Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu việt nam (tt)

Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

BÙI VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU VIỆT NAM

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 9440117

Hà Nội – 2018

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Bùi Minh Lý

Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 là một trong những biển quan trọng nhất của thế giới, có nguồn rong biển đa dạng và phong phú Trên thế giới có khoảng 6.000 loài rong biển đã được xác định và chia làm 03 ngành rong chính dựa

trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) và rong đỏ (Rhodophytes) Rong

biển có vai trò quan trọng trong nguồn lợi sinh vật biển, càng ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp Theo các kết quả nghiên cứu thì hiện

nay Việt Nam đã phát hiện gần 1000 loài rong biển, trong đó có khoảng 143 loài rong nâu (Phaeophyta) là

nhóm rong có kích thước cá thể rất lớn và dài cùng với sinh lượng lớn Do vậy, rong nâu được coi là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá của hiện tại và trong tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu,

thực phẩm chức năng và mỹ phẩm Trong các ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu được sử dụng

làm nguồn nguyên liệu chính để chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran, alginate và hợp chất khác như phlorotannin, mannitol,… với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [1-6]

Trong số các polysaccharide từ rong nâu, fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do

có nhiều hoạt tính sinh học quý như chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể cả HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, các đặc tính chống bổ thể, chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật,… [6] Fucoidan là sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng của các liên kết glycoside cũng như nhiều gốc đường đơn khác nhau liên kết với nhau và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate cũng như các nhánh khác được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường là bao gồm chủ yếu fucose và sulfate cùng một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose , đôi khi còn có axít uronic [6,7]

Nhờ vào sự đa dạng cấu trúc hóa học và sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) đã được nghiên cứu mạnh và sâu Việc giải thích làm sáng rõ chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là hết sức phức tạp, fucoidan được tách ra từ rong nâu thường là hỗn hợp của nhiều cấu trúc sulfated polysaccharides khác nhau Fucoidan thông thường là có cấu trúc phân nhánh và chứa nhiều monosaccharide khác nhau cũng như có nhóm sulfate và axtate [7,8] Fucoidan từ rong nâu thuộc chi

Sargassum, Hormophysa và Turbinaria có cấu trúc hóa học phức tạp [9,10] nhưng lại rất hấp dẫn về hoạt

tính cũng như ứng dụng của chúng và sẵn có trong tự nhiên Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan [10,11,12] như liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh, vị trí các gốc sulfate, các phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn các công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học được tiến hành trên các sản phẩm fucoidan thô Vì vậy, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [12,13,14] Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu thì việc xác định chính xác cấu trúc hóa học của fucoidan là điều quyết định đầu tiên và đang thu hút sự chú ý của

nhiều nhà khoa học trên thế giới Chính vì vậy tôi chọn tên đề tài luận án là “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc

và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam”

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là:

Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu trên của luận án, các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

Nghiên cứu sàng lọc một số loài rong nâu để chọn ra các đối tượng nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan

Nghiên cứu sâu về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của các fucoidan chiết xuất từ một số loài rong nâu chọn lọc

Khảo sát mối quan hệ giữa các đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của một số fucoidan chọn lọc

Bố cục của luận án: Luận án gồm 175 trang: Mở đầu 3 trang, Chương 1 Tổng quan 45 trang, Chương 2 Đối

tượng và phương pháp nhiên cứu 21 trang, Chương 3 Thực nghiệm 15 trang, Chương 4 Kết quả và thảo luận

79 trang, Kết luận và kiến nghị 4 trang, Danh mục các công trình đã công bố 2 trang, Tài liệu tham khảo 12 trang, có 31 bảng biểu và 64 hình ảnh

Chương 1 TỔNG QUAN

Rong biển hay còn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn [1,4] Tổng số loài rong biển trên thế giới được

báo cáo chủ yếu thuộc 3 ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và hiện nay đã có nhiều công

trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới

Fucoidan là một sulfated polysaccharide phân lập từ rong nâu lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [23] Theo danh pháp carbohydrate, vì các polysaccharide được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan Sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu và động vật trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai (echinoderms), cụ thể là cầu gai và hải sâm [10] Nhưng ngược lại, cấu trúc của các sulfated polysaccharide từ rong nâu phức tạp hơn nhiều trong thành phần Ngoài fucose và sulfate, chúng còn có thể chứa thêm các monosaccharide khác như: galactose, xylose, manose, axít glucuronic,… đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần Cấu trúc hóa học chi tiết của các polymer sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến Sulfated polysaccharide (Fucoidan) là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng và đặc thù của chúng như: kháng đông tụ, kháng huyết khối, kháng virut, kháng dính, kháng tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, ngừa thai [6] Vì vậy, mà fucoidan trở thành một nguồn tiềm năng cho các ứng dụng làm thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu, và số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng 10 năm trở lại đây [25]

Khi nghiên cứu tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước chúng tôi rút ra kết luận sau: Các nghiên cứu về hàm lượng, thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan tách chiết và phân lập

từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum và Sargassum

binderi, chưa được nghiên cứu đầy đủ và hệ thống Về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính của fucoidan từ hai

loài rong nâu nghiên cứu trong luận án Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens chưa được nghiên cứu ở trong và ngoài nước Cấu tạo hóa học của fucoidan từ 6 loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp),

Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii

(Fsw) và Tubinaria ornata (Fto), đã được nghiên cứu ở các công trình trước, tuy nhiên chưa có nghiên cứu

nào nói về mối quan hệ giữa cấu tạo mạch nhánh của fucoidan với hoạt tính gây độc tế bào Vì vậy chúng tôi

sẽ nghiên cứu mối quan hệ giữa hình dạng, kích thước với hoạt tính sinh học của fucoidan nhánh từ 6 loài

Fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium (FSA) và Turbinaria decurrens (FTD), các

fucoidan này dùng để nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của luận án Hai loài rong nâu này là đối tượng chính của luận án

Fucoidan từ 6 loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum

oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) và Tubinaria ornata (Fto), các

fucoidan này đã được nghiên cứu cấu trúc, dùng để nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học

Fucoidan từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum

và Sargassum binderi, là đối tượng nghiên cứu về thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của fucoidan

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng là: Chiết tách các fucoidan từ rong nâu bằng các phương pháp chiết tách thông thường, tham khảo các công bố trên thế giới phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của luận án

Các phương pháp chính để xác định thành phần và cấu trúc của các fucoidan là kết hợp các phương pháp sắc ký, phương pháp hóa học, phổ hiện đại (IR, NMR, MS, SAXS) và các phép thử hoạt tính sinh học

Xác định cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường Cấu trúc của fucoidan chiết từ rong nâu thường hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh và polymer hóa của chúng Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải phân tích, xác định được các thông số sau: Thành phần các gốc đường và hàm lượng sulfate, vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường, vị trí liên kết giữa các gốc đường, trật tự sắp xếp của các gốc đường

Chương 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Thu thập và xử lý rong

Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam Thời gian thu mẫu rong nâu vào tháng 5 năm 2014 Các mẫu rong nâu được phân loại bởi TS Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang), tất cả các tiêu bản được lưu giữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Rong nâu được thu hoạch, rửa sạch bằng nước biển để loại bỏ cát, đất, các chất bẩn khác,…Sau khi thu hoạch tiếp tục được phơi khô tự nhiên Mẫu rong sau khi phơi khô được cắt nhỏ trước khi đem tách chiết fucoidan

3.2 Chiết tách và phân lập fucoidan từ rong nâu

Hình 3.3 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium

Hình 3.4 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens

Hình 3.5 Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan rừ các loài rong nâu S.polycystum (Fsp), S.mcclurei (Fsm),

S.oligocystum (Fso), S.denticarpum (Fsd), S.swatzii (Fsw) và T.ornata (Fto)

Hình 3.6 Qui trình chiết theo Bản quyền của Nga (Patent WO 2005/014657) [109]

3.3 Xác định thành phần và cấu trúc của fucoidan

3.3.1 Xác định hàm lượng tổng carbohydrate

3.3.2 Xác định thành phần monosaccharide

3.3.3 Xác định hàm lượng sulfate

3.3.4 Phương pháp khử sulfate

3.3.5 Xác định hàm lượng axít uronic

3.3.6 Phân tích liên kết bằng methyl hóa

3.3.7 Thủy phân tạo oligosaccharide

3.3.8 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

3.3.9 Phổ IR

3.3.10 Phổ NMR

3.3.11 Phổ ESI-MS/MS

3.3.12 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)

3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan

Chúng tôi sử dụng quy trình chiết tách fucoidan của Bilan và cộng sự [87] để nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan

4.2 Hàm lượng fucoidan và một số polysaccharide tan trong nước của 06 loài rong nâu sinh trưởng ở

biển Nha Trang, thành phần hóa học của các fucoidan thu được

Trong nội dung nghiên cứu này, 06 loài rong nâu sinh trưởng ở vịnh Nha Trang được khảo sát về các thành phần polysaccharide tan trong nước, bao gồm fucoidan, laminaran và alginat Hàm lượng fucoidan được xác định bằng cách phân lập trực tiếp theo phương pháp của Bilan và cs Hàm lượng laminaran và alginat được xác định bằng tách chiết thông thường trong quy trình tách fucoidan

Kết quả phân tích cho thấy:

 Fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 9.2 - 62.9% trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó hàm lượng

fucose cao nhất là fucoidan chiết từ rong Turbinaria decurrens (62.9%) và thấp nhất là fucoidan chiết từ rong Sargassum aquifolium (9,2%)

 Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi Sargassum chiếm tỉ lệ tương đối cao chỉ đứng sau hàm lượng fucose Trong khi đó, các mẫu fucoidan chiết từ Turbinaria decurrens có hàm lượng galactose gần bằng một nửa so với fucose

 Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của các loài rong nghiên cứu đều có thêm các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ hơn là mannose, xylose và glucose

 Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong khác nhau, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố

trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan [6,20]

 Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate và các axít uronic Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 4.2), dao động trong

khoảng 21.9-25.6% so với lượng mẫu phân tích, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong Sargassum

binderi (25.6%) và nhỏ nhất là fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum (21.9%)

Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong khác nhau,

thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brasil cũng có thành phần rất khác

nhau Nhìn chung fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác Trong khi đó fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose, Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trường có

ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu

4.3 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai loài rong nâu S binderi và S duplicatum

Trong nội dung này, chúng tôi nghiên cứu sơ bộ một số đặc điểm cấu trúc của các fucoidan từ hai

loài rong nâu Sargassum binderi và S duplicatum Quá 4.trình chiết tách, hiệu suất phân lập và các thành

phần cấu tạo của các fucoidan tổng của hai loài rong nâu này được trình bày trong nội dung 4.2 của luận án Các kết quả được trình bày trên Bảng 4.1 và Bảng 2

4.3.1 Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum binderi

Tách phân đoạn fucoidan tổng FSB của rong nâu Sargassum binderi trên cột sắc ký trao đổi anion

DEAE-cellulose rửa giải lần lượt với các dung dịch muối NaCl 0.5M, 1M, 1.5M và 2.0M cho 04

Như vậy, các phân đoạn fucoidan của rong nâu Sargassum binderi với thành phần đường chính là

fucose và galactose cùng một lượng lớn sulfat được gọi là các galactofucan sulfat hóa Trong khi đó fucoidan

của một số loài rong nâu khác thuộc cùng bộ Fucales sống ở vùng ôn đới như Fucus evanescens, Fucus

vesiculosus trong thành phần của chúng chỉ chứa fucose và sulfat được gọi là các fucan sulfat hóa [68,35]

Phổ 13C-NMR của phân đoạn F2 tách từ rong nâu Sargassum binderi được trình bày trên Hình 4.4

Phổ có nhiều tín hiệu mạnh ở vùng anomeric (99.7 - 103.18 ppm) và ở vùng từ trường cao (15.40 ppm và 16.16 ppm) là tín hiệu điển hình của gốc α-L-fucopyranoside Các tín hiệu trong vùng 67 -84 ppm là của các nguyên tử C2 - C5 của vòng pyranoid Các tín hiệu ở 61.5 ppm ứng với nhóm CH2OH của gốc β-D-galactopyranose và tín hiệu ở 65.0 ppm là của nhóm CH2OR được cho là của gốc O-6-β-D-galactopyranose

Một số tín hiệu mạnh ở 173.7 - 174.6 ppm và 20.92 ppm khẳng định sự hiện diện của nhóm O-acetyl

Phổ 1H-NMR của F2 bao gồm một vài tín hiệu mạnh trong vùng α-anomeric (5.09 - 5.23 ppm) và vùng

trường cao (1-1.5 ppm) Trong khi đó tín hiệu trong vùng 2.0 - 2.2 ppm xác định sự hiện diện của nhóm

O-acetyl

Cấu trúc của fucoidan tách từ rong nâu Sargassum binderi của Malaysia đã được nghiên cứu và công

bố vào năm 2016 [84]

4.3.2 Nội dung và kết quả nghiên cứu loài Sargassum duplicatum

Kết quả xác định thành phần hóa học (Bảng 4.4.) cho thấy 2 phân đoạn SDAuF1 và SDAuF2 đều có đường fucose và galactose là các thành phần đường trung tính chính Fucose của phân đoạn SDAuF2 cao hơn (59,5 %) phân đoạn SDAuF1 (40 %), phân đoạn SDAuF2 không có sự xuất hiện của đường mannose

Cả 2 phân đoạn không có sự xuất hiện đường glucose, phân đoạn SDAuF2 hàm lượng xylose chỉ chiếm một lượng nhỏ

Fucoidan tổng FSDu được phân lập từ rong nâu S duplicatum với hiệu suất 2,28% theo phươn pháp

của Bilan và cs Trên phổ hồng ngoại IR chỉ ra ở hình 4.6 của FSDu xuất hiện tín hiệu hấp thụ ở 1.244 cm-1 (vùng dao động đặc trưng của liên kết S=O) Vùng tín hiệu đặc trưng cho liên kết C – O – S ở 800-845 cm-1

không được thể hiện rõ

Giống như nhiều fucoidan chiết xuất từ rong nâu khác trên thế giới, fucoidan FSDu từ rong nâu S

duplicatum cũng có phổ 1H-NMR rất phức tạp do có rất nhiều pic chồng chất lên nhau (Hình 4.7.) Tuy nhiên trên phổ 1H-NMR cũng có những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng giúp cho việc nhận biết fucoidan Đó là các tín hiệu xuất hiện trong vùng proton anomer (5,0 – 5,5 pm) và các tín hiệu ở vùng trường cao (1,2 - 1,5 ppm) của nhóm CH3 của vòng α-L-Fucopyranose

Trên phổ 1H-NMR của fucoidan từ rong nâu S duplicatum cũng xuất hiện những tín hiệu đặc trưng

giúp ta nhận biết fucoidan Đó là các tín hiệu ở vùng 1,2 - 1,4 ppm (nhóm methyl của fucose) và 5,1-5,3 ppm

(H-anomer của gốc →3)-α-L-Fucp(1) Các tín hiệu ở 5,3 ppm và 3,5 ppm đặc trưng cho H-1 và H-6 của

gốc β-D-galactose Ngoài ra tín hiệu ở 2,1 - 2,3 ppm còn xác nhận sự có mặt của nhóm O-acetyl trong phân

tử của fucoidan này

Trong một công trình nghiên cứu độc lập với luận án này, cấu trúc chính xác của fucoidan FSDu đã được xác định bới Usoltseva và cộng sự thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nga ở Viễn đông [113] Theo đó fucoidan này là một galactofucan sulfat hóa và acetyl hóa FSDu có cấu trúc phân nhánh rất phức tạp làm cho các phổ NMR của nó rất khó giải thích Mạch chính của nó được cấu tạo chủ yếu bởi các gốc 4)-α-L-Fuc-(1 và β-D-Gal luân phiên liên kết với nhau Mạch nhánh liên kết với O-6 của galactose và cấu tạo bởi các gốc fucose có liên kết mạch ở O-3 và có các nhóm thế sulfat ở các vị trí O-2 và O-4 Mạch nhánh có đến

5 gốc đường hoặc có thể nhiều hơn nữa

Kết luận chung cho các nội dung nghiên cứu 4.2 và 4.3 nhằm lựa chọn đối tượng rong nâu để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính:

 Kết quả phân tích fucoidan và các thành phần polysaccharid tan trong nước khác chỉ ra rằng fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của fucoidan vô cùng phức tạp Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong trên đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfat cao, hai đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfat hóa Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan

sulfat hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi rút, [95]

 Các fucoidan tách chiết và phân lập từ các loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum,

Sargassum denticarpum và Sargassum binderi là các fucogalactan sulfat hóa chứa nhóm este sulfat và

nhóm axít uronic, cùng các thành phần đường chính là fucose và galactose, với một lượng nhỏ các đường

đơn mannose, xylose và glucose Cấu trúc của các fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum duplicatum

và Sargassum binderi đã được nghiên cứu kỹ lưỡng [84,113]

 Sau khi nghiên cứu thành phần hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu chúng tôi chọn các đại

diện của mỗi chi Sargassum, Turbinaria mỗi loài đại diện để nghiên cứu sâu về cấu trúc và hoạt tính sinh học Các loài đó bao gồm Sargassum aquifolium và Turbinaria decurrens Các loài này cũng là loài rong

nâu tương đối phổ biến ở biển Việt Nam nói chung và vịnh Nha Trang nói riêng

 Đại diện cho chi rong nâu Turbinaria chúng tôi chọn loài rong nâu Turbinaria decurrens vì loài này

chưa có nhà khoa học nào nghiên cứu ra cấu trúc hoàn thiện của chúng

 Đại diện cho chi Sargassum chúng tôi chọn loài rong nâu Sargassum aquifolium vì loài rong nâu này

chưa từng được nghiên cứu ở Việt Nam cũng như trên thế giới Mặt khác fucoidan này có thêm một thành phần cấu tạo là axít uronic Điều này hứa hẹn khả năng tìm ra một dạng cấu trúc fucoidan có tính

mới cao

4.4 Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum

aquifolium

4.4.1 Chiết xuất và làm sạch fucoidan

Tương tự như các fucoidan khác, FSA là một hỗn hợp của nhiều polysaccharid anionic khác nhau về thành phần cấu tạo và mật độ điện tích, vì thế chúng có thể được tách ra thành các phân đoạn có tính chất đồng nhất hơn bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion Cụ thể FSA đã được tách thành các phân đoạn có hàm lượng sulfate tăng dần trên cột sắc ký trao đổi anion như sau:

 FSA là một hỗn hợp không đồng nhất của các polysaccharide có các đặc trưng về thành phần cấu tạo khác nhau

 Hàm lượng sulfat của các phân đoạn tăng dần lên cùng với nồng độ của dung dịch muối rửa giải, trong khi hàm lượng của axít uronic giảm dần đi

 Phân đoạn FSA-0.5M (4,7% tính theo FSA) có hàm lượng axít uronic và glucose cao có thể được giải

thích bởi sự hiện diện của các tạp chất trong mẫu là alginat và laminaran

 Phân đoạn chính là FSA-1.0M (21,9% tính theo FSA) có các thành phần đường đơn đặc biệt phức tạp

với sự có mặt đáng kể của fucose, galactose, xylose và mannose, ngoài ra còn thêm lượng lớn các nhóm sulfat và axit uronic

 Phân đoạn FSA-1.5M (9,8% tính theo FSA) cấu tạo chủ yếu từ các thành phần chính là fucose, galactose

và sulfat Các thành phần khác chỉ có hàm lượng nhỏ

 Phân đoạn FSA-2M (2,3% tính theo FSA) có thành phần cấu tạo đơn giản nhất, gần như chỉ gồm fucose,

galactose và sulfat Tuy nhiên hàm lượng của nó trong FSA lại quá nhỏ

4.4.2 Xác định cấu trúc của fucoidan

4.4.2.1 Tách loại các nhóm sulfat (Desulfation)

Kết quả xác định thành phần của các sản phẩm (Bảng 4.6) cho thấy 1,0M-deS tuy còn chứa một lượng vết sulfat, các thành phần đường đơn của nó đã tăng lên như mong đợi, tuy nhiên hàm lượng tương đối của fucose lại giảm đi rõ rệt Nguyên nhân có thể là do đã xảy ra phản ứng chia cắt một phần các liên kết glycosid yếu của fucose

Bảng 4.6 Thành phần (%) của các fucoidan tách loại sulfat 1,0M-deS và 1,5M-deS so sánh với fucoidan

mẹ của chúng (FSA-1,0M và FSA-1,5M)

Fucoidan H% Fuc Xyl Man Glc Gal Axít Uronic SO3Na

4.4.2.2 Phổ NMR của FSA và các phân đoạn sắc ký anion của FSA

Phổ NMR cung cấp các thông tin quí giá về cấu trúc của các polysaccharid, nhưng việc áp dụng các phương pháp của CHTHN trên các fucoidan chiết xuất từ tảo biển bị hạn chế bởi sự đa dạng của các thành phần phân tử của chúng [7] Thực tế chỉ có một số rất ít công bố về kết quả giải trực tiếp cấu trúc của fucoidan tự nhiên chưa bị biến đổi bằng các kỹ thuật NMR [31] Cách tiếp cận thực tế hơn là kết hợp các phép phân tích CHTHN và hóa học để xác định các yếu tố cấu trúc của cả polysaccharid tự nhiên và polysaccharid đã tách loại sulfat

Riêng trong trường hợp FSA và các phân đoạn sắc ký trao đổi anion của nó, các phổ NMR quá phức tạp (Hình 4.11, 4.12, 4.13 và phụ lục), không thể sử dụng trực tiếp để giải cấu trúc được Ngay cả phân đoạn

FSA-2.0M (một galactofucan sulfat hóa) có thành phần đơn giản nhất, phổ 13C-NMR của nó cũng chỉ ra tối thiểu là sáu tín hiệu trong vùng C-anomer 105-95 ppm cũng như cùng một số lượng các tín hiệu C-methyl của các gốc fucose trong vùng 20-17 ppm (Hình 4.11) Kết hợp với việc các tín hiệu ứng với các nhóm

CH2OH tự do của galactose vắng mặt, các dữ kiện này cho thấy FSA-2.0M có cấu trúc phân nhánh không

có qui luật, mức độ phân nhánh rất cao, các nhóm sulfat gắn với nhiều vị trí khác nhau, các đường đơn gắn kết với nhau theo nhiều kiểu khác nhau

Phù hợp với dự đoán từ thành phần cấu tạo đa dạng, phổ 13C-NMR của phân đoạn FSA-1.5M còn

phức tạp hơn (Hình 4.12) Cụ thể trên phổ xuất hiện nhiều tín hiệu hơn ở vùng C-anomer Một số tín hiệu xuất hiện trong vùng CH2OH không thế ở 63-61 ppm

Trên phổ NMR của phân đoạn FSA-1.0M (Hình 4.13) xuất hiện cụm tín hiệu ở vùng 17 ppm ứng

với nhóm methyl của các gốc fucose Tại vùng C-anomer (110 - 95 ppm) xuất hiện rất nhiều tín hiệu với cường độ gần tương đương nhau chứng tỏ sự có mặt của nhiều loại đường cũng như của nhiều kiểu liên kết glycosid trong mẫu nghiên cứu Trong phổ cũng xuất hiện tín hiệu của nhóm CH2OH của galatose không thế trong vùng 63-61 ppm và của nhóm cacboxyl của axit uronic tại 175,6 ppm

Phổ 1H-NMR của FSA và của tất cả các phân đoạn sắc ký đều không tách bạch, vì thế không thể áp dụng kỹ thuật HMBC để gán đặc điểm cấu trúc cho các tín hiệu

4.4.2.3 Phân tích liên kết bằng methyl hóa (Methylation analysis)

Kết quả phân tích cho thấy có 3 dẫn xuất của xylose, 9 dẫn xuất của fucose và 16 dẫn xuất của hexose (manose và galactose) đã được phát hiện Thành phần của chúng trong các đối tượng nghiên cứu được trình bày trên Bảng 4.7

Bảng 4.7 Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa

FSA-mol%

1.5MdeS, mol%

 Có khá nhiều fucitol methyl hóa có nguồn gốc từ các gốc fucofuranose Đây là điểm đặc biệt vì trước

đây chỉ có một trường hợp tìm thấy sự có mặt một lượng đáng kể của fucofuranose trong loài Chordaria

flagelliformis [8]

 Các polysaccharid sulfat hóa bao gồm chủ yếu các gốc fucose thế hai, thậm chí đến ba lần Như vậy, khi nằm trong chuỗi mạch thẳng chúng sẽ phải gắn với một nhóm sulfat hoặc một mạch nhánh

 Các mẫu tách loại sulfat chứa nhiều gốc fucose đầu mạch không khử (terminal nonreducing residues)

Có khả năng là chúng liên kết với các đường đơn khác loại nằm trên mạch chính

 Hàm lượng mannose trong 1,5M-deS là không đáng kể Vì vậy tất cả các hexitol methyl hóa bắt nguồn

từ các gốc galactose Phần lớn các gốc này có gắn kết ở C-4 và C-6

 Phân đoạn fucoidan mẹ FSA-1,5M có một ít gốc galactose chỉ có gắn kết ở C-6, nhưng hầu hết số còn lại

có thêm các nhóm thế khác, có khả năng là fucose hoặc sulfat

 Phân đoạn 1,0M-deS có hàm lượng mannose và galactose không khác nhau nhiều Điều đó làm cho việc phân tích các dữ kiện methyl hóa của FSA-1,0M và 1,0M-deS trở nên phức tạp vì các dẫn xuất methyl hóa của hai hexose này không thể phân biệt được bằng phương pháp phổ khối lượng