Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu nhân giống vôtínhcây hoa triệu chuông (calibrachoa praviflora) bằng kĩ thuậtnuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN --- HÀ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY HOA TRIỆU CHUÔNG Calibrachoa praviflora BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

HÀ THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY HOA

TRIỆU CHUÔNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG

KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

HÀ THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY HOA

TRIỆU CHUÔNG ( Calibrachoa praviflora ) BẰNG

KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

Người hướng dẫn khoa học

Th.S PHẠM PHƯƠNG THU

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Phương Thu giảng viên Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện

để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của thầy La Việt Hồng và cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

HÀ THỊ LAN ANH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

HÀ THỊ LAN ANH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA: Napthlacetic acid BAP: 6- Benzyl amino purin MS: Murashige và Skoog Nxb: Nhà xuất bản

CT: Công thức ĐC: Đối chứng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất 20 khử trùng 20 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây hoa Triệu chuông 21

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ cây hoa Triệu chuông in vitro 22

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây hoa Triệu chuông 23 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian và nồng độ chất khử trùng NaClO đến khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh chồi 25 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi của cây Triệu chuông 27 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây mô Triệu chuông sau

2 và 4 tuần ra ngôi 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.Hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) 3

Hình 1.2 Một số màu hoa hiện có của hoa Triệu chuông 5

Hình 3.1 Chồi cây hoa Triệu chuông 25

Hình 3.2 Cụm chồi Triệu chuông sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BAP 29

Hình 3.3 Chồi in vitro của hoa Triệu chuông có bổ sung 0,3 mg/l Kinetin sau 6 tuần nuôi cấy 30

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng hình thành rễ ở cây hoa Triệu chuông 31

Hình 3.4 Tạo rễ cây Triệu chuông in vitro 32

Hình 3.5 Cây hoa Triệu chuông trong giai đoạn rèn luyện 35

Hình 3.6 Triệu chuông in vitro đã ra hoa ngoài tự nhiên 35

Hình 3.7 Nhân nhanh cây hoa Triệu chuông in vitro 36

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa của đề tài 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) 3

1.1.1 Vị trí, phân loại: 3

1.1.2 Nguồn gốc 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí 3

1.1.4 Kĩ thuật chăm sóc cây hoa Triệu chuông 5

1.2 Kĩ thuật nhân giống cây hoa Triệu chuông 7

1.2.1 Nhân giống hữu tính 7

1.2.2 Nhân giống vô tính 7

1.2.3 Nhân giống vô tính in vitro cây hoa Triệu chuông 8

1.2.3.1 Cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật 8

1.2.3.2 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro 9

1.2.3.3 Đặc điểm của cây giống in vitro 11

1.2.3.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro 11

1.3 Tình hình sản xuất và các nghiên cứu về nhân giống hoa Triệu chuông 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 17

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 17

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 18

2.2.4 Điều kiện nuôi cấy 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 19

2.3.2 Phương pháp phân tích số liệu 23

CHƯƠNG 3: K T QUẢ VÀ THẢO UẬN 24

3.1.Tạo vật liệu in vitro từ chồi cây hoa Triệu chuông 24

3.2 Nhân nhanh chồi cây hoa Triệu chuông in vitro 26

3.3 Kích thích chồi ra rễ tạo cây in vitro hoàn chỉnh 30

3 4 Ảnh hưởng của các loại giá thể lên tỷ lệ sống của cây in vitro khi đưa ra vườn ươm 32

CHƯƠNG 4: K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 37

4.1 Kết luận 37

4.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

MỞ ĐẦU 1.Lí do chọn đề tài

Triệu chuông (Calibrachoa parviflora là loài hoa thuộc họ Cà (Solanaceae), phân bố chủ yếu ở vùng Nam Mỹ, Mexico, và tây nam Hoa Kỳ

[7], [16] Đây là loài hoa cảnh được ưa chuộng trên thế giới bởi màu sắc vô cùng đa dạng và phong phú Về hình thái, hoa Triệu chuông có đặc điểm gần giống với hoa Dạ yên thảo, cả hai loài này cùng thuộc họ Cà nhưng ở hai chi khác nhau Theo nghiên cứu củaStehmann và cộng sự (1997), hoa Triệu chuông có bộ NST 2n = 18, Dạ yên thảo có bộ NST 2n = 16 và chúng khác xa nhauvề cấu trúc nhiễm sắc thể [20] Đặc tính nổi bật của hoa Triệu chuông so với Dạ yên thảo là hoa nhỏ và sai hoa hơn, cây có thể ra hoa quanh năm, thời gian chơi hoa dài hơn, khả năng chịu nắng nóng và mưa tốt hơn Vì thế, đây được xem là đối tượng hoa cảnh rất phù hợp để phát triển với điều kiện ở Việt Nam hiện nay

Theo thông tin từ các cơ sở cung ứng giống, hiện nay phần lớn cây giống Triệu chuông được gieo từ hạt F1 nhập khẩu, tuy nhiên giá bán hạt giống Triệu chuông khá cao, tỷ lệ nảy mầm của hạt tương đối thấp (khoảng 50% - 60%), cây con có tỷ lệ chết cao, do đó ảnh hưởng đến giá thành cây giống Ngoài phương pháp gieo hạt, Triệu chuông còn có thể nhân giống bằng phương pháp giâm cành, tuy nhiên phương pháp nhân giống này có hệ số nhân thấp, cây giâm cành có sức sống yếu hơn cây gieo bằng hạt và nhanh tàn

hơn Do vậy, việc cung ứng nguồn cây in vitro sạch bệnh, hoàn thiện quy

trình nhân giống hoa Triệu chuông là rất cần thiết Đây cũng là tiền đề quan trọng để góp phần bảo tồn nguồn gen và phục vụ công tác chọn tạo giống Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện nay mới chỉ tập trung vào phân loại [20] và xây dựng cây phát sinh loài [7]

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu xác định

được qui trình nhân giống cây Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) bằng kĩ

thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm cung ứng cây giống sạch bệnh và giảm giá thành cho thị trường hoa cảnh Việt Nam

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được quy trình nhân dòng vô tính cây hoa Triệu chuông

(Calibrachoa parviflora) in vitro

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo vật liệu in vitro từ chồi đỉnh cây Triệu chuông (Calibrachoa

parviflora)

- Ảnh hưởng của BAP, Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi của cây

Triệu chuông (Calibrachoa parviflora) in vitro

- Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ của cây Triệu chuông

(Calibrachoa parviflora) in vitro

- Công thức giá thể tối ưu nhất phù hợp với cây Triệu chuông in vitro

ở giai đoạn vườn ươm

4 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu

về nhân giống in vitro cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora)

- Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần sản xuất giống Triệu chuông có hiệu quả cao, chất lượng tốt

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora)

Các giống hoa Triệu chuông hoang dại đầu tiên được phát hiện ở Brazil có sự đa dạng về màu sắc, kích thước và hình dáng hoa Thông qua quá trình lai tạo và chọn lọc, các giống hoa Triệu chuông trồng hiện nay có nhiều ưu điểm để phù hợp với thị hiếu của người chơi hoa

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lí

- Rễ: Rễ cây hoa Triệu chuông thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển

theo chiều ngang, ở tầng đất mặt từ 10 - 20 cm Kích thước các rễ trong bộ

rễ chệnh lệch nhau không nhiều, số rễ tương đối nhiều nên khả năng hút

Hình 1.1.Hoa Triệu chuông (Calibrachoa parviflora)

nước và dinh dưỡng của cây rất mạnh Vì vậy, Triệu chuông rất thích hợp trồng trên các loại giá thể tơi xốp, chủ động điều chỉnh thành phần dinh dưỡng phù hợp để kích thích bộ rễ phát triển

- Thân: Cây hoa Triệu chuông thuộc loại cây hoa thân thảo rủ có chiều

cao từ 10 - 50 cm Thân khá cứng, phủ ít lông dính, nhánh cây được phân ra

từ các nách lá Trên thân có các mắt ngủ tiềm sinh ở giữa cuống lá và thân Thân có khả năng tái sinh nên được sử dụng để nhân giống vô tính

- Lá: á đơn mọc cách trên thân không có lá kèm Phiến lá mềm

mỏng, mép nguyên không có răng cưa, có thể to hay nhỏ hình thuôn hoặc oval, có màu sắc khác nhau (xanh đậm, xanh nhạt ) tùy thuộc vào giống.Mặt trên và mặt dưới của lá có lớp lông phủ mịn, gân lá hình chân chim

-Hoa: Triệu chuông là loại hoa quanh năm nếu được chăm sóc tốt.Hoa

hình chuông, cánh mướt như nhung và viền cánh hoa có gợn sóng Cụm hoa chủ yếu có một hoa hoặc tập hợp một vài hoa trên đỉnh cành dài, cứng Màu sắc hoa rất đa dạng, hầu như có tất cả các màu trong tự nhiên (trắng, tím, đỏ hồng, ) và độ đậm nhạt thay đổi từ khi hoa bắt đầu nở đến khi hoa tàn Một bông có thể có một màu hoặc nhiều màu pha trộn Đường kính bông hoa chỉ khoảng 1 - 2cm tuy nhiên cây vô cùng sai hoa Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành Cánh đài hợp ở gốc, còn lại ở quả, cánh

tràng hợp thành ống loe rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy

- Quả: nang hai mảnh, nhiều hạt

Hình 1.2 Một số màu hoa hiện có của hoa Triệu chuông 1.1.4 Kĩ thuật chăm sóc cây hoa Triệu chuông

Nếu ai đã từng chăm Dạ yến thảo thì chăm sóc hoa Triệu chuông rất dễ dàng Không “đỏng đảnh” như Dạ yến thảo, Triệu chuông không dễ dàng bị héo khi nhiệt độ tăng, khả năng chịu mưa và nắng nóng cũng tốt hơn

- Ánh sáng: Triệu chuông ưa sáng hoàn toàn, càng nhiều nắng cây

càng sai hoa

- Nhiệt độ: Mặc dù ưa nắng, tuy nhiên là cây thân thảo bộ rễ ăn nông

nên Triệu chuông dễ bị đốt nóng nếu trưng dưới ánh nắng mặt trời gay gắt

Nhiệt độ phù hợp với Triệu chuông từ 15 - 280C, mùa hè cần che nắng hoặc

trưng cây dưới giàn lưới Nhiệt độ cao quá khiến cây xấu yếu, phát triển kém

- Độ ẩm: Cây hoa Triệu chuông sinh trưởng, phát triển thuận lợi nhất

trong điều kiện ẩm độ đất từ 65 - 80%, độ ẩm không khí từ 60 - 75% Trong thời kỳ nở hoa nếu độ ẩm quá cao gây thối hoa và sâu bệnh phát triển mạnh làm giảm chất lượng hoa và độ bền của hoa Khi trồng nên sử dụng chậu thoáng và thoát nước tốt

- Tưới nước: Triệu chuông ưa nước nhưng không chịu được úng Cây

nhiều lá hoa nên cần bổ sung nước đầy đủ, mùa hè nhiệt độ cao nước thoát nhanh nên tưới 2 - 3 lần vào sáng sớm hoặc chiều mát mỗi lần tùy kích thước chậu khoảng 300 - 500ml Mùa đông khi nhiệt độ ngoài trời 15 - 220C, lượng mưa ít thì có thể trưng ra ngoài mà không sợ cây bị mưa táp Tưới nước khi thấy đất trên mặt chậu se khô [23]

Tốc độ sinh trưởng của Triệu chuôngkhá nhanh, cây liên tục ra hoa hết đợt này đến đợt khác, thời gian chơi hoa rất dài và có khi được dùng làm hoa tết để bàn tạo không gian đẹp cho các gia đình Bên cạnh đó, chúng không cần cầu kì trong chăm sóc, rễ cây khỏe, nhu cầu nước không khắt khe,

ít sâu bệnh và cóthể chịu được nắng mưa thất thường [22] Với những ưu thế này, hoa Triệu chuông xứng đáng là cây hoa ban công hoàn hảo phù hợpnhiều vùng sinh thái của nước ta, đặc biệt là khu vực miền Bắc Vì vậy, để đảm bảo cho sự sinh trưởng, phát triển của cây hoa Triệu chuông được thuận lợi, nâng cao năng suất và chất lượng hoa, cần tiến hành nghiên cứu trên các giống cụ thể và áp dụng các biện pháp kỹ thuật trồng như: thời vụ, giá thể, phân bón… phù hợp với từng giai đoạn sinh trưởng

1.2 Kĩ thuật nhân giống cây hoa Triệu chuông

1.2.1 Nhân giống hữu tính

Nhân giống hữu tính là hình thức dùng hạt để làm giống, cây con được hình thành từ hạt Đây là phương pháp nhân giống cây đơn giản, dễ làm, ít tốn kém và không cần nhiều trang thiết bị Hạt giống được hình thành

do kết quả thụ tinh giữa giao tử đực (hạt phấn với giao tử cái (noãn Từ hạt

sẽ hình thành một cây mới mang đặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối Cây con mọc lên từ hạt, thường tạo thành cây giống khỏe, có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, khả năng chống chịu cao (sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh , năng suất cao

Tuy nhiên, phương pháp nhân giống hữu tính cũng nhược điểm là: Hạt giống tạo ra có bản chất lai, có ưu thế lai, cây có tính dị hợp, cây thường bị phân ly với tỷ lệ cao, tỷ lệ cây mọc thường biến động, cây có thời gian sinh trưởng rất dài 5 - 6 tháng Mặt khác, phương pháp nhân giống bằng hạt thường gặp nhiều khó khăn: khả năng thụ phấn thụ tinh thấp ở những vùng sinh thái có nhiệt độ, ẩm độ… không phù hợp Do đó, chất lượng hoa không cao, giá trị thương phẩm thấp Nên phương pháp nhân giống này ít được sử dụng trong sản suất

1.2.2 Nhân giống vô tính

Cây hoa Triệu chuông cũng có thể được nhân giống từ các cơ quan, bộ phận sinh dưỡng của cây như thân, lá Ðây là hình thức nhân giống vô tính phổ biến ở nhiều loại cây trồng Quá trình nhân giống vô tính có thể diễn ra trong tự nhiên và nhân tạo Phương pháp nhân giống vô tính có nhiều ưu điểm:

- Giữ được những đặc tính di truyền của cây mẹ

- Cây giống sau trồng sớm ra hoa

- Thời gian nhân giống nhanh

- Các đột biến có lợi khó bị mất đi do không phải trải qua quá trình phân bào giảm nhiễm

Bên cạnh những ưu điểm nổi bật, phương pháp nhân giống này vẫn còn có một số nhược điểm sau:

- Cây mẹ truyền bệnh virus sang cho cây con

- Cây giống nhanh bị thoái hóa (sinh trưởng phát triển không đều, cây nhanh tàn, giảm giá trị thương phẩm

- Hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và cây giống dễ bị thoái hóa qua quá trình canh tác lâu dài

1.2.3 Nhân giống vô tính in vitro cây hoa Triệu chuông

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống, thường được sử

dụng cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bằng việc sử dụng các bộ phận khác nhau của cây với kích thước nhỏ

1.2.3.1 Cơ sở khoa học về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng, dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt G.(1902 là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [9] Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế

bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào [3]

Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau

Quá trình phân hóa tế bào có thể hiện thị:

Tế bào phôi sinh  Tế bào dãn  Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào

Tế bào chuyên hoá (mô  Tế bào phôi sinh [14], [15]

Ứng dụng kỹ thuật nhân giống in vitro đã mở ra một hướng phát triển

mới trong ngành nông nghiệp, giúp tăng sản lượng và chất lượng cây giống, đảm bảo nguồn cung cấp cây giống có chất lượng tốt cho thực tiễn sản xuất

1.2.3.2 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro

Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp

dụng cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài).Giáo sư Murashige của trường

Ðại học California đã chia quy trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và

một giai đoạn tiếp sau in vitro [12]:

1 T o vật liệu nu i c h i đ u in vitro

Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Các mẫu đã được khử trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới Giảm tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này và thường kéo dài từ 4 - 6 tuần

2 Nhân nhanh ch i c m ch i in vit o

à giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin

3 T o câ hoàn ch nh hu n u ện cây con

Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá,

rễ Trong giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng độauxin nhằm kích thích sự hình thành rễ

Huấn luyện cây con: à giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài

hệ thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định

4 hu n câ a t ng ngoài đi u iện tự nhi n

Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang

sống hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên Sự biến động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong

việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên

Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in

vitro vào thực tiễn

1.2.3.3 Đặc điểm của cây giống in vitro

Cây giống in vitro khi đưa ra môi trường tự nhiên, gặp một số vấn đề

như sau:

- Cây dễ bị mất nước do cấu trúc lá có lớp cutin trên bề mặt ít

- Bộ máy quang hợp và lục lạp kém phát triển

- Rễ của các chồi không có khả năng đồng hóa cabon và thường bị chết do rễ được hình thành từ callus thân, cho nên mối liên kết rễ - không bào và thân không tốt

Vì vậy, trước khi đưa cây ra ngoài cần phải có các biện pháp xử lý để tăng khả năng sống sót của cây Các biện pháp đó gọi là huấn luyện cây trước khi đưa cây ra ngoài

Việc huấn luyện cây bao gồm:

- Giảm thể nước của môi trường

- Giảm ẩm độ trong bình nuôi cây

Cả 2 dạng xử lý nhằm phát triển chức năng của khí khổng và lớp cutin Các biện pháp có thể áp dụng như: đậy nút bình bằng các vật liệu có thể thoát

hơi nước, mở nắp bình trước khi trồng vài ngày, khi cho cây ra rễ in vitro

điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ cao hơn các giai đoạn trước… [14], [15]

1.2.3.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro

a Mẫu cấy

Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ còn tất cả các mô khác trong

cơ thể thực vật đều có thể dùng làm vật liệu cấy Tuy vậy, các mô đang phát triển mạnh như mô phân sinh ngọn, thượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát sinh, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh đốt khi đặt vào môi trường chứa chất sinh trưởng thích hợp có khả năng nuôi cấy để tạo mô sẹo hoặc tạo thành cây hoàn chỉnh [3]

b Phương pháp vô trùng

Mẫu có chứa ít hay nhiều vi khuẩn, nấm tùy theo sự tiếp xúc của chúng với môi trường Để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi mô nuôi cấy thì phương pháp thông dụng hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm vi khuẩn

Khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn của hóa chất vô trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lí và mức độ xâm nhập của chúng trên bề mặt nuôi cấy Để tăng hiệu quả thì người ta có thể ngâm mẫu vào etanol 70 - 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lí với dung dịch diệt khuẩn Với các mẫu quá bẩn thì phải rửa kĩ bằng nước xà phòng và phải để dưới vòi nước chảy từ 20

- 30 phút, sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy

Tác nhân vô trùng ngoài diệt nấm, vi khuẩn còn ảnh hưởng tới mô cấy Vì vậy, chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và sự mẫn cảm của mẫu [1]

c Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài,

bộ phận và mục đích nuôi cấy, vì vậy thành phần của môi trường là khác nhau Thành phần môi trường còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cây và mục đích nuôi cấy như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh [1]

Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất, nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy đều gồmcó các thành phần sau: Các loại muối khoáng nguồn cacbon, vitamin, các chất điều tiết sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn [5]

* Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy

mô - tế bào thực vật được chia thành hai nhóm theo hàm lượng sử dụng:

- ác ngu n tố hoáng đa ượng:

Nitơ (N : thường được sử dụng ở hai dạng nitrat (NO3- hoặc muối amoni (NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau

ưu huỳnh (S : Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4

2- Photpho (P : Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho rất cao Chính vì vậy photpho là một nguyên tố cần thiết của môi trường và thường được đưa vào môi trường ở dạng ortophotphat hoặc đường photphat Ngoài ra khi photpho ở dạng H2PO4 và HPO4- còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

- ác ngu n tố hoáng vi ượng: Ngoài các nguyên tố khoáng đa

lượng, trong môi trường còn cần các nguyên tố vi lượng là Fe, B, Mn, I, Mo,

Cu, Zn, Ni, Co

* Nguồn cacbon

Hầu hết các mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp cacbon Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Trong phần lớn các môi trường, nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu là saccarosevà glucoselà nguồn cacbon tốt nhất Ở một số mô thì có thể dùng mantose, fructosevà galactose

* Vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả

năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng do đó phải bổ sung thêm vào môi trường một số vitamin, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B như vitamin B1, B3, B5, B6, axit nicotinic, meso-inosit Năm 1972, theo kết quả nghiên cứu của Riley, vitamin B1 được coi là vitamin thiết yếu đối với sự sinh trưởng của tế bào thực vật [18]

* Các chất điều hòa sinh trưởng

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (phytohoocmon là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy Nhờ những chất này, các nhà nghiên cứu có thể chủ động điều khiển quá trình phát sinh hình thái của thực

vật in vitro Có hai nhóm chất được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin

Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ tạo mô sẹo Các chất thuộc nhóm auxin thường dùng là IBA, IAA, NAA và 2,4D

Các cytokinin thường dùng trong môi trường nuôi cấy là Kinetin, BAP Các mức thấp hơn của cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm Hàm lượng cytokinin cao

sẽ hoạt hóa thành chồi bất định, chồi nhiều nhưng kích thước nhỏ Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu của Narayanaswami năm 1996 cho thấy nồng độ cao của cytokinin còn kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ [13]

* Các nhóm chất chất bổ sung

Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như: nước dừa, dịch chiết nấm men nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy có trường hợp người ta sử dụng cả than hoạt tính như một chất phụ gia, kết quả nghiên cứu của Fridborg và cộng sự (1978 cho thấy than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất tiết ra từ mô cấy, vỏ bao phấn và làm tăng hiệu suất sinh phôi [8]

* Chất độn (thạch - agar)

Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường Theo nghiên cứu của Bhojwani và Razdan (1983), khi nồng độ của agar cao, môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng như hấp thụ của

mô gặp khó khăn [6] Đa số nuôi cấy phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào loài cây mà sử dụng cho phù hợp

d Điều kiện nuôi cấy

* Nhiệt độ

Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển ở các loài là không như nhau Thực tế nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ được duy trì, ít biến đổi, thường là 25 ± 10C

Theo tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981 thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi trong suốt thời gian nuôi cấy [19]

* Ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thành của

mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux được dùng phổ biến cho nhiều loại

mô

* Giá trị pH của môi trường

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy, đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường với mức ổn định ban đầu Giá trị pH của môi trường thích hợp cho sinh trưởng và phát triển ở nhiều loài thực vật biến đổi

từ 5,0 - 6,0 Khi pH thấp sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolose dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của các tế bào trong mô nuôi cấy