Xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV (QPCR) để phát hiện virus viêm gan b (HBV)

Dựa vào tín hiệu khuếch đại trong phân tử đích có thể xác định được số phân tử DNA đích trong mẫu.. Kĩ thuật lai bắt giữ Kĩ thuật lai bắt giữ Hybrid capture technology là phương pháp kh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-    -

Nguyễn Quang Duy

XÂY DỰNG BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR)

ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV)

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-    -

Nguyễn Quang Duy

XÂY DỰNG BỘ KIT ĐỊNH LƯỢNG PCR HBV (QPCR)

ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS VIÊM GAN B (HBV)

Chuyên ngành Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Võ Thị Thương Lan

Hà Nội - 2017

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS

TS Võ Thị Thương Lan Cô đã hướng dẫn và truyền đạt cho em kiến thức và kinh

nghiệm quý báu Cô cũng luôn nhắc nhở, bảo ban và động viên em trong suốt thời gian hoàn thành luận văn này Dưới sự hướng dẫn của cô, em không chỉ học được nhiều về kiến thức chuyên môn mà còn có được những bài học về cuộc sống Đây sẽ

là những hành trang quý báu để em bước tiếp trong sự nghiệp của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Phạm Anh Thùy Dương, chị là

người đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện

đề tài Chị cũng là người dạy cho em tính tự giác và thái độ nghiêm túc trong các công việc được giao

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Tạ Bích Thuận, cô là người

luôn động viên và chia sẻ với em những khó khăn trong suốt thời gian qua, giúp em

có thế hoàn thành tốt luận văn của mình

Em xin gửi lời cảm ơn đến NCS Ngô Thị Hà, CN Nguyễn Thu Trang và

những người bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Y đã luôn giúp đỡ và động viên tinh thần em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình đã hỗ trợ em vật chất và tinh thần trong thời gian em thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày tháng năm Học viên cao học

Nguyễn Quang Duy

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Real-time PCR : Real-time Polymerase Chain Reaction (PCR thời gian thực) HBcAg : Hepatitis B core antigen (Kháng nguyên lõi virus)

Anti - HBc : Kháng thể của HBcAg

HBeAg : Hepatitis B envelope antigen (Kháng nguyên vỏ virus) Anti - HBe : Kháng thể của HBeAg

HBsAg : Hepatitis B surface antigen (Kháng nguyên bề mặt virus) Anti - HBs : Kháng thể của HBsAg

HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

cccDNA : Covalently closed circular DNA (Cấu trúc DNA siêu xoắn) Genotype : Kiểu gen

Sub genotype : Dưới kiểu gen

ORF : Open Reading Frame (Khung đọc mở)

HBxAg : Hepatitis B virus X antigen (Kháng nguyên X của virus)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 : So sánh các kit thương mại được sử dụng để định lượng HBV 15

Bảng 2.1 : Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.2 : Trình tự các đầu dò Taqman được sử dụng trong nghiên cứu 25

Bảng 2.3 : Điều kiện phản ứng PCR tối ưu để khuếch đại HBV 26

Bảng 2.4 : Thành phần và điều kiện phản ứng real-time PCR 27

Bảng 2.5 : Thành phần gel polyacrylamide 8% dùng trong điện di DNA 27

Bảng 2.6 : Thành phần và điều kiện phản ứng cắt plasmid HBV 29

Bảng 3.1 : Giá trị Ct của các plasmid HBV khi sử dụng các nồng độ

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 : Hình ảnh dưới kính hiển vi tử và số lượng gần đúng của

các thành phần liên quan đến HBV trong 1 ml huyết thanh bệnh nhân mang HBV mãn tính

2

Hình 1.4 : Phân bố địa lý về genotypes của HBV trên thế giới 7

Hình 1.5 : Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý 8

Hình 1.9 : Biểu đồ khuếch đại của một mẫu trong real-time PCR 16

Hình 1.10 : Real-time PCR sử dụng đầu dò Taqman 20

Hình 3.1 : Kết quả khuếch đại gen P từ 2 mẫu dương tính HBV bằng

cặp mồi HBV F/R

31

Hình 3.2 : Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn HBV 105 bp

trên gel agarose 2%

32

Hình 3.3 : Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid HBV 32

Hình 3.4 : Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn của plasmid HBV với 8

trình tự genotype

33

Hình 3.5 : Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid HBV

sau khi cắt với ScaI và tinh sạch

34

Hình 3.6 : Sản phẩm IC khuếch đại từ DNA thực khuẩn thể 35

Hình 3.7 : Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn IC 218 bp trên

gel agarose 2%

35

Hình 3.8 : Kết quả xác định nồng độ và điện di kiểm tra plasmid IC 36

Hình 3.9 : Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn IC với trình tự trên

NCBI

37

Hình 3.10 : Kết quả khảo sát dải nồng độ plasmid HBV trộn 105 copy

plasmid IC với nồng độ mồi 0.67 µM

38

Hình 3.11 : Kết quả khảo sát dải nồng độ 102, 103, 106, 107 copy

plasmid HBV trộn 105 copy plasmid IC với nồng độ mồi 0.8 µM, 1.0 µM và 1.2 µM

38

Hình 3.12 : Kết quả khảo sát dải nồng độ 3, 5, 102, 105 copy plasmid

HBV trộn 105 copy plasmid IC ở nhiệt độ gắn mồi 62oC

39

Hình 3.13 : Khảo sát độ nhạy phát hiện plasmid HBV 40

Hình 3.14 : Kết quả phối trộn 5x104 và 105 copy plasmid IC với 5, 50,

Hình 3.17 : Đường chuẩn xây dựng từ hai set plasmid 44

Hình 3.18 : Đường tín hiệu khuếch đại trong phản ứng định lượng bốn

mẫu bệnh phẩm

45

Hình 3.19 : Đường chuẩn định lượng bốn mẫu bệnh phẩm 45

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu về Hepatitis B Virus 2

1.1.1 Cấu trúc HBV 2

1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm của HBV 4

1.1.3 Phân loại 6

1.2 Dịch tễ học của viêm gan B 7

1.2.1 Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2.2 Phương thức lây truyền 9

1.2.3 Các giai đoạn nhiễm HBV 9

1.3 Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV 11

1.3.1 Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology) 12

1.3.2 Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology) 12

1.3.3 PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR) 13

1.3.4 Real-time PCR 16

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU 22

2.1 Thiết kế thí nghiệm 22

2.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.2 Hóa chất và sinh phẩm 24

2.2.3 Trang thiết bị 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp PCR và phương pháp real-time PCR 26

2.2.2 Phương pháp điện di 27

2.2.3 Phương pháp ligate 28

2.2.5 Phương pháp xác định nồng độ DNA 29

2.2.6 Cắt và tinh sạch plasmid sau khi cắt 29

2.2.7 Phương pháp pha loãng 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Tách dòng plasmid mang đoạn gen P của HBV 31

3.2 Tạo mẫu chuẩn HBV 33

3.3 Tạo DNA nội chuẩn 34

3.3.1 Thiết kế đoạn IC 35

3.3.2 Tách dòng IC 35

3.4 Chuẩn hóa điều kiện phát hiện HBV và IC 37

3.4.1 Tối ưu thành phần và điều kiện phản ứng 37

3.4.2 Khảo sát độ giới hạn phát hiện HBV 39

3.4.3 Tối ưu hóa nồng độ plasmid IC phối trộn với plasmid HBV 40

3.4.4 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR 42

3.5 Xây dựng đường chuẩn định lượng HBV và xác định giới hạn phát hiện HBV trong real-time PCR 42

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

MỞ ĐẦU

Viêm gan virus B (Hepatitis B virus - HBV) là một nhóm bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm hàng đầu trên thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính có khoảng 257 triệu người mắc bệnh viêm gan B mãn tính Trong đó, hơn 887.000 người tử vong mỗi năm do các biến chứng của viêm gan B, bao gồm xơ gan và ung thư gan Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc viêm gan B cao Các nghiên cứu gần đây cho thấy tỉ lệ nhiễm HBV trong dân số dao động từ 10% đến 20% Nếu không được theo dõi và điều trị kịp thời, 1/4 số bệnh nhân mắc viêm gan B mãn tính sẽ tử vong do ung thư gan và suy gan

Ngày nay, nhờ các tiến bộ của công nghệ hiện đại, việc điều trị bằng các thuốc kháng virus đã giúp giảm thiểu và ngăn chặn bệnh viêm gan tiến triển tới bệnh lý nặng như xơ gan, ung thư tế bào gan nguyên phát, suy gan… Để có hiệu quả, theo dõi tải lượng virus giúp lựa chọn phác đồ điều trị hay kiểm tra đáp ứng thuốc của bệnh nhân là rất cần thiết Kỹ thuật Real-time PCR cho phép xác định số lượng virus HBV hoàn chỉnh có trong huyết thanh của người bệnh thông qua việc định lượng vật chất

di truyền của virus Với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cùng thời gian tiến hành ngắn nên real-time PCR được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc theo dõi và điều trị đối với bệnh nhân nhiễm HBV Tuy nhiên, hầu hết các bộ kit thương mại phục vụ cho xét nghiệm real-time PCR định lượng HBV đều nhập từ nước ngoài và có giá thành cao Khắc phục điều này, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV (qPCR) để phát hiện virus viêm gan B” với giá thành phù hợp nhưng vẫn đảm bảo tính chính xác của xét nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về Hepatitis B Virus

1.1.1 Cấu trúc HBV

1.1.1.1 Hình thái

Virus viêm gan B là một loại virus hướng gan có vật chất di truyền là DNA

thuộc họ Hepadnaviridae virus [4, 36] Trong huyết thanh của bệnh nhân ở giai đoạn

virus đang tái bản, có thể quan sát thấy ba kiểu cấu trúc bao gồm: hình cầu, hình ống

và hạt dane hoàn chỉnh [36] Cấu trúc hình cầu có đường kính 20 nm Cấu trúc hình ống có chiều rộng 22 nm và chiều dài thay đổi Những dạng này được cấu tạo bởi kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và lipit có nguồn gốc từ vật chủ, không chứa axit nucleic của virus do đó không có khả năng lây nhiễm [18] Hạt dane có đường kính

42 nm gồm lớp vỏ lipid và HBsAg bao quanh một nucleocapsid chứa hệ gen của virus và polymerase sẽ giúp virus nhân lên trong cơ thể vật chủ [29]

Hình 1.1: Hình ảnh dưới kính hiển vi tử và số lượng gần đúng của các thành phần

liên quan đến HBV trong 1 ml huyết thanh bệnh nhân mang HBV mãn tính [19]

1.1.1.2 Hệ gen

Hệ gen của HBV là phân tử DNA dạng vòng chiều dài khoảng 3200 nucleotide (3.2 kb) có dạng xoắn kép không hoàn toàn gồm hai sợi đơn có chiều dài khác nhau Sợi ngoài (sợi âm) có chiều dài cố định là 3.2 kb và gắn một gốc tyrosine của protein

P tại đầu 5’ Sợi trong (sợi dương) có chiều dài thay đổi từ 50-100% chiều dài của bộ gen và nối với một phân tử RNA ngắn tại đầu 5’ [37] Hệ gen của virus mã hóa cho 4 khung đọc mở (Open Reading Frames-ORF) là S, C, P và X nằm gối lên nhau [36]:

- Khung đọc mở S mã hóa cho protein bề mặt virus (HBsAg) được chia thành 3 vùng preS1, preS2 và S nhờ ba codon khởi đầu khác nhau [48] HBgAg được chia làm 3 loại: L-HBsAg là thành phần chính của thụ thể được dịch mã từ mRNA preS1; protein M và S-HBsAg được dịch mã từ mRNA preS2/S và mRNA preS [13]

- Khung đọc mở C mã hóa cho kháng nguyên lõi (HBcAg) hoặc kháng nguyên e (HBeAg) hỗ trợ đóng gói cấu trúc genome tùy thuộc vào vị trí bắt đầu dịch mã

- Khung đọc mở X mã hóa cho protein HBxAg Protein HBx có vai trò trong nhân bản HBV bao gồm tín hiệu kích hoạt phiên mã, sửa chữa DNA và ức chế quá trình phân hủy protein [15]

- Khung đọc mở P mã hóa cho polymerase là một protein lớn được chia thành 4 domain: terminal protein domain (đóng vai trò như mồi tổng hợp DNA virus), spacer domain (chưa rõ vai trò), reverse transcriptase domain (chịu trách nhiệm cho phiên mã và nhân bản RNA virus) và RNAase H domain (phân hủy RNA tiền gen) Trong đó, RNA tiền gen đóng vai trò là khuôn tổng hợp DNA virus thông qua quá trình phiên mã ngược [29]

Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của HBV [44].

1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm của HBV

Quá trình xâm nhập của HBV vào tế bào gan của vật chủ được bắt đầu bằng tương tác không đặc hiệu giữa vùng preS1 của protein L-HBsAg với bề mặt tế bào gan hoặc đặc hiệu với thụ thể NTCP [54] Sau khi xâm nhập vào tế bào, virus di chuyển nhờ hệ thống vi ống đến phức hệ màng nhân Tại đây, virus sẽ bỏ lớp vỏ capsid giải phóng DNA vào trong nhân [31] Trong nhân tế bào gan, DNA của sợi dương được tổng hợp hoàn chỉnh Sau đó, các sợi sẽ co xoắn lại cùng với protein histon tạo thành phân tử cccDNA (covalently closed circular DNA) có dạng nhiễm sắc thể mini, đóng vai trò phiên mã tổng hợp mRNA của virus [43] Đoạn dài nhất 3.5

kb mã hóa protein lõi, tiền lõi và polymerase Đoạn 2.4 kb mã hoá cho protein HBsAg, trong khi đoạn 2.1 kb mã hoá protein M và S-HBsAg Đoạn nhỏ nhất 0.7 kb

L-mã hoá protein X [39] Cấu tạo bền vững của phân tử cccDNA tạo nên tính kháng thuốc của HBV Khi cccDNA còn ổn định ở trong tế bào, nó sẽ làm khuôn mẫu cho tất cả các mRNA virus Do đó, cccDNA là nguồn tạo các thế hệ virus mới [13, 23]

Các mRNA được phiên mã từ cccDNA sẽ được vận chuyển ra bào tương, làm khuôn cho quá trình dịch mã tổng hợp polymerase, vỏ capsid, protein bề mặt và protein X Trong khi nucleocapsid được lắp ráp trong bào tương, RNA tiền gen kết

hợp cùng polymerase khởi động quá trình phiên mã ngược RNA tiền gen đóng vài trò làm khuôn cho quá trình tổng hợp DNA sợi âm Sau khi tổng hợp xong sợi âm, RNA tiền gen bị phân cắt bởi RNase Sợi âm được sử dụng làm khuôn tổng hợp sợi dương Quá trình tổng hợp sợi dương hiếm khi hoàn thành nên thường bắt gặp sợi dương có độ dài khác nhau trong virus HBV [13, 54]

Một số virus mang bộ gen hoàn chỉnh sẽ quay trở lại nhân tế bào gan và DNA mới được tổng hợp sẽ lại chuyển dạng cccDNA để duy trì một lượng khuôn ổn định cho quá trình phiên mã Số virus còn lại sẽ đi vào hệ thống lưới nội chất chứa các protein bề mặt của virus thông qua hình thức “nảy chồi” Bằng cách này các “lõi” virus sẽ bọc bởi các kháng nguyên bề mặt tạo ra cấu trúc virus hoàn chỉnh và thoát khỏi tế bào gan đi vào hệ thống tuần hoàn [17]

Hình 1.3: Quá trình xâm nhiễm của HBV [17] HBV gắn kết với thụ thể trên bề mặt

và xâm nhập vào tế bào Sau đó, HBV di chuyển tới nhân và chuyển dạng thành cccDNA làm khuôn để tổng hợp mRNA; mRNA được dịch mã để tổng hợp protein

bề mặt virus, lõi, polymerase và protein X; mRNA này tiếp tục tham gia vào quá trình phiên mã ngược thành DNA virus kết hợp với capsid tạo thành hạt virus, các hạt virus này hoặc di chuyển vào mạng lưới nội chất hoặc quay lại nhân tế bào gan

1.1.3 Phân loại

Dựa vào cấu trúc hệ gen, HBV được chia làm nhiều kiểu gen (genotypes) Trước đây, có 8 genotypes đã được biết rõ (A-H) Theo các nghiên cứu gần đây, 2 genotypes khác được xác định là I và J Một vài genotypes của HBV được phân chia thành dưới kiểu gen (sub-genotypes) Trong phân loại, các genotype có trình tự khác nhau hơn 8%, các sub-genotype trong cùng một genotype khác nhau 4-8% [52] Hiện nay, hơn 30 sub-genotype của HBV đã được xác định, nhưng các cơ chế gây bệnh khác nhau giữa chúng chưa được rõ ràng Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự khác biệt giữa genotypes và sub-genotypes phụ thuộc vào phân bố địa lý và liên quan đến

sự tiến triển của bệnh, tiến triển lâm sàng và khả năng đáp ứng điều trị [12] Genotypes A, B, C, D và F được chia thành nhiều sub-genotype và genotypes E, G và

H không có sub-genotype nào được xác định [28, 42] Genotype A phổ biến ở vùng cận Sahara-Châu Phi, Bắc Âu và Tây Phi Genotype B và C xuất hiện phổ biết ở Châu

Á Genotype C chủ yếu quan sát thấy ở Đông Nam Á Genotype D chiếm ưu thế ở Châu Phi, Châu Âu, các nước Địa Trung Hải và Ấn Độ Genotype G được báo cáo ở Pháp, Đức và Hoa Kỳ Genotype H thường gặp ở Trung và Nam Mỹ Genotype I gần đây được tìm thấy ở Việt Nam và Lào Genotype HBV mới nhất là genotype J được xác định ở quần đảo Ryukyu của Nhật Bản [35]

Hình 1.4: Phân bố địa lý về genotypes của HBV trên thế giới [35] Các con số bên

cạnh các biểu đồ hình tròn là số lượng mẫu kiểm tra Kích thước của biểu đồ hình tròn đã được điều chỉnh sao để hiển thị rõ các phần trong biểu đồ [34]

Các kiểu gen có thể liên quan đến một số thể đột biến trên khung đọc mở C

Do đó, chúng có thể dẫn đến sự khác nhau về diễn biến tiền lâm sàng cũng như về tỷ

lệ viêm gan tối cấp giữa các nhóm kiểu gen khác nhau Ví dụ: kiểu gen B và đặc biệt dưới kiểu gen Bj khiến người bệnh dễ mắc viêm gan tối cấp nhiều hơn so với kiểu gen A hoặc C [10]

1.2 Dịch tễ học của viêm gan B

1.2.1 Tình hình mắc viêm gan B trên thế giới và ở Việt Nam

Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt HBsAg, tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính trong năm 2015 trên toàn thế giới có khoảng 257 triệu người đang bị nhiễm HBV và khoảng 887,000 ca tử vong do HBV, chủ yếu từ các biến chứng bao gồm xơ gan và ung thư gan [58] Dựa trên tỉ lệ nhiễm HBV, các vùng trên thế giới được xếp vào các mức độ nhiễm cao, trung bình và thấp (Hình 1.5)

Hình 1.5: Phân bố tỷ lệ người nhiễm HBV theo địa lý [57]

Vùng lưu hành dịch cao: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg ≥8% và người đã

từng phơi nhiễm với HBV >60% Khoảng 45% dân số thế giới sống ở khu vực dịch tễ này, bao gồm các nước Châu Á, Châu Phi, một phần Trung Đông, lưu vực sông Amazon [45]

Vùng lưu hành dịch trung bình: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7%

và tỷ lệ người đã từng phơi nhiễm với HBV từ 20-60%, bao gồm một phần Nam Âu, Đông Âu, Nga và Nam-Trung Mỹ [47]

Vùng lưu hành dịch thấp: là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg <2% và tỷ lệ

người từng phơi nhiễm với HBV <20%, bao gồm Mỹ, Tây Âu, Úc với khoảng 12% dân số thế giới sống ở vùng này [58]

Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc viêm gan B cao trong đó ước tính có khoảng 8,6 triệu người nhiễm HBV Tỷ lệ nhiễm HBV mãn tính được ước tính khoảng 8,8%

ở phụ nữ và 12,3% ở nam giới Người nhiễm HBV mãn tính thường không có các biểu hiện rõ ràng làm người bệnh thường có tâm lý chủ quan Do đó, ở Việt Nam, nhiễm HBV mãn tính là nguyên nhân chính gây xơ gan và ung thư gan

1.2.2 Phương thức lây truyền

HBV lây truyền khi các tổn thương trên bề mặt da và niêm mạc tiếp xúc với dịch tiết hoặc máu của người đã nhiễm virus HBV có hàm lượng lớn trong máu và dịch tiết từ vết thương Lượng virus được phát hiện thấp hơn trong tinh dịch, dịch tiết

âm đạo và có rất ít trong nước bọt HBV không lây truyền qua không khí và đồ ăn [57] Các con đường lây truyền chính của virus như sau:

- Lây truyền từ mẹ sang con có thể xảy ra quanh lúc chuyển dạ sinh Lây truyền trong tử cung ít gặp, chỉ xảy ra từ 2-5% số lây truyền từ mẹ sang con Không có bằng chứng cho thấy virus có thể lây truyền qua việc cho con bú Nguy cơ lây truyền từ mẹ sang con phụ thuộc vào sự tồn tại của kháng nguyên HBeAg và lượng virus cao trong máu mẹ Tỷ lệ lây truyền lên đến 70-90% nếu mẹ dương tính với HBeAg và 5-20% nếu mẹ âm tính với HBeAg [57]

- Lây truyền từ trẻ này sang trẻ khác có thể là nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm HBV Lây truyền thường xảy ra giữa những trẻ cùng sống trong gia đình, giữa những trẻ trong cùng một trường học, nhà trẻ Cơ chế của lây truyền có thể do những vết thương trên da tiếp xúc với máu hoặc các dịch tiết vết thương [57]

- Lây truyền qua con đường tiêm truyền không an toàn, truyền máu HBV có thể lây truyền qua máu, các sản phẩm máu, bệnh phẩm có máu của người mang bệnh, kim tiêm không đảm bảo vô trùng, dụng cụ tiêm chích, sử dụng chung kim xăm mình, kim châm cứu, dụng cụ phẫu thuật, dụng cụ nha khoa bị nhiễm máu hoặc huyết thanh không đựợc khử trùng thích hợp [57]

- Lây truyền qua quan hệ tình dục [57]

1.2.3 Các giai đoạn nhiễm HBV

1.2.3.1 Nhiễm HBV cấp tính

Thời gian ủ bệnh sau khi lây nhiễm HBV kéo dài từ 6 tuần đến 6 tháng và các biểu hiện khi phát bệnh thay đổi tùy thuộc vào độ tuổi Ở trẻ sơ sinh nói chung không

có các biểu hiện lâm sàng, các biểu hiện điển hình của bệnh quan sát thấy ở 5-15% trẻ

từ 1 đến 5 tuổi Chỉ 33-50% các trường hợp nhiễm HBV ở người lớn và trẻ lớn có biểu hiện lâm sàng Các triệu chứng lâm sàng thường gặp là sốt nhẹ, mệt mỏi, chán

ăn, buồn nôn và nôn, vàng da, vàng mắt, nước tiểu sẫm mầu, phân bạc màu, đau bụng Đôi khi có các biểu hiện ngoài gan như phát ban trên da, đau khớp và viêm khớp Viêm gan tối cấp khoảng 1-2% số bệnh nhân viêm gan cấp và tỷ lệ tử vong do hôn mê gan là 63-93% số bệnh nhân viêm gan tối cấp [2]

1.2.3.2 Nhiễm HBV mãn tính

Người nhiễm HBV mãn tính được xác định khi tồn tại HBsAg trong huyết thanh ít nhất 6 tháng hoặc khi dương tính với HBsAg và âm tính với IgM anti-HBc trong huyết thanh Nguy cơ nhiễm virus mãn tính phụ thuộc nhiều vào tuổi của người nhiễm virus Nguy cơ cao nhất lên đến 90% là khi lây nhiễm trong giai đoạn mới sinh, 25-50% ở giai đoạn 1-5 tuổi, 6-10% ở trẻ lớn và người trưởng thành Hậu quả của tình trạng nhiễm HBV mãn tính là các bệnh như xơ gan hay ung thư gan nguyên phát Thời gian nhiễm HBV kéo dài là yếu tố chính gây nên các bệnh lý gan nguy hiểm Khoảng 25% những người nhiễm HBV ở tuổi nhỏ và sơ sinh sẽ phát triển thành

xơ gan hoặc ung thư gan và 15% với nhóm nhiễm HBV ở độ tuổi vị thành niên và trưởng thành [39] Nhiễm HBV mãn tính sẽ trải qua 4 giai đoạn sau:

Giai đoạn dung nạp miễn dịch (immune tolerance): Là giai đoạn HBV có mặt

trong cơ thể nhưng chưa có sự phản ứng của hệ thống miễn dịch cơ thể chống HBV HBsAg, HBeAg đựợc tìm thấy trong huyết thanh, HBV-DNA thường rất cao (>105copy/mL), các enzyme gan (ALT, AST) bình thường hoặc tăng rất ít Những tổn thương gan ít thấy mặc dù có sự nhân lên mạnh mẽ của HBV và xuất hiện kháng nguyên HBcAg trong tế bào gan Sau đó, người mang HBV chuyển sang giai đoạn kích hoạt miễn dịch [30, 32]

Giai đoạn kích hoạt miễn dịch (immune active) là giai đoạn mà hệ thống miễn

dịch cơ thể hoạt động mạnh mẽ chống lại sự có mặt của HBV HBV-DNA huyết thanh giảm và các enzyme gan tăng Ở giai đoạn này, những hội chứng bệnh lý gan

có thể xuất hiện; ALT, AST tăng cao hoặc dao động Ở một số bệnh nhân có hiện tượng chuyển đổi huyết thanh: HBeAg từ dương tính sang âm tính, sau đó xuất hiện kháng thể anti-HBe trong máu [30]

Giai đoạn mang HBsAg không hoạt động (inactive HBsAg carrier) hay giai đoạn virus không nhân lên hoặc nhân lên chậm (low replication) Trong giai đoạn

này, sự nhân lên của HBV vẫn tồn tại nhưng rất thấp vì bị ức chế do hệ miễn dịch của vật chủ hoạt động hiệu quả Đặc trưng cho giai đoạn này là chuyển đổi huyết thanh HBeAg âm tính và anti-HBe dương tính Người nhiễm HBV nhưng không xác định được HBsAg, mà chỉ có thể phát hiện bằng anti-HBs Enzyme ALT bình thường, HBV-DNA trong huyết thanh rất thấp hoặc không phát hiện được Ở một số bệnh nhân đã chuyển đổi huyết thanh, thường kèm theo đột biến có chọn lọc làm gián đoạn tạo HBeAg Do vậy, ở các bệnh nhân HBeAg chuyển về âm tính có thể tiến triển đến viêm gan B mạn tính thể HBeAg âm tính [30]

Giai đoạn tái hoạt động (HBV reactivation) hay giai đoạn hoạt động miễn dịch HBeAg âm tính Người mang HBV có sự hiện diện của HBsAg, âm tính với

HBeAg và dương tính với kháng nguyên anti-HBe Lượng HBV-DNA phát hiện lớn hơn 104 copy/mL Ở giai đoạn này ALT bình thường hoặc tăng cao Viêm gan có khả năng chuyển thành xơ gan [30, 32]

Việc tái hoạt động của virus ở người nhiễm HBV mãn tính diễn ra chậm nên người bệnh cần đi khám định kì, sử dụng các phương pháp chuẩn đoán HBV để có kiểm soát và điều trị bệnh kịp thời

1.3 Các phương pháp chuẩn đoán nhiễm HBV

Hiện nay, việc định lượng DNA HBV được coi là dấu chuẩn phân tử hữu ích nhất để chẩn đoán người nhiễm HBV [55] Dưới đây là những phương pháp thường được sử dụng trong định lượng HBV

1.3.1 Kĩ thuật DNA nhánh

Kĩ thuật DNA nhánh (Branched DNA – bDNA) là kĩ thuật khuếch đại tín hiệu

để phát hiện sự có mặt của nucleic acid đặc hiệu bằng việc đo tín hiệu được tạo ra từ quá trình lai tạo nhánh (branched) Phân tử bDNA gồm hai đầu, một đầu liên kết với trình

tự đặc hiệu và đầu còn lại có nhiều nhánh, có khả năng liên kết với nhiều đầu dò phát tín hiệu Dựa vào tín hiệu khuếch đại trong phân tử đích có thể xác định được số phân tử DNA đích trong mẫu Vì vậy, bDNA là kĩ thuật định lượng và được sử dụng trong xác định tải lượng virus [7, 11, 33] Thông thường, kĩ thuật DNA nhánh thực hiện trong hai ngày

Hình 1.6: Kĩ thuật DNA nhánh [56] Tách DNA và biến tính thành sợi đơn (1) và lai

với đầu dò bắt giữ trên giếng (2) Lai đầu dò đích (3), đầu dò tiền khuếch đại (4) và đầu dò khuếch đại (5) với DNA trên giếng Lai đầu dò được đánh dấu alkaline phosphatase (6) với cách nhánh đầu dò khuếch đại (5), thêm chất nền dioxetane (7)

và đo tín hiệu màu

1.3.2 Kĩ thuật lai bắt giữ

Kĩ thuật lai bắt giữ (Hybrid capture technology) là phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng cách sử dụng kháng thể để cố định và các tín hiệu hóa học phát xạ Kĩ thuật lai bắt giữ là sự kết hợp của kĩ thuật acid nucleic như dùng đầu dò RNA để lai với DNA kết hợp phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể lai với phức hợp RNA:DNA giúp nhanh chóng phát hiện gen đích [46]

Kĩ thuật lai bắt giữ gồm một số bước chính: (1) giải phóng DNA từ tế bào và biến tính DNA; (2) lai DNA đích với đầu dò RNA tạo phức hợp sợi kép RNA:DNA; (3) phức hợp lai RNA:DNA bị bắt giữ bởi các kháng thể (phủ ở đáy giếng); (4) phát hiện phức RNA:DNA-kháng thể bởi kháng thể thứ hai gắn alkaline phosphatase (AP)

và (5) phát hiện tín hiệu khuếch đại [4, 49, 60]

Hình 1.7: Kĩ thuật lai bắt giữ [5].

1.3.3 PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR)

Kĩ thuật PCR cạnh tranh định lượng (Quantitative-competitive PCR) cho phép phát hiện chính xác số copy DNA có trong mẫu Phương pháp này có sự tham gia của DNA cạnh tranh được thêm vào mẫu trước khi tách chiết và khuếch đại [56] Các bước chính của kĩ thuật PCR cạnh tranh định lượng được chỉ ra ở Hình 1.8

Hình 1.8:PCR cạnh tranh định lượng [62] C: sản phẩm cạnh tranh, T: sản phẩm đích.

Hai mồi a và b được thiết kế để khuếch đại trình tự DNA đích cần định lượng Đồng thời, một đoạn DNA cạnh tranh được thiết kế cũng được khuếch đại bởi hai mồi này nhưng có chứa thêm một đoạn trình tự ở giữa (màu đỏ) Một lượng DNA đích cố định sẽ được trộn với một dải nồng độ DNA cạnh tranh và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Sản phẩm sau khi khuếch đại sẽ được kiểm tra trên gel điện di và xác định tỉ lệ giữa sản phẩm cạnh tranh (C) với sản phẩm đích (T) Từ tỉ lệ C/T và

lượng khuôn DNA cạnh tranh đã biết rõ từ trước, người ta xây dựng một đường chuẩn Từ đó, xác định số phân tử cạnh tranh tương ứng với tỉ lệ C/T=1 Giá trị này cũng chính là số lượng phân tử của đích cần định lượng [62]

Các phương pháp trên đã được phát triển trở thành các bộ kit thương mại để phục vụ cho chuẩn đoán và định lượng HBV Tuy nhiên, kĩ thuật real-time PCR ra đời cho phép biết kết quả ngay sau khi DNA được khuếch đại, nhờ đó giảm thiểu thời gian cũng như thao tác tiến hành thí nghiệm Đồng thời, real-time cho độ nhạy phát

hiện cao đã khiến cho các kĩ thuật định lượng trên trở nên lỗi thời [46]

Bảng 1.1: So sánh các kit thương mại được sử dụng để định lượng HBV

DNA 3.0 (Bayer Healthcare LLC, NY, USA)

200 copy/ml Konnick và cs,

2005 [2]

Real-time PCR COBAS AmPliprep (Roche

Diagnostics, NJ, USA; with total nucleic acid isolation)

35 copy/ml Ronsin và cs,

2006 [4]

1.3.4 Real-time PCR

Real-time PCR là một trong những phương pháp định lượng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Đặc biệt, kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị sau mỗi chu kì của phản ứng nhiệt [57] Cơ sở của kĩ thuật này dựa trên cường độ phát màu huỳnh quang được máy ghi nhận tương quan với nồng độ sản phẩm PCR được khuếch đại tại thời điểm tương ứng [33] Dựa vào cường độ huỳnh quang thu nhận được trong quá trình khuếch đại, phẩm mềm máy tính sẽ xây dựng một biểu đồ khuếch đại (amplification plots)

Hình 1.9: Biểu đồ khuếch đại của một mẫu trong real-time PCR [3].

Biểu đồ Hình 1.9 biểu diễn trục hoành là số chu kỳ nhiệt, trục tung (∆Rn) là cường độ huỳnh quang ở từng thời điểm ∆Rn được xác định theo công thức ∆Rn = Rnf – Rnb trong đó: Rnf là mức độ tín hiệu máy đọc được của mẫu ở các thời điểm trong quá trình khuếch đại và Rnb là mức độ tín hiệu nền của máy trước khuếch đại [20, 24] Tại những chu kì đầu, ∆Rn thường rất nhỏ gần như bằng 0 vì trong giai đoạn này dù DNA đích đã được nhân bản thành các bản sao nhưng do số lượng ít nên cường độ huỳnh quang chưa đủ để máy ghi nhận Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ

để được máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đường biểu diễn khuếch đại bắt

đầu tăng Cường độ huỳnh quang trong phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kì nhiệt do số lượng bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kì Cường độ huỳnh quang trong phản ứng sẽ tăng đến một mức nào đó thì sẽ chậm dần

và không thay đổi tương ứng với đường biểu diễn khuếch đại đi ngang, do enzyme

Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa [24]

Một đường biểu đồ khuếch đại luôn đi kèm với một vài thông số quan trọng Threshold là một ngưỡng tín hiệu huỳnh quang nền Một tín hiệu huỳnh quang được phát hiện ở trên ngưỡng này được coi là một tín hiệu khuếch đại thực sự, được sử dụng để xác định chu kì ngưỡng (Ct-cycle threshold) cho một mẫu Chu kì ngưỡng là

số chu kì tín hiệu nhận được vượt qua mức ngưỡng phát hiện tín hiệu Ct là một trong những thông số quan trọng trong việc xác định chính xác kết quả định lượng [3] Nếu trong ống phản ứng có số lượng bản sao DNA đích nhiều thì chỉ cần vài chu kì nhiệt

để đạt đến số lượng bản sao đủ để tín hiệu huỳnh quang mà máy sẽ ghi nhận được Trong trường hợp này, Ct sẽ có giá nhỏ Còn nếu số lượng DNA đích ít hơn thì cần nhiều chu kì nhiệt hơn như vậy Ct sẽ có giá trị lớn hơn [36]

Có hai loại hóa chất phổ biến để phát hiện các sản phẩm PCR trong real-time PCR là sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu bám vào DNA sợi đôi và

sử dụng đầu dò huỳnh quang (probe) bao gồm các oligonucleotide có khả năng phát huỳnh quang sau khi đầu dò gắn với sợi bổ sung [43]

 Thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green I được sử dụng trong Real-time PCR [25, 26] SYBR Green I là thuốc nhuộm phổ biến nhất cho Real-time PCR do chi phí thấp và nguyên lý hoạt động đơn giản [59] Thuốc nhuộm SYBR I có khả năng bám vào DNA sợi đôi (không có khả năng bám vào DNA sợi đơn) Khi không liên kết với DNA, SYBR Green I phát tín hiệu rất yếu, nhưng khi được gắn với DNA thì tín hiệu huỳnh quang trở nên rất mạnh [41] Tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng trong quá trình tổng hợp DNA và giảm trong quá trình biến tính DNA Do đó, việc đọc tín hiệu huỳnh quang được thực hiện vào cuối bước kéo dài của mỗi chu kì PCR để theo dõi lượng DNA khuếch đại Ưu điểm của kĩ thuật này là chi phí rẻ vì nó có thể sử dụng

cùng với bất cứ cặp mồi nào Tuy nhiên, thuốc nhuộm SYBR Green sẽ bám vào tất cả các DNA sợi đôi bao gồm sản phẩm không đặc hiệu và dimer gây ảnh hưởng đến kết quả định lượng Phương pháp real-time PCR với đầu dò huỳnh quang đã khắc phục nhược điểm của phương pháp này [41] Dưới đây là một số loại đầu dò thường được

sử dụng trong phản ứng real-time PCR

 Real-time PCR sử dụng đầu dò kép Trong kỹ thuật này, người ta dùng hai probe Probe có đầu 3’ gắn chất phát huỳnh quang D (gọi là probe cho - donnor probe) và probe có đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang A (gọi là probe nhận - acceptor probe) Huỳnh quang từ D phát ra có bước sóng trùng với nguồn sáng kích thích của

A để làm cho A phát ra được huỳnh quang có bước sóng khác biệt với huỳnh quang phát ra từ D Hai probe này được thiết kế sao cho khi bắt cặp trên sợi khuôn thì đầu 3’ của probe cho gần với đầu 5’ của probe nhận [3] Ở bước gắn mồi, probe cho và probe nhận cùng bắt cặp được vào sợi khuôn, nhờ đó tín hiệu huỳnh quang phát ra từ

D sẽ là nguồn sáng kích thích A, làm cho A phát huỳnh quang và máy real-time PCR

sẽ đọc được huỳnh quang từ A Cơ chế hoạt động của probe là như vậy nên kĩ thuật này còn gọi là kĩ thuật FRET Real-time PCR (Fluorescence Resonance Energy Transfer) [8] Ứng dụng kĩ thuật này, Aliyu và công sự đã phát triển một bộ kit nội bộ

để phát hiện HBV Kết quả thu được cho thấy bộ sinh phẩm phát hiện HBV sử dụng real-time PCR với đầu dò kép là một phương pháp có khoảng phát hiện rộng, độ nhạy cao hơn hai bộ kit thương mại là “The Quantiplex™ HBV DNA (bDNA) Assay” và

“COBAS Amplicor HBV Monitor Test” [2] Việc sử dụng hai đầu dò đã làm tăng tính đặc hiệu của phương pháp, nhưng đó cũng là một khó khăn do cần một vùng trình tự lớn để chứa hai đầu dò cách nhau 2-5 nucleotide

 Real-time PCR sử dụng đầu dò Beacon Đầu dò này có cấu trúc phân tử sợi đơn DNA dạng kẹp tóc, có chất phát huỳnh quang ở một đầu và chất hấp thụ ở đầu còn lại [53] Nhờ cấu trúc kẹp tóc nên khi phân tử ở dạng tự do trong dung dịch, chất phát huỳnh quang và chất hấp thụ sẽ ở gần nhau và không phát huỳnh quang Khi đầu

dò Beacon lai với trình tự đích, chất phát huỳnh quang và chất hấp thụ bị tách rời nhau dẫn đến chất phát huỳnh quang phát quang dưới tác dụng của ánh sáng kích

thích [8, 50] Phương pháp này chủ yếu dùng để phát hiện đột biến điểm [14, 49], định lượng các mầm bệnh [16] và phát hiện giới tính phôi [49] Năm 2004, Sum và công sự đã sử dụng real-time PCR với đầu dò Beacon để phát hiện và định lượng HBV Kết quả của nhóm thí nghiệm được so sánh với bộ kit “COBAS AMPLICOR HBV Monitor test” không chỉ thấy sự tương đồng về kết quả mà còn chỉ ra sự vượt trội về khoảng phát hiện và độ nhạy của phương pháp đầu dò Beacon [51] Tuy nhiên, phân tử Beacon tương đối khó thiết kế, nhất là khi thiết kế trình tự ở hai đầu 5’ và 3’ phải chú ý để có sự bắt cặp đủ mạnh làm cho probe có cấu trúc kẹp tóc mà không duỗi ra, vì như vậy sẽ làm cho tín hiệu mong muốn ở đầu phát huỳnh quang ở trạng thái tự do Ngoài ra sự bắt cặp của trình tự ở hai đầu cũng không được quá mạnh để không ngăn cản probe bắt cặp vào sợi đích khi có mặt của sợi đích

 Real-time PCR sử dụng đầu dò Taqman Đây là đoạn đầu dò oligonucleotide

có đầu 5´ được gắn một chất phát tín hiệu huỳnh quang (reporter) và ở đầu 3´ là một chất thu nhận tín hiệu (quencher) [40] Nhờ có trình tự bổ sung với đoạn DNA đích nên ở giai đoạn gắn mồi, đầu dò gắn đặc hiệu vào trình tự đích, khi đó tín hiệu huỳnh quang phát ra từ reporter đều bị hấp thụ bởi quencher Trong giai đoạn tổng hợp, sợi DNA được kéo dài đến vị trí gắn của đầu dò, polymerase phá hủy các liên kết gắn giữa đầu dò với trình tự đích và đồng thời phá hủy đầu dò, làm cho reporter và quencher không còn ở gần nhau Kết quả reporter phát ra tín hiệu huỳnh quang Sự tăng lên của các sản phẩm đích sau mỗi chu kì tỉ lệ với lượng đầu dò bị phá hủy và tín hiệu nhận được từ reporter [6, 21, 22] Đầu dò Taqman là loại đầu dò với cấu trúc đơn giản đã khắc phục được nhược điểm của đầu dò Beacon và đầu dò kép Do đó, chỉ sau

3 năm kể từ khi đầu dò Taqman được phát hiện, có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để phát hiện và định lượng HBV [1, 9, 38, 46, 61] Sự ra đời của các bộ kit thương mại dựa trên phương pháp real-time PCR với đầu dò Taqman như “COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test” của hãng Roche, artus HBV PCR Kits của hãng Qiagen, GeneProof Hepatitis B Virus (HBV) PCR Kit … cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các xét nghiệm y học

Hình 1.10: Real-time PCR sử dụng đầu dò Taqman [3]

Real time PCR là một phương pháp được sử dụng phổ biến trong xét nghiệm virus viêm gan B, với ưu điểm: định lượng được mật độ virus, đảm bảo tính chính xác, tính đặc hiệu và thời gian thao tác nhanh [61] Tuy nhiên cũng như các phương pháp khác, real time PCR đòi hỏi phải có một mẫu chứng đi kèm trong quá trình thực hiện xét nghiệm để kiểm soát từ khâu tách chiết DNA cho tới khâu khuếch đại sản phẩm [9], được gọi là nội chuẩn (Internal control, IC) DNA nội chuẩn (IC) là đoạn DNA được khuếch đại đồng thời cùng với DNA đích nhưng cho sản phẩm khuếch đại

có kích thước khác nhau hoặc có trình tự khác nhau một phần hay hoàn toàn nhờ đó

có thể phân biệt được với gen đích Một IC lí tưởng cần có các đặc điểm sau: dễ dàng được chuẩn bị; có thể bảo quản được lâu và thích hợp với việc vận chuyển; không phải là tác nhân gây bệnh cho người, không gây ra các vấn đề thiếu an toàn trong quá trình sản xuất và sử dụng; dùng để kiểm soát tất cả các bước của xét nghiệm [9] c

Hiện nay, các bộ kit nhập từ các công ty nước ngoài là có chứng nhận IVD (In Vitro Diagnostic): Roche Diagnostic; Abbott; Qiagen và GeneProof… với giá thành dao động khoảng từ 10-35 triệu/ 50 phản ứng Nếu tính cả tính việc lấy mẫu và tách chiết thì giá thành một xét nghiệm sẽ rơi vào khoảng 1,4 - 1,6 triệu đồng Các kit nội địa (Việt Á; Nam Khoa…) có giá thành thấp hơn, khoảng 5triệu/ 50 phản ứng tuy nhiên tính ổn định của các kit này cũng không cao, nên thường không được các phòng xét nghiệm tin dùng Trên thực tế, nhiều phòng xét nghiệm đã tự xây dựng một quy trình chuẩn cho xét nghiệm Realtime PCR định lượng DNA HBV giá thành rẻ hơn so với các kit thương mại nhập ngoại mà vẫn đảm bảo các tiêu chuẩn xét nghiệm khắt khe Như ở viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung Ương giá thu dịch vụ bệnh nhân xét nghiệm định lượng HBV theo phương pháp nội bộ là 800 trăm nghìn đồng gần bằng 1 nửa so với các xét nghiệm sử dụng kit thương mại nhập ngoại

Việt Nam là nước có tỷ lệ hiện mắc HBV mãn tính cao nên rất cần các biện pháp định lượng DNA HBV để hỗ trợ chuẩn đoán và theo dõi tình trạng bệnh Mặt khác, sử dụng bộ kit thương mại với giá thành cao, làm tăng gánh nặng khi khám

chữa bệnh Nắm vững được các kĩ thuật, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng bộ kit định lượng PCR HBV (qPCR) để phát hiện virus viêm gan B” với mục đích

xây dựng một bộ kit với giá thành tốt và chất lượng tương đương các bộ kit thương

mại ngoại nhập

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN CỨU

2.1 Thiết kế thí nghiệm

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn gen P làm gen đích để phát hiện HBV do do các đặc điểm và chức năng của gen này trong quá trình xâm nhiễm tái bản của HBV Dựa trên các trình tự đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu (NCBI), chúng tôi chọn vùng trình tự bảo thủ của gen X để thiết kế mồi Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được chúng tôi tách dòng tạo plasmid HBV và xử lý với enzyme giới hạn để đưa về một dạng đồng nhất Plasmid này sẽ được sử dụng để chuẩn hóa điều kiện phát hiện HBV và làm mẫu chuẩn cho phản ứng real-time PCR

Đoạn IC của chúng tôi có lõi là DNA lambda có thành phần GC tương đồng với trình tự gen P, có hai đầu của IC là vị trí bám của cặp mồi đặc hiệu Trong phản ứng định lượng, đoạn IC được khuếch đại với gen đích bằng chính cặp mồi của gen đích, qua đó đánh giá đc hiệu quả của phản ứng khuếch đại IC được tách dòng trong vector pTZ57R/T tạo thành phân tử DNA vòng, sợi đôi có kích thước 3.2kb (plasmid IC) tương đồng với kích thước genome virus Điều này cho thấy IC của chúng tôi hoàn toàn thích hợp để kiểm soát quá trình tách chiết và khuếch đại DNA Tuy nhiên, việc sử dụng cùng một cặp mồi khuếch đại với HBV sẽ gây ra phản ứng cạnh tranh giữa HBV và IC

Sau đó, plasmid HBV và plasmid IC được sử dụng làm khuôn để chuẩn hóa điều kiện phản ứng PCR phát hiện HBV và tối ưu nồng độ phối trộn IC để giảm thiểu tối đa sự cạnh tranh này Sử dụng điều kiện PCR đã tối ưu cùng nồng độ IC xác định, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn HBV và xác định giới hạn phát hiện với mẫu chuẩn HBV

Từ đó, chúng tôi tiến hành xây dựng sơ đồ thí nghiệm gồm 6 bước như sau:

- Bước 1: Tạo plasmid HBV DNA HBV được khuếch đại gen P bằng cặp mồi đặc hiệu và tách dòng trong vector pTZ57R/T