ cơ thể Neuraminidase mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân

nhóm NA Có 9 phân nhóm NA từ N1 đến N9 được phát hiện chủ yếu ở vi rút cúm gia cầm, hai phân nhóm N1 và N2 được tìm thấy ở vi rút cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử

Phân tử NA còn là một kháng nguyên bề mặt có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch sinh ra kháng thể đặc hiệu kháng NA Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của vi rút là các đích chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch và điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm

Neuraminidase trong vi rút H7N9 là loại N9 có khả năng kép, do vậy Neuraminidase không những có khả năng lan tràn mạnh mà khả năng thâm nhập cũng rất mạnh Khi phân tử sinh học Hemagglutinin bị ức chế bởi thuốc thì ngay lập tức phân tử sinh học Neuraminidase sẽ hoạt động thay thế và giúp vi rút xâm nhập vào tế bào, đây là điểm khác biệt thứ hai của vi rút này Tuy nhiên, cụ thể khả năng này trong phân tử vi rút H7N9 đến đâu thì người ta chưa kiểm định được do biến thể này mới xuất hiện (Lê Văn Hiệp và cs, 2008; Murphy BR et al , 1996)

1.3.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên

1.3.4.1 Hiện tượng lệch/trượt kháng nguyên (antigenic drift)

Lệch kháng nguyên (còn được gọi là trượt kháng nguyên) là sự biến đổi kháng nguyên HA và NA trong một phân nhóm Đây thực chất là các đột biến điểm ở các phân đoạn gen hoặc hệ gen của vi rút, dẫn đến sự biến đổi trình tự các amino acid cấu trúc nên phân tử HA và NA Hiện tượng lệch kháng nguyên xảy ra ở tất cả các nhóm

vi rút cúm A do vi rút không có enzyme sửa chữa RNA trong quá trình phiên mã và sao chép Dẫn đến việc chèn thêm, làm mất đi hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide Các đột biến điểm trong bộ ba mã hóa có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy ra đột biến Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao khoảng 1 đột biến trên 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA của vi rút cúm A) Như vậy, gần như mỗi hạt vi rút đều chứa đựng một đột biến điểm được tích lũy qua các thế hệ làm tăng khả năng xuất hiện một biến thể vi rút mới thay đổi độc lực gây bệnh hay mang đặc tính kháng nguyên mới (Murphy BR et al, 1996; WHO, Technical Report Series 927, 2005)

1.3.4.2 Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carbonhydrate (oligosaccharide) vào amino acid asparagine (vị trí N) ở một số vị trí nhất định trong

chuỗi polypeptide HA, NA hay một số polypeptide khác của vi rút cúm Thông thường

chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N-X-S/T (N = Asparagine; X= amino acid bất

kì, trừ proline; S/T = serine hoặc threonine) Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm Hiện tượng lệch kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của asparagine, tạo tiền đề cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và

NA, giúp cho vi rút thoát khỏi tác động miễn dịch bảo vệ của cơ thể chủ và điều hoà

sự nhân lên của vi rút (Lê Văn Hiệp và cs, 2008; Murphy BR et al, 1996; WHO, Technical Report Series 927, 2005)

Hiện tượng trượt kháng nguyên và glycosyl hóa xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng trộn kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của vi rút cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính

là vấn đề đáng lo ngại của vi rút cúm A/H5N1 hiện nay và vì về lý thuyết hoàn toàn có thể xảy ra đối với vi rút cúm A/H7N9, vi rút này hoàn toàn có khả năng gây bệnh được cho người dù chưa thích nghi để dễ dàng lây nhiễm ở người Vi rút cúm A/H7N9 hoàn toàn có thể tái tổ hợp gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng vi rút cúm A khác để tạo ra một biến chủng vi rút mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong phòng chống (Lê Văn Hiệp và cs, 2008; WHO, Technical Report Series 927, 2005)

1.3.5 Cơ chế xâm nhiễm vào tế bào vật chủ

Vi rút cúm A ký sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của vi rút xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm, có những nét đặc trưng như sau:

Xâm nhiễm: Quá trình xâm nhiễm được mở đầu bằng sự kết hợp của HA với thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào chủ sau đó hòa màng và giải phóng hệ gen của vi rút vào trong bào tương của tế bào nhiễm

Sao chép RNA: sự sao chép RNA của vi rút cúm chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các vi rút khác Trong nhân tế bào các RNA của vi rút cúm tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen vi rút, từ đó tổng hợp nên RNA của vi rút mới nhờ RNA- polymerase Các sợi này không được adenine hóa ở

đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với NP tạo thành phức hợp RNP (ribonucleoprotein)

hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của vi rút cũng được sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của vi rút

và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của

vi rút

Tổng hợp protein HA và NA: Hệ gen của vi rút sử dụng bộ máy sinh học của tế

bào tổng hợp các protein của vi rút và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA Phức hợp protein – RNA của vi rút được vận chuyển vào trong nhân tế bào Các phân tử NA và

HA của vi rút sau khi tổng hợp được vận chuyển ra phía ngoài gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi tạo thành các gai nhú, quá trình này được gọi là hiện tượng “nảy chồi” của vi rút NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của vi rút Sau cùng các RNP của vi rút được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” vi rút gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt vi rút trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của vi rút cúm A ở tế bào (Bernd Sebastian Kamps, Christian Hoffmann, Wolfgang Preiser, 2006)

1.3.6 Khả năng gây bệnh

Vi rút cúm A/H7N9 gây bệnh chủ yếu với gia cầm nuôi trong nhà, được xếp vào hàng có khả năng gây bệnh yếu trong họ hàng nhà vi rút cúm A gia cầm Trong một số trường hợp, vi rút này có khả năng gây bệnh trên người Chúng đặc biệt có ái tính với

tế bào kết mạc ở mắt và tế bào đường hô hấp trên Người bệnh có biểu hiện bệnh bao gồm các triệu chứng viêm kết mạc, viêm đường hô hấp trên và viêm phổi Viêm kết mạc là hiện tượng ngứa mắt, cộm mắt, đỏ mắt, chảy nước mắt Triệu chứng viêm đường hô hấp trên cũng giống như các loại vi rút khác như sốt, đau mỏi cơ, ho, khó thở, khò khè, khàn tiếng, viêm phổi Hiện tại, chưa có bằng chứng chứng minh khả năng lây từ người sang người hay từ động vật sang người như thế nào? Và cũng chưa xác định được mức độ gây bệnh của loại vi rút này là mạnh hay yếu vì chưa có thử nghiệm nào với loại vi rút biến thể mới nhất này Chỉ biết có một số trường hợp bệnh nhân mắc bệnh tại Trung Quốc đã tử vong do H7N9 Vi rút này có đặc điểm dễ nhạy cảm với điều trị, nhưng dễ kháng lại thuốc do có tính năng xâm nhập kép H7N9 dễ mẫn cảm với các thuốc điều trị bao gồm các thuốc ức chế neuraminidase như oseltamivir, zanamivir và peramivir Chúng rất dễ mẫn cảm với các chất kháng khuẩn như dung dịch natri hypochlorit 1%, cồn 70º, glutaraldehyde, formalin và iot Loại vi rút này dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ 56 - 60ºC trong 60 phút Chúng có khả năng sinh tồn ở nước ao hồ và ở nước 220C khoảng 4 tuần, còn ở nước 00C, chúng có thể tồn tại

và sinh bệnh tới 30 ngày sau Việc phòng chống cúm H7N9 tương tự với các loại cúm khác Vệ sinh và giết mổ gia cầm an toàn là cách phòng bệnh tốt nhất Mặc dù, đây có thể là một loại cúm có tính sinh bệnh yếu nhưng chúng lại hoàn toàn có thể có tính sinh bệnh cao nhờ vào những điều kiện cụ thể của môi trường Do đó, luôn cần tính phòng ngừa lên trên hết ( BTEC-NC State University, 2011; Couch RB, Patel SM, Wade-Bowers CL, et al, 2012)

1.4 Tổng quan về vắc xin cúm

Vắc xin cúm được sử dụng với mục đích làm giảm tỷ lệ mắc và chết do bệnh cúm bằng cách tạo ra đáp ứng kháng thể kháng lại vi rút gây nên bệnh cúm thông thường hàng năm (hay còn gọi là cúm mùa) hoặc những chủng vi rút mới được phân lập từ những vụ dịch cúm có khả năng phát triển thành đại dịch Miễn dịch hàng năm với các chủng vi rút cúm mùa cũng giúp hạn chế nguy cơ phát triển thành đại dịch do

tính chất biến đổi gen của chủng vi rút cúm mùa thành chủng vi rút gây đại dịch Vắc xin cúm mùa cũng giúp tạo miễn dịch cơ bản chống lại vi rút cúm cho trẻ em, những đối tượng chưa từng bị nhiễm vi rút cúm (Lê Văn Hiệp, 2009)

Năm 1931, kỹ thuật nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi được phát triển Năm

1941, vắc xin cúm bất hoạt lần đầu tiên được sản xuất bằng kỹ thuật này và được phép

sử dụng cho quân đội Mỹ trong chiến tranh thế giới thứ 2 Ngày nay, nhờ áp dụng những tiến bộ của khoa học công nghệ, thế giới đang tiến tới mực tiêu sản xuất vắc xin cúm an toàn hơn và đại trà hơn

Có hai loại vắc xin cúm truyền thống là vắc xin bất hoạt và vắc xin sống giảm độc lực đang được sử dụng, các vắc xin này được sản xuất hàng năm bằng cách nuôi

cấy chủng vi rút trên trứng gà có phôi hoặc một số dòng tế bào như: MDCK, Vero và PER.C6 Các dòng tế bào này có thể nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh

và đã được chấp nhận để sản xuất vắc xin cho người Vắc xin cúm chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi Năm 2003 khi dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ thành đại dịch, quá trình nghiên cứu phát triển vắc xin cúm đại dịch được đầu tư trên các nền tảng công nghệ công nghệ khác nhau như công nghệ nuôi cấy trên tế bào, công nghệ tái tổ hợp… Đồng thời nghiên cứu phát triển các tá chất sử dụng trong vắc xin nhằm tăng cường khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tăng sản lượng vắc xin dự phòng cho đại dịch (Julian Hickling and Erik D’Hondt, 2006)

1.4.1 Các loại vắc xin cúm

1.4.1.1 Vắc xin sống giảm độc lực

Vắc xin sống giảm độc lực (LAIV) được nghiên cứu và phát triển trên 30 năm đây là vắc xin dạng khí dung, miễn dịch bằng đường niêm mạc mũi Vắc xin này được sản xuất từ chủng nhược độc được tạo ra bằng cách tái tổ hợp gen sản xuất HA và NA của chủng vi rút cúm đang lưu hành với chủng vi rút dự tuyển sản xuất vắc xin Có 2 loại chủng dự tuyển sản xuất bao gồm :

Chủng nhạy cảm nhiệt độ : chủng này phát triển kém ở nhiệt độ 37 – 39oC nên khả năng nhân lên hạn chế ở đường hô hấp dưới, có khả năng phát triển ở đường hô hấp trên do vậy có thể kích thích hệ thống miễn dịch nhày đường hô hấp và miễn dịch toàn thân

Chủng thích ứng lạnh: có thể phát triển tốt ở nhiệt độ thấp (250C) do vậy thích hợp cho phát triển ở đường hô hấp trên

Vắc xin sống giảm độc lực được sử dụng ở Liên bang Xô Viết cũ trong nhiều năm và cũng đã được cấp phép sử dụng tại Mỹ năm 2003

Ưu điểm của loại vắc xin này là quy trình tinh chế sau thu hoạch đơn giản, dễ thực hiện, có năng suất cao gấp 15 đến 20 lần so với vắc xin bất hoạt, không cần tiêm chích và tạo đáp ứng miễn dịch màng nhày niêm mạc đường hô hấp, đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào Ngoài ra, khả năng kích thích hệ thống miễn dịch cũng mạnh hơn đối với vắc xin bất hoạt Do vậy hiện nay nhiều công

ty đầu tư nghiên cứu phát triển vắc xin cúm đại dịch theo hướng này (Bosch FX et al, 1981; Julian Hickling et al, 2006; Executive office of the President – US, 2010)

Nhược điểm vắc xin sống giảm độc lực có thể gây ra bệnh nhẹ, có thể lây nhiễm

vi rút, cần bảo quản lạnh để vi rút không chết

1.4.1.2 Vắc xin bất hoạt

Các loại vắc xin cúm mùa hiện nay trên thế giới là vắc xin bất hoạt 3 thành phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là A/H1N1, A/ H3N2 và một chủng vi rút cúm B Mỗi liều vắc xin chứa 15g kháng nguyên mỗi chủng vi rút thành phần Hầu hết các loại vắc xin cúm mùa hiện nay trên thế giới được sản xuất theo công nghệ trên trứng

gà có phôi Nhiều vắc xin đại dịch một thành phần cũng áp dụng công nghệ này để sản xuất Từ 2007, vắc xin bất hoạt cũng được nghiên cứu sản xuất theo công nghệ nuôi cấy trên tế bào và đã có một số vắc xin được cấp phép lưu hành Các loại tế bào sử dụng trong nuôi cấy bao gồm tế bào vero, MDCK, PER66 …v.v Có ba loại vắc xin bất

hoạt là vắc xin toàn hạt vi rút (whole virion), vắc xin dạng mảnh (split) và vắc xin tiểu phần (subunit)

Hình 1.5 Các thế hệ vắc xin cúm

Vắc xin toàn hạt vi rút là vắc xin thế hệ thứ nhất (1958) được sản xuất trên trứng

gà có phôi, vi rút được bất hoạt bằng formalin hoặc β-propiolactone Đây là loại vắc xin an toàn, dung nạp tốt, hiệu quả bảo vệ 75 - 90 %

Vắc xin dạng mảnh vi rút là vắc xin thế hệ thứ hai (1968), cũng được sản xuất như vắc xin toàn thân nhưng hạt vi rút được phá vỡ bằng các yếu tố hóa lý như sóng siêu âm, triton, tween 80…tạo thành các mảnh kháng nguyên bề mặt, nuclecapside

Vắc xin tiểu phần là vắc xin thế hệ thứ ba (1976) được sản xuất như vắc xin dạng mảnh nhưng quy trình tinh chế nghiêm ngặt hơn vì thành phần chính là các protein HA

và NA tinh chế, các thành phần khác của vi rút bị loại bỏ

Những nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu và sản xuất vắc xin DNA từ các mảnh gene của vi rút: gene HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa xác định được loại vắc xin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các vi rút cúm A (Julian Hickling et

al, 2006; Executive office of the President – US, 2010)

1.4.1.3 Vắc xin cúm tái tổ hợp

Ngoài những công nghệ sản xuất thường gặp trên trứng gà có phôi và trên tế bào, hiện nay công nghệ tái tổ hợp đang được nghiên cứu, áp dụng trong sản xuất nhiều loại vắc xin như vắc xin HPV, HBV Trong công nghệ này, thành phần protein mang bản chất kháng nguyên vi rút được tổng hợp bằng công nghệ sinh học phân tử bằng cách gắn gen mã hóa tổng hợp protein HA của vi rút cúm lên tế bào đích và thu lại protein cần thiết mang bản chất kháng nguyên trong môi trường nuôi cấy để sản xuất vắc xin

Ưu điểm lớn nhất của loại vắc xin này là có thể rút ngắn thời gian sản xuất và

tăng sản lượng sản xuất dựa trên công nghệ tái tổ hợp

Nhược điểm sản xuất vắc xin cúm tái tổ hợp còn gặp những trở ngại do cần

nguồn kinh phí đầu tư lớn Hệ thống các quy định, hướng dẫn, tiêu chuẩn cho cấp phép chưa đầy đủ Ngoài ra, kháng nguyên thu được có độ tinh khiết cao nên khả năng kích thích hệ thống miễn dịch thấp, nên cần phải tích hợp kháng nguyên vào cấu trúc VLP hoặc phối hợp với tá chất để tăng khả năng sinh miễn dịch Do vậy cần có sự đầu

tư và lộ trình để thực hiện trong tương lai (Julian Hickling et al, 2006; Phạm Văn Ty, 2005)

1.4.1.4 Vắc xin đa năng (universal)

Vi rút cúm là tác nhân gây bệnh đặc biệt, Hàng năm, sự biến đổi kháng nguyên

bề mặt tạo ra chủng vi rút mới có khả năng chống lại sự bảo vệ của cơ thể đã sử dụng vắc xin đối với chủng chưa biến đổi, do vậy vắc xin đặc hiệu với mỗi chủng gây bệnh cũng cần được thay đổi hàng năm, đồng thời cần có dự báo để sẵn sàng chủng sản xuất vắc xin cho năm tiếp theo Những nghiên cứu gần đây cho thấy, có những thành phần mang tính kháng nguyên của hạt vi rút cúm không thay đổi giữa các chủng cúm làm cơ

sở cho nghiên cứu vắc xin đa năng kháng được tất cả các chủng vi rút cúm

Hầu hết các loại vi rút gây bệnh mà hiện nay đã sản xuất được vắc xin bảo vệ bền vững là những tác nhân gây bệnh trên người và người cũng là vật chủ duy nhất Các vi rút này có thể phát triển trong cơ thể người nhưng không gây bệnh hoặc gây bệnh có triệu chứng lâm sàng ở các mức độ khác nhau Vi rút cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên bề mặt nên với trình độ công nghệ hiện nay chưa tạo ra được vắc xin gây miễn dịch bền vững và có tác dụng với các chủng vi rút khác nhau Do vậy, vắc xin cúm đa năng là một thách thức lớn trong việc tìm kiếm những cấu trúc kháng nguyên có tính chất bền vững, không thay đổi giữa các chủng đồng thời có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch và kết hợp với kháng thể đặc hiệu

Cấu trúc haemaglutinin bề mặt vi rút cúm đóng vai trò kháng nguyên và kết hợp với kháng thể đặc hiệu Cấu trúc phân tử HA gồm hai phần, phần đỉnh có tác dụng gắn với kháng thể và là điểm bám vào tế bào đích Phần gốc gắn lên bề mặt của vi rút Để

né tránh bị trung hòa bởi kháng thể, vi rút cúm đột biến để tạo ra cấu trúc mới ở vùng đỉnh của cấu trúc HA trong khi cấu trúc phần gốc thường ổn định và bền vững Những

nghiên cứu gần đây cho thấy có thể tạo ra được kháng thể đặc hiệu gắn với phần gốc của HA, đây là cơ sở cho việc đầu tư nghiên cứu loại vắc xin đa năng kháng lại vi rút cúm nói chung Tuy nhiên để phát triển được loại vắc xin này cũng còn nhiều vấn đề phải giải quyết như chế tạo loại kháng nguyên này như thế nào trong khi chưa có vắc xin nào được tạo ra theo hướng đó và sau khi vắc xin được tạo ra vi rút có thể đột biến

để thay đổi cấu trúc phần này làm mất tác dụng của vắc xin hay khôngẦDo vậy, mặc

dù trên lý thuyết vắc xin đa năng là một hướng phát triển nhiều triển vọng nhưng vẫn còn nhiều vấn đề cần được đầu tư nghiên cứu (Julian Hickling et al, 2006)

1.5 Tổng quan về công nghệ sản xuất vắc xin cúm

1.5.1 Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi

Công nghệ sản xuất vắc xin cúm là một yếu tố quan trọng để các nhà sản xuất lựa chọn và áp dụng Hiện tại, đa số các nhà sản xuất lựa chọn công nghệ sản xuất trên trứng gà có phôi vì đây là công nghệ truyền thống an toàn, tin cậy được thế giới áp dụng từ những năm 1950 và phổ biến hiện nay với khoảng 90% sản lượng vắc xin cúm toàn cầu đang được lưu hành được sản xuất theo công nghệ này và được sử dụng an toàn

Trứng gà có phôi 10 - 11 ngày tuổi cung cấp từ các đàn gà có kiểm soát được sử dụng để gây nhiễm Sau khi gây nhiễm vi rút, ủ trứng ở nhiệt độ và độ ẩm thắch hợp Sau thời gian nuôi cấy thắch hợp chuyển trứng vào buồng lạnh (4oC) để qua đêm Ngày hôm sau thu hoạch dịch niệu nang rồi tiến hành các công đoạn tinh chế kháng nguyên

và bất hoạt Phương pháp và mức độ tinh chế tùy thuộc vào dạng vắc xin toàn hạt vi rút, tiểu phần hay kháng nguyên bề mặt

* Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi

Ưu điểm của công nghệ này là một phương pháp sản xuất chuẩn thức được sử dụng rộng rãi trên 60 nãm và mỗi nãm hàng trãm triệu liều vắc xin cúm đã được sản xuất, sử dụng an toàn trên thế giới, chủng vi rút sản xuất vắc xin được tối ưu hóa để phát triển tốt trên trứng gà, vấn đề giấy phép cũng như các phương pháp phân tắch phù hợp cần thiết đã được thiết lập và đã được WHO chấp thuận, đã được chứng minh, đánh giá và có chứng cứ thuyết phục, quy định trong cấp phép sử dụng đã được áp dụng Ngoài ra công nghệ này cũng phù hợp với các cơ sở sản xuất quy mô vừa và

nhỏ, dễ đầu tư công nghệ do vốn đầu tư ban đầu để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui

mô này thấp, giá thành vắc xin tương đối rẻ Với những ưu điểm này, hàng tỷ liều vắc xin cúm sản xuất theo công nghệ trên trứng gà có phôi đã được sản xuất và sử dụng trên toàn thế giới, từ các công ty đa quốc gia như GSK, Novartis, Sanofi Aventis, Merck… đến các nhà sản xuất tại các quốc gia đang phát triển ở Châu Á, Châu Phi và Nam Mỹ

Vắc xin toàn vi rút chỉ đòi hỏi một lần siêu ly tâm phân đoạn sucrose trong khi vắc xin tiểu phần đòi hỏi phải có quá trình phá vỡ các hạt vi rút bằng các chất tẩy rửa (triton X100, sodium lauryl sulfate, tween 80 ) và qua 2 lần siêu ly tâm phân đoạn sucrose Vắc xin kháng nguyên bề mặt đòi hỏi nhiều bước tinh chế hơn thay vì ly tâm phân đoạn sucrose lần thứ 2

* Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi

Tuy nhiên công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi vẫn còn những hạn chế như: khó mở rộng quy mô sản xuất, phụ thuộc vào nguồn sản xuất trứng nguyên liệu, lượng chất thải rắn trong qui trình sản xuất lớn, cẩn phải có hệ thống xử

lý thích hợp… Ngoài ra, công nghệ này cũng có một vài nhược điểm do đây là 1 dây chuyền riêng biệt chỉ dùng cho việc sản xuất vắc xin cúm Nếu nhu cầu vắc xin cúm đột ngột giảm xuống không tận dụng được cơ sở vật chất sẵn có để sản xuất loại vắc xin khác vì thế phải tính toán chi tiết khi đầu tư mở rộng sản xuất Nguồn cung cấp trứng sẽ hạn chế đặc biệt khi dịch xảy ra trên gà Chất thải rắn trong qui trình sản xuất chiếm 80% lượng nguyên liệu cung cấp nên cần phải có hệ thống xử lý thích hợp Hiệu suất vắc xin sản xuất trên trứng: Mỗi một chủng vi rút có những đặc tính phát triển trên trứng khác nhau cho hiệu suất khác nhau Đối với chủng cúm đại dịch A/H1N1/09, cũng là một thành phần trong vắc xin cúm mùa nhiều năm nay, thì sản lượng ổn định và không thay đổi so với vắc xin cúm mùa Tuy nhiên, trong thực tế chủng vi rút cúm A/H5N1 làm vắc xin được tạo ra từ kỹ thuật di truyền đảo ngược hiện nay chỉ tạo được năng suất khoảng 30- 40% so với các chủng vắc xin cúm mùa và điều này hoàn toàn có thể đúng với các chủng sản xuất vắc xin cúm đại dịch khác trong đó có vắc xin cúm A/H7N9 Đây cũng là thách thức chung cho cả vắc xin sản xuất trên tế bào và cần được khắc phục trong tương lai gần (Bosch FX et al, 1981; BTEC-NC State University, 2011; WHO, 2005)

1.5.2 Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác

Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà: Sản xuất vắc xin theo công nghệ này có thể là phương pháp nhanh nhất để mở rộng quy mô sản xuất vắc xin cúm Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những bất lợi như đòi hỏi phải có trứng sạch SPF, huyết thanh bào thai bê và năng lực sản xuất có hạn vì rất ít nhà sản xuất đầu tư phương pháp này

Vắc xin DNA: Vắc xin chứa DNA của HA và NA được tiêm trong da dưới dạng đạn bọc DNA (hãng PowderMed, Oxford Anh) Vì DNA có thể được sản xuất nhanh chóng nên vắc xin này đang thu hút sự quan tâm của các nhà chuyên môn Tuy nhiên quy trình công nghệ phức tạp và quyền sở hữu trí tuệ gây khó khăn cho việc triển khai rộng rãi loại vắc xin này

Vắc xin HA theo kiểu vector và tái tổ hợp: Kháng nguyên HA được sản xuất bởi hệ thống vi rút baculo (hãng Protein Sciences Corporation, Mỹ) hoặc trong thực vật cấy DNA của vi rút (hãng Microbix, Mỹ) Ưu điểm của dạng vắc xin này là năng suất kháng nguyên cao và sản xuất nhanh Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch bị hạn chế lai (Julian Hickling et al, 2006)

1.6 Tổng quan về Nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong và ngoài nước 1.6.1 Tình hình nghiên cứu vắc xin H7N9 ở ngoài nước

Để chủ động kiểm soát và khống chế bệnh trước nguy cơ đại dịch, ngay sau khi xác định được nguyên nhân gây bệnh, WHO đã tiến hành phân lập chủng vi rút để phát triển chủng dự tuyển sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 thông qua Hệ thống Ứng phó

và Kiểm soát bệnh Cúm toàn cầu (GISRS) Đến nay đã có 3 chủng dự tuyển sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 được tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược dòng đã được WHO chấp nhận và tiếp tục đánh giá đầy đủ về đặc tính và an toàn của chủng bao gồm chủng NIBRG-267 được sản xuất từ chủng A/Sanghai/2/2013, chủng NIBRG-268 từ chủng A/Anhui/1/2013 do Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học (NIBSC - Anh) thực hiện và chủng IDCDC-RG32A do Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh (CDC - Hoa Kỳ) tạo chủng tái tổ hợp từ chủng A/Sanghai/2/2013 Các chủng này được cung cấp miễn phí cho các nhà sản xuất vắc xin để nghiên cứu phát triển vắc xin

dự tuyển cúm A/H7N9 Ngoài ra, WHO cũng khuyến cáo các nhà sản xuất chuẩn bị

các điều kiện về cơ sở vật chất, công nghệ, nguyên liệu v.v… để sẵn sàng sản xuất vắc xin cúm A/H7N9 đáp ứng đủ số lượng và chất lượng dự phòng khi đại dịch xảy ra (Riedmann EM, 2013)

Vắc xin phòng bệnh cúm được xem là giải pháp quan trọng và hiệu quả nhất để kiểm soát sự lây lan Nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới đã và đang đầu tư nghiên cứu phát triển vắc xin đặc hiệu phòng bệnh cúm A/H7N9 lây lan trên gia cầm Một số kết quả nghiên cứu đã cho thấy protein của kháng nguyên H7 có tính sinh miễn dịch kém ở người vì có rất ít nhóm quyết định kháng nguyên (epitope) đặc hiệu với tế bào

T trên cấu trúc phân tử HA và khả năng phản ứng chéo với các epitope của tế bào T của các chủng cúm lưu hành cũng rất hạn chế Do đó, việc phát triển một vắc xin đặc hiệu và hiệu quả với vi rút cúm A/H7N9 là một vấn đề không dễ giải quyết Đến thời điểm hiện tại, ít nhất bốn cơ sở nghiên cứu công bố đã phát triển thành công vắc xin cúm A/H7N9 bao gồm Greffex, Protein sciences, Medicago và Novavax Cả bốn công

ty này đều áp dụng công nghệ gen tiên tiến để nghiên cứu vắc xin dạng tiểu phần tinh khiết dự tuyển phòng cúm A/H7N9 Trong đó công ty Medicago và Novavax phát triển vắc xin dạng VLP cho kết quả bước đầu khả quan trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng (Couch RB, Patel SM, Wade-Bowers CL, et al, 2012; Smith GE et al , 2013)

Vắc xin VLP phòng cúm A/H7N9 do công ty Novavax phát triển chứa kháng nguyên HA từ chủng gốc A/Anhui/1/2013-H7N9, kháng nguyên NA từ chủng A/Anhui/1/2013-H7N9 và kháng nguyên M1 từ chủng A/Indonesia/05/2005-H5N1 Loại vắc xin này không những tạo được đáp ứng kháng thể kháng HA ở mức cao ≥ 1:64, kháng NA của vi rút cúm A/H7N9 mà còn tạo được đáp ứng miễn dịch chéo với các chủng vi rút cúm thuộc nhóm H7 như A/H3N2 Kết quả nghiên cứu trên chuột nhắt cho thấy tất cả động vật được tiêm vắc xin đều tạo được đáp ứng kháng thể với vi rút cúm A/H7N9 trong khi tất cả chuột tiêm vắc xin cúm A/H5N1 và giả dược đều chết Ngoài ra công nghệ sản xuất vắc xin VLP đơn giản và rút ngắn được thời gian với thực tế chỉ mất 26 ngày sản xuất vắc xin loại này Vắc xin này cũng không chứa vật chất di truyền cần thiết cho vi rút nhân lên và xâm nhập vào tế bào chủ Do vậy khi

so sánh với các công nghệ sản xuất vắc xin cúm bất hoạt hoặc giảm độc lực cổ điển thì vắc xin này có thể sử dụng nhanh chóng tiện lợi và an toàn hơn khi dịch xảy ra Những

nghiên cứu sâu hơn bao gồm cả thử nghiệm lâm sàng trên người vẫn đang tiếp tục được thực hiện

1.6.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vắc xin H7N9 ở trong nước

Năm 2005, khi dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở gia cầm và gây bệnh cho người, các

cơ sở nghiên cứu và sản xuất trong nước đã tiến hành nghiên cứu, phát triển vắc xin cúm phòng đại dịch theo các công nghệ khác nhau Tất cả các vắc xin cúm do Việt

Nam nghiên cứu phát triển đến nay đều là vắc xin đơn giá (monovalent), toàn hạt vi rút

bất hoạt Tuy nhiên cho đến thời điểm này chưa có vắc xin cúm nào được cấp phép lưu hành

Năm 2008, IVAC được WHO và Bộ Y tế đầu tư công nghệ và kinh phí để xây dựng cơ sở thực nghiệm, phát triển vắc xin cúm đại dịch bằng công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi Đây là dây chuyền sản xuất vắc xin cúm chuyên biệt, đạt tiêu chuẩn GMP – WHO có công suất 3 triệu liều/năm Tự chủ nguồn trứng gà nguyên liệu tin cậy đủ tiêu chuẩn sản xuất vắc xin cho người được cung cấp tại chỗ từ cơ sở chăn nuôi

gà kiểm soát, đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học Cho đến nay, IVAC đã phát triển thành công quy trình “lõi” sản xuất vắc xin cúm toàn hạt vi rút tinh khiết, bất hoạt bằng formalin để chủ động đáp ứng nhanh sản xuất vắc xin, ứng phó kịp thời với những biến thể của vi rút mới có thể gây dịch hoặc đại dịch Năm 2011, IVAC đã sản xuất thành công vắc xin cúm A/H1N1/09 và hoàn tất thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 trên người Năm 2013, IVAC phát triển sản xuất thành công vắc xin cúm A/H5N1, hoàn thành thử lâm sàng giai đoạn 1 cho đến năm 2015, 2016 đã sản xuất thành công vắc xin cúm A/H5N1 và vắc xin cúm mùa và đã hoàn tất thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2,3 trên người và đang tiếp tục hoàn thiện hồ sơ để đăng ký lưu hành vào cuối năm

2017 đầu năm 2018 Dây chuyền sản xuất vắc xin cúm nói trên đã được Bộ Y tế tái cấp chứng nhận GMP - WHO năm 2016

Ngoài IVAC, trong nước chưa có cơ sở nào khác nghiên cứu sản xuất dự tuyển vắc xin Cúm A/H7N9

1.7 Tổng quan Công nghệ sản xuất vắc xin cúm tại IVAC

1.7.1 Cơ sở sản xuất vắc xin cúm tại IVAC

Đối với chủng dự tuyển sản xuất vắc xin cúm A/H7N9, trên cơ sở khuyến cáo của WHO, IVAC đã chọn lựa và sử dụng chủng NIBRG-267 được tái tổ hợp từ chủng gốc A/Sanghai/2/2013 do WHO cung cấp thông qua Viện NIBSC (Anh) Việc tạo

chủng sản xuất được thực hiện bằng cách nuôi cấy chuyền trên trứng gà SPF (Specific Pathogen Free) Đây là loại trứng gà được kiểm soát các tác nhân ngoại lai và chuyên

dụng trong quá trình tạo chủng sản xuất Số đời nuôi cấy chuyền phụ thuộc vào các kết quả đánh giá chất lượng mỗi đời nuôi cấy để chọn ra đời nuôi cấy cho hàm lượng HA cao và đảm bảo các đặc tính về di truyền và sinh học của chủng phù hợp với tiêu chuẩn của nhà cung cấp

1.7.1.2 Nguồn nguyên liệu trứng

Chuẩn bị nguồn trứng đạt tiêu chuẩn chất lượng là một yếu tố quan trọng để

đảm bảo cho quy mô sản xuất và kiểm soát chất lượng sản phẩm Tại IVAC trứng gà

được cung cấp từ nguồn tại chỗ từ giống gà siêu trứng NovoWhite Trong quá trình

nuôi dưỡng các chế độ ăn uống, phòng bệnh và điều kiện môi trường được kiểm soát chặt chẽ Trứng gà dùng cho sản xuất được thu thập từ nhóm gà 26 – 72 tuần tuổi, trọng lượng trung bình mỗi trứng từ 55 – 65 gam, kiểm tra cảm quan kiểm soát mức độ tạp nhiễm vi sinh vật và không được nhiễm một số tác nhân gây bệnh có thể ảnh

tính toán, để sản xuất 1 triệu liều vắc xin cúm một năm cần 1 triệu trứng gà đạt tiêu chuẩn Với quy mô hai nhà chăn nuôi gà hiện nay là 7000 con/nhà, hàng năm IVAC có thể tự chủ nguồn trứng cho sản xuất 3 triệu liều vắc xin cúm đại dịch

1.7.1.3 Ấp trứng tạo phôi

Mục đích của giai đoạn này là để phôi gà phát triển đến một giai đoạn nhất định, có lượng dịch niệu nang đủ lớn để vi rút phát triển trong giai đoạn nuôi cấy Thông thường có thể sử dụng trứng có phôi từ 10 đến 11 ngày để sản xuất Trong quy trình sản xuất tại IVAC, trứng gà có phôi 11 ngày được sử dụng để gây nhiễm và nuôi cấy vi rút Các thử nghiệm cho thấy nếu sử dụng trứng sớm hoặc muộn hơn để cấy vi rút sẽ gây tỷ lệ chết phôi cao, lượng dịch ít ảnh hưởng tới toàn quy trình Giai đoạn ấp trứng cần kiểm soát chặt các điều kiện vi khí hậu như nhiệt độ, độ ẩm và tuân thủ quy trình khử nhiễm nhằm giảm thiểu vi sinh vật trên bề mặt vỏ trứng

Tại IVAC, trứng đưa vào ấp được khử nhiễm bằng khí formalin, cồn 70% hoặc oxy già 5% Quá trình ấp trứng tự động trong tủ ấp chuyên dụng công suất 20.000 trứng/lô trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp Việc duy trì điều kiện vi khí hậu

ổn định trong suốt thời gian nuôi cấy có ý nghĩa quan trọng trong việc giữ ổn định chất lượng trứng, phát triển đồng đều của phôi và duy trì lượng dịch trứng Ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn sẽ làm phôi phát triển chậm hơn hoặc chết Độ ẩm thấp sẽ làm giảm lượng dịch trứng, ảnh hưởng tới sản lượng và hiệu suất của quy trình Sau 11 ngày tiến hành soi và chọn trứng, loại bỏ những trứng không phát triển phôi, phôi chết hoặc nứt

vỡ Những trứng đạt tiêu chuẩn sẽ được sử dụng để nuôi cấy

1.7.1.4 Gây nhiễm

Các chủng vi rút cúm sử dụng trong sản xuất vắc xin cúm hiện nay tại IVAC là chủng do WHO cung cấp thông qua các trung tâm nghiên cứu chuẩn thức Trong nghiên cứu vắc xin cúm A/H7N9 sử dụng chủng NIBRG- 267 tái tổ hợp từ chủng A/Sanghai/2/2013 Đây là chủng do WHO và Viện NIBSC (Anh) cung cấp, đảm bảo đặc tính và pha loãng bằng PBS 7,2 với độ pha loãng đã nghiên cứu thông số phù hợp Gây nhiễm với liều lượng 0,2mL  20% trên một trứng gà có phôi ở 11 ngày.Quá trình pha loãng chủng và gây nhiễm cần được kiểm soát chặt chẽ để hạn chế nguy cơ tạp nhiễm ảnh hưởng tới quá trình nhân lên của vi rút trong dịch trứng cũng như chất lượng của dịch trứng khi thu hoạch Quy trình gây nhiễm tại IVAC sử dụng

máy Rame - Hart bán tự động công suất 10.000 trứng/giờ để gây nhiễm, mỗi chu kỳ gây nhiễm đồng thời 36 trứng và khử nhiễm hệ thống kim gây nhiễm bằng hóa chất sau mỗi chu kỳ Điều này hạn chế việc nhiễm chéo giữa các trứng

1.7.1.5 Nuôi cấy

Trứng đã gây nhiễm được chuyển sang ủ ấm trong tủ chuyên dụng để tiến hành nuôi cấy vi rút, điều kiện nuôi cấy được kiểm soát chặt chẽ cả về nhiệt độ, độ ẩm và vi sinh vật Việc xác định và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi rút giúp cho khả năng nhân lên của vi rút trên trứng đạt hiệu suất cao làm tăng sản lượng và hiệu suất của toàn bộ quy trình Trong sản xuất vắc xin cúm đại dịch, các thông số nuôi cấy được xác định trong khoảng nhiệt độ đã nghiên cứu phù hợp, độ ẩm 70 % trong thời gian khảo sát thích hợp Với mỗi chủng vi rút cúm cần xác định dải nhiệt độ nuôi cấy phù hợp cho

sự phát triển của vi rút, cho hàm lượng HA cao như với vi rút cúm A/H1N1/09 là

34oC- 35oC, vi rút cúm A/H5N1 là 35 oC- 36oC… Việc duy trì độ ẩm 70% giúp ổn định lượng dịch trứng khi thu hoạch, nếu độ ẩm quá thấp thì lượng dịch thu được có thể giảm từ 10 đến 20%

Sau thời gian nuôi cấy, trứng được chuyển sang kho lạnh ở nhiệt độ 2 oC – 8 oC trong thời gian 20 – 24 giờ Mục đích của giai đoạn này để dừng sự phát triển của vi rút trong dịch niệu của trứng, đồng thời gây chết phôi gà chủ động làm cho các mạch máu của phôi co lại và xẹp xuống giúp cho việc thu dịch trứng được dễ dàng và hạn chế sự lẫn tạp máu các thành phần khác của phôi trong giai đoạn thu hoạch Tỷ lệ trứng sống sau nuôi cấy ≥ 95%

1.7.1.6 Thu dịch niệu nang (gặt)

Sau giai đoạn nuôi cấy và làm lạnh, trứng được chuyển sang phòng thu dịch trứng để cắt vỏ và thu dịch niệu nang theo nguyên lý hút chân không, sử dụng máy thu dịch bán tự động của Rame- Harte, công suất 10.000 trứng một giờ Đây là giai đoạn quan trọng và ảnh hưởng tới chất lượng cũng như hiệu suất của toàn bộ quy trình Lượng dịch tối đa trong một trứng có thể tới 16 mL, tuy nhiên lượng dịch thu càng nhiều thì mức độ tạp nhiễm các thành phần của phôi như lòng đỏ, máu, các mô càng lớn và sẽ gây khó khăn cho giai đoạn lọc tách sau này, do vậy cần cân đối giữa thể tích

và chất lượng dịch trứng phù hợp Hiện nay, quy trình tại IVAC đã thiết lập để trong