Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắcxin phòng bệnh cho cá mú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠ

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -NGUYỄN THỊ THANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện Toàn

bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Thanh

đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính, cơ sở vật chất, trang thiết bị từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15 Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này

Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tất cả những sự giúp

đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2018 Tác giả luận án

Nguyễn Thị Thanh

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh mục bảng ix

Danh mục hình x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá mú 4

1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú 4

1.1.2 Đặc điểm phân bố 4

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 5

1.1.4 Đặc điểm sinh sản 6

1.1.5 Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú 6

1.2 Ýnghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú 7

1.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam10 1.3.1 Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển 10

1.3.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới 12

1.3.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam 15

1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá 17

1.4 Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 21

1.5 Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 25

1.6 Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá27 1.6.1 Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh 27

1.6.2 Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới 30

1.6.3 Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam 34

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 37

2.2 Nội dung nghiên cứu 38

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú 38

2.3.1.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 38

2.3.1.2 Phương pháp mô bệnh học 38

2.3.1.3 Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào 39

2.3.1.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 40

2.3.1.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 41

2.3.1.6 Điện di axit nucleic trên gel agarose 41

2.3.1.7 Phương pháp tách dòng gen: 41

2.3.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV) 45

2.3.2.1 Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1 45

2.3.2.2 Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú 46

2.3.2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1 47

2.3.2.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú 48

2.3.3 Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 48

2.3.3.1 Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen 48

2.3.3.2 Nối gen T4 vào vector pET32a+ 49

2.3.3.3 Chuyển gen vào E coliJM109 49

2.3.3.4 Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn 50

2.3.3.5 Nuôi cấy E coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+ -T4 51

2.3.3.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE 51

2.3.3.7 Phương pháp Western blot 52

2.3.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng

nguyên tái tổ hợp 53

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 56

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57

3.1 Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam 57

3.1.1 Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học 57

3.1.2 Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR 59

3.1.3 Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào 62

3.1.4 Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV 67

3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú 72

3.2.1 Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào mẫn cảm72 3.2.2 Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú 73

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 75

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú 77

3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 80

3.3.1 Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4 80

3.3.2 Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh85 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coliBL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV 85

3.3.2.2 Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp 87

3.3.2.3 Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 92

3.3.3 Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp 95

3.3.4 Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 97 3.3.4.1 Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ 97 3.3.4.2 Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú 100

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa Amino axit

BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử

thần kinh trên cá bơn)

bp Base pair (cặp bazơ)

BSA Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)

cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid (Chuỗi Axit

Deoxyribonucleic acid bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (Hiệu ứng bệnh tích tế bào)

CNS Central nervous system (Hệ thần kinh trung ương)

cs Cộng sự

Da Dalton

DAB Diamino bezidine (kit làm hiện màu)

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (phản ứng miễn dịch

liên kết enzyme) EtBr Ethidium Bromide

FCS fetal calf serum (Huyết thanh bào thai bê)

HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase)

kb kilobase

KDa Kilodalton

GAA Global Aquaculture Alliance (Liên minh nuôi trồng thủy sản

toàn cầu)

GS Grouper spleen (tế bào lách cá mú)

IPTG isopropyl β-D- thiogalactoside

Ig Immunoglobulin (kháng thể)

LB Leibovitz’s (môi trường nuôi tế bào)

LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) NCR Non coding region

ND Not done (không đánh giá)

NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây hoại tử thần kinh)

nt nucleotid

OD Optical Density (mật độ quang)

ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở)

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di trên gel

polyacrylamide) PCR Polemerase Chain Reaction (chuỗi phản ứng polime)

PVDF Polyvinylidene Fluoride

RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút gây hoại

tử thần kinh trên cá mú chấm đỏ) RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse Transcription PCR (PCR phiên mã ngược)

SDS Sodium dodecyl sulphase

SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút gây hoại tử thần

kinh trên cá măng sọc) TAE Tris - acetate - EDTA

TBS Tris Buffer Saline

VLPs Virus-like particles (Tạo hạt giả vi rút)

VNN Viral Nervous Necrosis (Bệnh hoại tử thần kinh)

DANH MỤC BẢNG Thứ tự

1.1 Vùng địa lý và sự phân bố một số loài cá mú có biểu hiện

bệnh hoại tử thần kinh 13 1.2 Các kiểu gen của Betanodavirus 23 1.3 Thuận lợi và tồn tại của vắc-xin DNA 33 1.4 Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú 34 3.1 Kiểm tra vi rút bằng phương pháp mô bệnh học 58

3.2 Kiểm tra vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp

3.3 Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 65

3.4 So sánh mức độ đồng nhất của trình tự đoạn gen T4 thu được

với các trình tự của GenBank 70

3.5 Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào

3.10 Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần

kinh ở mô hình in vitro 97

3.11 Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần

kinh ở mô hình in vivo 99

3.12 Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV

trên mô hình in vitro 101

DANH MỤC HÌNH Thứ tự

1.1 Hình thái ngoài cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) 4 1.2 Sản lượng cá mú nuôi ở một số quốc gia trên thế giới 8 1.3 Dấu hiệu bệnh lý của cá mú bị VNN 11 1.4 Cấu trúc không gian của Betanodavirus 22 1.5 Cấu trúc gen của Betanodavirus 22 2.1 Quy trình thực hiện phương pháp mô bệnh học 39

2.2 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây

nhiễm của vi rút trên tế bào 47

2.3 Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây

nhiễm của vi rút trên cá mú 48 3.1 Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá 57

3.2 Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm

3.3 Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV 63

3.4 Mức độ gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) khi gây

nhiễm NNV trên tế bào GS1 66 3.5 Thiết kế vector tái tổ hợp pGEM-T-T4 68 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp 69

3.7 So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với

đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1 71 3.8 Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV 76 3.9 Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+

-T4 81 3.10 Cắt vector pGEM-T-T4 (A) và cắt vector pET32a+

(B)

3.11 Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector

3.12 Đĩa khuẩn lạc thu được sau khi chuyển gen pET32a+

3.16 Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E

coliBL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 86

3.17

Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp

vector tái tổ hợp pET32a+

MỞ ĐẦU

Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanh chóng, dần khẳng định vị trí của mình và trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam Nghề nuôi cá biển được đánh giá là nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một trong những loài

nuôi chủ lực Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế rất cao do hàm

lượng dinh dưỡng giàu axit béo không no, thịt cá thơm ngon bổ dưỡng cho nên được thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá mú phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít khó khăn bởi dịch bệnh gây ra trên cá Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá mú thường là vi rút, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất

là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy -VER) do Betanodavirus

gây ra Vi rút có thể tấn công và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn phát triển từ ấu trùng, cá giống đến cá thương phẩm Khi bị bệnh cá có biểu hiện rối loạn thần kinh như bơi mất thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới hoặc treo trên mặt nước hay nằm dưới đáy bể, đáy lồng Cá bệnh

có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi cá trên cả nước Mùa vụ xuất hiện bệnh từ tháng 5 đến tháng 10 khi nhiệt độ nước từ 24 đến 30ºC Tỷ lệ chết do VNN gây ra dao động từ 50 - 100% tùy thuộc theo loài và giai đoạn xuất hiện bệnh (Đỗ Thị Hoà và cs, 2004) [2]

Hiện tại, ở Việt Nam mặc dù chưa có báo cáo tổng quát về bệnh hoại

tử thần kinh gây ra cho cá mú nuôi, nhưng các số liệu từ nghiên cứu của trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh cao lên tới 82% mẫu cá bệnh thu thập (Nguyễn Ngọc Du và cs,

2005; Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh, 2004; Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên, 2008) [1][13][3]

Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch khá tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó việc nghiên cứu tạo nguyên liệu để sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá đang là vấn đề cấp thiết hiện nay Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại

tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất

vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)”

Mục tiêu của đề tài luận án:

- Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh

- Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh được thu từ các vùng biển

Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa, Bình Thuận

- Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú được xác định

- Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh cá

mú

- Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: tháng 7 năm 2012 đến tháng 5 năm 2015

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

- Tính khoa học: Luận án đã xác định được vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú và một số đặc tính sinh học của chúng Đồng thời luận án đã sản xuất kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp của vi rút gây bệnh, bước đầu

đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch làm cơ sở cho việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú Dữ liệu khoa học của luận án sẽ cung cấp thêm tư liệu giảng dạy và nghiên cứu về bệnh ở cá mú cũng như định hướng sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú nuôi hiện nay

- Tính thực tiễn: Đề tài đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp

và đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm khi được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp này Trên cơ sở đó có thể dùng kháng nguyên protein tái tổ hợp làm nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh, tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá mú ở nước ta

Đóng góp mới của đề tài luận án:

- Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú với một số đặc tính sinh học như khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và trên cá mú, đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và trên cá

mú

- Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và bảo hộ cho cá mú cho đến ngày thứ 90 sau khi tiêm Đây là cơ sở khoa học vững chắc để sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá mú

1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú

Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống

Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers Giống Epinephelus gồm 99 loài, khu

vực Ấn Độ, Thái Bình dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống

Epinephelus Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển nước ta có

khoảng 30 loài cá mú (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]

nâu (Epinephelus coioides)

1.1.2 Đặc điểm phân bố

Cá mú là loài cá sống tại những vùng nước ấm, phân bố chủ yếu ở

những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy ở vùng biển ôn đới Nhiệt độ

thích hợp cho các loài cá mú phát triển là từ 22-32ºC, thích hợp nhất là

25-30ºC Cá chịu được độ mặn từ 11- 41‰

Môi trường sống của chúng thay đổi tuỳ theo loài, chẳng hạn như loài

E akaara, Cephalopholis miniata sống ở những nơi nước có độ trong cao,

có chất đáy là rạn đá ngầm, san hô (ngoài khơi) Các loài E merra, E

fuscogustatus, E bleekeri sống chủ yếu ở vùng biển cạn, nơi có bờ đá và

rạn san hô, độ mặn cao và ổn định Cá con thường tìm thấy ở trong các đám

rong, cỏ biển Các loài E tauvina, E malabaricus, E coioides, E

dao động từ 10-32‰, chất đáy rất đa dạng từ đáy cứng, cát đến đáy bùn

Cá con thường tìm thấy ở vùng triều ven bờ, cửa sông và rừng ngập mặn

Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển Việt Nam có khoảng

30 loài, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế, giá trị xuất khẩu cao như: cá

mú chấm đỏ (E akaara), cá mú vạch (E brunneus), cá mú chấm tổ ong (E

merra), cá mú mỡ (E tauvina), cá mú đen (E heeberi), cá mú cáo (E megchir), cá mú chấm nâu (E coioides) Vùng biển Bắc bộ có cá mú mỡ, cá

mú đen, cá mú cáo, cá mú chấm nâu Vùng biển Trung bộ có cá mú đỏ, vùng biển Đông và Tây Nam bộ có cá mú đỏ, cá mú mỡ Ngoài ra cũng có nhiều loại có giá trị cao nhưng chưa được đưa vào nuôi phổ biến, chủ yếu là do

đánh bắt như cá mú nghệ (E lanceolatus) (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Sự tăng trưởng cá mú khác nhau giữa các loài Cá nuôi sau 1 năm, với

cá mú chấm đỏ (E akaara) đạt khoảng từ 0,3 - 0,4 kg, cá mú chấm xanh (E malabaricus), cá mú chấm nâu (E coioides) là 0,8 kg, cá mú mỡ (E

tauvina) là 1,0 - 1,2 kg; cá mú nghệ (E lanceoratus) là 3 - 4 kg, đây cũng là

loài lớn nhất trong họ cá mú Hiện nay đã khai thác được cá mú ngoài tự nhiên có những con đạt khối lượng tới 150 kg

Cá bột sau 1 ngày tuổi có chiều dài trung bình 2,18 mm, miệng đóng, chưa có sắc tố, khối noãn hoàng vẫn còn Sau 3 ngày tuổi, miệng mở, cá bắt đầu ăn thức ăn ngoài, lúc này ống tiêu hoá chưa hoàn chỉnh Khi cá đạt 12 ngày tuổi, dài 3,57 mm; miệng, mắt, ống tiêu hoá hoàn chỉnh, bắt đầu phát triển sắc tố thân Sau 18 ngày tuổi, chiều dài cá từ 5-8 mm, gai lưng thứ 2 dài, giai đoạn này cá rất nhạy cảm với các yếu tố bên ngoài, thời điểm này tỷ lệ hao hụt rất lớn Cá 32 ngày tuổi, chiều dài 8-10 mm; vây phát triển hoàn thiện và có sắc tố đen trên tất cả các tia vây, gai lưng thứ 2 và cơ thể ngắn lại Cá 39 ngày tuổi dài 10-12 mm, các vây hoàn chỉnh, tỷ lệ gai lưng thứ 2 giảm đáng kể Cá 54 ngày tuổi dài 16,5 mm, gai lưng ngắn, hình dáng và sắc

tuổi dài 18 cm, 2 tuổi dài 18 -24 cm, 3 tuổi dài 23-28 cm, khối lượng 0,5 kg,

4 tuổi dài 26- 33 cm khối lượng 0,7-1,0 kg, 5 tuổi dài 31-34 cm (Nguyễn Thị Vui, 2012) [14]

1.1.4 Đặc điểm sinh sản

Cá mú có khả năng chuyển đổi giới tính, thông thường lúc nhỏ là cá cái, khi trưởng thành chuyển thành cá đực Cá thường sinh sản vào ban đêm theo tuần trăng Trứng đẻ ra được thụ tinh ngay trong môi trường nước, đường kính trứng khoảng 0,76-0,82 mm và có giọt dầu nhỏ giúp trứng nổi trong nước Trứng sau khi thụ tinh sẽ xảy ra quá trình phân cắt tế bào và

sự phát triển phôi Ở độ mặn 30‰, hàm lượng oxy trên 5 mg/l, nhiệt độ

26-30oC và sau thời gian từ 15 đến 25 giờ trứng sẽ nở ra cá bột

1.1.5 Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú

Ở cá xương nói chung và cá mú nói riêng có các hàng rào cơ học như dịch nhờn, da và mang bảo vệ giúp cơ thể cá chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]

Cá mú có hệ miễn dịch không đặc hiệu gồm: các yếu tố ức chế sinh trưởng như tranferin, interferon, lisin có trong bổ thể, protein có trong phản ứng C và lectin Bên cạnh đó cá mú còn có hàng rào bảo vệ cấp tế bào như: đại thực bào, bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, bạch cầu ái kiềm

Cá mú có hệ miễn dịch đặc hiệu, cơ thể cá có khả năng sinh miễn dịch khi được tiếp xúc với các kháng nguyên và tạo được kháng thể có khả năng bảo hộ với mầm bệnh tương ứng

Cơ thể cá mú có các tế bào tham gia vào quá trình bảo vệ đặc hiệu như cơ quan lympho, trong đó thận được xem là cơ quan lympho ngoại vi của cá, là nơi xảy ra quá trình bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên cho hệ thống đáp ứng miễn dịch của cá mú Các tế bào lympho tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch cũng có nguồn gốc và chức năng gần giống như động vật trên cạn

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể ở cá: khi kháng nguyên xâm nhập vào trong cơ thể cá thì được đưa vào hệ thống tế bào bạch cầu, chủ yếu là đại thực bào vây bắt và trình diện kháng nguyên, xử lý và trình diện yếu tố quyết định kháng nguyên lên bề mặt làm kích hoạt các tế bào lympho T Tế bào lympho T kích thích lên tế bào lympho B chuyển thành tương bào sản sinh kháng thể Tương bào xuất hiện và tăng số lượng trong lách và thận sau một tuần từ khi có kháng nguyên kích thích Kháng thể trong huyết thanh thường xuất hiện khi số lượng tương bào đạt giá trị cao nhất sau khoảng 10-15 ngày; lượng Immunoglobin (Ig) tăng lên mạnh mẽ và đạt cực đại vào 20-30 ngày sau khi tiêm kháng nguyên So với động vật có vú, pha mẫn cảm ở cá kéo dài hơn và thời gian duy trì hàm lượng kháng thể cũng dài hơn

Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở mang: mang cá có vai trò hấp thụ kháng nguyên, đặc biệt kháng nguyên không hòa tan Mang cá có khả năng sản xuất kháng thể tại chỗ cho nên mang có vai trò quan trọng đối với cá

Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở da: Immunoglobulin đã được phát hiện trong dịch nhớt được tiết ra trên da cá Sự có mặt của lympho, tương bào và đại thực bào ở biểu bì đã khẳng định có sự đáp ứng miễn dịch cục bộ trên da

cá (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]

Đáp ứng miễn dịch cục bộ ở dịch nhầy: dịch nhầy có chứa globulin miễn dịch chủ yếu là IgM và các yếu tố hòa tan khác như ngưng kết tự nhiên, lysin, lysozym, bổ thể Khi tiến hành ngâm hoặc cho tiếp xúc với kháng nguyên bằng cách cho ăn sẽ hình thành kháng thể trong dịch nhầy song không làm tăng kháng thể trong huyết thanh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]

1.2 Ýnghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú

Theo Liên minh nuôi trồng thủy sản toàn cầu (GAA), sản lượng cá mú nuôi trên toàn thế giới năm 2009 ước đạt hơn 70.000 tấn, sản lượng tăng dần trong những năm gần đây và năm 2018 dự kiến đạt gần 160.000 tấn [67] Hiện nay có khoảng 22 loài cá mú được nuôi ở các nước Đông Nam Á và

Đông Á So với một số quốc gia khác thì nghề nuôi cá mú ở Việt Nam còn khá khiêm tốn

(Nguồn: Global Aquaculture Alliance) [67]

Hình 1.2 Sản lượng cá mú nuôi ở một số quốc gia trên thế giới

Theo Tổng cục Thủy sản, cá biển là một trong 5 đối tượng nuôi chính hiện nay Năm 2016, diện tích nuôi cá biển ở ao đầm của Việt Nam đạt 6.300

ha và 1.164.643 m3 lồng, sản lượng cá biển nuôi đạt 28.293 tấn Các loài cá nuôi phổ biến nhất là cá mú (chiếm 50%), cá giò (30%) và cá vược (7-8%) [72] Cá mú là đối tượng nuôi có giá trị kinh tế rất cao Giá thị trường đối với loài cá mú đen và cá mú chấm nâu có khối lượng từ 800 g đến 1000 g là 200.000 - 300.000 đồng/kg Với cá mú chấm đỏ có giá dao động 400.000-500.000 đồng/kg [73][74]

Thị trường cá mú trên thế giới rất có tiềm năng, nhiều nước trong khu vực Đông Nam Á và lân cận có giá trị xuất khẩu cá mú cao như Indonesia, Philippin, Đài Loan, Singapore, Úc Giá cá mú tại Hồng Kông khá cao và phụ thuộc vào từng loài đánh bắt tự nhiên hoặc nuôi Cá mú được nuôi ở nhiều nước thuộc khu vực Đông Nam Á bao gồm Indonesia, Malaysia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan, Hồng Kông, Việt Nam

Ở Việt Nam nhu cầu tiêu thụ cá mú trong nước và xuất khẩu cao, vì vậy trong tự nhiên cá đang bị khai thác quá mức Nghề nuôi cá mú ở nước ta

đã hình thành và đang phát triển mạnh với hai vùng nuôi tập trung: ở phía Bắc

là 2 tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng và ở phía Nam là các tỉnh Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Việt Nam có khoảng 6.800 lồng nuôi cá biển; trong đó có 80% là nuôi cá mú và 500 ha ao đìa nuôi cá mú, sản lượng cá mú nuôi hàng năm đạt trên 3.000 tấn, trong đó nuôi lồng chiếm 2/3 sản lượng, các loài cá mú thường được nuôi ở Việt Nam

như: cá mú chấm xanh (E malabaricus), cá mú chấm nâu (E coioides), cá

mú chấm đỏ (E akaara), cá mú bleeker (E bleekeri), cá mú sáu sọc (E

sexfasciatus), cá mú tảo (E moara), cá mú mỡ (E tauvina), cá mú chấm đen

(E fuscoguttatus) Hai loài là cá mú son (Cephalopholis miniata) và cá mú chấm nhỏ (Plectropomus leopardus) thường được khai thác tự nhiên Giá trị

thương phẩm từ cá mú nuôi hàng năm ước đạt hơn 300 tỉ đồng (Lê Thị Thu Thảo và cs, 2011) [10]

Tại Việt Nam nguồn cá mú giống chủ yếu được đánh bắt ngoài tự nhiên hoặc nhập khẩu từ Đài Loan, Philippines Năm 2005, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã ương giống cá mú đen chấm đỏ thành công Hiện tại, một

số trung tâm giống cũng tự sản xuất được một lượng giống nhất định nhưng

số lượng cá giống còn rất ít so với nhu cầu để cung cấp cho các vùng nuôi cá thương phẩm

Cá mú được nuôi nhiều trong các lồng tre hay bè gỗ, được đặt cố định hay thả nổi ở các vùng biển ít gió bão, sóng nhẹ như các vịnh, đầm, phá Ngoài ra hiện nay cá mú còn được nuôi trong các ao đầm nước lợ ven biển

Cá giống được thả với có kích cỡ khoảng 8-12 cm, nuôi từ 6 đến 8 tháng thì đạt khối lượng khoảng 0,5-1,5 kg/con, khối lượng cá xuất bán tùy yêu cầu của thị trường

Tuy có giá trị kinh tế rất cao như vậy song cá mú thường hay bị một số bệnh như đốm đỏ, bệnh hoại cơ, bệnh đường ruột các bệnh này đều do vi khuẩn gây nên Đặc biệt bệnh nguy hiểm mà cá mú mắc phải và có tỷ lệ tử

vắc-xin phòng ngừa loại vi rút này và biện pháp phòng bệnh chủ yếu vẫn là đảm bảo vệ sinh và cách ly các nguồn lây nhiễm vi rút

1.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam

1.3.1 Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển

Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm đối với cá biển trên toàn thế giới Theo các nghiên cứu cho thấy bệnh này đã gây ra trên 70 loài thủy sản nước mặn và nước ngọt trong đó có 32 loài

cá biển, cá mú là loài rất mẫn cảm với bệnh này (Munday và cs, 2002; Doan

và cs, 2017) [44][31]

Tác nhân gây bệnh được xác định là Betanodavirus thuộc họ Nodaviridae (Nishizawa và cs, 1997; Setty và cs, 2012) [48][62] Vi rút thường cư trú nhiều nhất là ở hệ thần kinh trung ương như não và võng mạc mắt Ngoài ra vi rút còn được tìm thấy ở tuỷ sống, tuyến sinh dục, gan, dạ dày

và ruột (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004; Breuil và cs, 2000; Muroga, 1995; Nakai và

cs, 1995; Munday và cs, 2002; Grotmol và cs, 2000) [2][21][45][46][44][34]

Khi cá bị VNN thì có một số dấu hiệu bệnh lý tùy theo từng giai đoạn phát triển của cá Khi cá còn nhỏ (dưới 20 ngày tuổi) dấu hiệu bệnh lý không thể hiện rõ ràng tuy nhiên bệnh gây ra tỷ lệ chết cao (trên 80%) Khi cá nuôi được 20 đến 45 ngày tuổi thì cá có một số biểu hiện như cá bơi gần mặt nước, màu sắc cơ thể đen xám, bóng hơi căng phồng

Khi cá nuôi được 4 tháng tuổi thì dấu hiệu bệnh lý thể hiện rõ ràng: cá bơi không định hướng, bơi xoay tròn theo hình xoắn ốc, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, cá bỏ ăn, cuối cùng cá rơi vào trạng thái hôn mê, nằm ở đáy lồng, đáy bể hoặc đáy ao Giải phẫu cá bệnh cho thấy bóng hơi căng phồng, trong ruột không có thức ăn chỉ chứa dịch hơi xanh và nâu, gan nhợt nhạt

Hình 1.3 Dấu hiệu bệnh lý của cá mú bị VNN

(Nguồn: Đỗ Thị Hòa và cs, 2004 [2]) A: Cá bỏ ăn, màu sắc cơ thể đen tối B: Cá bơi tách đàn

C: Giải phẫu cá bệnh, bóng hơi căng D: Cá bơi ngửa, bơi xoay tròn

VNN có phạm vi phân bố rộng, xuất hiện ở nhiều nước từ châu Mỹ đến châu Âu: Pháp, Đức, Italy Ở Châu Á bệnh này đã được báo cáo xuất hiện tại Hồng Kông, Indonesia, Nhật Bản, Malaysia, Philippines, Hàn Quốc, Thái Lan

và Việt Nam Các loài cá mú dễ bị nhiễm bệnh bao gồm: E coioides, E

malabaricus; E bruneus; Cromileptes altivelis

Cá bột, cá hương khi bị nhiễm VNN tỷ lệ chết tới 80%, cá cỡ 2,5 -7,5

cm chết tới 100%, khi cá đạt kích cỡ lớn hơn 15 cm thì tỷ lệ chết giảm dưới 20% Bệnh hoại tử thần kinh đã thực sự trở thành mối đe dọa đối với nghề

1.3.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới

Trong một vài năm trở lại đây, nhiều nước đã chủ động cho sinh sản nhân tạo cá mú thành công nên càng thúc đẩy nghề nuôi cá thương phẩm phát triển Những số liệu thống kê cho thấy 95% cá nuôi lồng bè và 80% cá nuôi

ao có ảnh hưởng bởi dịch bệnh trong đó cả 2 loại tác nhân Nodavirus và

Iridovirus đã gây thất thoát 62,44% tổng giá trị sản lượng cá nuôi (Munday và

Tại Thái Lan vào năm 1995, cá mú loài E malabaricus nuôi cỡ từ

2,5-15 cm bị VNN có triệu chứng bơi quay tròn với tỷ lệ chết lên tới 100% ở cỡ

cá nhỏ, 20% ở cỡ cá lớn (Danayadol và cs, 1995) [30]

Tại Singapore năm 1998, Chew lim và cs đã phân lập được

Betanodavirus từ loài cá mú mỡ E tauvina với cỡ cá 2-5 cm và xác định đó

chính là nguyên nhân gây chết 86 - 91% cá giống Cá bị bệnh không có dấu hiệu hoại tử hay lở loét bên ngoài cũng như trong cơ thể, cá có biểu hiện bơi xoay tròn không định hướng, một số nhảy lên mặt nước, hoạt động yếu dần và chết (Hegde và cs, 2003) [36]

Tại Đài Loan, năm 1994 lần đầu tiên VNN đã gây thành dịch trên các

loài cá mú E fuscoguttatus, E akaara và E owoara Bệnh đã bùng phát trở

lại năm 1995 và làm chết tới 60% sản lượng cá nuôi (Chi và cs, 2003) [24]

Tại Hàn Quốc, VNN đã gây chết tới 80% cá mú chỉ trong vài tuần Bệnh có thể xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá nhưng tỷ lệ nhiễm bệnh nặng nhất là giai đoạn ấu trùng dưới 20 ngày tuổi Năm 1998, Sohn và Park tổng kết rằng bệnh này đã ảnh hưởng đến 7 loài cá mú nuôi ở Hàn Quốc, bệnh thường xảy ra vào mùa hè và tỷ lệ chết lên tới 80% (Sohn và

cs, 1998) [63]

Tại Indonesia (năm 2001), VNN đã xuất hiện và gây tác hại trên một số

loài cá mú: E malabaricus, E fuscoguttatus và E coioides ở giai đoạn ấu

trùng và tiền trưởng thành Gần đây, bệnh này lại được phát hiện trên loài E

coioides và E bleekeri, tỷ lệ chết lên tới 100% trong vòng 2 tuần từ khi dấu

hiệu bệnh lý đầu tiên xuất hiện (Zafran và cs, 2001) [71]

Năm 2013, Betanodavirus đã nhiễm trên cá E coioides, Chromileptes

altivelis nuôi ở Malaysia và gây ra tổn thất lớn đối với nghề nuôi cá mú ở

nước này Do đó, để hạn chế dịch bệnh, các chính sách an toàn sinh học cần phải được thực hiện ở tất cả các cơ sở nuôi trồng thủy sản trong cả nước (Ransangan và cs, 2013) [56]

- Đặc điểm dịch tễ của VNN: bệnh trên cá mú có liên quan đến vùng nuôi có nhiệt độ nước cao Betanodavirus nhiễm trên cá ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới ngoại trừ Châu Phi Sự phân bố của một số loài cá mú nhiễm Betanodavirus theo khu vực địa lý được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Vùng địa lý và sự phân bố một số loài cá mú có biểu hiện

bệnh hoại tử thần kinh

Đài Loan Cá mú chấm đỏ E akaara Chi và cs, 2003 [24]

Cá mú vàng E awoara Lai và cs, 2001 [42]

Indonesia Cá mú chuột Cromileptes altivelis Zafran và cs, 2001 [71] Malaysia Cá mú mỡ E tauvina Bondad và cs, 2000 [19] Singapore Cá mú mỡ E tauvina Hegde và cs, 2003 [36] Thái Lan Cá mú chấm xanh E malabaricus Danayadol và cs, 1995 [30] Nhật Bản Cá mú tảo E moara Nakai và cs, 1995 [46]

Cá mú bảy vạch (E septemfasciatus) Fukuda và cs, 1996 [33]

Cá mú bảy vạch (E septemfasciatus) Nishizawa và cs, 2012 [49] Hàn Quốc Cá mú bảy vạch (E septemfasciatus) Sohn và cs, 1998 [63]

Philipine Cá mú cọp E fuscogutatus Pakingking và cs, 2010 [51]

Có hai phương thức lan truyền bệnh: lan truyền theo chiều ngang và lan truyền theo chiều dọc

Phương thức truyền bệnh theo chiều ngang: vi rút từ những cá bị bệnh

lây lan sang những con khoẻ qua tiếp xúc trực tiếp hoặc vi rút được lan truyền gián tiếp thông qua thức ăn, dòng chảy bị ô nhiễm Vi rút cũng có thể theo dịch tiết của cá bệnh vào môi trường nước và chúng xâm nhập vào cá khỏe qua mang, da và miệng cá hoặc lây lan qua các dụng cụ chuyên dùng trong nuôi cá như lưới, vợt, dây sục khí

Theo nghiên cứu của Chi và cs (2003) [24], những con cá tạp nhỏ được thu từ các trại nuôi mà bị nhiễm VNN khi dùng làm thức ăn thì cá nuôi có thể nhiễm vi rút Các tác giả đã chính thức phân lập được vi rút từ nguồn thức ăn

hàng ngày cho cá gồm: Artemia salina, Tigriopus japonicas, Acetesinte

medius và khẳng định thức ăn là một trong những nguồn lây nhiễm vi rút

Ngoài ra, cá nuôi trong cùng một bể ăn thịt lẫn nhau cũng được xem như một con đường lây nhiễm VNN Có vài nhân tố ảnh hưởng đến phương thức lan truyền theo chiều ngang như mật độ nuôi cá, nhiệt độ nước và độc lực của các chủng vi rút ở các điều kiện nuôi dưỡng (Tanaka và cs, 2001) [65]

Phương thức truyền bệnh theo chiều dọc: vi rút gây bệnh được truyền

từ bố mẹ sang con qua trứng và tinh trùng, đã chứng minh khi phát hiện thấy

vi rút ở tuyến sinh dục và trứng đã thụ tinh ở Pseudocaranx dentex bằng

phương pháp ELISA Sau đó một số báo cáo chứng tỏ sự lây truyền theo chiều dọc đã được phát hiện ở cá mú 7 vạch, cá măng sọc, cá bơn, cá chim

Sự lây nhiễm vi rút vào buồng trứng cũng được công bố ở loài Dicentrarchus

labrax (Arimoto và cs, 1993) [17]

Vi rút gây bệnh trên cá mú có thể chịu đựng ngưỡng pH rất rộng từ 2 đến 9 và duy trì sống được ở nhiệt độ nước 15oC trong vòng hơn 1 năm (Frerichs và cs, 2000) [32] Vi rút thích nghi được ở những vùng nước ấm hoặc bệnh chỉ xảy ra vào mùa hè 20-30o

C Sau khi tiêm vào phần cơ của cá

hỗn dịch vi rút từ não và mắt của cá bị bệnh loài E septemfasciatus và E

akaara, Tanaka và cs (2001) [65] đã kết luận rằng cả tỷ lệ chết và triệu chứng

của bệnh đều bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ nước Khi nhiệt độ cao hơn 28o

C thì

tỷ lệ chết cao nhất và thời gian ủ bệnh nhanh nhất Tác giả cũng xác định

được VNN hiếm khi bùng phát trên cá E septemfasciatus ở nhiệt độ thấp 14

-15oC

1.3.3 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam

Nghề nuôi cá mú ở Việt Nam bắt đầu từ năm 1990 Cho đến năm 2003 một số khu vực nuôi cá mú tập trung đã phát triển ở vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Nha Trang, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu và Kiên Giang (Lê Anh Tuấn, 2004 [11], Võ Văn Quang và cs, 2013 [5]) Trong những năm qua cả nước ta có 500 ha vùng biển ven bờ được xây dựng thành các ao đìa nuôi cá mú Sản lượng cá mú hàng năm cung cấp trên 3000 tấn sản phẩm Cá mú chấm đỏ, cá mú chấm nâu đang là các đối tượng nuôi được lựa

chọn đối với nhiều người dân vùng ven biển

Ở Việt Nam, đã phát hiện một số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần

kinh (Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh, 2004) [13] Trong đó có các loài: E

coioides, E fuscogutatus, E tauvina, E lanceolatus, E malabaricus ở Khánh

Hoà; loài E coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh hoại

tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam được phát hiện lần đầu tiên vào năm

2002 ở các lồng nuôi tại Vân Đồn, Quảng Ninh Theo Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2004) [13], bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10 hàng năm khi nhiệt độ từ 25 đến 300C, ở nhiệt độ 280C độc lực của vi rút mạnh hơn nhiều so với ở nhiệt độ 160

C

Cá mú ương từ 40 đến 45 ngày tại Cửa Hội, Nghệ An bị VNN Cá có dấu hiệu bỏ ăn, bơi xoay tròn và tỷ lệ chết lên tới 70 - 80% trong vòng 7 ngày Bằng phương pháp chẩn đoán mô bệnh học đã tìm thấy các không bào có kích

cỡ 5-7 µm, màu trắng đục, không bào có trong não nhưng không thấy trong mắt cá Cá nuôi từ 45 ngày đến 4 tháng tuổi nhiễm bệnh được nhận biết qua các dấu hiệu như: bơi không định hướng, bơi quay tròn, cá kém ăn hay bỏ ăn,

bệnh hoạt động yếu, đầu treo trên mặt nước hoặc dưới đáy bể, lồng Cá chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết từ 80-100% (Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh, 2004) [13]

Theo Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên (2008) [3], tại Khánh Hòa, có gần 30% hộ nuôi cá biển chịu tác hại của VNN Giai đoạn cá nhỏ (5-20 cm) thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn, tỷ lệ chết từ 50 đến 100% Vào tháng 7 năm 2008, VNN xuất hiện trên cá mú cỡ 5-6 cm nuôi tại các bè của trại thực nghiệm trường Đại Học Nha Trang, bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100% cá trong vòng một tuần Khi cá nuôi lồng bị bệnh người ta còn quan sát được một số loài cá khác sống xung quanh lồng cũng có dấu hiệu bệnh tương tự

Kết quả điều tra của khoa Nuôi trồng thủy sản, Đại Học Nha Trang cho thấy cá mú nuôi tại vùng biển Khánh Hòa thường xuất hiện dấu hiệu tương tự VNN như bơi không định hướng, bơi thành vòng tròn trên mặt nước, cá bỏ

ăn, màu sậm đi Tuy nhiên, các biểu hiện bên ngoài này chỉ xuất hiện ở cá mú giống và cá nuôi thương phẩm giai đoạn nhỏ ở Cửa Hội (Nghệ An) VNN trên

cá mú nuôi ở Cát Bà thì không có biểu hiện đặc trưng của bệnh (Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh, 2004) [13]

Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên (2008) [3] quan sát mô bệnh học trên

cá mú chấm nâu, cá mú cọp, cá mú mỡ, cá mú nghệ, cá chẽm, cá bớp (cá giò) chết có dấu hiệu VNN nuôi tại Khánh Hoà Trong nghiên cứu các tác giả cho thấy tác nhân gây bệnh đã phá huỷ các tế bào thần kinh và võng mạc mắt, tạo

ra các không bào có hình dạng và kích thước khác nhau Ở mô não và mắt của các loài cá trên thấy xuất hiện của 2 dạng không bào là dạng hình tròn và dạng hình elip với đường kính từ 4-30 µm

Theo Nguyễn Ngọc Du và cs (2005) [1] cho biết VNN thường xảy ra trên cá mú giống nuôi tại Vũng Tàu Khi tiến hành xét nghiệm 64 mẫu cá thì

có 53 mẫu cá nhiễm bệnh với tỷ lệ nhiễm là 82,8%, bệnh đã gây chết toàn bộ

cá nuôi

Tháng 5 năm 2010, tại hai khu vực nuôi cá mú lồng tại xã Hải Dương, huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế đã xảy ra hiện tượng cá nuôi từ một đến hai tháng tuổi chết hàng loạt, số lượng thiệt hại ước tính trên 25 vạn con với tổng giá trị thiệt hại khoảng 450 triệu đồng Cá mú bị bệnh có các biểu hiện như bỏ ăn, màu sậm, xương sống cong lên, mắt lồi, bơi lòng vòng, chết rất nhanh và chết đồng loạt Những biểu hiện bệnh lý trên cá mú là đặc điểm điển hình của bệnh hoại tử thần kinh

Đầu năm 2013, dịch bệnh trên cá mú lại xuất hiện tại vùng nuôi của xã Xuân Thịnh và Xuân Hòa thuộc thị xã Sông Cầu (tỉnh Phú Yên) Số lồng bị bệnh là 370 trên tổng số 527 lồng nuôi trong khu vực Tỷ lệ cá mắc bệnh từ 50-70% trong tổng số 75.400 con, kích cỡ cá bị bệnh từ 0,4-0,7 kg/con Cá

mú bị chết vào thời điểm đầu tháng 5 đến tháng 8 (Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên, 2008) [3] Như vậy VNN gây ra trên cá mú có sự phân bố khắp các vùng từ Bắc vào Nam và gây ra thiệt hại rất lớn cho người nuôi cá vì vậy các phương pháp chẩn đoán bệnh ngày càng được cải tiến nhằm xác định sớm mầm bệnh và có biện pháp phòng bệnh cho cá

1.3.4 Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá

Hiện nay để chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh gây ra trên cá thường sử dụng các phương pháp: mô bệnh học, phân lập vi rút trên tế bào, sinh học phân tử, sử dụng kính hiển vi điện tử và chẩn đoán miễn dịch học (OIE, 2005) [15]

1.3.4.1 Kỹ thuật mô bệnh học

Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương trong mô tế bào dựa trên kỹ thuật nhuộm và quan sát tế bào trên kính hiển vi để phát hiện không bào do NNV tạo ra Đây là một trong những kỹ thuật đơn giản và có thể nhận biết sự có mặt của vi rút gây bệnh

Thông thường, ấu trùng nhỏ kích thước dưới 1,5 cm được cố định cả con, cá có kích cỡ lớn hơn được giải phẫu lấy đầu hoặc lấy não và mắt, rồi cố

sau khi cắt tiêu bản được nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin, mẫu được gắn bằng keo nhân tạo và quan sát trên kính hiển vi quang học (OIE, 2005) [15]

Tuy nhiên, trong một số trường hợp bằng phương pháp mô bệnh học không phát hiện được thể vùi của vi rút nhưng kiểm tra PCR lại cho kết quả dương tính với NNV Điều này có thể do NNV đang ở giai đoạn tiền nhiễm hoặc số lượng NNV thấp chưa thể phá hủy các tế bào thần kinh Như vậy phương pháp này chỉ áp dụng được cho những trường hợp cá đã có biểu hiện bệnh, không áp dụng được trong trường hợp khi vi rút ở dạng ẩn trong bộ gen của tế bào chủ Bằng phương pháp này có thể quan sát Betanodavirus nhiễm trên cá bao gồm thể vùi và vùng hoại tử ở hệ thần kinh trung ương đặc biệt là

ở não, mắt và tủy sống Khi giải phẫu ở não cá bệnh cho thấy: vùng não trước

có tỷ lệ nhiễm cao hơn vùng não sau Ngoài ra trong vùng chất xám của não

bộ cũng xác định được thể vùi của NNV

Tại Singapo năm 2003, Hegde và cs đã phân lập được vi rút gây hoại

tử thần kinh từ cá mú mỡ (E tauvina) bị bệnh NNV được nuôi trên dòng tế

bào SB (sea bass), đã xác định đặc tính sinh hóa và khả năng gây bệnh Vi rút

có nhân chứa RNA với đường kính 28-30 nm Các tác giả đã phân tích cấu trúc protein của vi rút bằng SDS-PAGE thấy có polypeptid có trọng lượng xấp xỉ 25 kDa Vi rút gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (Cytopathogenic effect - CPE) như tạo ra các vùng mụn bao quanh tế bào, khoanh vùng các tế bào chết

và tách rời các mảng tế bào Bệnh tích tế bào do NNV tạo thành các vòng và các vết loang xung quanh tế bào, vùng tế bào chết và tế bào bị tan rã sau 3-5 ngày gây nhiễm vi rút với hiệu giá vi rút TCID đạt 10-7.2

(Hegde và cs, 2003) [36]

1.3.4.2 Phân lập NNV trên tế bào

Phân lập vi rút trên tế bào hiện là phương pháp quan trọng và hữu hiệu cho việc tái bản và nhận diện vi rút Trên thế giới, cho đến năm 1993, hơn

150 dòng tế bào đã được sử dụng cho phân lập và nhận dạng vi rút gây bệnh cho cá Tuy nhiên hầu hết những dòng tế bào trước đó đều được tạo từ mô của các loài cá nước ngọt Khi xuất hiện bệnh hoại tử thần kinh, nhiều nghiên cứu

để phân lập vi rút từ những dòng tế bào đang có đều không thành công

Năm 1991, dòng tế bào SSN-1 được nhiều nhóm nghiên cứu tạo từ tế

bào ấu trùng cá Striped snakehead để phân lập Betanodavirus nhiều lần

nhưng đều thất bại Lý do chủ yếu là vì dòng tế bào này dễ bị nhiễm một loài retrovirus týp C còn gọi là SnRV Sau nhiều nỗ lực hoàn thiện dòng tế bào này đã có thể nuôi được trên 17 loài vi rút thuộc cả 4 kiểu gen của Betanodavirus (Iwamoto và cs, 2000) [39] Các tác giả này đã khẳng định, E-

11 là một dòng tế bào mới được tạo từ dòng tế bào SSN-1 có tiềm năng lớn cho định tính, định lượng Betanodavirus bởi tính ổn định, CPE đặc trưng và

có nhiều thuận lợi cho việc lưu giữ và tái bản vi rút Hiện nay nhiều dòng tế bào nhạy cảm với Betanodavirus đã được sử dụng như: SF từ ấu trùng của cá

chẽm Lates calcarifer (Chang và cs, 2001) [23], GB từ não của E awoara (Lai và cs, 2001) [42], GS từ lách của cá mú chấm nâu E coioides (Qin và cs,

2006) [55] Những dòng tế bào này là công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân

lập và tái bản Betanodavirus cả ở in vitro và in vivo

Khi dùng dòng tế bào SSN-1, CPE thường xuất hiện vào ngày thứ 3 kể

từ ngày nhiễm vi rút và đặc trưng bởi sự xuất hiện những không bào kích cỡ khác nhau phân bố khắp lớp tế bào nuôi cấy

1.3.4.3 Chẩn đoán bằng PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều để chẩn đoán bệnh do vi rút gây ra Phương pháp này có thể phát hiện được hàm lượng rất nhỏ DNA hay RNA trong bất kỳ mẫu mô nào Đây là phương pháp

khuếch đại bằng RT-PCR của Betanadovirus trên cá và liên quan đến việc thiết kế mồi cho vùng bảo tồn của protein vỏ (RNA2) của SJNNV (Nishizawa

và cs, 1997) [48] Các cặp mồi đặc trưng cho nhiều loài Betanodavirus cũng được các nhà sản xuất chú trọng thiết kế để tăng độ nhạy cho phản ứng PCR với nhiều chủng, loài khác nhau Cặp mồi cho PCR chẩn đoán, phân loại thường nhắm đến những trình tự trên RNA2, hầu hết là trình tự gen T2 và gen T4 Các cặp mồi có kích thước khoảng 20 nucleotit

Tùy mục đích chẩn đoán hay nghiên cứu người ta có thể tiến hành nhân bản những vùng đích đặc trưng hay nhân cả hệ gen của vi rút

Để chẩn đoán nhanh, người ta có thể thao tác PCR với mẫu mô bệnh trên lam kính và đặt vào thiết bị chuyên dụng để thực hiện RT-PCR tại chỗ hoặc tách chiết RNA tổng số từ mẫu cá bệnh và tiến hành RT-PCR để phát hiện trình tự đặc trưng

Thông thường, kỹ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên

mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA và giai đoạn khuyếch đại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết Kết quả PCR sẽ được điện di và

so sánh với các mẫu chuẩn để kết luận

1.3.4.4 Kỹ thuật quan sát vi rút bằng kính hiển vi điện tử

Vi rút có thể quan sát thấy ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết với màng lưới nội chất hoặc ngoại bào bằng kính hiển vi điện tử

Một số trường hợp quan sát thấy các vi rút hợp lại thành dạng tinh thể trong tế bào chất Bằng cách này, người ta đã quan sát được cả virion ở nhiều vùng tế bào của cá bệnh như: tế bào nơron thần kinh, tế bào hình sao, tế bào màng trong, các tế bào lympho gần màng trong tim, các tế bào màng ngoài tim (Grotmol và cs, 2000) [34]

Betanodavirus có kích thước nhỏ 25-30 nm nên việc quan sát bằng kính hiển vi điện tử trên những mẫu bệnh, đặc biệt là khi mật độ vi rút thấp, có thể gặp trở ngại, đó cũng chính là giới hạn của phương pháp này Ngoài ra, người

ta có thể quan sát thể vùi ở một số tổ chức bị bệnh do NNV gây ra

1.3.4.5 Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay- Phản ứng miễn dịch liên kết enzyme) là kỹ thuật dựa trên sự kết hợp giữa kháng

nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo ra sản phẩm có màu hay phát sáng cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ thấp ELISA rất hữu ích trong phát hiện những cá thể mang vi rút gồm cả những cá thể sống sót sau dịch bệnh và những cá thể còn nhỏ (ấu trùng, cá giống) không có biểu hiện bệnh Tuy nhiên, giới hạn của ELISA gián tiếp là trong một số trường hợp cá bệnh cho kết quả dương tính với những test phát hiện kháng nguyên nhưng lại cho kết quả âm tính với ELISA, do cá bệnh chưa tạo được kháng thể đặc hiệu hoặc nồng độ kháng thể thấp Tuy nhiên, theo Watanabe

và cs (2000) [68] việc phát hiện những cá thể mang bệnh nên kết hợp đồng thời 2 công cụ là PCR để phát hiện hệ gen vi rút và ELISA để phát hiện kháng thể đặc hiệu sẽ cho kết quả chẩn đoán chính xác hơn

1.4 Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá được xác định là Betanodavirus

Betanodavirus có hệ thống phân loại:

Ngành: virus

Họ: Nodaviridae Giống: Alphanodavirus (nhiễm trên côn trùng) Betanodavirus (nhiễm trên cá)

Vi rút có hình cầu, nhân không có màng bao, đường kính từ 25-30 nm,

22 mặt đối xứng với T = 3, vỏ protein được bao gồm 180 protein

Cấu trúc genome của Betanodavirus: hệ gen của Betanodavirus có cấu trúc phân đoạn, RNA mạch đơn, sợi (+), tuyến tính hai phía của betanodavirus có hai tiểu phần Tiểu phần lớn của hệ gen chứa RNA1 (3.1 kb)

mã hóa cho một protein có kích thước 100 kDa với chức năng như là RNA polymerase (hay còn gọi protein A) Một khung đọc mở (ORF) là ORF1b

(khung đọc mở có trình tự là một phần ở đầu 3' của ORF1a), ORF1b này mã hóa cho protein B1 và B2

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của Betanodavirus

Tiểu phần nhỏ của hệ gen chứa RNA2 (1.4 kb) mã hóa cho 2 phân tử protein vỏ lớn có kích thước 43 kDa và 41 kDa được hình thành do quá trình đồng sao chép một chuỗi polypeptide Trên RNA2 chứa một khung đọc mở (ORF) cho một protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp)

và T4 (420 bp) (Nishizawa và cs, 1997) [48]

Hình 1.5 Cấu trúc gen của Betanodavirus

- Phân loại kiểu gen của Betanodavirus

Giống Betanodavirus được phân thành 4 kiểu gen chính được trình bày

ở bảng 1.2 (Iwamoto và cs, 2000; Setty và cs, 2012; Costa và cs, 2016; Toffan

và cs, 2016) [39][63][29][66]

Mỗi kiểu gen có sự phân bố theo vùng miền địa lý và đặc tính gây bệnh khác nhau Kiểu gen RGNNV là gây bệnh nhiều nhất ở các nước thuộc khu vực Châu Á Thái Bình Dương: Trung Quốc, Đài Loan, Philippines, Indonesia nơi có vùng nhiệt độ thích hợp với khí hậu Việt Nam, đây là kiểu gen có nhiều khả năng gây ra dịch bệnh trên cá biển ở nước ta

Bảng 1.2 Các kiểu gen của Betanodavirus

BFNNV C Các loài cá nước lạnh: Atlantic

halibut, Atlantic cod, flounders 15-20ºC

RGNNV C Các loài cá nước ấm: Groupers,

Asian seabass, European seabass 25-30ºC

RGNNV có kích thước nhỏ, đường kính khoảng 30 nm, hình thái đối xứng 20 mặt (T3) Cấu tạo gồm có vỏ capsid bao quanh 2 RNA sợi đơn (+), không có màng bao Vỏ capsid được cấu thành bởi 32 capsome gồm tổng cộng 180 protein, khối lượng phân tử 8.106

Da

Khối lượng hệ gen RGNNV chiếm khoảng 20% khối lượng hạt virion RNA hệ gen gồm có 2 sợi đơn với kích thước dài tổng cộng 4500 nucleotit (Bovo và cs, 1999) [20]

Hệ gen của RGNNV được giải trình tự đầy đủ vào năm 2003 Kích

thước RNA1 là 3105 bp từ nucleotit (nt) 79 đến 3027 là cùng ORF mã hóa cho protein A (RNA- dependent RNA polymerase), kế 2 bên là vùng 5' và vùng 3' không mã hóa với kích thước lần lượt là 78 bp và 76 bp Từ trình tự

trên, khối lượng phân tử của RNA1 RGNNV là 992.735 Da Vùng ORF mã

hóa cho protein A với khối lượng phân tử ước tính 110.420 Da Phân tử protein A có kích thước 982 axit amin cũng đã được giải trình tự đầy đủ Ngoài ra, từ nt 2753 đến 2980 là đoạn gen mã hóa cho protein B có kích thước 75 axit amin Vai trò của protein B trong quá trình tái bản của NNV còn đang được nghiên cứu Kích thước protein này tương đương giữa nhiều chủng NNV ở những kiểu gen khác nhau

RNA2 của RGNNV có kích thước 1434 bp từ nt 27 đến 1043 mã hóa cho protein vỏ vi rút có kích thước 338 axit amin Hai cùng 5' NCR và 3' NCR có kích thước lần lượt là 26 nt và 390 nt Khối lượng phân tử của RNA2

là 459.025 Da và mã hóa cho protein capsid khối lượng 37.004 Da

Kiểu gen BFNNV và TPNNV thì có nhiệt độ phát triển tối ưu thấp hơn 20ºC Đây là kiểu gen gây bệnh đối với cá biển sống ở những vùng có nhiệt

độ lạnh như: Nhật Bản, Bắc Mỹ và Châu Âu (Frerichs và cs, 2000) [32]

Kiểu gen SJNNV có bộ gen được nghiên cứu khá kỹ lưỡng ở các nước Nhật Bản, Mỹ và Châu Âu Nhiệt độ thích hợp để vi rút phát triển thường từ 20-25ºC

Dựa vào trình tự hệ gen của NNV thể hiện rõ ở RNA2 mã hóa protein

vỏ và RNA1 mã hóa cho RNA phụ thuộc RNA polymerase (Nishizawa và cs, 1997) [48] Phân tích trình tự chi tiết của SJNNV, tiểu phần RNA2 chứa gen với chiều dài 1421 bazơ và chứa một vùng đọc mở (ORF) có 1023 bazơ mã hóa protein của 340 amino axit Khi so sánh trình tự của SJNNV với các chủng khác của Betanodavirus như RGNNV, TPNNV, BFNNV và JFNNV cho thấy có trên 75,8% sự khác biệt về số nucleotit và trên 80,9% mức amino axit (Nishizawa và cs, 1997) [48]

Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy Betanodavirus có thể xâm nhiễm vào cá suốt từ giai đoạn ấu trùng đến tiền trưởng thành (Munday và cs, 2002) [44]

Cơ chế gây bệnh của NNV

Cơ chế gây tổn thương mô bệnh học của NNV đã được nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa học như Nakai và cs, 2000 [47], Rimmer và cs, 2006 [58] cho

thấy: NNV nhiễm vào nguồn nước, từ thức ăn tươi sống, sau đó vi rút xâm nhập vào trong cơ thể cá qua da, mang, miệng, ruột, dạ dày, gan, thận, tuyến sinh dục Cuối cùng vi rút tấn công vào mô đích là hệ thống thần kinh (não, tủy sống) và võng mạc Tại các mô đích vi rút sinh trưởng, phát triển và gây hoại tử hệ thần kinh của vật chủ Nếu vi rút chưa tấn công vào não thì cá vẫn sống sót sau dịch bệnh Tuy nhiên trứng cá có thể nhiễm vi rút thông qua tuyến sinh dục và nguồn nước

Quá trình hoại tử các nơron thần kinh được quan sát thấy ở hầu hết các loài cá bị nhiễm NNV Thể vùi nội bào cũng được tìm thấy ở nhiều loài cá đặc biệt là ở cá mú chấm nâu Những tổn thương mô bệnh học liên quan tới

nhiễm Betanodavirus chứng minh một cách rõ ràng rằng vi rút tấn công trước

tiên vào hệ thần kinh trung ương và võng mạc, nơi có vị trí tái bản của nó Tuy nhiên còn có những quan điểm khác nhau về con đường cũng như phương thức lây truyền của NNV trong cơ thể cá

Ngoài ra ở khoang mũi cũng có khả năng là một đường xâm nhập của

vi rút khi phát hiện thấy kháng nguyên ở thùy khứu giác, bên cạnh đường qua mang, miệng, da (Peducasse và cs, 1999) [53]

Một số tác giả cho biết với kỹ thuật kiểm tra kháng thể huỳnh quang

gián tiếp (IFAT) đã phát hiện thấy vi rút ở những cơ quan khác nhau của những cá thể cá sống sót sau dịch bệnh như: tuyến sinh dục, gan, thận, ruột,

dạ dày nhưng lại không phát hiện thấy vi rút ở hệ thần kinh trung ương và võng mạc Kết quả đó củng cố thêm giả thuyết về quá trình nhiễm vi rút vào trứng cá qua con đường sinh sản (Ransangan và cs, 2013; Roy và cs, 2010) [56][59]

1.5 Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

VNN đã được phát hiện hơn 20 năm, nhưng những hiểu biết về cơ chế gây bệnh và dịch tễ học vẫn còn hạn chế, đó cũng có thể là một lý do mà cho đến hiện nay chưa có loại vắc-xin nào đạt được hiệu quả mong muốn Vì vậy

những biện pháp đảm bảo vệ sinh, tránh các nguồn lây nhiễm vẫn được coi như là biện pháp chủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn

Phương pháp kiểm soát thường áp dụng là loại trừ sự có mặt của vi rút từ các trại sản xuất giống hoặc ở khu vực nuôi vừa bằng cách khử trùng nước đồng thời là loại trừ vi rút ở cá bố mẹ từ trại giống và vùng nuôi Một trong những hóa chất diệt vi rút được dùng nhiều nhất là iodphors có hiệu quả ngay

cả ở nồng độ thấp từ 25-100 ppm (Frerichs và cs, 2000) [32] Dung dịch hypochlorite cũng có hiệu quả khá tốt trong khi sử dụng formalin cho kết quả thấp Một số thuốc khác được người nuôi cá dùng để kiểm soát bệnh do NNV gây ra và một số bệnh kế phát khác như Oxytetracilline, Flophenicol, PVP iodine (Arimoto và cs, 1996) [18]

Khử trùng trứng đã thụ tinh bằng ozone với hàm lượng 1g O3/lít nước trong 1 phút có thể trung hòa hoàn toàn vi rút bám trên bề mặt của trứng do

đó giảm khả năng nhiễm bệnh cho ấu trùng (Grotmol và cs, 2000) [31]

Theo Munday và cs, 2002 nước đi vào bể ương nên được xử lý với ozone và không tái sử dụng nước Tuy nhiên, nếu điều kiện không cho phép thì chỉ nên tái sử dụng tối đa 1/2 lượng nước của bể Nhiều tác giả cũng khuyến cáo nên xử lý nước với tia UV trước khi đưa vào bể nuôi [45]

Cá bố mẹ được sàng lọc để kiểm tra sự hiện diện của vi rút, vừa kiểm tra bằng RT-PCR vừa sàng lọc huyết thanh bằng kháng thể đặc hiệu (Breuil

và cs, 2000; Watanabe và cs, 2000) [21][67] Ngoài ra, các tác giả cũng khuyến cáo rằng trứng cá nên rửa bằng nước biển với ozon ở hàm lượng 0,2 µg/ml đối với cá măng sọc (Arimoto và cs, 1996) [16] và 4 µg/ml đối với cá chim (Grotmol và cs, 2000) [34] Nakai và cs (1995) [46] cũng khuyến nghị nên ngâm trứng cá măng sọc với PVP iodine 50 µg/ml trong 10 phút để hạn chế sự lây nhiễm của vi rút trên trứng Phương pháp kiểm soát khác là nuôi tách ấu trùng và cá măng sọc giống, nước được diệt khuẩn bằng tia UV ở 1.0x105 µW/s.cm2 hoặc ozon ở 0,1 µg/ml từ 2 đến 5 phút, xử lý các dụng cụ với chlorine nồng độ 50 µg/ml trong 10 phút Chế độ vệ sinh nghiêm ngặt ở

các trại giống như không tái sử dụng nước, dùng hóa chất sát trùng nước biển

và khử trùng các bể trong suốt chu kỳ ấp nở trứng đã đem lại thành công ở trang trại sản xuất giống cá chẽm Chọn lọc cá giống không bị nhiễm vi rút, mua cá giống đã qua kiểm dịch tại các cơ sở có uy tín và được kiểm soát chất lượng chặt chẽ; khử trùng ao, lồng nuôi và các dụng cụ trước khi đưa vào nuôi

Để hạn chế sự lan truyền của vi rút theo vùng và giữa các châu lục thì việc sàng lọc NNV bằng các kỹ thuật chẩn đoán có độ nhạy cao là cần thiết Một vài nhóm nghiên cứu trên thế giới đã và đang thử nghiệm dùng vắc-xin phù hợp để kiểm soát bệnh cho cá Theo một số báo cáo của Nakai, 2000 [47], Tanaka và cs, 2001 [65], Husgard và cs, 2001 [38] về việc thử nghiệm

sử dụng protein vỏ tái tổ hợp của Betanadovirus để phòng bệnh cho cá nuôi Tuy nhiên hiện vẫn chưa có báo cáo chứng minh được sự biểu hiện protein

mã hóa của NNV cũng như hiệu quả của vắc-xin DNA thế hệ mới (Sommerset và cs, 2005) [64]

1.6 Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá

1.6.1 Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh

Kháng nguyên là những chất lạ từ bên ngoài, sau khi xâm nhập vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sản sinh kháng thể dịch thể và tế bào mẫn cảm đặc hiệu chống lại sự xâm nhập và gây bệnh của mầm bệnh

Kháng nguyên được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng chống bệnh truyền nhiễm cho động vật thường là kháng nguyên của vi sinh vật Thành phần hóa học của kháng nguyên vi sinh vật đều là protein, lipopolysaccarid, polysaccarid Trong các loại kháng nguyên của vi sinh vật thì kháng nguyên có bản chất là protein và lipopolysaccarid có tính kháng nguyên mạnh và tính đặc hiệu cao (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010) [4]