Nghiên cứu đa hình di truyền gen COX 1 và COX 2 trên ADN ty thể liên quan đến bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở việt nam

Một số đột biến, đa hình trên gen COX-1, COX-2 ty thể đã được xác định có liên quan với một số bệnh ở người bao gồm cả bệnh ung thư.. Trên gen COX-2 ty thể, một số đột biến cũng đã được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình di truyền gen COX-1 và COX-2

trên ADN ty thể liên quan đến bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Việt Nam

Mã số đề tài:

Chủ nhiệm đề tài:

QG.15.05 ThS Phạm Thị Bích

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu đa hình di truyền gen COX-1 và COX-2 trên ADN ty thể liên

quan đến bệnh nhân ung thư đại trực tràng ở Việt Nam

1.2 Mã số: QG.15.05

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 ThS Phạm Thị Bích Khoa Sinh học, Trường

5 PGS.TS Tạ Văn Tờ Bệnh viện K, Hà Nội Thành viên

1.4 Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Điện thoại: 04 3 8584515 Fax: 04 38583061

E-mail:dhkhtnh@hn.vnn.vn

Website: www.hus.vnu.edu.vn

Địa chỉ: 334, Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Nguyễn Văn Nội

Số tài khoản: 8123.1, Mã đơn vị quan hệ ngân sách: 1059420

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Đống Đa

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 02 năm 2017

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng… năm…

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 02 năm 2015 đến tháng 02 năm 2017

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 160 triệu đồng

PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Đặt vấn đề

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư phổ biến ở người Trên thế giới, trong tổng số các loại ung thư, UTĐTT xếp thứ ba sau ung thư phổi và ung thư tiền liệt tuyến ở nam giới, đứng thứ hai sau ung thư vú ở nữ giới Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày, vú Tỷ lệ mắc UTĐTT chiếm khoảng 8,7% tổng số bệnh nhân ung thư (globocan, 2012) UTĐTT là loại ung thư có tiên lượng tốt nếu bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị khi còn ở giai đoạn sớm Tuy nhiên, tỷ lệ tử vong do UTĐTT vẫn ở mức cao, điều đó cho thấy thực trạng chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm vẫn còn hạn chế đặc biệt ở các nước chậm phát triển (globocan, 2012)

Có nhiều yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc UTĐTT như chế độ ăn uống, tuổi tác, lối sống, nghề nghiệp và hội chứng đa polyp theo gia đình Đặc biệt, các nghiên gần đây đã chỉ ra rằng biến đổi trên ADN ty thể là một yếu tố góp phần làm tăng nguy cơ mắc bệnh Kết quả nghiên cứu về biến đổi trên ADN ty thể cho thấy đây là hướng nghiên cứu tiềm năng để tìm các chỉ thị giúp hỗ trợ chẩn đoán ung thư (Czarnecka và cs, 2010)

Gen cytochrome c oxidase I CO1 hay COX-1) và gen cytochrome c oxidase II

(MT-CO2 hay COX-2) được định vị trên sợi nặng của ADN ty thể, từ vị trí nu 5904 đến 7455 (gen COX-1), từ vị trí nu 7586 đến 8269 (gen COX-2) Gen COX-1 và COX-2 mã hóa cho sản phẩm

tương ứng là cytocrome c oxidase I và cytocrome c oxidase II, là hai enzyme quan trọng thuộc phức hệ IV của chuỗi hô hấp ty thể (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4512/4513) Sự thay đổi trong cấu trúc và chức năng của các protein thuộc phức hệ này có thể tác động tới quá trình sinh năng lượng của tế bào gây ảnh hưởng đến chức năng của cơ thể Một số đột biến, đa hình trên

gen COX-1, COX-2 ty thể đã được xác định có liên quan với một số bệnh ở người bao gồm cả

bệnh ung thư Trên bệnh UTĐTT, Chihara và cs đã sàng lọc được biến đổi G6709A thuộc gen

COX-1 Biến đổi G6709A làm thay đổi axit amin Glycine thành Glutamic tại vị trí 269 Biến

đổi này có thể làm thay đổi hình dạng của protein CO1 đặc biệt là thay đổi cấu trúc xoắn α thứ cấp vì vậy có thể ảnh hưởng đến chức năng của phân tử protein này Ngoài ra, kết quả giải trình

tự còn chỉ ra một số biến đổi khác trên gen COX-1 như biến đổi G5973A làm thay đổi axit amin

Alanine thành Threonine tại vị trí 24 trong chuỗi axit amin, biến đổi tại vị trí 6146 không làm

Trên gen COX-2 ty thể, một số đột biến cũng đã được xác định trên nhóm bệnh nhân hội

chứng MAP (MUTYH associated polyposis) là hội chứng có nguy cơ cao dẫn đến UTĐTT Đặc biệt, đột biến G7763A xuất hiện với tần suất cao và có liên quan đến đột biến gen KRAS

là gen trên nhân đã được xác định có liên quan đến hội chứng MAP (Venesio và cs, 2013) Cũng tương tự trên nhóm bệnh nhân MAP, bệnh nhân FAP (hội chứng đa polyp theo gia đình), Errichiello và cs đã chỉ ra rằng đột biến ADN ty thể xảy ra chủ yếu ở bệnh nhân MAP

(p=0.0055), ngoài ra phát hiện 17 đột biến thường phân bố chủ yếu ở gen COX-2 (p<0.0001)

và thường ở dạng đột biến thay đổi nucleotide từ dạng G thành A (Errichiello và cs, 2015)

Ngoài ra, các biến đổi trên gen COX-1, COX-2 còn được xác định trên bệnh ung thư vú

(Ghatak và cs, 2014; Tan và cs, 2002), ung thư tuyến tiền liệt (Arnold và cs, 2013; Anna và

cs, 2009) Ở Việt Nam, cho đến nay cũng có những công bố liên quan đến đột biến ADN

ty thể trên một số bệnh như bệnh nhân nghi hội chứng cơ não (Huệ và cs, 2012), hội chứng MELAS (Huệ và cs, 2012) bệnh ung thư vú (Anh và cs, 2015; Trang và cs, 2015) Trên đối tượng bệnh UTĐTT, nghiên cứu về đột biến ADN ty thể và mối liên quan giữa đột biến ADN ty thể với bệnh UTĐTT vẫn còn là một hướng nghiên cứu mới, có triển vọng để tìm ra các chỉ thị hỗ trợ chẩn đoán hoặc giải thích nguyên nhân gây bệnh Vì vậy,

từ những lý do trên, trong phạm vi của đề tài này chúng tôi tiến hành sàng lọc các biến đổi

(đột biến, đa hình) của gen COX-1, COX-2 ty thể và đánh giá mối liên quan giữa một số biến đổi trên các gen COX-1, COX-2 xác định được với các đặc điểm bệnh học của bệnh

UTĐTT Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 2 năm 2015 đến tháng 2 năm 2017 tại Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN

2 Mục tiêu

1 Xác định được đa hình di truyền của gen COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể ở một

nhóm mẫu quần thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng người Việt Nam

2 Xác định được mối liên quan giữa một số dạng đa hình di truyền của các gen COX-1

và COX-2 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng ở nhóm bệnh nhân nghiên cứu

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu mô u, mô lân cận u (LCU) và một số mẫu máu được cung cấp k m theo mẫu mô của các bệnh nhân bị bệnh UTĐTT Mẫu ung thư được cung cấp

từ Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Hà Nội Mẫu máu của người kh e mạnh bình thường (máu ĐC) dùng làm đối chứng Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu ung thư là những mẫu được lấy từ các bệnh nhân có kết quả giải phẫu bệnh sau phẫu thuật là ung thư biểu mô tuyến, dạng ung thư nguyên phát, v ng không bị hoại tử (được xác định tại Khoa Giải phẫu bệnh của Bệnh viện) Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân UTĐTT do di căn từ các mô, cơ quan khác tới Mô u lấy tại vị trí trung tâm của khối u, mô LCU lấy tai vị trí cách khối u từ 5-10cm

Các hóa chất chính được sử d ng trong nghiên cứu (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Các h a chất chính được sử dụng trong nghiên cứu

1

Kit QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN (Đức)

Tách chiết ADN tổng số

GeneJET Whole Blood Genomic DNA

Purification Mini Kit Thermo Scientific (Mỹ)

2 Agarose, APS, Acrylamide,

Bis-Acrylamide

Invitrogen (Mỹ), Pharmacia (Th y Điển) Điện di

3

Các cặp mồi d ng cho phân tích

Hot Start PCR Master Mix 2x Thermo Scientific, Mỹ

4 Các enzyme cắt giới hạn Fermentas / New

England Biolabs (NEB) PCR-RFLP

5

Kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR

pGEM T easy, T4 DNA ligase, pJET1.2,

chủng vi khuẩn E.coli DH5α

Promega, Fermentas,

6 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Mỹ) ADN chuẩn

3.2 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu

1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thư và mẫu máu bằng kit tách chiết thương phẩm: Kit QIAamp DNA Mini Kit, GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit, các bước tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2 Phương pháp điện di trên gel agarose, polyacrylamide để kiểm tra độ sạch của sản phẩm tách chiết, sự có mặt của sản phẩm PCR, sản phẩm cắt bằng enzyme

4 Phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, so sánh kết quả giải trình tự với trình tự ADN ty thể chuẩn được công bố trên NCBI mã số (NC_012920.1) để xác

định các biến đổi trên gen COX-1, COX-2

5 Phương pháp PCR kết hợp với cắt ADN bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP) Kỹ thuật này d ng để khuếch đại các đoạn ADN đồng thời d ng enzyme cắt để nhận biết các biến đổi Hai enzyme được sử d ng để xác định biến đổi tại vị trí 6340 và

7853 có trình tự nhận biết và sản phẩm sau khi cắt được trình bày trong bảng 3.2

6 Nhân dòng trực tiếp đoạn gen chứa vị trí biến đổi vào vector pJET 1.2 nhằm: Phân lập một đoạn gen (ADN) đặc hiệu từ một hỗn hợp các phân tử ADN ban đầu được tách chiết từ các mẫu sinh học

7 Phân tích số liệu bằng các phương pháp thống kê Sử d ng kiểm định chính xác của Fisher và kiểm định Khi bình phương (Chi-square test – χ2) với mức ý nghĩa α =

0,05 để phân tích mối liên quan giữa biến đổi xác định được trên 2 gen COX-1,

COX-2 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh nhân UTĐTT Các giá trị có ý

nghĩa thống kê khi P < 0,05 theo 2 phía

Bảng 3.2 Các enzyme giới hạn d ng trong nghiên cứu

(COX-1)

 161 bp  128 bp và

33 bp

4 Tổng hợp kết quả nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đạt được những kết quả ph hợp với m c tiêu nghiên cứu đã đề ra

4.1 Kết quả thu th p và tách chiết ADN tổng số từ các m u nghiên cứu

Chúng tôi đã thu thập được 86 cặp mẫu mô ung thư (86 mẫu mô u, 86 mẫu mô LCU) của

86 bệnh nhân UTĐTT 67 mẫu máu của của người kh e mạnh (máu ĐC) Danh sách bệnh nhân UTĐTT kèm theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng chi tiết theo Ph l c nghiên cứu 1 Một số đặc điểm của bệnh nhân UTĐTT được thống kê theo số lượng (n) gồm: nam giới (n=41), nữ giới (n=45), với độ tuổi trung bình 58,71 13 trong đó trên 50 tuổi (n=66), dưới

50 tuổi (n=18) Theo vị trí ung thư gồm: ung thư trực tràng (n=41), ung thư đại tràng và đại trực tràng (n=45) Theo mức độ xâm lấn khối u (giai đoạn T) gồm: giai đoạn T1 (n=9), giai

đoạn T2 (n=35, giai đoạn T3 và T4 (n= 40) Theo mức độ di căn hạch (giai đoạn N) gồm chưa có sự di căn hạch (giai đoạn No) (n=51), có sự di căn hạch (giai đoạn N1, N2) (n=32) Theo kích thước khối u: có kích thước u nh hơn 3cm (n=21), kích thước u từ 3 đến 3,5 cm (n=16), kích thước u lớn hơn 3,5 cm (n=42) Theo mức độ biệt hóa: mức độ biệt hóa cao (n=10), mức độ biệt hóa vừa (n=39), mức độ biệt hóa k m (n=6) Theo giai đoạn bệnh (giai đoạnTNM) gồm có: giai đoạn I (n=30), giai đoạn II (n=21), giai đoạn III và IV (n=33) ADN tổng số của các mẫu nghiên cứu được tách chiết bằng kit tách chiết của hãng Qiagen Kết quả tách chiết ADN của một số mẫu nghiên cứu được minh họa trong Hình 4.1

Hình 4.1: Ảnh điện di sản phẩm ADN tổng số từ một số m u nghiên cứu

Giếng 1,2: từ mô u, giếng 3, 4 từ mô U 2 n n n UTĐTT,

giếng 5, 6: từ m u Đ , giếng 7: m u n n n UTĐTT

Hình 4.1 cho thấy sản phẩm ADN tổng số thu được từ các mẫu nghiên cứu đều có băng ADN sáng, khá r n t ADN tổng số sau khi tách chiết được đo mật độ hấp th ánh sáng tử ngoại và xác định hàm lượng để ph c v cho các nghiên cứu tiếp sau

4.2 Quy trình kỹ thu t phân tích đa hình di truyền của gen COX-1 và COX-2 thuộc

ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu đã đăng ký theo thuyết minh đề tài để

xây dựng quy trình phân tích đa hình di truyền của gen COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể

ở bệnh nhân UTĐTT và đã thu được những kết quả tương ứng sau:

4.2.1 Kết quả thiết kế 2 cặp mồi, điều kiện phản ứng PCR nhân để nhân bản toàn bộ gen COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể ở các mẫu nghiên cứu

Sử d ng chương trình Primer-BLAST thuộc NCBI (Mỹ), primer 3, trình tự ADN ty thể chuẩn (NC_012920.1) để thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR nhân bản toàn bộ gen

Bảng 4.1 Trình tự và vị trí b t cặp của hai cặp m i COX-1.2 và COX-2.2

Tên m i Gen

đích

Kích thước sản phẩm PCR (bp), (vị trí)

Trình tự m i xuôi (5’-3’)

Trình tự m i ngược (5’-3’)

bộ gen COX-1 và COX-2 như sau:

Đối với gen COX-1: Thành phần PCR bao gồm: 6,25µl Hot Start 2X Master Mix;

200nM mồi xuôi và mồi ngược; 2 ng l ADN khuôn, sau đó bổ sung H2O đến 12,5 l Chu trình nhiệt gồm các bước: biến tính ở 940C trong 30 giây, khuếch đại 35 chu kỳ (940C: 30 giây, 600C: 30 giây, 680C: 130 giây), 680C: 5 phút Đối với gen COX-2 thành phần PCR tương tự như đối với gen COX-1, chu trình nhiệt chỉ thay nhiệt độ bắt mồi là 520C và k o dài chuỗi trong 60 giây Kết quả PCR đối với hai cặp mồi, thành phần PCR, chu trình nhiệt sau khi tối ưu được minh họa ở Hình 4.2

Hình 4.2 Ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp m i COX-1.2(A); COX-2.2 (B)

Giếng M: T ng uẩn 1k , Giếng 1-6 n v : Sản p ẩm P R tương ứng

6 n n n trong ng i n ứu Giếng (-): Đối ứng m

Hình 4.2 cho thấy sản phẩm PCR cho băng r n t, không xuất hiện băng ph , băng lạ Kích thước băng khoảng 1060 bp và 1745 bp đúng theo tính toán lý thuyết Giếng đối chứng

âm không lên băng Như vậy, với cặp mồi COX-1.2, COX-2.2 chúng tôi đã khuếch đại

thành công đoạn ADN chứa toàn bộ gen COX-1, COX-2 ty thể ph c v cho việc xác định

trình tự gen

4.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR nhân lên từ 2 gen COX-1 và COX-2

Toàn bộ gen COX-1, COX-2 ty thể được nhân lên với cặp mồi COX-1.2 và COX-2.2

bằng phản ứng PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp Kết quả giải trình tự được minh họa trong Hình 4.3 và 4.4

Hình 4.3 Một số vị trí biến đổi trên gen COX-1 ty thể

, : iến đổi T6253 , 6340T/ (dạng k ông đồng n ất) - mẫu #17401,

: iến đổi 6455T- mẫu #17180; D: iến đổi 7299G - mẫu #3753

Hình 4.4 Một số vị trí biến đổi trên gen COX-2 ty thể

, , , D, E: vị trí iến đổi nu leotide dẫn đến t y đổi xit min mẫu #4120, #3089, #19561, # 37158, #11777, tương ứng

F: iến đổi nu leotide k ông l m t y đổi xit min mẫu #42440

Kết quả giải trình tự Hình 4.3 và 4.4 cho thấy các đỉnh r ràng, không có đỉnh ph , không bị nhiễu như vậy việc tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự đã đạt yêu cầu Đối

với gen COX-1, trong 25 mẫu được giải trình tự thành công, chúng tôi đã xác định được 17

biến đổi, trong đó có 4 biến đổi làm thay đổi axit amin (C6340T; T6253T; A7299G; C6455T) (Hình 4.3) và 13 biến đổi ở dạng đồng nghĩa (Bảng 4.2) Một điều đặc biệt là trong

số các biến đổi đồng nghĩa, biến đổi C7028T là biến đổi xuất hiện với tần suất cao (24 25

Bảng 4.2 Các vị trí biến đổi trên gen COX-1 ty thể ở 25 m u UTĐTT

STT Vị trí

biến đổi

Loại biến đổi

Thay đổi axit amin

Số lượng

m u có biến đổi

Tần suất (%)

Công bố trên MITOMAP

Đối với gen COX-2 ty thể, trong 31 mẫu được giải trình tự thành công, chúng tôi đã xác

định được 13 biến đổi, trong đó có 5 biến đổi làm thay đổi axit amin (T7674C, T7679C, G7775A, G7853A và C8130T) và 8 biến đổi ở dạng đồng nghĩa (Hình 4.4, Bảng 4.3)

Bảng 4.3 Thống kê các vị trí biến đổi trên gen COX-2 ty thể ở 31 m u UTĐTT

STT Vị trí

biến đổi

Loại biến đổi

Thay đổi axit amin

Số lượng

m u có biến đổi

Tần suất (%)

Công bố trên MITOMAP

4.2.3 Kết quả sàng lọc biến đổi C6340T và G78543A trên gen COX-1 và COX-2 bằng phương pháp PCR-RFLP

Biến đổi C6340T thuộc gen COX-1, G7853A thuộc gen COX-2 là biến đổi làm thay đổi

axit amin và được xác định ở một số loại ung thư Trong nghiên cứu này, hai biến đổi trên được xác định ở dạng không đồng nhất và có tần suất cao Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc biến đổi C6340T, G7853A bằng phương pháp PCR-RFLP trên những bệnh nhân khác để xác định tần suất của biến đổi và đánh giá mối liên quan với bệnh UTĐTT Chúng

tôi đã thiết kế được hai cặp mồi để nhân bản đoạn gen chứa vị trí 6340 trên gen COX-1 có

kích thước sản phẩm PCR là 161bp (cặp mồi COX-1.1 (6221F; 6381R) và đọan gen chứa vị

trí 7853 trên gen COX-2 có kích thước sản phẩm PCR là 472 bp (cặp mồi COX-2.2) Kết

quả PCR-RFLP được minh họa trên Hình 4.5 và 4.6

Hình 4.5 Ảnh điện di sản phẩm PCR được c t bằng enzyme BccI trên mô u,

LCU, m u máu của bệnh nhân UTĐTT (gel polyacrylamide 10%)

Hình A: Giếng M: T ng DN uẩn 50 p Giếng (+): Đối ứng dương l sản

p ẩm ắt enzyme (mẫu ó iến đổi tại vị trí 6340 dạng k ông đồng n ất đượ

k ẳng địn ằng giải tr n tự); ặp giếng (1, 2); (3, 4); (5, 6) l sản p ẩm P R v

sản p ẩm ắt ằng enzyme tương ứng mô LCU (dạng k ông đồng n ất), mô u

(dạng iến đổi đồng n ất) mẫu m u (dạng k ông iến đổi) n n n #16689,

giếng 7 sản p ẩm ắt mô u n n n #17401 dạng k ông đồng n ất, giếng (-)

đối ứng m sản p ẩm P R đượ t y ằng H2O trong p ản ứng ắt Hình B: Kết

quả đi n di một số mẫu iến đổi dạng k ông đồng n ất: Giếng 1, 4, 7 l sản p ẩm

P R, giếng (2,3); (5,6); (8,9) l sản p ẩm ắt mẫu #17401 U

(l n ận u), #17401U (mô U), #16689 U tương ứng

Kết quả điện di ở Hình 4.5A cho thấy: sản phẩm PCR (giếng 1, 3, 5) có kích tương ứng

161 bp, các băng r , không có băng ph , chứng t cặp mồi COX-1.1được thiết kế là đặc hiệu Sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân #16689 (giếng 2, 4, 6) cho thấy ở mô LCU xuất

đột biến sôma Kết quả điện di Hình 4.5B cho thấy một số mẫu biến đổi ở dạng không đồng nhất Tuy nhiên, mức độ biến đổi trên mô u và mô lân cận u có sự khác biệt lớn Ở bệnh nhân 17401 mô lân cận u, trên bản gel điện di băng 161bp đại diện cho những bản sao mang đột biến mờ hơn so với băng 128bp đại diện cho bản sao không mang đột biến (giếng 2, 3) trên mô u kết quả lại ngược lại (giếng 5, 6) Hình 4.5B.

Biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 trong các m u nghiên cứu

Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc biến đổi G7853A bằng phương pháp PCR-RFLP Kết quả PCR-RFLP được minh họa trên Hình 4.6

Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm PCR được c t bằng enzyme HincII trên mô u, LCU, m u máu của bệnh nhân UTĐTT (gel agarose 2,5%)

(U: mô u, U: mô l n ận u, M: mẫu m u, N: n n n) Giếng M: T ng DN uẩn 50 p Giếng 1: Đối ứng dương- sản p ẩm ắt enzyme (mẫu

ó iến đổi G7853 đượ k ẳng địn ằng giải tr n tự); giếng: 2,4,6,8,10,12: Sản p ẩm P R; giếng: 3,5,7,9,11,13: Sản p ẩm ắt ằng enzyme HincII; giếng (-): đối ứng m

Kết quả điện di ở Hình 4.6 cho thấy: sản phẩm PCR (giếng 2, 4, 6, 8, 10, 12) có kích tương ứng 472 bp, các băng r , không có băng ph , chứng t cặp mồi COX-2.1 được thiết

kế là đặc hiệu Sản phẩm cắt enzyme của bệnh nhân #17176 (giếng 3, 5, 7) cho thấy ở mô u

và LCU xuất hiện biến đổi (sản phẩm cắt có 2 băng: 257, 215 bp - giếng 3, 5), trong khi đó

ở mẫu máu không có biến đổi (xuất hiện 3 băng: 113, 144, 215 bp - giếng 7) Ở bệnh nhân

#17180 (giếng 9, 11, 13) xuất hiện biến đổi trên cả mô u, LCU, mẫu máu (sản phẩm cắt đều cho 2 băng 257 và 215 bp) Như vậy, kết quả PCR-RFLP cho thấy biến đổi G7853A có sự khác biệt giữa mẫu mô và mẫu máu trên c ng một bệnh nhân 17176, do đó có thể cho rằng biến đổi G7853A là dạng đột biến sôma Mặt khác, kết quả cắt enzyme cũng cho thấy ở tất

cả các mẫu chỉ thu được 2 băng (257 và 215 bp với trường hợp có biến đổi) hoặc 3 băng (113, 144 và 215 bp với trường hợp không có biến đổi), chứng t biến đổi G7853A trên gen

COX-2 ty thể ở dạng đồng nhất (homoplasmy)

4.2.4 Nhân dòng và ác đ nh trình tự nucleotide c các đoạn gen m ng đột biến và dạng bình thường tương ứng

Tiếp nối kết quả phân tích các đột biến C6340T, G7853A bằng PCR-RFLP, các đoạn gen mang đột biến và dạng bình thường được nhân dòng vào vector pJET 1.2 và biến nạp

vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α Plasmid vector tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm được

tách, tinh sạch, giải trình tự nucleotide và so sánh với trình tự gen tương ứng đã được công

bố trong NCBI (NC_012920.1) Với mỗi vị trí, chúng tôi lựa chọn 2 mẫu dạng có biến đổi

và dạng không biến đổi để tiến hành nhân dòng Kết quả nhân dòng được minh họa trong Hình 4.7 và 4.8

Hình 4.7 Ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid mang đoạn chèn chứa vị trí 6340 dạng đột biến (A)

và dạng không đột biến (B) được biến nạp vào E.coli DH5α

Hình 4.8 Ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid mang đoạn chèn chứa vị trí 7853 dạng đột biến (A)

và dạng không đột biến (B) được biến nạp vào E.coli DH5α

Các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có bổ sung ampicillin được chúng tôi tiến hành kiểm tra PCR sử d ng cặp mồi đặc hiệu COX-1.2 và COX-2.2 Nếu sản phẩm PCR điện di cho băng kích thước tương ứng kích thước của đoạn gen chèn là 161 bp và 472 bp tương ứng thì chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm nhân dòng và gửi giải trình tự Kết quả giải trình tự được minh họa trong Hình 4.9 và 4.10

Hình 4.9 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen COX-1 với trình tự gen chuẩn và trình tự

nucleotide không chứa đột biến tại vị trí 6340(A) và có biến đổi tại vị trí 6340T (B)

Hình 4.10 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen COX-2 với trình tự gen chuẩn bằng

chương trình Blast và trình tự nucleotide không chứa đột biến tại vị trí 7853 (A)

và c đột biến tại vị trí 7853 (B)

Như vậy, chúng tôi đã nhân dòng thành công dạng biến đổi và không biến đổi tại vị trí

6340 và 7853 thuộc các gen COX-1 và COX-2 tương ứng

4.2.5 Đánh giá kết quả phân tích đ hình di truyền c gen COX-1 và COX-2 thuộc ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Tổng số mẫu sàng lọc biến đổi C6340T bằng hai phương pháp giải trình tự và RFLP là 86 cặp mẫu Trong đó trên mô u phát hiện có 1/86 (chiếm 1,16%) mẫu biến đổi đồng nhất từ C thành T, 2 86 mẫu có biến đổi ở dạng không đồng nhất (heteroplasmy) Trên

PCR-mô LCU có 1 mẫu biến đổi đồng nhất (chiếm 1,16%) và 2 mẫu có biến đổi ở dạng dị tế bào chất Tính chung trên cả mô u và LCU tần suất biến đổi C6340T chiếm 3,48% (3 86 mẫu)

So với máu đối chứng và máu bệnh (đều có tần suất biến đổi C6340T là 0%) thì tần suất dạng biến đổi ở mô của bệnh nhân UTĐTT có xu hướng cao hơn, tuy nhiên chưa tìm thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ biến đổi C6340T giữa mô và mẫu máu ĐC (P>0,05) (Bảng 4.4)

Bảng 4.4 Phân bố của biến đổi T6340C và nguy cơ của bệnh UTĐTT

Loại mô

Tần suất T6340C

OR (CI 95%) P 6340T, n (%) 6340C, n (%)

Mô u của bệnh nhân

Sử d ng test chính xác của Fisher và kiểm định Chi-square test (χ2) để đánh giá mối liên

quan giữa biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh

nhân UTĐTT Tổng hợp kết quả giải trình tự và kết quả phân tích PCR- RFLP cho thấy tần suất biến đổi G7853A trên mô u (15,1%) thấp hơn so với mô LCU (21,2%) Tuy nhiên, sự khác biệt về tần suất biến đổi G7853A giữa mô u và LCU không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Dùng chỉ số chênh (odd ratio - OR) để đánh giá nguy cơ của biến đổi G7853A và bệnh UTĐTT, kết quả kiểm định OR cho thấy 7853A là một yếu tố có xu hướng làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTĐTT (OR=1,25, CI 95%: 0,29-5,18) (Bảng 4.5)

Theo các đặc điểm của bệnh UTĐTT cho thấy, biến đổi G7853A liên quan với giới tính

và giai đoạn T của bệnh (p<0,05), không liên quan với một số đặc điểm khác như độ tuổi, kích thước khối u, mức độ biệt hóa, giai đoạn N, giai đoạn bệnh (P>0,05), (Bảng 4.6)

Bảng 4.5: Tần suất biến đổi G7853A và nguy cơ UTĐTT Loại mô

Tần suất G7853A

OR (CI 95%) P 7853G, n (%) 7853A, n (%)

Bảng 4.6: Mối liên quan giữa biến đổi G7853A với một số đặc điểm bệnh học

0,0028 **

T3+T4 40 3(7,50) 37(92,50) Giai đoạn bệnh

0.15 *

III + IV 33 8(24,24) 25(75,76)

Ghi chú Gi i đoạn I: T 1-2 N 0 M 0 ; gi i đoạn II: T 3-4 N 0 M 0 ; gi i đoạn III: T bất kỳ N 1-2 M 0 ;

gi i đoạn IV: T bất kỳ N bất kỳ M 1 ; *: giá tr p tính theo kiểm đ nh Fisher;

**: Kiểm đ nh Khi bình phương ( χ2)

Nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được 4 17 biến đổi trên gen COX-1, 5/13 biến đổi

trên gen COX-2 làm thay đổi axitamin Các biến đổi này đều chưa được công bố trên đối

tượng UTĐTT trên thế giới Mặt khác, trong 4 biến đổi thuộc gen COX-1 có hai biến đổi

dạng C>T cũng là dạng biến đổi mà trong công bố của Venesio và cs, 2013 đã xác định

được trên bệnh nhân UTĐTT người Ý Trên gen COX-2 chúng tôi xác định được 2 4 biến

đổi dang G>A làm thay đổi axitamin cũng là dạng biến đổi thường được xác định thấy trên

bệnh nhân UTĐTT người Ý (Venesio và cs, 2013) Đặc biệt nghiên cứu của chúng tôi còn

cho thấy biến đổi C6340T ở dạng không đồng nhất Như vậy, so sánh với kết quả công bố

trên thế giới trên đối tượng bệnh nhân UTĐTT thì kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi

có những điểm mới như biến đổi C6340T, G7853A lần đầu tiên xác định thấy ở bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam, biến đổi C6340T là biến đổi ở dạng không hoàn toàn Ngoài ra

trong nghiên cứu này chúng tôi còn đánh giá được biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 có

liên quan đến giới tính và giai đoạn T của bệnh nhân UTĐTT

Kết lu n

- Chúng tôi đã sàng lọc được 17 biến đổi trên gen COX-1, 13 biến đổi trên gen COX-2 ty thể trong đó có 5 biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-2, 4 biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-1 ở bệnh nhân UTĐTT Tần suất biến đổi C6340T là 3,48%,

G7853A trên mô u và LCU tương ứng là 15,1% và 21,2%

- Đánh giá được mối liên quan giữa biến đổi biến đổi G7853A với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh UTĐTT Biến đổi C6340T, là dạng đột biến sôma và xác định được ở cả dạng đồng nhất và không đồng nhất, là một yếu tố có xu hướng làm tăng nguy cơ gây bệnh Biến đổi G7853A có liên quan với giới tính, giai đoạn T (P<0,05), nhưng không có liên quan với các đặc điểm khác của bệnh UTĐTT như độ tuổi, vị trí khối u, kích thước khối u, mức độ biệt hóa, giai đoạn bệnh (P>0,05)

TÀI IỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt

1 Tô Thị vân Anh, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Trịnh Hồng Thái, (2015), Biến đổi của gen ND1 ty thể ở bệnh nhân ung thư vú , Tạp chí Sinh học số 37 (1), tr 143-149

2 Trương Thị Huệ, Phạm Minh Huệ, Lê Ngọc Yến, Phạm Thị Vân Anh, Ngô Diễm Ngọc, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở một số bệnh nhân nghi hội chứng cơ não”, Tạp chí Sinh học số 34 (2), tr 246-252

3 Trương Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện và định lượng đột biến A3243G trong hệ gen ty thể ở hội chứng MELAS”, Tạp chí Công nghệ sinh học số 10 (3), tr 423-429

4 Lưu Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Tạ Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái (2015), Mất đoạn 4977bp trên ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú , Tạp chí Sinh học số

37 (1), tr 111-116

Tài liệu tiếng Anh và trang web

5 Anna M R., Albert M Julie A Douglas., John A P.(2009), “Sequence Variation in the Mitochondrial Gene Cytochrome c Oxidase Subunit I and Prostate Cancer in African

American Men” Prostate 69(9): pp.956–960

6 Arnold RS., Sun Q., Sun CQ (2013), “An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer altersreactive oxygen, reactive

nitrogen and proliferation”, Biomed Res Int doi: 10.1155/2013/239257

7 Chihara N., Amo T., Tokunaga A., Yuzuriha R., Wolf AM., Asoh S., Suzuki H., Uchida E.,

Ohta S (2011), “Mitochondrial DNA alterations in colorectal cancer cell lines”, J Nippon

stem cells, and mutated clones expand by crypt fission”, Proc Natl Acad Sci U S A 103(3),

pp 714-719

10 Czarnecka AM, Cza.rnecki JS., Kukwa W., Cappello F., Scińska A., Kukwa (2010),“A

Molecular oncology focus - is carcinogenesis a 'mitochondriopathy'?” J Biomed Sci doi:

10.1186/1423-0127-17-31

11 Errichiello E., Balsamo A., Cerni M., Venesio T (2015), “Mitochondrial variants in

MT-CO2 and D-loop instability are involved in MUTYH-associated polyposis”, J Mol Med

(Berl) 93(11), pp.1271-1281

12 Tan DJ., Bai RK., Wong LJ (2002), “Comprehensive scanning of somatic mitochondrial

DNA mutations in breast cancer”, Cancer Res 62(4), pp 972-976

13 Venesio T, Balsamo A, Errichiello E, et al (2013), “Oxidative DNA damage drives carcinogenesis in MUTYH-associated-polyposis by specific mutations of mitochondrial and

MAPK genes”, Mod pathol , 2013 (26), pp 1371-1381

14 http://www.mitomap.org A human mitochondrial genome database (2016)

15 http://globocan.iarc.fr/Default.aspx (2016)

16 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4512)

5 Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết lu n

Chúng tôi đã đạt được các m c tiêu và hoàn thành yêu cầu về sản phẩm của đề tài C

thể, chúng tôi đã sàng lọc thấy 4/17 biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-1, 5/13 biến đổi làm thay đổi axit amin trên gen COX-2 ty thể Biến đổi C6340T thuộc gen COX-1

là dạng đột biến sôma và xác định được ở cả dạng đồng nhất và không đồng nhất, là một

yếu tố làm tăng nguy cơ gây bệnh Biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 có liên quan với giới

tính và giai đoạn T (P<0,05), nhưng không có liên quan với các đặc điểm khác của bệnh UTĐTT như độ tuổi, vị trí khối u, mức độ biệt hóa, giai đoạn bệnh (P>0,05) Như vậy,

nghiên cứu này đã cung cấp thông tin về một số biến đổi thuộc gen COX-1 và COX-2 ty thể

ở bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam Đồng thời kết quả nghiên cứu cũng đánh giá được mối liên quan giữa biến đổi G7853A với một số đặc điểm bệnh học lâm sàng của bệnh UTĐTT ở Việt Nam Đặc biệt, biến đổi G7853A có liên quan đến giai đoạn T của bệnh

T m t t kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

T m t t kết quả bằng tiếng Việt

Nghiên cứu được thực hiện nhằm sàng lọc các biến đổi (đột biến, đa hình) trên hai gen

O -1 v O -2 ty thể ở mẫu mô của một nhóm bệnh nhân UTĐTT, xác định được mối

liên quan giữa một số dạng biến đổi của gen COX-1 và COX-2 với các đặc điểm bệnh học

lâm sàng ở nhóm mẫu nghiên cứu Sử d ng phương pháp giải trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR và PCR-RFLP, chúng tôi đã sàng lọc thấy 4 17 biến đổi làm thay đổi axit amin

thuộc gen COX-1, 5/13 biến đổi làm thay đổi axit amin thuộc gen COX-2 ty thể Biến đổi G7853A thuộc gen COX-2 ty thể ở mô u và mô LCU với tần suất tương ứng là 15,1 và

21,2%, là dạng đột biến sôma và có liên quan với giới tính, giai đoạn T (P<0,05), nhưng không liên quan đến các đặc điểm bệnh học khác như kích thước u, vị trí u, mức độ biệt hóa,

giai đoạn bệnh và độ tuổi (P>0,05) Biến đổi C6340T thuộc gen COX-1 xác định được ở cả

dạng đồng nhất và không đồng nhất với tần suất là 3,48% Hai biến đổi C6340T và G7853A không liên quan r rệt đến bệnh UTĐTT, nhưng có xu hướng làm tăng nguy cơ gây bệnh đối với những người mang hai biến đổi này

T m t t kết quả bằng tiếng Anh

The aims of this study are to screen alterations of mitochondrial COX-1 gene (mtCOX-1 gene) and mitochondrial COX-2 gene (mtCOX-2 gene) in a group of colorectal cancer patients

in Vietnam and then determined the association between these alterations and some pathological characteristics of colorectal cancer We used PCR-RFLP combining with DNA

directly sequencing method in order to determine alterations 17 alterations of mtCOX-1 gene

were detected by using DNA sequencing method Four detected alterations including C6340T

were involved in amino acid substitutions 13 alterations of COX-2 gene were detected in

which, five alterations result in substitution of amino acid Frequences of G7853A alteration

in tumor tissue and adjacent tumor tissue were 15,1 and 21,2%, respectively The G7853A was shown to be a somatic mutation This alteration was significantly associated with gender and T stage (P<0,05), but not with some other pathological characteristics including the age, tumor size, tumor location, cell differentiation and TNM stage (P>0,05) Percentage of samples carrying C6340T in CRC tissues group was 3,48% and this alteration was detected in both homoplasmy and heteroplasmy in tissue samples and was shown to be a somatic mutation too Overall, the study demonstrated a lack of association between G7853A and C6340T alterations and CRC susceptibility However, a tendency to increase risk of CRC was

in patients harbouring the G7853A and C6340Talterations

PHẦN III SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Kết quả nghiên cứu

TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thu t

2 Đào tạo Hỗ trợ đào tạo 01 tiến sĩ - 01 NCS là chủ nhiệm đề tài

3 Quy trình Quy trình kỹ thuật phân tích

đa hình di truyền của gen

COX-1 và COX-2 trên bệnh

nhân ung thư đại trực tràng

Đã hoàn thiện

4 Bộ dẫn liệu Dẫn liệu liên quan giữa đa

hình gen COX-1 và COX-2

ty thể với bệnh ung thư đại

trực tràng

Đã hoàn thiện

Đánh giá chung

(Đạt, không đạt)

1 Công trình công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI Scopus

2 Sách chuyên khảo được xuất bản hoặc ký hợp đồng xuất bản

3 Đăng ký sở hữu trí tuệ

4 Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI Scopus

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc

gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

5.1 1 Phạm Thị Bích, Nguyễn Thị Tươi, Trịnh

Hồng Thái (2016), Biến đổi trên gen COX-2

ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng ",

Tạp í Sin lý ọ Vi t N m, 20(4), tr 40-47

5.2 Phạm Thị Bích, Lê Thị Quỳnh Thơ, Trịnh

Hồng Thái (2016), "Biến đổi trên gen COX-1

ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng" Tạp

í K o ọ ĐHQGHN: K o ọ Y Dượ ,

Tập 32, Số 2 (2016), tr.17-25

6 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng của đơn vị sử d ng

7 Kết quả dự kiến được ứng d ng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở ứng

d ng KH&CN

3.3 Kết quả đào tạo

cơ sở số

4684 ĐHKHTN

QĐ-Cử nhân

1 Lê Thị Quỳnh Thơ 12 tháng Quyết định tên luận văn cao học

Đồng tác giả 01 bài báo

Quyết định tên

đề tài số

8983 ĐHKHTN

QĐ-2 Nguyễn Thị Tươi 12 tháng Khóa luận tốt nghiệp,

Đồng tác giả 01 bài báo

2016