Chọn tạo giống lúa tính trạng hàm lượng amylose thấp bằng chỉ thị phân tử SSR trên quần thể lai hồi giao FILE gốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠHỒ VĂN ĐƯỢC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA HÀM LƯỢNG AMYLOSE THẤP BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒ VĂN ĐƯỢC

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA HÀM LƯỢNG AMYLOSE THẤP BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 9 42 02 01

CẦN THƠ, 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HỒ VĂN ĐƯỢC

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA HÀM LƯỢNG AMYLOSE THẤP BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRÊN QUẦN THỂ LAI HỒI GIAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 9 42 02 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYỄN THỊ LANG

CẦN THƠ, 2018

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân thành cảm ơn sâu sắc đến:

Giáo viên hướng dẫn đã dành nhiều thời gian quý báu, công sức và tậntình chỉ dẫn tôi trong thời gian thực hiện luận án và theo học tại trường

Quý Thầy Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tư vấn, động viên, hỗ trợchuyên môn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu vàhọc tập tại Viện

Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh đạo, Quý thầy cô, anh chị

em Bộ môn Di Truyền Chọn giống cây trồng Viện lúa Đồng Bằng Sông CửuLong; Ban lãnh đạo Viện NC&PT Công nghệ Sinh học trường Đại học CầnThơ; đã sắp xếp công việc cũng như tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và cơ

sở vật chất để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và luận án đúng tiếnđộ

Cuối cùng, sự thành công của luận án không thể không kể đến sự đónggóp không nhỏ của các thành viên trong gia đình, sự tạo điều kiện thuận lợicủa Lãnh đạo cơ quan và các đồng nghiệp cơ quan, những người luôn ủng hộ,động viên và giúp tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trong thời gian học tập.Chân thành cám ơn./

TÓM TẮT

Gạo chất lượng cao đang là nhu cầu cấp thiết cho nội tiêu và xuất khẩucủa vùng đồng bằng Sông Cửu Long Hàm lượng amylose là một tính trạngquan trọng liên quan trực tiếp đến phẩm chất của hạt gạo Nghiên cứu giốnglúa có hàm lượng amylose thấp thông qua sự kết hợp giữa phương pháp lai tạotruyền thống và chọn lọc hiện đại bằng chỉ thị phân tử cho phép rút ngắn thờigian và tăng hiệu quả tạo chọn giống lúa có chất lượng ngon dẻo Trongnghiên cứu này, vật liệu bố mẹ được đánh giá đầu tiên sử dụng phương phápphân tích kiểu hình dựa trên hàm lượng amylose và năng suất kết hợp đánh giá

kiểu gen với gen mục tiêu waxy Các quần thể lai hồi giao được tạo ra từ các

bố mẹ được lựa chọn Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) được ứng dụngtrong chọn lọc các tổ hợp lai với chỉ thị Wx cho gen mục tiêu, RM240,RM162, RM256 và RM257 cho gen được đánh dấu trên các cá thể mẹ (gen tái

tổ hợp) Các cá thể/dòng phù hợp sẽ được chọn cho tự thụ đến thế hệ thứ hai(F2) Ở thế hệ này, bản đồ GGT được thiết lập trên 12 nhiễm sắc thể để đánhgiá mối quan hệ di truyền của các cá thể chọn và qua đó tuyển lựa các cá thể

có nền tảng di truyền thích hợp nhất với mục tiêu chọn giống Các cá thể triểnvọng nhất cuối cùng được chọn lọc dựa vào hàm lượng amylose thấp (~20%)

và năng suất cao (~7,0 tấn/ha) trên đồng ruộng Kết quả chọn lọc vật liêu laicho thấy các giống bố cho gen (donor) thích hợp là Jasmine85, KDML105 vàOM7347, và các giống mẹ nhận gen (recipient) bao gồm OM6976, OM5930

và OM6073 Khi phân tích hệ số di truyền (h2BS) cũng như hiệu quả chọn lọc(GA) ở thế hệ F2, chỉ có 3 tổ hợp lai OM6976/Jasmine85, OM6976/KDML105

và OM5930/OM7347 được đánh giá là có tiềm năng nhất để tiếp tục phát triển

Ba tổ hợp lai hồi giao (OM6976/Jasmine85//OM6976,OM6976/KDML105//OM6976 và OM5930/OM7347//OM5930) được chọn

thể của tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976, 2 cá thể của tổ hợp

OM5930/OM7347//OM5930 được chọn vì các dòng này vừa mang gen waxy

dị hợp tử và vừa mang 4 gen tái tổ hợp đồng hợp tử Phân tích bản đồ GGT ởthế hệ BC4F2 cho thấy tổ hợp OM6976/Jasmine85//OM6976 có 4 dòng

(BC4F2-1, BC4F2-3, BC4F2-20 và BC4F2-25), tổ hợpOM6976/KDML105//OM6976 có 1 dòng (BC4F2-44) và tổ hợp

OM5930/OM7347//OM5930 có 2 dòng (BC4F2-16 và BC4F2-40) mang gen

waxy đồng hợp và 100% đồng hợp tử gen tái tổ hợp trên cả 12 nhiễm sắc thể.

Ở thế hệ BC4F3, các dòng lúa trên tiếp tục được lựa chọn trên đồng ruộng,

High quality rice is an imperative demand for domestic consumption andexport of the Mekong Delta Amylose content is an important trait that directlyrelates to the quality of rice grains Research on the low amylose content inrice through a combination of traditional crossing and modern selectionmethods by molecular markers to shorten the time and increase the efficiency

of selecting good quality rice varieties In this study, parent materials werefirstly evaluated through phenotypic analysis based on amylose content and

yield combined with genotypic analysis of the target gene “waxy” Backcross

populations were generated from selected parents Marker-assisted selection

(MAS) was applied in choosing individuals with Wx marker for the waxy

gene, and 4 markers, RM240, RM162, RM256 and RM257, for recombinantgenes Selected individuals were selfed to the second generation (F2) In thisgeneration, the GGT map was established on 12 chromosomes to assess thegenetic relationships among selected individuals, and thereby candidatingindividuals with the most genetic background to match the breeding objective.Finally, the most elite individuals were selected based on low amylose content(~ 20%) and high yield (~ 7.0 tons/ha) in the field As a result, the suitabledonor genotypes were Jasmine85, KDML105 and OM7347, and recipientgenotypes included OM6976, OM5930 and OM6073 Based on heritability(h2BS) as well as genetic advance (GA) in the F2 generation, three

OM5930/OM7347, were most potential to grow The three backcrosspopulations (OM6976/Jasmine85//OM6976, OM6976/KDML105//OM6976and OM5930/OM7347//OM5930) were selected untill to BC4 generation Inthe BC4F1 generation, 10 individuals of OM6976/Jasmine85/OM6976, 2individuals of OM6976/KDML105//OM6976 and 1 individual ofOM5930/OM7347//OM5930 were selected because these lines carried the

heterozygote waxy gene and four homozygous recombinant genes The

analysis of the GGT map at BC4F2 showed that the population of OM6976/Jasmine85//OM6976 with 4 lines (BC4F2-1, BC4F2-3, BC4F2-20 and BC4F2-25), the population of OM6976/KDML105//OM6976 with 1 line (BC4F2-44),and the population of OM5930/OM7347//OM5930 with (BC4F2-16 and

BC4F2-40) carried both of the target gene and 100% homozygous recombinantgenes in all 12 chromosomes In the BC4F3 generation, the rice lines wereselected on the field, in which, the eight best lines were D75, D131, D142,D150, D296, D233, D230 and D397 These rice lines were considered to be

ability to develop in the Mekong Delta as well as a valuable resource for further research.

Key word: backcross population, MAS, waxy gene, amylose content, yield.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN………

LỜI CẢM ƠN………

TÓM TẮT……….

SUMMARY………

MỤC LỤC……….

DANH SÁCH BẢNG………

DANH SÁCH HÌNH………

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT……….

Chương 1: GIỚI THIỆU……….

1.1 Đặt vấn đề ………

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ………

1.2.1 Mục tiêu tổng quát ………

1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể ……….

1.3 Nội dung nghiên cứu ………

1.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp………

… 1.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai…………

1.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua MAS………

1.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BC n F 2 thông qua lập bản đồ GGT……….

1.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC n F 3 ………

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ………

1.4.1 Ý nghĩa khoa học ………

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn ………

Trang

i ii iii v vii xii xiii xvi

1

1 2 2 2 3

3 3 3 3

3 4 4 4

1.5 Tính khoa học của đề tài ……… 4

1.6 Những đóng góp mới của đề tài ……… 5

1.7 Tính ứng dụng của đề tài ……… 5

1.8 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ……… 5

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……… 6

2.1 Các chỉ tiêu phẩm chất của hạt gạo ……… 6

2.1.1 Hàm lượng amylose (AC) ……… 6

2.1.2 Độ bền gel (GC) ……… 7

2.1.3 Độ trở hồ (GT) ……… 8

2.2 Sơ lược về hàm lượng amylose ……… 9

2.2.1 Sự hình thành tinh bột ở cây lúa ………. 9

2.2.2 Amylose và amylopectin……… ………. 9

2.2.3 Cơ sở di truyền tính trạng hàm lượng amylose ……… 11

2.3 Phương pháp lai hồi giao trong chọn tạo giống lúa……… 14

2.3.1 Một số khái niệm trong phương pháp lai hồi giao ……… 14

2.3.2 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao ……… 16

2.3.3 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao ……… 16

2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa ……… 17

2.4.1 Sơ lược về phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử ………… 17

2.4.2 Một số thành tựu của chỉ thị SSR trong chọn giống lúa ……… 18

2.5 Chọn tạo giống bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với chỉ thị phân tử……… 19

2.5.1 Các giả thuyết mô hình MAS ……… 19

2.5.2 Điều kiện để ứng dụng MAS ……… 20

2.5.3 Đối với các tính kháng sinh học 22

2.5.4 Đối với các tính kháng phi sinh học 23

2.5.5 Đối với các đặc tính nông học 23

2.6 Các kết quả nghiên cứu giống phẩm chất cao trong và ngoài nước 23

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 26

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ……… 26

3.2 Vật liệu nghiên cứu ……… 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu ……… 27

3.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp ……… 27

3.3.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose ……… 27

3.3.1.2 Đánh giá các đặc tính nông học, các thành phần năng suất và năng suất 27 3.3.1.3 Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình ……… 28

3.3.1.4 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ ……… 29

3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ……… 31

3.3.2.1 Lai tạo lúa trong nhà lưới ……… 31

3.3.2.2 Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai F 2 ……… 33

3.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng amylose thấp thông qua MAS ……… 33

3.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BCnF2 thông qua lập bản đồ GGT ……… 35

3.3.4.1 Kiểm tra kiểu gen của quần thể con lai trên 12 nhiễm sắc thể dựa trên các chỉ thị phân tử đa hình giữa cây bố và mẹ ……… 35

3.3.4.2 Lập bản đồ GGT đánh giá sự di truyền của quần thể con lai, qua đó 35 chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn ………

3.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng 36 suất cao trên các quần thể lai hồi giao BCnF3 ………

3.3.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ……… 36

3.3.5.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần thể con lai ……… 37

3.3.5.3 Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất để chọn lọc các dòng con lai ưu tú vừa có hàm lượng amylose thấp vừa có năng suất cao……… 40

3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 40

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………

4.1 Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm

chất cao có hàm lượng amylose thấp ………

4.1.1 Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai ……….

4.1.2 Đánh giá đặc tính nông học trên bộ giống lúa vật liệu lai

4.1.5 Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ ………

4.2 Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai ………

4.3.1 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM6976/Jasmine85//OM6976 ………….

4.3.2 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM6976/KDML//OM6976 …

4.3.3 Kết quả lai tạo quần thể hồi giao OM5930/OM7347//OM5930

………

4.4 Chọn lọc các quần thể hồi giao BC4F2 thông qua lập bản đồ GGT…………

4.4.1 Chọn lọc các cá thể BC4F2 của quần thể lai hồi giao OM6976/ Jasmine85//

4.5 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao

trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 ………

4.5.1 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose thấp và năng suất cao

OM6976/Jasmine85//OM6976

6 4 6 7

696971727575x

4.5.2 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên

79

OM6976/KDML105//OM6976………

4.5.3 Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC4F3 của tổ hợp OM5930/OM7347//OM5930……… 84

4.6 Thảo luận……… 88

Chuơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……… 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

PHỤ LỤC……… 109

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Sự hiểu biết về Haplotype trong gạo dựa trên các đột biến gen Waxy……

Bảng 2.2 Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng triển vọng (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1………

Bảng 3.1: Các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan đến năng suất và thành phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ Bảng 3.2 Thành phần dung dịch đệm ly trích ADN và TE buffer (pH = 8) …………

Bảng 3.3 Các thành phần của gel polyacrylamide và agarose được sử dụng……

Bảng 3.4 Thang điểm đánh giá nhiệt trở hồ theo tiêu chuẩn của IRRI

Bảng 3.5 Phân loại độ bền thể gel theo tiêu chuẩn SES (IRRI, 1996) ………

Bảng 4.1 Kết quả đánh giá đa hình các chỉ thị phân tử liên kết các gen liên quan đến năng suất và thành phần năng suất trên các giống lúa bố mẹ………

Bảng 4.2 Số lượng các cá thể F1 của các quần thể lai được tạo ra………

Bảng 4.3 Các thông số di truyền và hiệu quả chọn lọc của các tổ hợp lai ………

Bảng 4.4 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1

Bảng 4.5 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ………

Bảng 4.6 Số lượng cá thể chọn lọc qua các thế hệ F1 đến BC4F1 ………

Bảng 4.7 Phẩm chất các dòng BC4F3 của quần thể OM6976/Jasmine85//OM6976 trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017 ………

Bảng 4.8 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC4F3 trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ………

Bảng 4.9 Phẩm chất các dòng BC4F3 của quần thể OM6976/KDML105//OM6976 trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017 ………

Bảng 4.10 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC4F3 trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ………

Bảng 4.11 Phẩm chất các dòng BC4F3 của quần thể OM5930/OM7347//OM5930 trong vu ̣Đông Xuân 2016-2017………

Bảng 4.12 Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BC4F3 trong vụ Đông Xuân 2016-2017 ………

13

21 26

30 31 38 39

50 51 55 57 66 68 76 78 80 83 85 87

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc của (a) amylose và (b) amylopectin (Liu, 2005) ………

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp lai hồi giao ………

Hình 2.3 Giá trị trung bình của gen phục hồi qua từng thế hệ hồi giao ………

Hình 3.1 Phân tích hàm lượng amylose bằng phương pháp sinh hóa và trên

máy đo quang phổ ………

Hình 3.2 Thao tác khử đực trên cây mẹ ………

Hình 3.3 Sự thụ phấn và tạo hạt lai ………

Hình 3.4 Sơ đồ quy tụ gen waxy trên quần thể lai hồi giao thông qua MAS

Hình 3.5 Phân tích GGT trên quần thể lai ở cây lúa………

Hình 3.6 Sơ đồ bố trí các dòng lúa hồi giao trên ruộng thí nghiệm chọn

dòng………

Hình 3.7 Nhiệt độ trở hồ………

Hình 3.8 Hình ảnh minh họa sự khác nhau của độ bền gel sau khi phân tích

hóa sinh………

Hình 4.1: Hàm lượng amylose (%) các giống lúa của bộ vật liệu lai…………

Hình 4.2: Thời gian sinh trưởng (ngày) được ghi nhận trên các giống lúa

của bộ lúa địa phương (a) và bộ lúa cao sản (b)………

Hình 4.3: Năng suất thực tế (tấn/ha) của các giống lúa trong bộ vật liệu lai

Hình 4.4: Phân nhóm di truyền các giống lúa cao sản trong bộ vật liệu lai (Ghi

chú: NS: năng suất; AC: hàm lượng amylose)……….

Hình 4.5: Phân nhóm di truyền các giống lúa địa phương trong bộ vật liệu lai

(Ghi chú: NS: năng suất; AC: hàm lượng amylose)………

Hình 4.6: Sản phẩm PCR của các giống lúa bố mẹ với chỉ thị Wx trên gel

agarose 3% ………

Hình 4.7: Kết quả đa hình của các giống bố mẹ với các chỉ thị cho gen liên

quan đến các thành phần năng suất và năng suất trên gel agarose 3%

Hình 4.8 Sự biến động của hàm lượng amylose trên con lai của các quần

thể lai hồi giao………

101515

2732323436

3738

3942

43444647495052

Hình 4.9: Sự biến động của năng suất trên con lai của các quần thể lai hồi

giao………

Hình 4.10: Sơ đồ chọn tạo quần thể OM6976/Jasmine85//OM6976 thông qua

MAS……….………….Hình 4.11: Kết quả kiểu gen F1 của một số cá thể thuộc quần thể

5356

OM6976/Jasmine85……… 57Hình 4.12: Kết quả kiểu gen BC1F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ……… 58Hình 4.13: Kết quả kiểu gen BC1F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 vàRM257……… 59Hình 4.14: Kết quả kiểu gen BC2F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx……… 60Hình 4.15: Kết quả kiểu gen BC2F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 vàRM257……… 60Hình 4.16: Kết quả kiểu gen BC3F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ……… 61Hình 4.17: Kết quả kiểu gen BC3F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 vàRM257……… 62Hình 4.18: Kết quả kiểu gen BC4F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử Wx ……… 63Hình 4.19: Kết quả kiểu gen BC4F1 của quần thể lai hồi giao

OM6976/Jasmine85//OM6976 với chỉ thị phân tử RM240, RM162, RM256 vàRM257………

64Hình 4.20 Sơ đồ chọn tạo quần thể OM6976/KDML105//OM6976 thông qua

MAS 65Hình 4.21 Sơ đồ chọn tạo quần thể OM5930/OM7347//OM5930 thông qua

Hình 4.22 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao 69OM6976/ Jasmine85// OM6976 trên nhiễm sắc thể số 6………

Hình 4.23 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao

OM6976/ Jasmine85// OM6976 trên 12 nhiễm sắc thể ………

Hình 4.24 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao

OM6976/ KDML105// OM6976 trên nhiễm sắc thể số 6………

Hình 4.25 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao

OM6976/ KDML105// OM6976 trên 12 nhiễm sắc thể………

Hình 4.26 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao

OM5930/ OM7347// OM5930 trên nhiễm sắc thể số 6………

Hình 4.27 Sự đa dạng di truyền các gen từ bố mẹ của quần thể lai hồi giao

OM5930/ OM7347// OM5930 trên 12 nhiễm sắc thể………

737475

7779828486

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

dCAPS Derived Cleaved Amplified Chuỗi đa hình nhân bản được cắt

GBSS Granule-bound Starch Synthase Enzyme xúc tác tổng hợp tinh bột

GT Gelatinization Temperature Độ trở hồ, nhiệt hóa hồ

INQR International Network for Quality Rice Mạng lưới quốc tế nghiên cứu lúa

chất lượngIRRI International Rice Research Institute Viện nghiên cứu lúa Quốc TếMABC Marker-Assisted Backcrossing Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

trong lai hồi giaoMAS Marker Assisted Selection Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

NTSYSpc Numerical Taxonomy System Hệ thống phân nhóm bằng sốPCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen

QTL Quantitative Trait Loci Di truyền tính trạng số lượng

SES Standard Evaluation System for Rice Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá trên

lúaSNP Single Nucleotide Polymorphism Đa hình nucleotide đơn

SSR Simple Sequence Repeat Trình tự lặp lại đơn giản

SSS Soluble Stach Synthase Enzyme xúc tác tổng hợp tinh bột

hòa tan

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan trọng

trên thế giới cung cấp nguồn năng lượng chính cho một nửa dân số trên thếgiới Trong đó, ở châu Á, hơn 90% sản lượng lúa được sản xuất và tiêu thụ.Trước đây, đa số nông dân Việt Nam có thói quen sản xuất giống lúa ngắnngày, năng suất cao và dễ canh tác vì chống chịu sâu bệnh tốt Tuy nhiên, cácgiống này thường có phẩm chất thấp, cứng cơm và không có mùi thơm Do đó,mặc dù có nhiều đột phá về mặt sản lượng nhưng chất lượng cũng như giáthành sản phẩm chưa cao và thị trường tiêu thụ còn hạn chế Ngày nay, với sựphát triển của xã hội, nhu cầu ăn ngon thay thế dần nhu cầu ăn no, các sảnphẩm gạo mềm dẻo, thơm ngày càng được ưa chuộng Chính vì vậy, việcnghiên cứu, lai tạo và phát triển các giống lúa mới ngon dẻo lại thích nghi đadạng và cho năng suất cao đang là nhu cầu cấp bách của sản xuất lúa gạo trongvùng

Chất lượng gạo là một khái niệm chung bao hàm rất nhiều các đặc tínhkhác nhau từ các đặc tính vật lý đến sinh hóa và sinh lý Tinh bột và prôtêin làhai thành phần chính trong nội nhũ của hạt, vì vậy nó là chìa khóa của chấtlượng hạt Tinh bột (polysacarit carbohydrate) chứa hỗn hợp amylose và

amylopectin (Juliano, 2003; Fitzgerald et al., 2009a; Chen et al., 2012) Nhiều

nghiên cứu cho rằng tính chất mềm dẻo của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàmlượng amylose (AC), nó là kết quả của kiểu gen và một vài thay đổi của môi

trường (Fitzgerald et al., 2009a) Hàm lượng này được sử dụng như một chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng cơm (Asghar et al., 2012) Hàm lượng

amylose thấp đặc trưng cho tính mềm, dẻo và bóng của hạt cơm Ngược lạihàm lượng amylose cao làm cho gạo hấp thụ nhiều nước hơn và do đó làmtăng tính trương nước của hạt gạo, dẫn đến khô, xốp và cứng khi nguội lại

(Fitzgerald et al., 2009a; Patindol et al., 2010) Về mặt di truyền, nhiều nghiên

cứu cho rằng tính trạng hàm lượng amylose cao và thấp đều do một gen duy

nhất điều khiển Gen waxy là gen điều khiển tính trạng hàm lượng amylose

trong hạt gạo định vị trên nhiễm sắc thể số 6 Gen trội A qui định hàm lượngamylose cao và gen đồng hợp lặn aa qui định hàm lượng amylose thấp Hạtmang gen dị hợp tử có hàm lượng amylose trung bình nhưng không ổn định.Nếu cần hạt có hàm lượng amylose trung bình thì bố hoặc mẹ phải có hàm

lượng amylose từ thấp đến trung bình (Denyer et al., 2001; Nakamura and

Yuki, 1992) Việc phát triển các giống lúa mới có năng suất và chất lượng cao

là thách thức đối với phương pháp chọn giống truyền thống Vì vậy cần cónhững đột phá mới cho công tác chọn tạo giống bằng phương pháp hiện đại.Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (MAS) cho lai hồi giao (MABC) làphương pháp chuyển một gen mục tiêu từ giống cho gen (donor) sang giốngnhận gen (recipient) trong khi vẫn giữ lại các đặc tính quan trọng của giốngnhận thông qua lai hồi giao Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép giải mã

di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, rút ngắn thời gian chọn tạo, do đó tăng hiệuquả chọn lọc gen trên một đơn vị thời gian (Hospital, 2003) MABC đã được

sử dụng trong nhiều nghiên cứu tạo chọn giống lúa chất lượng cao trước đây

(Hasan et al, 2015; Hồ Văn Được và ctv., 2016a, 2017; Nguyen Thị Lang and

Bui Chi Buu, 2004)

Xuất phát từ những vấn đề đặt ra, nghiên cứu được thực hiện nhằm khaithác phương pháp MABC trong lai tạo giống lúa có hàm lượng amylose thấp(≤20%), năng suất cao phù hợp với nhu cầu về giống lúa cũng như điều kiệncanh tác của ĐBSCL hiện nay

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu, chọn tạo các dòng/giống lúa có phẩm chất tốt liên quan đếnchỉ tiêu hàm lượng amylose thấp dựa trên sự kết hợp giữa phương pháp lai hồigiao và chọn giống bằng chỉ thị phân tử

1.2.2 Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

Khai thác gen liên quan đến chỉ tiêu hàm lượng amylose thấp thông qua

đa dạng nguồn vật liệu ban đầu từ bộ lúa địa phương và bộ lúa cao sản ngắnngày

Ứng dụng MABC trong chọn lọc các quần thể lai hồi giao thông qua

đánh giá kiểu hình và phân tích kiểu gen dựa trên việc xác định gen waxy trên

nhiễm sắc thể số 6 và các gen liên quan năng suất và thành phần năng suấtđược đánh dấu trên cá thể cây mẹ

Đánh giá đa dạng di truyền trên quần thể con lai và chọn lọc các cá thểmang gen mục tiêu mong muốn thông qua xây dựng bản đồ GGT trên cácquần thể NILs

Chọn lọc các dòng lúa triển vọng có tính trạng hàm lượng amylose thấp(≤20%) và năng suất cao (từ 7 - 8 tấn/ha vụ Đông xuân và 4 – 5 tấn/ha vụ Hèthu) nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa mới

1.3 Nội dung nghiên cứu

1.3.1 Nội dung 1: Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa phẩm chất cao có hàm lượng amylose thấp

Đánh giá hàm lượng amylose trên bộ giống vật liệu lai Đánh giá đặc tính nông học trên bộ giống lúa vật liệu lai

Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất trên bộ giống lúa vật liệulai

Phân nhóm đa dạng di truyền kiểu hình của bộ giống lúa vật liệu lai

Đa dạng nguồn gen trên các giống lúa bố mẹ

1.3.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu quả di truyền của các tổ hợp lai

Tạo các quần thể F1

Đánh giá hiệu quả chọn lọc tính trạng mục tiêu dựa trên các quần thể lai

F2

1.3.3 Nội dung 3: Chọn tạo quần thể lai hồi giao có hàm lượng

amylose thấp thông qua MAS

Lai tạo và chọn lọc các quần thể lai hồi giao nhờ các chỉ thị phân tử (BC1F1- BCnF1)

1.3.4 Nội dung 4: Chọn lọc các quần thể hồi giao BC n F 2 thông qua lập bản đồ GGT

Kiểm tra kiểu gen của quần thể con lai trên 12 nhiễm sắc thể dựa trên cácchỉ thị phân tử đa hình giữa cây bố và mẹ

Lập bản đồ GGT đánh giá sự di truyền của quần thể con lai, qua đó chọn lọc các cá thể mang gen mục tiêu mong muốn

1.3.5 Nội dung 5: Đánh giá và chọn lọc cá thể có hàm lượng amylose

và năng suất cao trên các quần thể lai hồi giao BC n F 3

Đánh giá kiểu hình và kiểu gen liên quan hàm lượng amylose trên quần thể con lai

Đánh giá các thành phần năng suất và năng suất để chọn lọc các dòng con lai triển vọng vừa có hàm lượng amylose thấp vừa có năng suất cao

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Khai thác nguồn gen một cách hiệu quả thông qua đa dạng nguồn vật liệu

lai bố mẹ từ lúa địa phương và lúa cao sản.

Nghiên cứu, chọn tạo các giống/dòng lúa có phẩm chất tốt và năng suấtcao kết hợp chọn giống truyền thống với phương pháp hiện đại bằng chỉ thịphân tử nhằm khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, rútngắn thời gian lai tạo và nâng cao hiệu quả chọn lọc

Những thành công bước đầu trong quy tụ gen hàm lượng amylose thấp

sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong côngtác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với chỉ tiêu hàm lượng amylose

mà còn đối với nhiều đặc tính nông học quý khác

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Ứng dụng các thành tựu mới của khoa học hiện đại vào trong chọn giốngnhằm khai thác triệt để nguồn gen, nâng cao hiệu quả chọn tạo, rút ngắn thờigian và tăng hiệu suất chọn lọc cũng như hiệu quả kinh tế

Đề tài chọn ra được các dòng lúa triển vọng có hàm lượng amylose thấp

để bổ sung vào cơ cấu giống phẩm chất cao nhằm phục vụ cho nhu cầu tiêu thụnội địa và nâng cao khả năng cạnh tranh với các nước trên thế giới về xuấtkhẩu gạo

Các nội dung nghiên cứu trong đề tài có thể ứng dụng cho công tác chọngiống hiện nay Sản phẩm từ đề tài là nguồn vật liệu và phương pháp của đề tài

là nguồn tư liệu cho các công trình nghiên cứu tiếp theo Ngoài ra, đề tài còngóp phần phục vụ trong các công tác nghiên cứu và giảng dạy

1.5 Tính khoa học của đề tài

Ứng dụng các kỹ thuật hiện đại để bổ sung cũng như giải quyết các hạnchế cho phương pháp lai tạo giống truyền thống

Kế thừa các nghiên cứu trước trong việc lựa chọn vật liệu lai và chỉ thịphân tử

Ứng dụng sinh học phân tử và tin sinh học để phân tích và đánh giá các

dữ liệu của đề tài

Các dòng lúa được chọn tạo trong đề tài là kết quả khoa học có khả năngứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất giống lúa phẩm chất cao ởvùng ĐBSCL

1.6 Những đóng góp mới của đề tài

Đề tài đã đánh giá và khai thác hiệu quả nguồn vật liệu bố mẹ mà cácnghiên cứu trước đây ở Việt Nam còn nhiều hạn chế

Bên cạnh mục tiêu chọn tạo giống có hàm lượng amylose thấp, đề tài cònchú ý đến năng suất cao và thời gian sinh trưởng phù hợp Điều này là điềukiện quyết định để các sản phẩm giống lúa có thể ứng dụng và phát triển rộngkhi đề tài kết thúc.

Kết hợp giữa lai tạo truyền thống, sinh học phân tử và tin sinh học trongnghiên cứu

1.7 Tính ứng dụng của đề tài

Đề tài được thực hiện thông qua phương pháp lai tạo truyền thống kếthợp phương pháp chọn lọc hiện đại bằng chỉ thị phân tử Thông qua kết quả đềtài cũng cho thấy tính hiệu quả của việc ứng dụng các kỹ thuật mới vào chọntạo giống truyền thống

Sản phẩm giống lúa của đề tài góp phần bổ sung vào cơ cấu giống phẩmchất cao hiện nay cho vùng đồng bằng Sông Cửu Long, phục vụ sản xuất vàxuất khẩu của vùng Ngoài ra, sản phẩm đề tài còn là nguồn vật liệu về giống

và chỉ thị phân tử cho các chương trình lai tạo giống kế tiếp

Đề tài cung cấp một chương trình chọn tạo giống hiệu quả, mang giá trịtham khảo cao

1.8 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các giống lúa địa phương thu thập ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long

và các giống cao sản từ Ngân hàng gen của Bộ môn Di truyền- Chọn giống,Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

Phòng phân tích phẩm chất, Phòng Sinh học phân tử, Nhà lưới, Ruộngthí nghiệm của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Các chỉ tiêu phẩm chất của hạt gạo

Đối với lúa gạo, chất lượng nấu nướng được người tiêu dùng quan tâmnhất Các loại gạo cho cơm ngon phải mềm xốp, hạt cơm nấu ít trương nở và

có mùi vị đặc trưng Tính chất mềm xốp của cơm phụ thuộc chủ yếu vào hàmlượng amylose/amylopectin trong thành phần tinh bột của hạt gạo Trong côngtác chọn tạo giống phẩm chất, các phương pháp xác định hàm lượng amylosetrong nội nhũ gạo đã được ứng dụng rộng rãi và cho độ tin cậy cao (Juliano,1971) Bên cạnh đó, độ bền gel liên quan đến độ mềm dẻo của cơm khi đểnguội và độ trở hồ liên quan đến thời gian nấu cơm Hai chỉ tiêu này tươngquan với hàm lượng amylose đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứutrước đây Trong một số trường hợp, các nhà chọn giống có thể dựa vào cáchthử độ trở hồ đơn giản để ước lượng hàm lượng amylose Vì vậy, hai chỉ tiêunày được thực hiện để kiểm chứng cho hàm lượng amylose của hạt gạo

2.1.1 Hàm lượng amylose (AC)

Hàm lượng amylose được coi là một trong những chỉ số quan trọng nhấtquyết định phẩm chất gạo Với những giống lúa cho gạo có hàm lượngamylose cao thường lâu chín, cơm khô và cứng khi để nguội Gạo có hàmlượng amylose thấp hoặc rất thấp thường dính không tơi cơm, trong khi đó gạo

có hàm lượng amylose trung bình thường tơi cơm, và không cứng khi để nguộinên được người tiêu dùng ưa chuộng

Dựa vào hàm lượng amylose hiện diện trong gạo, các giống lúa đượcphân ra thành hai nhóm phẩm chất: waxy (hàm lượng amylose 1-2%) vànonwaxy (hàm lượng amylose > 2%) Đối với nhóm nonwaxy, hàm lượngamylose thấp khi AC ≤ 20%, hàm lượng amylose trung bình khi AC = 20-25%

và hàm lượng amylose cao khi AC > 25% Các giống Basmati có nguồn gốc từ

Ấn Độ và Pakistan hầu hết là giống có hàm lượng amylose trung bình Trongkhi đó, phần lớn gạo có nguồn gốc từ Việt Nam, Thái Lan, Myanmar và tiểu

lục địa Ấn Độ có hàm lượng amylose cao (Trương Bá Thảo, 2006; Frei et al.,

2003; Coffman and Juliano, 1987) Hàm lượng amylose trong gạo dao động từ15-35% Phần lớn các quốc gia trồng lúa thích loại gạo có hàm lượng amylose

trung bình, ngoài trừ các giống japonica có hàm lượng amylose thấp (Nguyễn

Ngọc Đệ, 2008) Hàm lượng amylose có thể thay đổi giữa các giống do môi

trường và yếu tố di truyền (Chen et al., 2007; 2012) Một số nghiên cứu đã chỉ

ra rằng sự tương tác giữa kiểu gen và nhiệt độ môi trường xung quanh ảnh

hưởng đến hàm lượng amylose trong hạt gạo (Nkori Kibanda and Luzi-kihupi,

2007; Patindol et al., 2015) Bên cạnh hai yếu tố trên, hàm lượng amylose cũng bị

ảnh hưởng bởi độ dài của ngày (Lin et al., 2005) Vì vậy, trong cùng một địa điểmcanh tác, hàm lượng amylose của cùng một giống thay đổi theo từng mùa vụ

Ahmed et al (2015) cho rằng hàm lượng amylose bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ môi

trường xung quanh và nó giảm khi nhiệt độ môi trường ngày càng tăng

Các nghiên cứu đã chỉ ra một số enzyme chủ yếu tham gia tổng hợp tinhbột: ADP glucophosphate synthetase (AGPase) hoạt hoá glucose 1 phosphate

thành ADP glucose (Pressis et al., 1991) Granule – bound starch synthase

(GBSS) gắn các ADP – glucose vào đoạn mồi bắt đầu từ đầu không khử bằngliên kết 1-4 glycozid Enzym SBE cắt chuỗi liên kết 1-4 glucan và tạo liên kết

α – (1-6) glucan tạo nên các phân tử amylopectin (Okagaki wessler, 1988).Soluble starch synthase (SSS) cũng có tác động đến sự tạo mạch nhánh Tuynhiên SBE có vai trò chủ yếu tới sự tổng hợp amylopectin Enzyme GBSS

được mã hoá bởi gen waxy (Okagaki wessler, 1988) Gen waxy là gen chính quy định chỉ tiêu hàm lượng amylose Gen này được chứng minh nằm trên nhiễm sắc thể số 6 Trình tự của gene waxy trên giống O.sativa (Japonica Heng-feng) dài 5499 bp gồm 14 exon, 13 intron (Wang et al., 1990); Trên cơ

sở hàm lượng GBSS trong các loài non-waxy, đã tìm thấy

2 alen waxy là Wx a , Wx b lần lượt trên loài phụ indica và japonica, còn ở lúa nếp là alen lặn wx (Sano, 1980) Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng trên locus Wx có ít nhất 3 alen có chức năng khác nhau Wx a , Wx b , wx lần lượt trong

các loài indica, japonica và lúa nếp (Sano, 1984; Zhao et al, 2010; Kumar and

Khush, 1986)

2.1.2 Độ bền thể gel (Gel Consistency)

Độ bền thể gel là một trong những chỉ tiêu quan trọng liên quan đếnphẩm chất hạt gạo, quyết định độ mềm dẻo của cơm khi để nguội Mặc dù hàmlượng amylose là yếu tố quyết định hơn chất lượng nấu nướng, nhưng sự khácnhau của độ bền gel cũng góp phần quyết định đến phẩm chất cơm (NguyễnThị Lang, 2005)

Độ bền thể gel được điều khiển bởi đơn gen Một dãy alen ở cùng một

locus, gec a đối với gen điều khiển GC trung bình và gec b đối với gen điều

khiển GC cứng (Cai et al., 1998; Tang et al., 1991) Việc chọn lọc các dòng có

GC như ý muốn nên tiến hành ở thế hệ đầu Theo Tang et al (1991), F2 gópphần đến sự khác nhau trên tổ hợp lai và chịu ảnh hưởng bởi gen chính Chang

et al (1991) nghiên cứu các quần thể F1, F2, F3, BC1 và BC2 và cho rằng độ

bền thể gel được kiểm soát bởi đơn gen và có tính trội Nhưng trong một

nghiên cứu khác, Tang et al (2001) cho rằng GC được kiểm soát trên nhiềugen khi phân tích hạt đơn Độ bền thể gel có mối quan hệ trực tiếp với hàmlượng amylose và một số đặc tính khác (Morgante and Olivieri, 1993) Trongcùng một nhóm có hàm lượng amylose giống nhau, giống lúa nào có độ bền

thể gel mềm hơn, sẽ được ưa chuộng hơn (Hirano et al., 1998).

2.1.3 Nhiệt hóa hồ (Gelatinization Temperrature)

Nhiệt hóa hồ (GT) là một tính chất vật lý thể hiện sự biến đổi của tinh bột

từ trạng thái này sang trạng thái khác và không hoàn nguyên khi nhiệt độ giatăng ở ngưỡng xác định Ngưỡng nhiệt độ xác định của độ trở hồ từ 55oC tới

79oC, lúc đó gạo biến thành cơm và không hoàn nguyên Cấu trúc hạt tinh bột

là do sự sắp xếp không gian của các sợi amylose và amylopectin hình thànhnên Khi có tác dụng của nhiệt độ hoặc hóa chất thì cấu trúc này bị phá vỡ vàlàm biến dạng hạt tinh bột, quá trình này được gọi là sự hóa hồ (sự trở hồ)-gelatinization, nhiệt độ cần thiết cho quá trình này diễn ra gọi là nhiệt hóa hồ

(độ trở hồ) (Gelatinization temperature-GT) Theo Jenning et al (1979) nhiệt

hóa hồ là nhiệt độ mà khi đó nước được hấp thụ và hạt tinh bột phồng lênkhông hoàn nguyên, đồng thời dạng tinh thể biến mất Nhiệt hóa hồ thường từ55-79oC và được chia thành 3 nhóm chính: nhiệt hóa hồ thấp (dưới 70oC),nhiệt hóa hồ trung bình (70-74oC), nhiệt hóa hồ cao (trên 74oC)

Đặc tính vật lý của cơm có liên quan nhiều tới nhiệt hóa hồ, gạo có nhiệthóa hồ cao thì ít nở, cần nhiều nước và thời gian nấu chín lâu hơn Do vậy, hạtcơm đỗ lông khi nấu, đồng thời phản ánh độ cứng của hạt tinh bột và phôi nhũ

Độ trở hồ có liên quan một phần với hàm lượng amylose của tinh bột, là yếu tốchính quyết định phẩm chất gạo khi nấu Trong một số trường hợp, các nhàchọn tạo giống có thể dựa vào cách xác định độ trở hồ để ước lượng hàmlượng amylose Tuy nhiên, việc ước lượng này chỉ có thể sử dụng cho giốnglúa có hàm lượng amylose thấp vì nó có mối liên quan rõ rệt với độ trở hồ cao,còn giống lúa có hàm lượng amylose trung bình và cao thì đòi hỏi phải phântích hàm lượng amylose (Khush and Ikehashi, 1979)

Nhiệt hóa hồ có liên quan một phần với lượng amylose của tinh bột, khihạt tinh bột được tác động bởi nhiệt độ hoặc hóa chất thì các phân tử tinh bột

bị phá vỡ thông qua sự nóng chảy hay còn gọi là nhiệt hóa hồ (Vũ Hiếu Đông

và ctv., 2005) Chen et al (1992) và Kiani et al (2008) cho rằng độ trở hồ cao

trội hoàn toàn so với độ trở hồ thấp Độ trở hồ thấp không liên hệ chặt với hàmlượng amylose cao, thấp hay trung bình Gạo có độ trở hồ cao có phẩm chất

kém (Jennings et al., 1979).

2.2 Sơ lược về hàm lượng amylose

2.2.1 Sự hình thành tinh bột ở cây lúa

Sau khi thụ phấn khoảng 1-2 ngày, tinh bột chưa được tích lũy trong hạt,lúc đó độ pH khoảng 5,5 nhưng khi bắt đầu chín sữa thì độ pH tăng lên trên6,0 (khoảng pH thích hợp để tích lũy tinh bột) Dưới tác dụng củaphosphorylase, khi 1 phân tử glucose -1- phosphate tham gia tạo thành mộtphân tử tinh bột thì có 1 phân tử acid phosphoric được hình thành Chínhglucose-1-phosphate và acid phosphoric tự do quyết định sự cân bằng củaphản ứng Kiểm tra bằng phương pháp hóa học ở phôi nhũ nhận thấy: trongkhi lượng acid phosphoric tự do trong lớp tinh bột giảm xuống thì lượng acidphosphoric trong phôi và lớp dextrin tăng lên Vì vậy, gia tăng sản lượng phụthuộc vào cả hai yếu tố: hoạt tính của phosphorylase và khả năng kết hợp củaphosphate tự do (Juliano, 1990)

Khi phân tích glucid trong cây lúa hoặc nhựa vận chuyển từ thân, lá về bông,quan sát thấy có sự xuất hiện của saccharose, glucose, maltose nhưng không cóglucose-monophosphate Như vậy, các chất đồng hóa được vận chuyển đếnbông rồi mới thực hiện tổng hợp glucose-monophosphate để tạo tinh bột(Sano, 1984) Quá trình này đòi hỏi cung cấp nhiều năng lượng nên ở bông sự

hô hấp diễn ra rất mạnh Phần lớn glucid được tích lũy trong phôi nhũ là doquá trình đồng hóa sau khi trổ hoặc nước được dự trữ từ trong thân, lá Sự tíchtrữ này do giống hoặc kỹ thuật canh tác quyết định Vì thế, muốn cho quá trìnhchín diễn ra tốt cần cung cấp lượng acid phosphoric tương ứng lượng glucidtrong cây đồng hóa được, tuy nhiên nếu thừa acid photphoric sẽ ảnh hưởng đến

hoạt tính của phosphorylase làm hạn chế sự tạo tinh bột (Heu and Park, 1996; Yamagata et al., 1982).

2.2.2 Amylose và amylopectin

Ở cây lúa, tinh bột chiếm tỉ lệ 90% trong hạt gạo, và được hình thành dopolysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amylose (chuỗi thẳng 20-30%) vàamylopectin (chuỗi phân nhánh 70- 80%) Amylose là loại mạch thẳng, chuỗidài từ 500-2000 đơn vị glucose, liên kết nhau bởi liên kết α-1,4 với α- Dglucopyranosyl (α- D Glcp) Trong không gian nó cuộn lại thành hình xoắn óc

và được giữ bền vững nhờ các liên kết hydro Amylose thường ở dạng kết tinh

có lớp hydrate bao quanh xen kẽ amylose kết tinh không có lớp hydrate

Amylose có khối lượng phân tử 50.000 đến 160.000 kDa, do cấu trúc mạchthẳng, amylose có gốc hydroxyl tự do nhiều nên dễ hòa tan trong nước ấm.Tuy nhiên, ở dạng tinh thể không bền vững nên khi để yên tinh thể sẽ tách ra.Trong hạt tinh bột hoặc trong dung dịch hoặc ở trạng thái hóa amylose thường

có cấu hình mạch giãn, khi thêm tác nhân kết tủa amylose mới chuyển thànhdạng xoắn ốc Mỗi vòng xoắn ốc gồm 6 đơn vị glucose Amylopectin có cấutrúc phân nhánh Ở điểm phân nhánh có mạch liên kết α(1-4) glucan và α(1-6)glucan Cấu trúc phân tử của nó gồm một mạch thẳng trung tâm chứa liên kếtα(1-4) glucan, từ mạch này phân ra các mạch phụ khoảng vài chục gốcglucose Khối lượng phân tử của amylopectin ước chừng 500.000-1.000.000kDa, thường phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột Khi đun nóng sẽ làm thay đổikhông thuận nghịch cấu trúc phân tử amylose trong quá trình hồ hóa tinh bột.Môi trường có ảnh hưởng đến tỉ lệ cân đối giữa amylose và amylopectin trong

nội nhũ hạt (He et al., 1999; Gosht and Govindaswamy, 1972; Kenzei et al., 1983; Jacob et al., 1991).

HÌNH 2.1 Cấu trúc của (a) amylose và (b) amylopectin (Liu, 2005)

Hàm lượng amylose (AC) được coi là chỉ số quan trọng nhất trong việcphân loại các giống lúa (Juliano, 1985) bởi vì nó ảnh hưởng đến cấu trúc vàkhả năng biến tính của các loại ngũ cốc nấu chín (Champagne et al., 2004).Tùy vào hàm lượng các giống lúa được phân thành các nhóm: cao (> 25%),trung bình (20-25%), thấp (10-19%), rất thấp (3-9%), hoặc sáp (0-2%) (Kenzeiand Rutger, 1983) Các giống lúa nếp hầu như không có cấu trúc phân tửamylose, tuy nhiên có một số giống lúa nếp đã được báo cáo là có hàm lượng

amylose rất thấp (Chung et al., 2011; Juliano, 1971; Landers et al., 1991; Sanchez et al., 1988; Varavinit et al., 2003) Một kết quả nghiên cứu gần đây

đã chứng minh các giống gạo nếp có hàm lượng amylose trên 11% (Fitzgerald

et al., 2009a) Các báo cáo cũng đã chỉ ra sự hiện diện của amylose trong phôi

nhũ của hạt nếp non dựa trên các phản ứng màu với iốt (Badenhuizen, 1956;

Juliano et al., 1987).

2.2.3 Cơ sở di truyền tính trạng hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose được xem là tính trạng có ý nghĩa quyết định cho

phẩm chất mềm dẻo của hạt gạo (Bao et al., 2002) Gen “waxy” (Wx) là gen

điều khiển chỉ tiêu hàm lượng amylose định vị trên nhiễm sắc thể số 6 và được

cho là gen trội không hoàn toàn (Tsai, 1974; Echt and Schwartz, 1981; Ainsworth et al., 1983; Sano, 1984) Hàm lượng amylose có trong phôi nhũ

của hạt, phôi nhũ chứa hai kiểu tinh bột là: GBSS (granule-bound starchsynthase) và soluble stach synthase (SSS), hai hợp chất này được tác động chặtchẽ với nhau bởi enzyme của tinh bột để tổng hợp amylopectin Enzyme

GBSS được mã hóa bởi gen waxy, trong đó GBSS I (granule bound starch

synthease I) liên quan đến tổng hợp amylose, trong khi đó, enzyme SSS lại có

vai trò chủ yếu trong việc tổng hợp amylopectin (Kuipers et al., 1994) Một sốnghiên cứu khác cho thấy trong hạt tinh bột ngoài sự tổng hợp của enzyme

GBSSI còn có sự tham gia của các enzyme khác (Cao et al., 1999) Người ta

sử dụng microsatellite để xác định ba gen: “wx gene granule”, “bound starch synthase I” và “SSE” – gen mã hoá men tổng hợp tinh bột Bao (2002) and He

(1999) đã tìm thấy hàm lượng amylose được kiểm soát bởi gen chính định vị

trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen waxy và các alen chính giải thích biến

thiên di truyền 91,1%

Nghiên cứu của Gosh A and Govindaswamy (1972) and Heu (1996) cho

rằng tính trạng hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so vớihàm lượng amylose thấp, do một gen điều khiển hay gen phụ có tính chất cảitiến Hàm lượng amylose do một gen kiểm soát, trội hoàn toàn so với gen kiểm

soát hàm lượng amylose thấp Tuy nhiên, trong tổ hợp lai giữa lúa indica có

hàm lượng amylose thấp và lúa nếp thì tính di truyền amylose được kiểm soát

bởi gen số lượng Tính dẻo được kiểm soát bởi gen lặn wx nên nội nhũ của hạt nếp chỉ chứa amylopectin với kiểu 3n = wxwxwx, ngược lại ở gạo tẻ bao gồm

cả amylose và amylopectin được kiểm soát bởi gen trội Wx (Sano et al., 1991), (Satoh et al., 1994) Hoạt động tính trội của alen Wx không bị ảnh hưởng do thay đổi hàm lượng amylose của cây bố, nhưng alen trội Wx ảnh hưởng đến hàm lượng amylose trong nội nhũ (Heu and Park, 1996) Theo nghiên cứu của

Zhang (1996) về tính di truyền hàm lượng amylose của 7 cha mẹ có màu vỏcám đen, nâu, đỏ, trắng có hàm lượng amylose từ 0,93 đến 30,13% Kết quảchỉ ra ảnh hưởng cộng trội đóng vai trò quan trọng trong tính di truyền củahàm lượng amylose

Xu (1997) chứng minh khi lai giữa 4 giống lúa japonica và 5 giống lúa

indica, kết quả xác định được tính di truyền của hàm lượng amylose là tính

cộng Hay theo nghiên cứu của Cao (1999) về tính di truyền hàm lượng

amylose giữa indica và japonica đã xác định là do gen trội tác dụng cộng tính.

Theo Khush (1979) phôi nhũ của hạt gạo có 3n, trong đó 2n do mẹ và n

do bố Vì có sự khác nhau về alen nên nó xảy ra hiệu ứng tích lũy về lượng

của amylose Hàm lượng amylose của con lai F1 gia tăng theo sự gia tăng sốgen của bố (mẹ) có hàm lượng amylose cao hơn, mặc dù sự gia tăng này khôngphải lúc nào cũng tuyến tính Phân tích từng hạt riêng biệt ở quần thể F2, thấyrằng sự phân ly hàm lượng tùy thuộc vào sự tích lũy gen điều khiển hàm lượngamylose rất cao hoặc rất thấp) cho thấy rất rõ vai trò của đa gen hoặc hiệntượng gen phụ bổ sung (Khush and Ikehashi, 1979).

Nghiên cứu của Khush (1979) cho biết chọn lọc đối với đặc tính hàmlượng amylose nên được tiến hành ở các thế hệ sau sẽ tạo hiệu quả tốt hơn,chọn lọc con lai đang phân ly có hàm lượng amylose trung bình sẽ không cóhiệu quả bởi vì ảnh hưởng tích lũy về hàm lượng amylose sẽ xảy ra ở các thế

hệ sau Môi trường gây sự biến động lớn đến hàm lượng amylose, hàm lượngamylose có thể biến đổi khoảng 6% từ nơi này đến nơi khác hay từ vụ này

sang vụ khác, đặc biệt là nhiệt độ trong thời gian lúa vào chắc (McCouch et al,

1997)

Yanagisawa et al (2003) đã dùng kỹ thuật SNP (single nucleotide

polymorphism) và dCAPS (derived cleaved polymorphic sequence marker) đối

với gen Wx-D1 Đây là tính trạng waxy trong lúa mì, nó thể hiện Wx-D1 protein theo kết quả phân tích “immunoblot” Điều này có thể giúp cho việc

chọn lựa chỉ thị phân tử để tìm thấy các alen đột biến trong các dòng phân ly(Gu, 1992) Hơn nữa, điểm đột biến trong gen có thể làm cho thay đổi hìnhdạng Phương pháp SNP mở ra triển vọng mới, giúp cho nhà chọn giốngnghiên cứu nhanh các alen

Theo nghiên cứu của Asaoka (1985) về trồng lúa trong điều kiện kiểmsoát nhiệt độ đã xác định hàm lượng amylose trong tinh bột nội nhũ bị ảnhhưởng bởi nhiệt độ môi trường Nhiệt độ môi trường cao sẽ làm giảm hàmlượng amylose trong tinh bột nội nhũ

Gen điều khiển sự dao động hàm lượng amylose ae (amylose extender)được xác định trên nhiễm thể số 2 (Kaushik and Khush, 1991) Thành tựu có ýnghĩa trong nghiên cứu di truyền phân tử về phẩm chất cơm có thể được ghinhận qua công trình: bản đồ liên kết gen hệ enzyme III của tinh bột trong hạtgạo trên nhiễm thể số 2, với hai chỉ thị kế cận CDO 718 và RG 157

Gen waxy (Wx) thể hiện hiện sự đa hình với các alen khác nhau Các chức năng của alen Wx a và Wx b thể hiện bởi một sự thay đổi tại nối đầu 5' của

intron 1, phân biệt hàm lượng amylose thấp, trung bình và cao (Hirano et al., 1998; Wang et al., 1995) Sano (1984) chỉ ra rằng trên locus Wx có ít nhất ba alen có chức năng khác nhau Wx a , Wx b , wx lần lượt trong các loài indica,

japonica và lúa nếp Khi so sánh giữa hai alen Wx a và Wx b, Sano (1986) cũng

cho rằng Wx a tăng cường hoạt động của GBSS, do đó làm tăng hàm lượng

amylose trong nội nhũ hạt hơn so với Wx b So sánh trình tự Wx b và Wx a chothấy có sự thay thế một nu G bởi T tại vị trí cắt nối intron 1 (trình tự cắt nối từ

đầu 5’ của intron 1 của Wx a là AGGTATA, của Wx b là AGTTATA) Kết quảlàm giảm hàm lượng mRNA thành thục dẫn đến giảm GBSS tạo thành, từ đógiảm hàm lượng amylose (Sano, 1984; Hirano, 1998) Sự đột biến G → T ở vị

trí cắt của intron 1 gây ra sự sao chép không hiệu quả (Bligh et al., 1998; Cai

et al., 1998; Isshiki et al., 1998) Tuy nhiên, hai alen này không đủ để giải

thích sự biến đổi liên tục của các loại gen amylose “waxy” Một SNP (single nucleotide polymorphism) ở exon 6 (A → C), Wx in, có liên quan với amylose

trung gian (Chen et al., 2008; Larkin and Park, 2003; Mikami et al., 2008) Một biến thể khác là Wx op (hoặc Wx hp), mang cùng một SNP trong vị trí cắt

intron 1 với Wx a và một SNP (A → G) trên exon 4 (Liu et al., 2009; Mikami et

al., 1999) Hơn nữa, chấm dứt sớm việc dịch mã gây ra bởi một sự trùng lặp

23bp trong exon 2 của Wx gây ra một sự thay đổi trong khung đọc, điều này dẫn đến một bộ ba kết thúc và một kiểu hình waxy (Mikami et al., 2008; Wanchana et al., 2003).

Bảng 2.1: Sự hiểu biết về Haplotype (các dạng hình khác nhau) của amylose trong

gạo dựa trên các đột biến gen Waxy

Haplotype Intron 1 Exon 223-p Exon 4 Exon 6 Kiểu hình

Phân tích QTL kiểm soát hàm lượng amylose cho thấy vùng giả định

nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 với gen waxy và các alen khác, giải thích biến

thiên kiểu hình 91,1% trong quãng giữa hai marker RG573-C624 Yanagisawa

et al (2003) đã dùng kỹ thuật SNP và dCAPS (derived cleaved amplified

polymorphic sequence) tìm kiếm gen Wx-D1 trong lúa và lúa mì mã hóa protein wx-D1 thông qua phân tích immuno blot Hàm lượng amylose còn chịu

ảnh hưởng của tương tác: tính cộng x tính cộng, và tương tác trội x trội, trong

phân tích epistasis Nguyễn Thị Lang et al (2004) đã tìm thấy AC được kiểm

soát bởi gen chính định vị trên nhiễm sắc thể số 5 và 6 liên kết với chỉ thịRM42 (nhiễm sắc thể số 5) và Wx (nhiễm sắc thể số 6)

2.3 Phương pháp lai hồi giao trong chọn tạo giống lúa

2.3.1 Một số khái niệm trong phương pháp lai hồi giao

Lai hồi giao là phương pháp thường được sử dụng phổ biến nhất đểchuyển một gen hoặc một tính trạng mong muốn nào đó vào một giống đểchuyển thành giống ưu tú Con lai F1 sau khi được tạo ra sẽ lai lại nhiều lầnvới bố hoặc mẹ gọi là phép lai hồi giao

Phương pháp lai hồi giao được khởi xướng bởi Harlan và Pope vào năm

1922 Sau đó, nó được sử dụng rộng rãi trong việc chọn tạo giống cây trồng ở

nhiều loài cây khác nhau (Stoskof et al.,1993) Phương pháp này được thực

hiện trong trường hợp muốn du nhập một gene mục tiêu quan trọng nào đó từnguồn vật liệu cho (là giống cây bản địa, loài hoang dại có quan hệ gần gũi)

vào giống cây trồng (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007; Bao et al.,

2002)

Tổ hợp lai bao gồm nguồn vật liệu cho (donor) thường được sử dụng làm

bố và nguồn giống cây trồng có nhiều tính trạng ưu việt, chỉ thiếu một vàigene điều khiển tính trạng mục tiêu thường được sử dụng làm mẹ; thuật ngữchuyên môn gọi là giống tái tục (recurrent)

Theo Allard (1960) and Reyes (2000) thì kiểu gen của con lai có thểgiống với cây tái tục khoảng 99,2% sau 6 lần hồi giao Tuy nhiên, các con lai

ở thế hệ BC2 và BC3 (BackCrosses) có sự chênh lệch về kiểu gen với nhautrong suốt quá trình lai, giúp các nhà chọn giống có cơ hội chọn được nhữngdòng mong muốn Trong hầu hết các trường hợp, giống tái tục được sử dụngtrong lai hồi giao có phần lớn các tính trạng mong muốn nhưng chỉ thiếu một

vài tính trạng nào đó (Hasan et al., 2015) Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu

cũng cho rằng có 3 yếu tố chính quyết định đến sự thành công của mộtchươngtrình chọn giống hồi giao là chọn lựa giống làm giống tái tục, phươngpháp hiệu quả để chọn lọc các tính trạng mục tiêu và số lần lai hồi giao

(Acquaah, 2007)

nhóm hoang dại với nhóm trồng hoặc giữa nhóm indica và japonica (Bùi Chí

Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007)

HÌNH 2.3 Giá trị trung bình của gen phục hồi qua từng thế hệ hồi giao

2.3.2 Ưu điểm của phương pháp lai hồi giao

Về mặt di truyền, phương pháp lai hồi giao tạo ra sự kiểm soát di truyềntối đa trong quá trình cải tiến giống cây trồng Không có một phương phápchọn giống nào mà nhà chọn giống có thể dự đoán trước kiến tạo di truyền củadòng cây trồng mới Nhà chọn giống cũng có thể lặp lại tiến trình lai hồi giaonếu cần thiết để một lần nữa phát triển giống tái tục

Giống được phát triển bằng phương pháp lai hồi giao không cần trắcnghiệm ngoài đồng trên diện rộng Việc đánh giá chủ yếu dựa vào tính trạngmục tiêu của giống cho có kết hợp được trong giống tái tục hay không

Phương pháp lai hồi giao không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trườngtrong sự thể hiện tính trạng Nó có thể được thể hiện để tạo ra quần thể trongmùa nghịch hoặc bất cứ ở địa điểm nào Hệ số di truyền của tính trạng mụctiêu không quá quan trọng đặc biệt khi việc chọn lọc tính trạng của giống táitục chưa thật sự hoàn chỉnh

Phương pháp này cho chúng ta giải pháp lý tưởng để sử dụng nhữngnguồn gen chưa được thích nghi, chưa có tính chất cải tiến những nguồn gentiềm ẩn kháng stress, gen cho chất lượng nông sản tốt, hoặc năng suất cao

2.3.3 Nhược điểm của phương pháp lai hồi giao

Nhìn chung, phương pháp lai hồi giao được xem như một phương pháp

có tính chất bảo thủ về mặt di truyền, vì nó không tạo ra một năng suất đột phámới Nó mất nhiều thời gian từ (6-7 năm) để gắn thêm một hoặc một vài tínhtrạng có lợi cho giống cây trồng

Vì khuyết điểm này, người ta đã cố gắng tìm kiếm một phương pháp mới

để khắc phục yếu điểm thời gian, nhờ chỉ thị phân tử Những phát triển trongnghiên cứu chỉ thị phân tử gần đây đã mở rộng hướng sử dụng nguồn gen từloài hoang dại để cải tiến giống cây trồng Một phối hợp đặc biệt của hồi giaonhờ bản đồ QTL đối với các gen điều khiển tính trạng số lượng đã được công

bố với thuật ngữ chuyên môn là “Advanced Backcross QTL Analysis” (phântích QTL trên quần thể hồi giao cải tiến) đã được ứng dụng trên cà chua, nhằmchuyển tính trạng số lượng “tổng chất rắn hòa tan” (total soluble solids) vàogiống cà chua thương phẩm (Tanksley and Nelson, 1996) Đây là phương pháp

có một tiềm năng lớn để bổ sung cho phương pháp chọn tạo giống thôngthường khác và được kỳ vọng là một trong những phương pháp có tính chấttiếp cận với những phương pháp hiện đại trong thời điểm hiện nay

2.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa

Phương pháp lai hồi giao là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong chọntạo giống lúa để chuyển gen mục tiêu từ cây cho sang cây nhận Mục đíchchính của phương pháp này là giảm số lượng gen của cây cho trong con lai (Xi

et al., 2008) Các nước Nam Á và Đông Nam Á đã ứng dụng thành công

phương pháp tạo giống này để cải tiến khả năng kháng đạo ôn của các giống

lúa như KDML105, Basmati và Manawthukha (Joseph et al.,2004; Toojinda et

al., 2005) Cùng thời gian đó, phương pháp tiếp cận hồi giao mới cũng được

thiết lập bằng việc ứng dụng dấu phân tử Sự kết hợp này đã tạo ra nhiều thuận

lợi hơn trong việc lai tạo giống và báo cáo đầu tiên trên cây lúa bởi Chen et

al., (2000).

2.4.1 Sơ lược về phương pháp chọn lọc bằng chỉ thị phân tử

Việc sử dụng các chỉ thị phân tử ADN cho mục tiêu chọn lọc trong các

chương trình chọn giống được đề cập đầu tiên bởi Sorensen and Robertson

(1961) Với sự phát triển của công nghệ sinh học thì việc chọn giống cây trồngcũng đã có cuộc cách mạng lớn, hầu hết các phương pháp chọn lọc không thểthực hiện được bằng việc dựa trên kiểu hình thì có thể sử dụng các chỉ thị phân

tử liên kết với các gen quy định tính trạng đó Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử cólợi thế rất lớn vì nhiều đặc tính cây trồng không thể đánh giá được ở điều kiệnngoài đồng (Giora and Lavi, 2012) Bên cạnh đó, việc chọn lọc bằng chỉ thịphân tử có thể thực hiện ở giai đoạn sớm (khi cây còn nhỏ), giúp rút ngắn thờigian chọn lọc, công sức và chi phí thực hiện Tuy nhiên, ở một vài tính trạngthì việc chọn lọc kiểu hình sẽ hiệu quả và tiết kiệm chi phí hơn là sử dụng chỉthị phân tử Các nhà chọn giống đặc biệt quan tâm đến các tính trạng quantrọng như chống chịu với điều kiện bất lợi từ môi trường cũng như các tínhtrạng nông học

Có gần 100 gen chức năng và tính đa hình đã được xác định dưới điềukiện tự nhiên ở mức độ sinh lý và phát triển của cây Ở nhiều loài cây trồng,các gen này quy định cho một số tính trạng như thời gian nảy mầm và ra hoa,kiểu hình và cấu trúc của hạt và trái, cũng như các tính trạng năng suất và chất

lượng (Blanco et al., 2009) Chín gen tác động quy định đến sự khác nhau trong thời gian ra hoa của cây Arabidopsis đã được phân lặp và một số có ảnh hưởng chính như FRI, FRL1, FRL2 và FLC Ngược lại, sự phân tích thời gian

ra hoa ở cây bắp không cho thấy có QTL ảnh hưởng chính đến tính trạng này

Thay vào đó, các QTL chỉ có ảnh hưởng nhỏ đã được nhận định bởi Buckler et

al, (2009) Bên cạnh đó, Blanco et al (2003) cũng cho thấy rằng DOG1 cảm

ứng cho sự nảy mầm của hạt và biểu hiện trong suốt quá trình phát triển của

2.4.2 Một số thành tựu của chỉ thị SSR trong chọn giống lúa

SSR (Simple Sequence Repeat): Sự lặp lại trình tự đơn giản, là nhữngtrình tự đặc biệt của ADN mà có chứa sự lặp lại nối tiếp từ 2-6 base Các đoạnADN này sau đó được tách ra trên gel polyacryramide hoặc agarose và hiển thịnhờ phản ứng nhuộm Bạc (Ag) hoặc Ethydium Bromide sau đó chụp hìnhbằng tia UV Chiều dài các đoạn ADN trên điện di khoảng 100-200bp Cácđoạn mồi (primer) được thiết kế cho phản ứng PCR dựa trên chuỗi mà ở haiđầu của các “vệ tinh” Thể đa hình chiều dài các chuỗi mã đơn giản lặp lại(SSLPs) được xác định dựa trên sự khác biệt về số lượng các đơn vị lặp lại tại

vị trí mà chỉ thị đo định vị (Jacob et al., 1991; Jennings et al., 1979; McCouch

et al., 1997) và cung cấp một nguồn đánh dấu sự khác biệt ngay trên vật chất

di truyền

Chỉ thị SSR rất phong phú và phân bố rộng trong genome cây lúa vì thếchúng được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền giữa các giống (McCouch

et al., 1997; Lang et al., 2001b; Lang et al., 2002b).

Bản đồ di truyền SSR trên genome cây lúa được thiết kế với các SSRmarker được viết tắt là RM (Rice Microsatellite) ở Mỹ và OSR ở Nhật Sựphong phú về số lượng các chỉ thị SSR với các trình tự lặp lại phát triển trênnhững phần mã hoá và không mã hoá của genome cây lúa (Wu and Tanksley,

1993; Panaud et al., 1995, 1996; Akagi et al., 1996; Chen et al., 1997; Temnykh et al., 2000) giúp cho việc khảo sát sự hiện diện và khác biệt các chuỗi mã đơn giản lặp lại trên toàn bộ genome ngày càng hoàn hảo Cho et al.

(2000) xác định tỉ lệ đa hình tìm thấy nhờ các marker từ genome cao hơn rấtnhiều các chỉ thị từ ESTs (83,8% so với 54,0%) Về các trình tự lặp lại, mức độ

đa dạng di truyền cao nhất tìm thấy ở chỉ thị khuyếch đại chuỗi mã GA trongkhi hầu hết các chỉ thị khuyếch đại chuỗi mã CCG hoặc CAG không tìm thấy

sự khác biệt Ở lúa đã phát hiện các nhóm GA, GT, CAT, CTT (Liu, 2005)Nguyễn Thị Lang (2001a) đã thiết lập bản đồ di truyền cho gen khángmặn trên cây lúa bằng SSR marker trên các quần thể con lai BC2F2 của nhiều

tổ hợp lai khác nhau Đối với quần thể con lai giữa IR64/Chenghui bản đồđược thiết lập với 34 SSR marker có tổng chiều dài là 148,6 cM phủ trên 3nhiễm sắc thể số 1, 8, 9 Quần thể con lai giữa IR64/OM1706 có 35 SSRmarker được sử dụng để xây bản đồ, có tổng chiều dài 50,5 cM phủ trên nhiễmsắc thể số 1 với 8 marker Có 47 marker được sử dụng trong phân tích quần thểcon lai của tổ hợp IR64/FR13A, các marker này có tổng chiểu dài 191,6

18

cM phủ trên nhiễm sắc thể số 1 và 109,3 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 11.Quần thể con lai của tổ hợp Tequing/OM1706 sử dụng 28 chỉ thị SSR với tổngchiều dài 95,4 cM phủ trên nhiễm sắc thể số 6.

Cũng với chỉ thị vi vệ tinh, bản đồ gen mùi thơm được xây dựng nhờmarker RG28F-R liên kết trên nhiễm sắc thể số 8 thông qua phân tích BC1F1,

F1, F2, BC1F2 các tổ hợp lai IR/64/Jasmine, IR64/DS20 (Lang và Bửu, 2002b;

Nguyễn Thị Lang và ctv, 2004; Akagi et al., 1996; Lang và Bửu, 2002c)

2.5 Chọn tạo giống bằng phương pháp lai hồi giao kết hợp với chỉ thị phân tử

Phương pháp lai hồi giao có sự hỗ trợ của dấu phân tử (Marker – AssistedBackcross Method – MABC) là một trong những phương pháp chính xác vàhiệu quả để bảo tồn các đặc tính quan trọng của giống bố mẹ Trong phươngpháp này, một dấu phân tử được sử dụng dựa trên đặc tính hình thái, sinh hóahoặc dựa trên sự biến đổi của ADN/ARN để gián tiếp chọn lọc những kiểu genhoặc những tính trạng mà nhà chọn giống quan tâm (ví dụ như tính khángbệnh, khả năng chịu đựng với những điều kiện bất lợi của môi trường…).Nguyên tắc của MABC là tích hợp gen mục tiêu đã xác định được vị trí trênnhiễm sắc thể từ giống cho khi lai lại với bố mẹ Có ba yếu tố ảnh hưởng đếnhiệu quả của MABC là: số lượng cá thể của quần thể hồi giao, khoảng cáchcủa dấu phân tử với mục tiêu và số lượng dấu phân tử được sử dụng trong quá

trình chọn lọc (Neelam et al., 2016) MABC giúp các nhà chọn giống xác định

được chính xác sự hiện diện của gen mục tiêu trên các dòng hồi giao

(Mohammad et al., 2015) Điều này sẽ giúp cải thiện giống lúa, giúp các giống này có thể chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như lũ lụt hay

kháng được với sâu bệnh Như vậy, MABC nên được sử dụng để cải thiện chất

lượng và gia tăng năng suất lúa (Neelam et al., 2016).

2.5.1 Các giả thuyết mô hình MAS

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhà khoahọc đưa ra và được phân tích cặn kẽ Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hànhlai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọnlọc có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Hơn thếnữa, Frisch (1999) đã đưa ra chiến lược “chọn lọc hai giai đoạn” để áp dụngtrong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉ thị phântử

Theo Robert Koebner (2003) những tính toán dựa trên cơ sở máy tính để

so sánh các chiến lược chọn lọc 2 bước, 3 bước và 4 bước (stage) về tỷ lệ kiểugen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype-RPG) cho thấy: Với

chiến lược lấy mẫu 4 bước và quần thể từ 50-100 cá thể, tỷ lệ kiểu gen giống

bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90% Trong khi chọn giống truyềnthống phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn

Việc tăng số lượng chỉ thị để đánh giá kiểu gen ở mỗi thế hệ có rất ít tácdụng Khi ngưỡng 1 chỉ thị/20 cM đạt được, việc thêm chỉ thị nữa là không cầnthiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locus quan tâm) Điều đó cho thấy, việc lấymẫu quần thể lớn hơn với ít chỉ thị hơn có tác dụng hơn việc làm ngược lại.Collard và Mackill (1998) đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thịphân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặtvới locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thịADN (ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy

Theo Mackill et al (2006) MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có

những ưu điểm nổi bật là: đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọcdựa trên kiểu hình; tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc;rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt; có thể chọn lọc sớm,trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3; không bịảnh hưởng của môi trường; và có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp vàchọn lọc từng cây

Chọn tạo giống lúa ứng dụng chỉ thị phân tử gồm đánh giá nguồn vật liệu

di truyền trước khi thực hiện một chương trình chọn giống

Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cầnlai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình

2.5.2 Điều kiện để ứng dụng MAS

Theo Francia (2005) sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MASphụ thuộc vào các yếu tố: bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị

đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm;mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs; sự tái tổ hợpthích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen; khả năng đánh giá một

số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả Có 2 kiểu chỉ thị

có thể ứng dụng trong MAS: (1) chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm

vi gen quan tâm Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìmthấy loại chỉ thị này; (2) nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng với genquan tâm Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lýgần nhau Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS (linkagedisequilibrium -MAS)

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các

chương trình chọn giống với các ưu điểm sau: khả năng chọn lọc ngay từ giaiđoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khichúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếuchỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt,tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang); khả năng sàng lọc nhữngdấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví

dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với nhữngnòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh họcnhư hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc); khả năng phân biệt trạng thái đồnghợp tử hay dị hợp tử của nhiều vị trí trong cùng một thế hệ mà không cần kiểmtra thế hệ sau; khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thờigian, do vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví

dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trong trườnghợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lâynhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùnggây hại) rất khó đạt được kết quả Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân

tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm)khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

Bảng 2.2: Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng triểnvọng (nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1

Số thế hệ backcross (n) Tỷ lệ kiểu gen của dòng nhận gen

Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một QTL/gen từ dòng