Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá cẩm (Peristrophe bivalvis)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá cẩm Peristrophe bivalvis”.. Cây cẩm thuộ

LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH, khoa SINH - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà

Nội 2, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin gửi lời tri ân đến Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh-KTNN, Cán bộ phòng Thí nghiệm Sinh lý học Thực vật khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2, cùng các bạn trong nhóm đề tài Sinh lý học Thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình , bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và đóng góp ý kiến trong quá trình tôi học tập và hoàn thành khóa luận

Tôi xin trân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Người thực hiện

Ngô Ngọc Sơn

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá cẩm

(Peristrophe bivalvis)” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do PGS TS

Nguyễn Văn Đính hướng dẫn Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và không trùng lặp với kết quả và nghiên cứu của người khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Người thực hiện

Ngô Ngọc Sơn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Điểm mới, sáng tạo của đề tài 2

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

5 Phạm vi nghiên cứu 2

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Giới thiệu về cây cẩm tím 3

1.1 Đặc điểm, phân loại cây cẩm tím 3

1.2 Đặc điểm thực vật học 3

1.3 Một số kỹ thuật tách chiết màu từ lá cẩm 4

1.4 Một số ứng dụng và đặc tính của dịch chiết lá cẩm 5

1.5 Hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào ung thư của cây cẩm 6

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 8

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 8

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 8

2.3 Phương pháp nghiên cứu 9

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về hình thái, giải phẫu thực vật 9

2.3.2 Phương pháp thực nghiệm thu nhận sắc tố từ thân và lá cây cẩm tím 9

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 9

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính qu t gốc tự do DPPH 11

2.3.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 12

CHƯƠNG 3 :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

3.1 Đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây cẩm tím 14

3.2 Thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa, gây độc dòng tế bào ung thƣ 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu hình thái, giải phẫu thân, cuống lá và phiến lá cây cẩm tím 14 Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc hoạt tính quét gốc tự do DPPH của mẫu 19 Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan người Hep 3B và ung thư phổi người A549 của mẫu 20

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của cây cẩm tím 15

Hình 3.2 Đặc điểm giải phẫu của thân, cuống lá và phiến lá của cây 16

cẩm tím 16 Hình 3.3 Tách chiết, thu nhận và chứng minh đặc tính của cặn sắc tố từ cây cẩm tím 17 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình thu nhận chất nhuộm màu từ thân và lá cây cẩm tím 18

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiều loại địa hình nên

có nguồn thực vật đa dạng, trong đó có nhiều loại cây dùng cho chất màu để nhuộm thực phẩm: bánh, xôi, nước giải khát, rượu

Cây cẩm thuộc chi Peristrophe đã được người dân sử dụng để nhuộm

màu thực phẩm từ lâu, gần đây có một số nghiên cứu trên cây này đã được tiến hành nhưng kết quả mới chỉ dừng lại bước đầu.Trong nghiên cứu này, cây cẩm tím được thu phường Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc có các đặc điểm về hình thái và giải phẫu tương tự như mô tả của tác giả Đỗ Thị Xuyến và Nguyễn Thị Phương Thảo (2007) [7]

Ngày nay xã hội càng phát triển thì nhu cầu về thực phẩm càng gia tăng, sự gia tăng thể hiện ở cả chất và lượng của thức ăn Sự ra đời của các chất nhuộm màu nhân tạo đã tạo ra những thay đổi cho ngành công nghệ thực phẩm Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu, các chất nhuộm màu tổng hợp có gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của con người Các chất nhuộm màu có nguồn gốc tự nhiên đã được con người tìm kiếm và khai thác để thay thế chất nhuộm màu tổng hợp

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm thực vật, thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cây lá

cẩm (Peristrophe bivalvis)”

2

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng và hoàn chỉnh một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và thu nhận cặn sắc tố tự nhiên từ cây cẩm tím

3 Điểm mới, sáng tạo của đề tài

Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng quy trình thu nhận sản phẩm

là chất nhuộm màu (sắc tố) từ thân và lá cây cẩm tím được thu tại phường Xuân Hòa, thị xã Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Mô tả một số đặc điểm sinh học của cây cẩm tím

- Thu nhận sắc tố từ thân và lá cây cẩm tím

- Đánh giá hoạt tính sinh học của cặn sắc tố từ cây cẩm tím

5 Phạm vi nghiên cứu

Các thí nghiệm về đặc điểm hình thái, giải phẫu và thu nhận cặn sắc tố tự

nhiên từ cây cẩm tím được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học Thực vật, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và tại Viện Hóa Sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Ý nghĩa khoa học: Hoàn thiện một số đặc điểm hình thái, giải phẫu và thu nhận cặn sắc tố tự nhiên từ cây cẩm tím

Ý nghĩa thực tiễn: Tạo chất nhuộm màu có nguồn gốc tự nhiên không ảnh hưởng đến sức khỏe con người thay thế chất nhuộm màu tổng hợp

3

NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giới thiệu về cây cẩm tím

1.1 Đặc điểm, phân loại cây cẩm tím

Cây cẩm tím là một trong những loài cây thân thảo hàng năm có rất nhiều ứng dụng như dược liệu, chất nhuộm màu thực vật [6] Các loài cây này phân bố rất phổ biến ở nhiều quốc gia như Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam Chúng cũng được tìm thấy

ở dưới những tán rừng có độ cao từ 500-1000 m so với mực nước biển [11] Thuật ngữ thực vật học của các cây này đã có nhiều thay đổi trong thời gian

qua như Justicia bivalvis (1759), Dicliptera bivalvis (L) Juss (1807), Justicia tinctoria Roxb (1820), Peristrophe tinctoria (Roxb) Ness (1832), Peristrophe roxbughiana (Schult.) Bremek (1955), Peristrophe baphica

(Spreng) Bremek (1957) [6], [17]

Theo điều tra, loài này gồm 4 dạng (Cẩm đỏ; 02 dạng Cẩm tím; 1 dạng cẩm vàng), sự phân chia này dựa trên kết quả điều tra kinh nghiệm của người dân bản địa Theo “Danh lục các loài thực vật Việt Nam” [1], thì chi

Peristrophe Nees có 4 loài, trong đó chỉ có loài Cẩm (P bivalvis (L.) Merr.) ở Bắc Bộ và loài Kim loung nhuộm (P montana (Wall.) Nees) ở Nam Bộ được

coi là cây nhuộm màu

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy dịch chiết từ cây lá cẩm có lợi cho sức khỏe con người [19], [20], [21] Trong suốt thời gian dài, dịch chiết lá cẩm chướng xem như là nguồn chất nhuộm màu tốt đối với thực phẩm ở Việt Nam

và nhiều nước ở Châu Á [14]

1.2 Đặc điểm thực vật học

4

Cây cẩm thuộc chi Peristrophe, họ Acanthaceae Là loài cây thân thảo

mọc phổ biến ở những vùng ẩm ướt Ở nước ta, cây cẩm có nhiều ở Mường Khương (Lào Cai), Mộc Châu (Sơn La) và Thái Nguyên [6]

Loài Peristrophe roxburghiana là cây thân thảo dạng bụi Nó sinh

trưởng nhanh ở những vùng đất trũng ẩm cao Chiều cao của cây có thể đạt từ 30-50 cm Lá cây mọc đối, có hình dạng từ mũi mác (vuốt nhọn ở đầu tận cùng) đến dạng ovan, dài từ 4-9 cm, rộng từ 2-4 cm Lá của nó cũng có vị

ngọt Hoa của chi Peristrophe được miêu tả màu tím hồng, lá bắc dạng lá,

hình trứng, bó chùm nhỏ, dài 2 cm, rộng 10-12 cm, gân lá hình tim, đỉnh lá nhọn, có lông, cuống lá dài 3-4 cm, có 2 lá bắc, hình mũi mác dài 6 mm, rộng 1,5 mm, đài hoa xẻ 5 phần, đài hoa hình mũi mác, dài 4-6 mm, có nhiều lông, tràng hoa hai môi, dạng ống mảnh dài 1,8 cm, có 2 môi [2], [6]

1.3 Một số kỹ thuật tách chiết màu từ lá cẩm

Sắc tố từ lá cẩm được tách chiết bằng nhiều phương pháp khác nhau, phổ biến nhất là ba phương pháp chính:

- Tách chiết có sử dụng sóng siêu âm

- Tách chiết có sử dụng vi sóng

- Tách chiết bằng dung môi

Tác giả Jiang HZ và cộng sự (2011a) là người sử dụng sóng siêu âm để tách chiết chất màu từ cây cẩm và nhận thấy rằng cồn 70%, công suất siêu âm

300 W, nhiệt độ chiết 70oC trong thời gian chiết là 45 phút là tốt nhất, tỷ lệ giữa chất rắn và lỏng thu được là 1:35 [12] Trong khi đó, tác giả Jiang HZ (2011b) sử dụng kỹ thuật sóng siêu ẩm để thu các sắc tố đỏ từ những loài cây cẩm với dung môi là nước và đã tìm thấy điều kiện tách chiết tối ưu là công suất siêu âm 400 W, tỷ lệ giữa pha rắn:lỏng là 1:35, nhiệt độ chiết là 65oC trong thời gian chiết là 35 phút [13] Trong một nghiên cứu khác, tác giả Nguyễn Thị Thanh Hương và Trịnh Thị Thủy (2010) đã dùng nước chiết nóng

đỏ máu có mặt trong nhiều loại vi sinh vật và thực vật chẳng hạn như

Haematococcus pluvialis, Trentepohlia và Euglena cũng như có trong các

loại hồ tiêu đỏ và cây cẩm Các nhóm nghiên cứu của tác giả Niu G và cộng

sự (2006) [15], tác giả Jiang HZ (2011) [12], [13] cũng đã thành công khi tiến hành tách chiết từ cây cẩm bằng cách sử dụng kỹ thuật chiết kết hợp vi sóng Điều kiện tách chiết tốt nhất của phương pháp này là công suất vi sóng

là 320 W, thời gian chiết là 75 giây, tỷ lệ giữa nguyên liệu và dung môi là 1:20 (w/v) Đến nay, kỹ thuật này được xem như phù hợp nhất để tách chiết sắc tố haematochromen nhanh và hiệu quả cao [12], [13]

Trong dân gian, thân và lá cây cẩm tím được người dân thu hái và nấu lấy nước, các sắc tố hòa tan trong nước nấu này được sử dụng để nhuộm gạo nếp cho ra màu tím (theo thông tin phỏng vấn người dân của nhóm nghiên cứu)

1.4 Một số ứng dụng và đặc tính của dịch chiết lá cẩm

Ở nước ta, cây cẩm đã được sử dụng như nguồn chất màu để nhuộm thực phẩm từ rất lâu Các chất màu này qua thời gian được sử dụng rộng rãi trong dân gian đã khẳng định tính an toàn của chúng Tuy nhiên, các sắc tố từ cây cẩm gần đây mới được xem là có tiềm năng thay thế các chất nhuộm màu tổng hợp Trong những năm qua, các nhà khoa học thực phẩm ở Việt Nam và Trung Quốc quan tâm tới việc nghiên cứu thu nhận các sắc tố từ cây cẩm, trong đó nước được sử dụng làm dung môi để chiết sắc tố từ cây cẩm [2]

Nhóm nghiên cứu của tác giả Jiang và cộng sự (2011b) đã thu các sắc

tố đỏ từ cây cẩm bằng kỹ thuật chiết kết hợp sóng siêu âm với dung môi là

Các chất oxi hóa và vitamin C làm cho màu nhuộm từ dịch chiết từ cây cẩm bị mờ đi Sắc tố từ lá cẩm khá bền với nhiệt độ và ánh sáng Một số loại thức ăn được bổ sung axit citric và kali sorbat (dùng trong bảo quản thực phẩm) có ảnh hưởng rất nhỏ đến sự ổn định của sắc tố lá cẩm Các ion kim loại có nhiều trong thức ăn như K+, Na+, Cu2+, Mg2+, Zn2+ và Ca2+ không ảnh hưởng đến sự bền màu của các sắc tố này Ngược lại, các ion như Fe3+

, Al3+

có thể làm mờ màu đỏ của sắc tố từ lá cẩm

Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết từ lá cẩm có khả năng

kháng mạnh hoạt động của vi sinh vật như Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Escherichia coli [16], [20]

1.5 Hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào ung thư của cây cẩm

Các chất chống oxi hoá có vai trò rất quan trọng trong việc vô hiệu hóa các gốc tự do gây suy thoái DNA, tổn thương tế bào và rối loạn thể chất và tinh thần Vì vậy, các chất chống oxi hóa giúp bảo vệ con người chống lại bệnh nhiễm trùng và các bệnh thoái hoá do các gốc oxi tự do gây ra [18] Thực vật có chứa các chất chống oxi hoá tự nhiên Đã có nhiều công bố trước đây cho thấy flavonoid (flavones, flavanones, isoflavones, flavonols, flavanonols, flavan-3-ols, anthocyanins và anthocyanidins) và các hợp chất phenolic (dẫn xuất của axit benzoic như axit gallic, và dẫn xuất của axit cinnamic như coumaric, caffeic và acid ferulic) là những nhóm chính của các

7 chất chống oxi hoá tự nhiên có thể giúp cây trồng chống lại các điều kiện bất lợi (stress) và bệnh tật [8], [10]

8

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

Cây cẩm tím (Peristrophe bivalvis) thu tại phường Xuân Hòa, thị xã

Phúc Yên, tỉnh Vĩnh Phúc và sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm trong nghiên cứu

Hình 2.1 Cây cẩm tím trồng tại vườn thực nghiệm

Thời gian và địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành chính tại Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật (Khoa Sinh-KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2), Phòng thí nghiệm Hóa lý (Khoa Hóa học, trường ĐHSP Hà Nội 2) từ tháng 9-10/2017 và tại Viện Hóa Sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

9

Hóa chất: nghiên cứu sử dụng thuốc nhuộm carmin, dung dịch javen

(NaClO) (Trung Quốc), xanh mêtylen (Trung Quốc), nước cất

Dụng cụ: lam kính, dao cạo, lamen, ống hút, giấy lọc, đĩa petri, đĩa

đồng hồ

Thiết bị: kính lúp soi nổi (Optika), kính hiển vi (Carl Zeiss), tủ sấy

(Memmert), cân kỹ thuật (Satorious), lò vi sóng (LG), tủ lạnh (Toshiba), Thiết

bị cô quay chân không Strike 300 (Steroglass)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về hình thái, giải phẫu thực vật

- Quan sát và mô tả hình thái thực vật thân, lá, hoa,

- Phương pháp làm tiêu bản tạm thời để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu [2]:

+ Chọn mẫu (thân, cuống lá, phiến lá) tươi được cắt ngang thành bản mỏng bằng dao cạo

+ Ngâm nước javen 5 phút để tẩy các chất chứa trong tế bào

+ Rửa bằng axit acetic, sau đó rửa lại bằng nước cất

+ Nhuộm mẫu bằng axeto carmin trong 30 phút rồi đem rửa lại bằng nước

+ Nhuộm mẫu bằng xanh metylen khoảng 10 giây rồi rửa bằng nước cất

+ Đặt mẫu vào 1 giọt nước trên lam kính, đậy lá kính, soi trên kính hiển vi (Optika)

10

Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng viêm [22]

Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrate và nitrite) Phản ứng này đòi hỏi rằng nitrate (NO3) đầu tiên được giảm thành nitrite (NO2), do tác động của nitrate reductase

Nitrite được phát hiện và phân tích bằng cách hình thành một màu hồng

đỏ khi mẫu thử có chứa NO2

với thuốc thử Griess

Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu hồng

Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để đánh giá khả năng sống sót của tế bào [23] Ở các tế bào sống, hệ enzym oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng phân giải MTT thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm Do vậy, tỉ lệ tế bào sống sót được suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT Lượng formazan tạo thành được hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm Khả năng gây độc tế bào của các mẫu thử nghiệm được suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào

Các bước tiến hành:

Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở

37oC, 5% CO2 với 10% FBS, penicillin và streptomycin sulphate (10000µg/mL) Sau đó chúng được nuôi cấy trong giếng phiến 96 với mật độ 2,5 x 105 tế bào/giếng Tế bào được kích thích với LPS trong 24 giờ với sự có