Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thư của ricin tinh sạch từ hạt thầu dầu (ricinus communis)

Hiện nay, ngoài một số bệnh ung thư có khả năng ngăn ngừa bằng sử dụng vắc xin, việc điều trị ung thư chủ yếu phụ thuộc vào khả năng phát hiện sớm và điều trị kết hợp các phương pháp như

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thơ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG

THƯ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thơ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG

THƯ CỦA RICIN TINH SẠCH TỪ HẠT THẦU DẦU (Ricinus communis)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Ts.Nguyễn Đình Thắng

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới người thầy

tôi luôn yêu quý, Ts Nguyễn Đình Thắng Thầy là người đã luôn tận tình dìu dắt,

hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này Thầy cũng là người thắp lửa, truyền cho tôi cảm hứng và niềm đam mê khoa học từ những ngày đầu bước chân vào con đường nghiên cứu Xin cảm ơn thầy đã tiếp nhận, luôn quan tâm, động viên khích lệ và bao dung tới tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Phòng Sinh học nano và ứng dụng, thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và protein và Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào động vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơnTs Ngô Ngọc Trung, các thầy cô, các anh chị và các bạn trong nhóm nghiên cứu Phòng sinh học Nano và ứng dụng, nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm đã luôn bên cạnh ủng hộ và hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơnđến các thầy cô và cán bộ trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt các thầy cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh và Bộ môn Sinh học tế bào đã luôn tận tình truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn thành viên trong Tổ chức SYSDO Việt Nam, các thành viên trong Nhóm phát triển Dự án 88 và các bạn bè thân hữu đã luôn bên cạnh, khích lệ, là niềm động lực để tôi thay đổi và trở thành một người trẻ tốt đẹp hơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân đã luôn bên tôi, động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi để có thể tiếp tục học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Hà Nội, tháng 10 năm 2017

Nguyễn Thị Thơ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT……… vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1.Giới thiệu về ung thư 3

1.1.1.Ung thư 3

1.1.2.Đặc tính của tế bào ung thư 4

1.1.3.Ung thư da 4

1.2.Giới thiệu về ricin 7

1.2.1.Cấu trúc phân tử ricin 9

1.2.2.Cơ chế gây độc của Ricin 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1.Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 16

2.2.Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 16

2.3.Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1.Phương pháp tách dịch chiết thô từ hạt thầu dầu 17

2.3.2.Phương pháp tách chiết protein tổng số 17

2.3.3.Phương pháp tách chiết và tinh sạch Ricin 18

2.3.3.1.Phương pháp tinh sạch ricin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE – sepharose 18

2.3.3.2.Phương pháp tinh sạch ricin sử dụng sắc ký lọc gel sephadex G-100 18

2.3.3.3.Sử dụng phương pháp Bradford để định lượng nồng độ protein 19

2.3.3.4.Phương pháp thẩm tách miễn dịch 19

2.3.3.5.Phương pháp xác định độ tinh sạch của ricin 20

2.3.3.6.Phương pháp khối phổ 20

2.3.4.Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn 20

2.3.5.Phương pháp đánh giá khả năng chống tế bào ung thư 21

2.3.5.1.Phương pháp nuôi cấy tế bào 21

2.3.5.2.Phương pháp khảo sát độc tính của ricin tinh sạch lên tế bào 21

2.3.5.3.Phương pháp khảo sát tác động của ricin lên khả năng tạo khối u in-vitro 22 2.3.5.4.Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới mức độ biểu hiện của một số protein marker của tế bào 23

2.3.5.5.Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới quá trình apoptosis của tế bào 24

2.3.6.Phân tích kết quả 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1.Kiểm tra hoạt tính của hạt thầu dầu 25

3.2.Thu dịch tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu 28

3.2.1.Tách chiết protein tổng số 28

3.2.2.Tinh sạch ricin từ protein tổng số 30

3.3.Khả năng kháng khuẩn của ricin tinh sạch 36

3.4.Khả năng ức chế của ricin tinh sạch lên tế bào in vitro 37

3.4.1.Độc tính của Ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào HaCaT 38

3.4.2.Khả năng ức chế quá trình tạo khối của ricin lên tế bào SKMEL28 in vitro……… ………39

3.4.3.Tác động của ricin tới mức độ biểu hiện của một số protein marker của tế bào 42

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Cấu trúc protein ricin 9

Bảng 1.2: Amino axit nội phân tử ricin 10

Bảng 1.3: Vùng chức năng trong phân tử ricin 11

Bảng 3.1: Hiệu suất phân tách protein trong muối (NH4)2SO4 29

Bảng 3.2: Quy trình 4 bước phân tách và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh ung thư da [67] 5

Hình 1.2: Con đường truyền tín hiệu MAPK trong tế bào động vật [64] 6

Hình 1.3: Hình ảnh cây Thầu dầu (Ricinnus communis) [63] 7

Hình 1.4: Hình ảnh hạt thầu dầu [63] 8

Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ricin [52] 9

Hình 1.6: Quá trình nhập bào và các con đường di chuyển của ricin trong tế bào động vật [55] 12

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của ricin [55] 13

Hình 1.8: Hai con đường chết theo lập trình của tế bào [58] 14

Hình 3.1: Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn gram âm…… 26

Hình 3.2: Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch chiết hạt thầu dầu lên vi khuẩn gram dương… 27

Hình 3.3: SDS-PAGE kiểm tra protein sau khi tủa với các nồng độ khác nhau của (NH4)2SO4…… 30

Hình 3.4: Hàm lượng protein qua các phân đoạn sau khi chạy sắc ký trao đổi ion DEAE - sepharose 31

Hình 3.5: Thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh sạch của ricin sau khi qua sắc ký lọc gel Sephadex G100 32

Hình 3.6: Trình tự ricin từ EST gi|255587301 34

Hình 3.7: Phổ khối phổ của các đoạn peptide HEIPVLPNR (A), SFIICIQMISEAAR (B), SAPDPSVITLENSWGR (C) và LSTAIQESNQGAFASPIQLQR (D) 35

Hình 3.8: Tác động của ricin lên khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn sau khi xử lý với ricin trong 24 giờ 36

Hình 3.9: Độc tính của ricin lên dòng tế bào HaCaT 38Hình 3.10: Độc tính của ricin lên dòng tế bào SKMEL28 39Hình 3.11: Hình ảnh thể hiện tác động của ricin của lên khả năng tạo khối của tế bào SKMEL28 40Hình 3.12: Kiểm tra khả năng tạo khối của tế bào sau khi xử lý với ricin 41Hình 3.13: Biểu hiện và mức độ phosphoryl hóa ERK tại tế bào SKMEL28và HaCaT tại nồng độ 3µg/ml 43Hình 3.14: Kiểm tra tác động của ricin lên quá trình apoptosis của tế bào SKMEL28

và HaCaT sau 36 giờ 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ

2 - ME 2-Mercaptoethanol 2-Mercaptoethanol

BSA Bovine serum albumin Albumine huyết thanh bò

CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc DEAE Diethylaminoethanol

ERK Extracellular signal regulated kinase Kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò

HPR Horseradish Peroxidase Peroxidase cải ngựa

IACR International Association for

MAPK Mitogen-activated protein kinase Protein kinase hoạt hóa phân chia MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Điện di trên gel polyacrylamide PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối đệm phosphat

RIP Ribosome inactivating protein Protein bất hoạt ribosome

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SDS Sodium dodecyl sulfate

TKR Tyrosine kinase receptor Thụ thể Tyrosine kinase

UPR Unfolded protein response Phản ứng mở protein

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

MỞ ĐẦU

Ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ 2 trên toàn thế giới với hàng triệu

ca mắc bệnh mới được phát hiện hàng năm Theo thống kê của WHO, trong suốt 2 thập niên vừa qua số ca bệnh nhân ung thư đã tăng 70% và xu hướng tăng mạnh trong những năm gần đây Nguyên nhân gây ung thư có thể do thói quen sống, các tác nhân độc hại từ môi trường và di truyền Hiện nay, ngoài một số bệnh ung thư

có khả năng ngăn ngừa bằng sử dụng vắc xin, việc điều trị ung thư chủ yếu phụ thuộc vào khả năng phát hiện sớm và điều trị kết hợp các phương pháp như hóa trị,

xạ trị, miễn dịch để tiêu diệt tế bào ung thư Tại các nước đang phát triển, ung thư là một căn bệnh đáng lo ngại do cơ sở vật chất không đầy đủ gây khó khăn cho việc chuẩn đoán sớm dẫn tới tỉ lệ tử vong cao Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc điều trị nhập ngoại có giá thành cao cũng là một gánh nặng về kinh tế cho người nhà bệnh nhân và xã hội

Ricin là một glycoprotein thuộc họ lectin, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricin được cấu tạo từ 2 chuỗi A và B được liên kết với nhau qua các cầu đisunfit Khi vào trong cơ thể người, ricin tác động thông qua cơ chế ức chế quá trình tổng hợp protein trong ribosome.Ricin có độ độc tính rất cao và được xếp vào chất độc nguy hiểm Trong những năm gần đây, việc ứng dụng chất độc từ nguồn gốc tự nhiên trong điều trị hóa trị ung thư rất được chú ý Một số nghiên cứu định hướng phát triển sử dụng ricin trong điều trị ung thư trên thế giới khẳng định ricin có tác dụng ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của một số dòng tế bào ung thư.Tại Việt Nam, ngành công nghiệp sản xuất dầu thầu dầu thải bỏ hàng tấn bã thầu dầu mỗi năm Những sản phẩm thừa này yêu cầu phải có một quy trình thải bỏ đặc biệt

do vẫn chứa hàm lượng lớn ricin có độc tính cao và có khả năng nguy hại tới sức khỏe cộng đồng

Với mong muốn tận dụng những sản phẩm từ thiên nhiên này bên cạnh tiềm năng ứng dụng cao về hoạt tính của ricin, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài

―Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn và ức chế tế bào ung thƣ của ricin tách

chiết và tinh sạch từ hạt thầu dầu (Ricinus communis)‖ Với vai trò là nghiên

cứu tiền đề trong sử dụng ricin trong điều trị ung thưhướng đích tại Việt Nam, đề tài

có các nhiệm vụ chính sau:

 Tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu

 Kiểm tra độc tính của ricin trên vi khuẩn và tế bào

 Bước đầu nghiên cứu tác động của ricin lên các đặc tính của tế bào ung thư,

cụ thể là khả năng tác độngvào quá trình tăng sinh, khả năng tạo khối và chết theo lập trình của tế bào ung thư da SKMEL28

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về ung thư

dạ dày (1,4%), ung thư vú (8,9%) và ung thư trực tràng (7%)

Ngoài nguyên nhân di truyền, ung thư có thể do một số nguyên nhân chính như: do tia cực tím (UV) từ mặt trời hoặc các nguồn tiếp xúc khác, tỉ lệ chất béo trong cơ thể cao, chế độ ăn uống không hợp lý, lười vận động, sử dụng thuốc lá và rượu bia Theo thống kê, thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu và là tác nhân trực tiếp dẫn tới 13 loại ung thư khác nhau Rượu bia với thành phần chính là ethanol cũng

là tác nhân chính gây ung thư Theo báo cáo của Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, người

sử dụng nhiều hơn 50 gam ethanol mỗi ngày có tỉ lệ ung thư gấp 2 đến 3 lần so với người không sử dụng rượu bia Nhiều nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng tỉ

lệ trường hợp mắc bệnh ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư trực tràng và ung thư vú cao có nguyên nhân xuất phát từ sử dụng rượu bia và thuốc lá quá mức Bên cạnh đó, thực phẩm không đảm bảo, chứa dư lượng chất bảo vệ thực vật và chất bảo quản cao, do chế độ ăn không hợp lý kết hợp béo phì cũng là nguyên nhân lớn dẫn tới ung thư

1.1.2 Đặc tính của tế bào ung thư

Tế bào ung thư là những tế bào có sự phát triển không bình thường, có khả năng phát triển và sinh trưởng vượt qua chu trình tế bào bình thường Hiện nay, đã

có hơn 100 loại tế bào ung thư được ghi nhận Do các kiểu tế bào ung thư phát triển

từ các loại tế bào khác nhau, nên đặc điểm và tính chất của các kiểu ung thư cũng có nhiều sự khác biệt Tuy nhiên, các tế bào ung thư đều có khả năng sinh học nổi bật

để tạo nên tổ chức bệnh như: duy trì tín hiệu tăng sinh, trốn khỏi tín hiệu ngừng tăng trưởng và chu trình chết của tế bào, phân chia không giới hạn, khả năng tạo khối, di căn và tạo mạch máu khối u Những đặc tính này xuất hiện do sự không ổn định của hệ gen và quá trình gây viêm Hệ gen không ổn định và quá trình viêm thúc đẩy hình thành khối u khi có tác động của chất gây ung thư hoặc ảnh hưởng từ môi trường

Sự tăng sinh không kiểm soát, hình thành khối tế bào và xâm lấn sang môi trường xung quanh là đặc điểm thường nhận thấy của tế bào ung thư Tuy nhiên, với một số đặc điểm khác nhau về khả năng di chuyển, mức độ nguy hiểm và tính chất khối u, ung thư được chia thành hai dạng: u lành tính và u ác tính Khối u lành tính (benign tumor) là những u có thế bào tăng sinh không kiểm soát tuy nhiên không lan rộng trong cơ thể và chỉ gây nguy hiểm khi xuất hiện tại những vị trí đặc biệt như ung thư não U ác tính (malignant) là những khối u nguy hiểm, có khả năng xâm lấn mạnh ảnh hưởng tới các mô bên cạnh và có khả năng di căn trong cơ thể

1.1.3 Ung thư da

Ung thư da (melanoma) là một dạng ung thư ác tính của tế bào sắc tố da (melanocytes) Melanoma chiếm tỉ lệ thấp (5%)trong tổng số ca mắc bệnh ung thư nhưng lại là ung thư nguy hiểm nhất với tỉ lệ bệnh nhân chết lên tới 75% Tế bào sắc tố da là dạng tế bào xuất hiện dưới da, có nhiệm vụ tổng hợp sắc tố melanin Khi chịu tác động của các yếu tố gây ung thư như tia UV hoặc các yếu tố độc hại từ môi trường làm ảnh hưởng tới hệ gen và các con đường chuyển hóa trong tế bào, tế bào sắc tố chuyển dạng không bình thường và có nguy cơ trở thành tế bào ung thư

da Ung thư da melanoma có đặc điểm tăng sinh nhanh và khả năng di căn cao

Người mắc bệnh ung thư da có nguy cơ tử vong cao, trong toàn bộ ca mắc bệnh các trường hợp sống hơn 5 năm chỉ chiếm 5 đến 15%

Hình 1.1: Hình ảnh ung thƣ da [67]

Con đường truyền tính hiệu protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK) là con đường chính truyền thông tin, các tín hiệu phía bên ngoài màng tế bào vào trong tế bào thông qua các thụ thể, protein và hàng loạt các phản ứng kinase Con đường truyền tín hiệu này giữ vai trò quan trọng trong quá trình sống của tế bào như: quá trình tăng sinh, phát triển, phân hóa tế bào, xâm lấn và apoptosis Các con đường MAPK đều bao gồm một mô đun kinase 3 lớp liên tiếp, cụ thể, khi nhận tín hiệu đầu tiên từ các phối tử trên thụ cảm thể ngoài màng tế bào, một MAPK sẽ được kích hoạt và tạo động lực kích hoạt hàng loạt MAPKK tới MAPKKK [29] Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằngrối loạn con đường tín hiệu ERK nói riêng và MAPK nói chung và các yếu tố kích hoạt mitogen cũng có vai trò quan trọng trong hình thành ung thư và xuất hiện tại giai đoạn sớm của ung thư Các thể đột biến và hư hỏng dẫn tới biểu hiện protein sai lệch và hình thành các đặc tính đặc trưng như tín hiệu tăng sinh độc lập, tránh apoptosis, không nhạy cảm với các yếu tố tăng trưởng

và có sự phân chia không thời hạn của tế bào ung thư [23,29, 31]

Hình 1.2: Con đường truyền tín hiệu MAPK trong tế bào động vật [64]

Con đường truyền tín hiệu RAS-RAF-MEK-ERK được thể hiện trên Hình1.2.Đối với các dòng tế bào melanoma, các tổn thương liên quan đến ung thư như các đột biến trên thụ thể tyrosine kinase (TKR), Ras và B-Raf hầu hết đều liên quan và có vai trò quan trọng trong hình thành ung thư, dẫn tới tăng cường biểu hiện của ERK trong tế bào làm thúc đẩy quá trình tăng sinh và khả năng xâm lấn của tế bào [29]

Trong những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới vẫn tiếp tục gia tăng Cuộc chiến chống ung thư luôn là mối quan tâm thường trực của cộng đồng, xã hội và các nhà khoa học Bên cạnh các hướng điều trị ung thư truyền thống như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật, nhiều hướng điều trị mới tiên tiến đã và đang được tiếp tục phát triển (phương pháp miễn dịch, điều trị hướng đích, gen trị liệu…) Là một trong những nỗ lực đó, nghiên cứu về ricin và phát triển loại protein này để hạn chế ung thư hiện đang được thực hiện và rất được quan tâm

1.2 Giới thiệu về ricin

Thầu dầu (Ricinus communis) là một loài trong họ Euphorbiacea, xuất hiện

nhiều tại khu vực nhiệt đới nóng ẩm như Châu Phi, Trung Á, Ấn Độ, Trung Quốc

và các nước Đông Nam Á Từ thời cổ đại, thầu dầu được trồng rộng rãi với nhiều ứng dụng khác nhau Người Hy Lạp niên đại 2000 năm trướcCông Nguyên đã bắt đầu dùng dầu thầu dầu ép từhạt với mục đích thắp sáng và làm đẹp Tại Ấn Độ, hạt thầu dầu được sử dụng với một lượng nhỏ để làm thuốc nhuận tràng, hay sử dụng

để diệt nấm và băng bó Hiện nay, thầu dầu được canh tác và sử dụng nhiều tại khu vực như Ấn Độ và Trung Quốc[19] Nghành công nghiệp sản xuất dầu Thầu dầu thải bỏ hàng triệu tấn bã hạt thầu dầu mỗi năm, với hàm lượng ricin độc hại cao và

có nguy cơ gây hại tới môi trường và sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên, sản phẩm thải

bỏ này có hàm lượng chất dinh dưỡng cao như Vitamin A, Vitamin C, Vitamin B6, Sterol, Tannin….[20] và có thể ứng dụng trong nghành trồng trọt và chăn nuôi như làm phân bón hữu cơ hay thức ăn gia súc sau khi đã xử lý độc

Hình 1.3: Hình ảnh cây Thầu dầu (Ricinnus communis) [63]

Ricin là một protein lectin được tổng hợp trong cây thầu dầu và tập trung chủ yếu tại hạt với tỉ lệ lên tới 1-5% theo khối lượng [60] Ricin là một chất gây độc tự nhiên màu trắngvà tác động tới tế bào thông qua con đường tổng hợp protein

Hình 1.4: Hình ảnh hạt thầu dầu [63]

Ricin có độc tính rất cao thông qua đường tiêm, miệng hoặc đường hô hấp; tiếp xúc với lượng nhỏ ricin thông qua mắt hoặc vùng da bị tổn thương cũng gây nguy hại nghiêm trọng Sau 2 đến 5 ngày nuốt phải, người bệnh xuất hiện tổn thương dạ dày, cơ, hệ thần kinh trung ương, thận, lá lách và gan tùy theo liều lượng mắc phải Ricin được xếp vào loại chất độc đặc biệt nguy hiểm theo phân loại độc tính của Hoa Kỳ Từ những năm 1800, nghiên cứu về độc tính của ricin đã được tiến hành trên động vật và gần đây nhất, nhóm nghiên cứu Benson và cộng sự đã xác định được liều gây chết 50% (LD50) khi tiêm trên chuột của ricin trong vòng 7 tiếng là 0,24µg/kg và 0,58µg/kg đối với chuột bạch [19] LD50 đối với liều uống trên chuột là 30mg/kg và ước tính LD50 trên người có giá trị từ 1 – 20mg/kg cơ thể [54]

Vì có độc tính mạnh, trong chiến tranh thế giới lần thứ hairicin đã được Hoa Kỳ và Liên bang Xô Viết sử dụng như một loại vũ khí sinh học, và gần đây nhất, vào năm

2013 ricin được sử dụng với mục đích khủng bố tại Hoa Kỳ Do vậy, hiện nay, ricin

đã bị nghiêm cấm mua bán, sử dụng thương mại và chỉ được sử dụng trong mục đích khoa học

1.2.1 Cấu trúc phân tử ricin

Hình 1.5: Cấu trúc phân tử ricin [52]

Ricin là loại protein ức chế ribosome tổng hợp protein (RIP) loại 2 Ricin được tạo thành bởi 2 tiểu phần là chuỗi A (RTA~30kDA) liên kết với chuỗi B (RTB~32kDA) bởi cầu liên kết đisunfit (Hình 1.5)

Bảng 1.1: Cấu trúc protein ricin [63]

Trình tự Vị trí Hình ảnh vị trí trong phân tử Độ dài

trúc và các đặc điểm nội phân tử chuỗi amino axit của ricin được thể hiện trong Bảng 1.2 Chuỗi A là một chuỗi N-glycosid hydrolase gồm 267 amino axit, chuỗi

có 3 domain với tỉ lệ xoắn alpha và gấp beta chiếm hơn 50% [44] Chuỗi B là một đoạn lectin gồm 262 amino axit, có khả năng bám glycolipid và glycoprotein bề mặt màng tế bào thông qua liên kết β (1-4) galactose nhờ 2 vị trí bám galactose trên cấu trúc (Bảng 1.3)

Bảng 1.2: Amino axit nội phân tử ricin [63]

A và chuỗi B)

Độc tính của ricin có được là do khả năng bất hoạt hóa ribosome quá trình thủy phân của một base adenine đơn (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL) của tiểu đơn vị lớn rRNA 28S RTA có thể hoạt động đơn lẻ như một chất độc, tuy nhiên để có thể vào được bên trong tế bào, RTA cần sự có mặt RTB với hai vị trí đặc hiệu có khả năng liên kết với galactose trên bề mặt tế bào Nhờ có RTB mà RTA có thể bất hoạt ribosome, khác với các RIP loại I có khả năng bất hoạt cho ribosome nhưng không thể gây độc cho tế bào do không có vị trí đặc hiệu có khả năng xâm nhập vào tế bào Các RTB cũng có hoạt tính lectin nhưng hoàn toàn không có khả năng bất hoạt Ribosome 28S như RTA

Bảng 1.3: Vùng chức năng trong phân tử ricin [63]

1.2.2 Cơ chế gây độc của Ricin

Khả năng gây độc của ricin dựa vào cấu trúc dị dimer Khác với các RIP loại

I khác, ricin có khả năng nhập bào thông qua khả năng bám galactose hoặc acetylgalactosmine trên glycoprotein và glycolipid trên bề màng tế bào động vật Với một số tế bào đặc biệt biểu hiện thụ thể bề mặt manose như tế bào bạch cầu và

N-tế bào biểu mô gan chuột, ricin bám trực tiếp vào chuỗi oligosaccharide của các thụ thể này[52] Sau khi bám vào các thụ thể trên bề mặt màng tế bào, ricin đi vào trong

tế bào qua con đường nhập bào Với mỗi loại thụ thể trên bề mặt tế bào khác nhau, ricin có thể đi vào tế bào thông qua thụ cảm thể clathrin, không bào hoặc cơ chế không phụ thuộc vào thụ cảm thể này (Hình 1.6c)

Vị trí Chức năng Hình ảnh vị trí trong phân tử Độ dài

Hình 1.6: Quá trình nhập bào và các con đường di chuyển của ricin trong tế

pathway) vào trong bộ máy Gôn gi (Hình 1.6h) và sau đó tới lưới nội chất (Hình 1.6i)[55] Tại khoang lưới nội chất, cầu nối liên kết đisunfit giữa RTA với RTB bị cắt đứt bằng enzyme đisunfit isomerase, sảnphẩm tạo thành là 2 chuỗi RTA và RTB riêng biệt Ricin RTA sau đó rời khỏi mạng lưới nội chất và đi vào trong tế bào chất Tại đây, một số phân tử RTA có thể tránh khỏi quá trình phân hủy thông qua ubiquitin bằng cách ngăn chặn các đáp ứng UPR (đáp ứng giúp tế bào hồi phục khỏi tác nhân stress của lưới nội chất) Ngược lại, RTB không trở về tế bào chất như RTA mà chỉ tồn tại trong khoang lưới nội chất trước khi bị phân hủy bởi cơ chế phục thuộc vào CDC48 và không bào

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của ricin [55]

Trong tế bào chất, hoạt động của RIP gây những tổn hại không thểphục hồi cho ribosome, chúng ức chế khả năng tổng hợp protein của ribosome bằng cách loại

bỏ một adenin trong chuỗi GAGA của vòng sarcin/ricin(SRL) [52] Cụ thể, RTA

bám vào adenin vị trí 4324 (A4324) và loại bỏ đặc hiệu axit amin này khỏi vùng trình tự bảo thủ của RNA ribosome 28S trong vòng sarcin/ricin (Hình 1.7).Vòng sarcin/ricin là một trình tự lặp lại ngắn và có vị trí gần đầu 3’ của rRNA, RTA bám vào vị trí này để thực hiện quá trình khử purin trên A4324 Sau khi bám vào vòng sarcin/ricin, chuỗi RTA kẹp A4324 giữa 2 vòng tyrosin của vùng xúc tác và thủy phân liên kết C-N glycosidic Kết quả của quá trình thủy phân dẫn đến mất một adenin tại vị trí 4324 (Hình 1.7B) Sự thay đổi này làm cho ribosome không thể tương tác với yếu tố kéo dài chuỗi 1 (eEF-1) và yếu tố kéo dài chuỗi 2 (eEF-2), do vậy ngăn chặn quá trình dịch mã và dẫn tế bào vào con đường chết theo lập trình [55]

Hình 1.8: Hai con đường chết theo lập trình của tế bào [58]

Theo các báo cáo gần đây, ngoài tác động ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp protein của tế bào, ricin còn có ảnh hưởng thúc đẩy tế bào bước vào apoptosis Tế bào động vật bước vào apoptosis theo 2 con đường chính là thông qua thụ thể chết (con đường ngoại bào) và con đường ty thể (con đường nội bào) Con đường

apoptosis thụ thể bắt đầu bằng thụ thể caspase 8 hoặc caspase 10, trong khi con

đường apoptosis nội bào bắt đầu bằng thụ thể caspase 9 Những caspase này sau đó

sẽ hoạt hóa caspase 3 và caspase 7 và bước vào con đường chết (Hình 1.6) Ricin có

vai trò tham gia vào con đường apoptosis nội bào thông qua tác động tới màng ty

thể dẫn đến giải phóng cytochrome c và cuối cùng hoạt hóa caspase 9 và dẫn tế bào

tới chu trình chết Điều này được mô hình hóa như trong Hình 1.8[55]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Hạt thầu dầu được cung cấp từ Viện Dược liệu và xác định tại Viện Hóa học – Môi trường quân sự, Bộ Tư LệnhHóa học, Bộ Quốc Phòng và Phòng thí nghiệm Hóa sinh và Sinh lý học thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 2 dòng tế bào HaCaT và SK-MEL

28 Dòng tế bào HaCaT và dòng tế bào SK-MEL28 được cung cấp từ hãng ATCC Hoa Kỳ

Chúng tôi sử dụng 3 chủng vi khuẩn E.coli (ATCC ® 25922 ™ ),

Staphylococcus aureus (ATCC® 25923™), Bacilus cereus (ATCC® 14579™), được

cung cấp từ hãng ATCC Hoa Kỳ; và chủng vi khuẩnVibrio vulnificus được phân lập

từ tôm mắc bệnh hoại tử gan tụy tại Viện Nuôi trồng thủy sản TW

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

 Hóa chất:

- Màng thẩm tích xelophan (ICN Biomedical)

- Gel Sephadex G-100 (Amersham Biosciences)

- DEAE Xenlulo (Armesham)

- Ricin chuẩn (chuỗi A và chuỗi B) (Vectorlabs, Hoa Kỳ)

- Hóa chất nuôi cấy tế bào: Môi trường RPMI, FBS, Kháng sinh Penicilin, PBS 1x (ATCC)

- Kháng thể ERK, p-ERK, HPR (ATCC, Hoa Kỳ)

- Cùng một số hóa chất khác được mua từ những hãng nổi tiếng như Sigma, ATCC….đạt chuẩn trong nghiên cứu sinh học phân tử

 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

- Buồng đếm tế bào (Malassez, Pháp)

- Đĩa nuôi cấy đa giếng (SPL, Hàn Quốc)

- Đĩa nuôi cấy tế bào 100mm (Corning, Hoa Kỳ)

- Ống eppendorf 1,5 ml (Corning, Hoa Kỳ)

- Ống falcon 15, 50 ml (Corning, Hoa Kỳ)

- Đầu típ 100µl, 200µl, 1000µl (SPL, Hàn Quốc)

 Máy móc và trang thiết bị chính:

- Bể ổn nhiệt Gra Operation SS40-1 (Đức)

- Hệ thống phân tích dòng tế bào miễn dịch tự động

- Huỳnh quang kế

- Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 CFL (Carl Zeiss, Đức)

- Máy Elisa

- Máy lắc ổn nhiệt (Satorius, Đức)

- Máy li tâm Universal (Hettich, Đức)

- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Đức)

- Máy soi gel Gel Doc (Biorad, Hoa Kỳ)

- Thẩm tách miễn dịch (Biorad, Hoa Kỳ)

- Thiết bị điện di đứng (Biorad, Hoa Kỳ)

- Tủ ấm 5% CO2

- Tủ ấm nuôi vi khuẩn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tách dịch chiết thô từ hạt thầu dầu

Bước đầu của nghiên cứu, thí nghiệm xác định thử hoạt tính kháng khuẩn của ricin được thực hiện nhằm định tính hoạt tính của hạt thầu dầu thu đã thu được

Nghiên cứu được tiến hành như sau: Lựa chọn hạt thầu dầu bóng khỏe, rửa sạch 2 lần với nước cất, để ráo Hạt thầu dầu được nghiền nhỏ, bổ sung nước khử ion theo tỉ lệ 1:10 (m/v), sau đó nghiền siêu âm 35 kHz trong 5 phút trên đá lạnh Đem mẫu ly tâm 3000 vòng/5 phút, loại bỏ cặn, thu dịch nổi và bảo quản tại điều kiện -20oC

2.3.2 Phương pháp tách chiết protein tổng số

 Thu dịch chiết từ hạt thầu dầu:

Hạt thầu dầu được lựa chọn và rửa sạch bằng nước cất 2 lần, sau đó được nghiềndưới áp suất cao để loại bỏ dầu và thu bã Bã thầu dầu được sấy khôtrong tủ

sấy 40oC và bổ sung axit acetic 5% theo tỉ lệ 1:10 (100g/1000ml), ủ lắc 12 giờ tại nhiệt độ phòng với tốc độ 400 vòng/phút.Sau 12 giờ, thu dịch và lọc dịchqua màng lọc Dịch chiết đã lọc được cất quaybằng máy cô quay chân không tại điều kiện

40oC – 45oC

 Tủa protein tổng số:

Chia dịch cất quay đã thu được vào các ống nhỏ, bổ sung từ từ dung dịch muối amoni sunfat tỉ lệ 30%, 40%, 50%, 60% và 70% vào các ống Đồng thời khuấy nhẹ cho muối tan hết ở 4oC Ủ hỗn hợp trong 4oC trong vòng 3 tiếng để tủa hết protein.Ly tâm dung dịch trong 12000 vòng/ phút trong 30 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi, thu tủa và bổ sung đệm hòa tan protein

2.3.3 Phương pháp tách chiết và tinh sạch Ricin

2.3.3.1 Phương pháp tinh sạch ricin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE

– sepharose

Chúng tôi tiến hành phân tách protein tổng số thu được sau bước tủa với (NH4)SO4 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE – sepharose (được cung cấp bởi Amersham Biosciences)

Thí nghiệm được thực hiện qua các bước sau:DEAE được ngâm trong dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M pH 8 qua đêm Sau đó trộn 20ml dung dịch protein tổng

số với 50 ml DEAE gel, khuấy 15 phút để proteinhấp phụ vào trong gel.Tải gel đã gắn protein thu được lên cột thủy tinh có kích thước 1,5 cmx 40 cm Tiến hành rửa cột với 100ml đệm Tris – HCl 0,05M và để cố định 30 phút Cột được phản hấp phụ bằng dung dịch đệm Tris – HCl 0,05M tại pH 8 bổ sung NaCl 0,05M với vận tốc 20-30ml/giờ Thu phân đoạn với thể tích 2ml/phân đoạn Sau đó tiến hành kiểm tra nhanh sự có mặt của Ricin trong các phân đoạn bằng kit được cung cấp bởi Osborn, Hoa Kỳ

2.3.3.2 Phương pháp tinh sạch ricin sử dụng sắc ký lọc gel sephadex G-100

Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G-100 để tiến hành phân tách

và thu ricin từ các phân đoạn có mặt ricin

Phương pháp được thực hiện như sau:Ngâm gel trong nước cất theo tỉ lệ 1g/10ml tại nhiệt độ phòng trong6 giờ Sau đó tải gel lên cột thủy tinh có kích thước 2,5 cm x 50 cm và để ổn định trong 30 phút Mẫu được tải lên cột và lọc chiết trong trong dung dịch đệm phosphat 0,002M tại pH 7,2 Tiến hành thu dịch lọc vớithể tích 2ml/phân đoạn

2.3.3.3 Sử dụng phương pháp Bradford để định lượng nồng độ protein

Phương pháp Bradford dựa vào liên kết giữa coomassie brilliant blue G-250 (CBB) với protein để tạo nên phức chất màu xanh, phức chất này có khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại ở 595 nm Phân tích cường độ màu có thể xác định được hàm lượng của protein trong dung dịch

Sử dụng huyết thanh bò (BSA) với hàm lượng đã biết làm đường chuẩn Cho 100µl dung dịch nổi thu được sau khi ly tâm vào ống nghiệm, bổ sung 500µl dung dịch Bradford, lắc đều và ủ trong 3 phút Sau đó đem dung dịch thu được đo tại bước sóng 595nm bằng quang phổ kế Giá trị A595 được so sánh với đường chuẩn để tính ra hàm lượng mẫu protein có trong mẫu

2.3.3.4 Phương pháp thẩm tách miễn dịch

Phương pháp thẩm tách miễn dịch được thực hiện để kiểm tra độ tinh sạch của ricin thu được, chúng tôi tiến hành phương pháp thẩm tách miễn dịch với kháng thể ricin

Phương pháp được thực hiện như sau: Dịch chiết tổng số được điện di trên gel SDS – PAGE.Sau đó lên chuyển màng nitrocellulose Hybond-P bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris – Glycine chứa 10% Methanol trong 50phút Trong quá trình điện chuyển màng, vị trí các băng protein được giữ nguyên Sau khi chuyển màng, ủ màng trong PBS 5% sữa gầy 60 phút tại nhiệt độ phòng.Đổ bỏ sữa gầy thừa và rửa sạch sữa gầy còn sót lại với PBS pH 7,4 1x, bổ sung Tween 80 với

tỉ lệ 0,1% Màng sau đó được ủ với kháng thể sơ cấp (nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dòng ricin) tỉ lệ 1:2000 (v/v), lắc nhẹ 1 tiếng ở nhiệt độ phòng.Rửa màng 5 lần với PBS 1x bổ sung Tween 20 0,1% để loại bỏ kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu Tiếp theo, ủ màng với kháng thể thứ cấp gắn HRPtỉ lệ 1:1000 trong bóng tối 1

giờ, tại nhiệt độ phòng Sau đó, màng được rửa 5 lần với PBS 1x bổ sung Tween 20 0,1% để loại bỏ kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu.Các băng protein được phát hiện bằng dung dịch tráng phim và ghi nhận kết quả

2.3.3.5 Phương pháp xác định độ tinh sạch của ricin

Sau khi lọc mẫu protein qua sắc ký lọc gel, để kiểm tra sự có mặt của ricin trong mỗi phân đoạn, 19 phân đoạn thu được thử nhanh với kit kiểm tra của Osborn, Hoa Kỳ với mẫu Ricin chuẩn (gồm chuỗi A và chuỗi B) được cung cấp từ Vectorlabs, Hoa Kỳ Hàm lượng protein trong các phân đoạn được đo dưới bước sóng A280 bằng máy đo quang phổ kế

Tiến hành gộp 2 phân đoạn có hàm lượng protein cao nhất, dung dịch thu được được kiểm tra bằng Phương pháp miễn dịch với kháng thể ricin và được gửi qua Mission Biotech Co., LTD., Đài Bắc, Đài Loan để định lượng ricin bằng Phương pháp khối phổ

2.3.3.6 Phương pháp khối phổ

Khối phổ là một kỹ thuật phân tích giúp xác định hàm lượng và loại chất hóa học có trong mẫu dựa trên tỷ lệ khối lượng trên điện tích và số lượng của các ion pha khí

Chất nghiên cứu được chuyển thành trạng thái hơi bằng phương pháp ion hóa trước khi được đưa vào bộ phận phân tích của máy khối phổ kế Các phân tử ion được tạo thành sẽ được phân tách bằng tỉ lệ khối lượng trến điện tích Cụ thể, bộ phận phân tích kiểm soát chuyển động của các ion ion bằng các điện từ trường trong môi trường chân không Ion được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung thành một dòng tia đi tới bộ phận phát hiện Các tín hiệu được phát hiện bằng bộ phận phát hiện và khuếch đại, cuối cùng kết quả được biểu diễn trên đồ thị ở dạng các đỉnh Mỗi đỉnh thể hiện một đoạn của phân tử phân tích

2.3.4 Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn

Tế bào vi khuẩn Bacilus cereus, E coli, Staphylococcus aureus và Vibrio

vulnificus (bảo quản trong glycerol 20%trong điều kiện -20oC) được lấy và rã đông

ở nhiệt độ phòng cho tới khi tan hoàn toàn

Ngay sau khi tế bào được rã đông, dung dịch vi khuẩn được cấy ria 30µl vào đĩa thạch LB 2% agar và đặt trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ Thu 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch vào 10ml dung dịch LB lỏng và nuôi lắc trong 37oC tới khi thu được giá trị A600 trong khoảng 0,5 đến 0,7 Dịch vi khuẩn được thu và pha loãng tới nồng độ 5x105 CFU/ml Vi khuẩn đã pha loãng được chia vào ống effendorf 1,5ml và bổ sung ricin theo các nồng độ 0 mg/ml, 100mg/ml, 20mg/ml, 5mg/ml và đối chứng dương ceftriaxon 3µg/ml, nuôi cấy trong tủ ấm 37oC Sau 24 giờ, pha loãng nồng dịch vi khuẩn đã xử lý ricin theo nồng độ 1:50, 1:100, 1:1000 và 1:10 000 Hút 50µl dịch vi khuẩn đã pha loãng vào trong đĩa thạch LB 2% agar và trải đều,tủ ấm

37oC.Sau 24 giờ, đếm số khuẩn lạc trên đĩa và lấy giá trị trung bình ở những đĩa mọc từ 20 đến 300 khuẩn lạc Đơn vị tạo thành khuẩn lạc (CFU) được tính như sau:

CFU/ml= Trung bình số khuẩn lạc mọc trên đĩa x độ pha loãng

2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng chống tế bào ung thư

2.3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào

 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào

Thu tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào keratin HaCaT được bảo quản trong Ni tơ lỏng, rã đông bằng bể ổn nhiệt 37oC và đưa ngay vào tủ vô trùng.Đưa dung dịch chứa tế bào vào ống fancol chứa 3ml môi trường nuôi cấy và ly tâm 1300 vòng/phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào Cặn tế bào được hòa vào trong 10ml môi trường nuôi cấy phù hợp chứa 10% FBS và 1% peniciline, mix nhẹ để tạo thành dung dịch huyền phù tế bào rồi chuyển sang đĩa petri đã khử trùng, nuôi cấy trong

tủ ấm 37oC, 5% CO2 Tế bào được kiểm tra hàng ngày, đến khi tế bào sinh trưởng đến 70-80% bề mặt đĩa, tiến hành cấy chuyển tế bào sang đĩa mới

 Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy:

Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ, rửa tế bào với PBS 1x Bổ sung dung dịch Trypsin 1x và ủ trong 5 phút 37oC, 5% CO2 Sau đó trung hòa Trypsine bằng môi trường nuôi cấy chứa FBS, hút dịch và ly tâm 1300 vòng/phút trong 5 phút

2.3.5.2 Phương pháp khảo sát độc tính của ricin tinh sạch lên tế bào

Thí nghiệm khảo sát độc tính của ricin lên tế bào ung thư da SKMEL28 và tế bào keratin thường HaCaT được thực hiện dựa trên phương pháp nhuộm tím tinh thể

Thí nghiệm được tiến hành như sau: Tế bào SKMEL28 và HaCaT được nuôicấy trong môi trường RPMI đầy đủ tới mật độ thích hợp Sau đó, cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng với mật độ 3x104 tế bào/giếng trong 3ml môi trường RPMI đầy

đủ Khi tế bào đã bám đĩa, bổ sung Ricin hòa tan trong PBS với các nồng độ: 10µl/ml, 1µl/ml, 100ng/ml, 50ng/ml, 10ng/ml, 5ng/ml, 1ng/ml, 0,5ng/ml, 0,1ng/ml, 0,05ng/ml và Đối chứng dương (10%PBS).Tế bào được ủ trong điều kiện 37°C, 5%CO2 Sau 48 giờ, quan sát, chụp ảnh và thu tế bào, loại bỏ môi trường nuôi cấy,

cố định tế bào bằng cách bổ sung 1ml dung dịch formalin 10% và ủ trong 1 giờ.Loại

bỏ formalin, nhuộm tế bào với tím tinh thể 0,1% trong 30 phút Tiếp theo, rửa 5 lần với nước cất, để khô và ly giải tế bào đã nhuộm với SDS 0,1% Đem dung dịch thu được đo tại bước sóng 560 nm bằng quang phổ kế

Giá trị OD560 thu được được sử dụng để tính giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%) Giá trị IC50 được tính theo phương pháp xây dựng đường cong đáp ứng liều theo công thức:

𝑦 = 𝐷 + 𝐴 − 𝐷

1 + 10(𝑥−𝑙𝑜𝑔𝐶 ) 𝐵

Với x là giá trị nồng độ ricin, y là giá trị OD560 đo được Các thông số A, B,

C, D được sử dụng để dựng hàm logarit và giá trị IC50 được tính toán dựa trên thông

số C

2.3.5.3 Phương pháp khảo sát tác động của ricin lên khả năng tạo khối u in-vitro

Thí nghiệm đánh giá khả năng tạo khối được thực hiện nhằm đánh giá khả năng ức chế của ricin lên quá trình tạo khối của tế bào ung thư SKMEL28

Thí nghiệm được tiến hành như sau: Nuôi cấy tế bào SKMEL28 trong môi trường RPMI đầy đủ, điều kiện 37°C, 5% CO2 tới mật độ thích hợp Thu tế bào và cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng với mật độ 3x104 tế bào/giếng trong 3ml môi trường RPMI đầy đủ.Sau khi tế bào đã bám đĩa, bổ sung ricin hòa tan trong PBS với

các nồng độ: 3ng/ml, 1ng/ml và 0ng/ml, ủ tế bào trong điều kiện 37°C, 5% CO2.Sau

48 giờ, tế bào được thu và trộn với agar 0,36% trong RPMI theo tỉ lệ 2,5x105 tế bào với 2ml agar RPMI.Nhỏ dịch tế bào và agar thu được lên agar 0,72% trong đĩa 6 giếng trong điều kiện 37°C, 5% CO2 Sau khi nuôi cấy trong 4 tuần, đếm những khối u có đường kính lớn hơn 50µm

2.3.5.4 Phương pháp đánh giá tác động của ricin tới mức độ biểu hiện của một số

protein marker của tế bào

 Thu dịch chiết tế bào

Tế bào HaCaT và SKMEL28 đượctrong điều kiện thích hợp, khả năng tăng sinh tốt.Cấy chuyển tế bào sang đĩa petri mới, với mật độ thích hợp (40-50% đĩa)

Tế bào được đặt cố định trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 3 giờ, để tế bào bám xuống đáy đĩa.Bổ sung ricin pha loãng trong PBS sao cho các nồng độ ricin cuối đạt được là 0ng/ml, 1ng/ml, 3ng/ml Đặt trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong.Sau 48 giờ, loại bỏ môi trường nuôi cấy và rửa sạch tế bào bằng PBS 1x lạnh 2 lần Bổ sung vào mỗi đĩa 300µl đệm lysis (20 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 12,5 mM b-glycerophosphate, 1,5mM MgCl2, 2 mM EDTA, 10 mM NaF, 2 mM DTT, 1mM Na3VO4, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20mM aprotinin, 0,5% Triton X-100), giữ trên đá lạnh 5phút Dùng que cào dồn tế bào về một đĩa và thu tịch tế bào vào ống eppendorf 1,5ml Dung dịch thu được được ly tâm tại 14000 xg trong 15 phút, sau đó hútdịch nổi và bỏ xác tế bào Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford Dịch chiết protein nội bào tổng sốđược sử dụng trong phương pháp lai miễn dịch với kháng thể ERK, p-ERK, Tubulin

Điện di dịch chiết thu được trên gel SDS – PAGE.Sau đó lên chuyển màng nitrocellulose Hybond-P bằng phương pháp điện chuyển trong đệm Tris – Glycine chứa 10% Methanol trong 50p Trong quá trình điện chuyển màng, vị trí các băng protein được giữ nguyên.Tiến hành kỹ thuật thẩm tích sử dụng kháng thể đơn dòng (Tubulin, ERK và p-ERK) tỉ lệ 1:1000 trong bóng tối 1 giờ, tại nhiệt độ phòng Các băng protein được phát hiện bằng dung dịch tráng phim và ghi nhận kết quả trên phim âm bản Kodak