Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu nhân giống cây dã yên thảo rũ hồng đậm (petunia hybrida l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nội dung nghiên cứu - Tạo vật liệu in vitro từ đoạn thân cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên - Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của cây Dã yên thảo in vitro - Nghiê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

==  ==

VŨ THỊ MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÃ YÊN

THẢO RŨ HỒNG ĐẬM (Petunia hybrida L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

==  ==

VŨ THỊ MAI

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY DÃ YÊN

THẢO RŨ HỒNG ĐẬM (Petunia hybrida L.)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Thị Thu Hiền giảng

viên Khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban

Chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều

kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận

tình của cô Phạm Phương Thu- Phòng thí nghiệm Di truyền học, thầy La

Việt Hồng và cô Mai Thị Hồng- Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã

giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi

cũng xin gửi lời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ

Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh

lí thực vật- trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị,

phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong

quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, ngày 2 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

VŨ THỊ MAI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số

liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của cây hoa Dã

yên thảo 29

Bảng 2.2.2 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo cụm chồi của cây hoa Dã yên thảo 30

Bảng 2.2.3 Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Dã yên thảo 30

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây hoa Dã yên thảo in vitro 31

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dã yên thảo 32

Bảng 3.1 Tỷ lệ nảy chồi của Dã yên thảo được khử trùng trong các 34

công thức 34

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Dã yên thảo sau 5 tuần nuôi cấy 36

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Dã yên thảo sau 4 tuần nuôi cấy 39

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh của Dã yên thảo in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 41

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BAP và NAA đến chồi in vitro cây Dã yên thảo sau 4 tuần nuôi cấy 43

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của Dã yên thảo 45

in vitro 45

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống của cây Dã yên thảo in vitro 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoa Dã yên thảo 4 Hình 1.2 Một số loài Dã yên thảo trong tự nhiên 8 Hình 3.1 Chồi của cây Dã yên thảo 35 Hình 3.2 Cụm chồi Dã yên thảo sau 5 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung BAP 38 Hình 3.3 Cụm chồi Dã yên thảo sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung kinetin 40 Hình 3.4 Chồi của Dã yên thảo rũ hồng đậm trên môi trường MS bổ sung BAP + kinetin sau 4 tuần nuôi cấy 42 Hình 3.5 Chồi của Dã yên thảo rũ hồng đậm trên môi trường MS được bổ sung BAP và NAA 44

Hình 3.6 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của Dã yên thảo in vitro

sau 4 tuần nuôi cấy 46 Hình 3.7 Cây Dã yên thảo rũ hồng đậm trong các giai đoạn rèn luyện 49

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa của đề tài 2

6 Nội dung nghiên cứu 3

NỘI DUNG 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Giới thiệu về cây Dã yên thảo rũ hồng đậm 4

1.1.1.Vị trí, phân loại 4

1.1.2 Mô tả 4

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố 6

1.1.4 Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo 6

1.1.4.1 Các loại Dã yên thảo 6

1.1.4.2 Cách trồng Dã yên thảo 8

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào 9

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 10

1.2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.2.1 Khử trùng mẫu và nuôi cấy khởi đầu 11

1.2.2.2 Giai đoạn nhân nhanh chồi 11

1.2.2.3 Tạo cây hoàn chỉnh 12

1.2.2.4 Giai đoạn huấn luyện cây in vitro ở ngoài môi trường tự nhiên 12

1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 1.2.3.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô 12

1.2.3.2 Các loại muối khoáng 13

1.2.3.3.Nguồn cacbon 15

1.2.3.4 Chất điều hòa sinh trưởng 16

1.2.3.5 Các nhóm chất bổ sung 19

1.2.3.6 Chất độn – thạch (Agar) 20

1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trong và ngoài nước 21 1.3.1 Nghiên cứu ngoài nước 21

1.3.2 Tình hình nuôi cấy mô ở Việt Nam 22

1.3.3 Tình hình nuôi cấy in vitro cây Dã yên thảo ở thế giới 23

1.3.4 Tình hình nuôi cấy in vitro cây Dã yên thảo ở Việt Nam 23

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nuôi cấy 25

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.3 Thiết bị và dụng cụ 25

2.4 Môi trường nuôi cấy cây Dã yên thảo 26

2.5 Điều kiện nuôi cấy in vitro 26

2.6 Phương pháp nghiên cứu 26

2.6.1 Bố trí thí nghiệm 26

2.6.2 Tạo vật liệu nuôi cấy 27

2.6.3 Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in vitro29 2.6.4 Tạo rễ cây hoa Dã yên thảo in vitro 31

2.6.5 Bước đầu huấn luyện cây Dã yên thảo in vitro ngoài môi trường tự

nhiên 32

2.7 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Khử trùng tạo mẫu sạch in vitro 33

3.2 Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo bằng phương pháp tạo cụm chồi in vitro 35

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Dã yên thảo 35

3.2.2 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Dã yên thảo 39

3.2.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Dã yên thảo in vitro 40

3.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Dã yên thảo 43

3.3 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro cây Dã yên thảo 45

3.4 Bước đầu huấn luyện cây dã yên thảo in vitro ở môi trường tự nhiên 47

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay xã hội phát triển, các khu đô thị mọc lên ở khắp nơi Từ thành thị đến nông thôn đều phát triển theo mô hình đô thị hóa Đời sống người dân cũng được cải thiện rõ rệt Những ngôi nhà mái ngói phủ rêu được thay thế bằng những ngôi nhà cao tầng san sát nhau làm thu hẹp diện tích đất trồng các loại cây Ví dụ như diện tích đất canh tác, hoa màu và diện tích trồng trọt các loại thực vật nói chung tại các khu đô thị đều giảm Do đó đã có rất nhiều hộ gia đình đã tận dụng khoảng ban công để trồng hoa, cây cảnh để tô điểm thêm cho ngôi nhà của mình Hiện nay, để đáp ứng nhu cầu trồng hoa ngày càng tăng nhanh, nhiều loài hoa ban công được ưa chuộng như Dã yên thảo, đồng tiền, hoa hồng, hoa nhài… Đã được thị trường hoa cảnh coi là nhân tố chính cần được đầu tư, phát triển để mang lại lợi ích kinh tế

Dã yên thảo được biết đến là nữ hoàng hoa ban công Dã yên thảo

có 2 dạng rủ và đứng để mọi người lựa chọn cho phù hợp với góc ban công mỗi căn hộ Với ưu điểm màu sắc hoa phong phú, Dã yên thảo mang lại rất nhiều sự lựa chọn cho người tiêu dùng Chỉ cần khéo léo kết hợp ban công sắt với cây cảnh, hoa lá bạn sẽ sở hữu một không gian độc đáo ấn tượng

Tuy nhiên giá thành của các loài hoa, cây cảnh khá cao trong đó có

Dã yên thảo Dã yên thảo được du nhập vào nước ta hiện nay chủ yếu là nhân giống từ hạt Theo Verdork (2005), cây Dã yên thảo có hạt nhỏ và rất chậm để xử lý hạt giống Đối với nhân giống bằng cành thì hệ số nhân thấp, không đồng đều nên chưa đáp ứng nhu cầu khi cần trồng cây

có số lượng lớn, đồng loạt [7] Trong khi đó nuôi cấy mô là một phương pháp hiệu quả trong nhân giống Nó giúp cây Dã yên thảo tăng

nhanh về số lượng và cả chất lượng Điều quan trọng, phương pháp này sản xuất ra một số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, cây sạch bệnh và trồng được quanh năm Để chủ động trong việc sản suất cây giống và giảm giá thành nên tôi chọn đề tài này: “NGHIÊN CỨU

NHÂN GIỐNG CÂY DÃ YÊN THẢO RŨ HỒNG ĐẬM (Petunia

hybrida L.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC

VẬT”

2 Mục đích nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của một số nhân tố bổ sung vào môi trường

nuôi cấy đến sinh trưởng của cây Petunia hybrida L môi trường in

vitro, đồng thời tìm hiểu ảnh hưởng của một số giá thể tới sự sinh

trưởng của Petunia hybrida L cấy mô khi chuyển ra ngoài tự nhiên

3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cây hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida L.) - hoa màu hồng

được mua ở chợ Hoàng Hoa Thám, khi đỉnh sinh trưởng cao từ 6-8 cm thì tiến hành cắt mẫu để nuôi cấy

4 Phạm vi nghiên cứu

Thực hiện các thí nghiệm trong điều kiện nuôi cấy in vitro tại

Phòng thí nghiệm di truyền, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

5 Ý nghĩa của đề tài

+ Ý nghĩa lý luận: nhằm bổ sung vào nguồn tư liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô cây Dã yên thảo

+ Ý nghĩa thực tiễn: đưa ra cơ sở phục vụ cho nhu cầu nhân nhanh

số lượng cây hoa Dã yên thảo Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt

6 Nội dung nghiên cứu

- Tạo vật liệu in vitro từ đoạn thân cây Dã yên thảo ngoài tự nhiên

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cụm chồi của

cây Dã yên thảo in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo cụm chồi của

cây Dã yên thảo in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + kinetin đến khả năng tạo

cụm chồi của cây Dã yên thảo in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + NAA đến khả năng tạo

cụm chồi của cây Dã yên thảo in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của cây Dã

yên thảo in vitro

NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Giới thiệu về cây Dã yên thảo rũ hồng đậm

Tên khoa học: Petunia hybrida L

Tên thông thường:Petunia

Tên Việt Nam: Dã yến thảo, Dạ yến thảo hay Dã yên thảo [32]

1.1.2 Mô tả

Cây Dã yên thảo rũ hồng đậm có tên khoa học là Petunia hybrida L.,

Dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước Nam Mỹ [33]

Đặc điểm hình thái, sinh lý:

Thân, tán, lá: Cây hoa Dã yên thảo là cây thân cỏ, sống hằng năm, cây cao 15- 30 cm Thân mềm, phủ đầy lông dính, nhánh cây được phân ra từ các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều nhánh Lá đơn, mọc cách, mặt trên và mặt dưới của lá có lớp lông phủ mịn Lá hình trái xoan, thuôn đều, mềm mại, mép nguyên không răng cưa, màu xanh bóng

Hình 1.1 Hoa Dã yên thảo

Hoa: nhỏ, đơn độc mọc ở nách lá, trên một cọng dài 2-3 cm, đài hoa cao 1-2,5 cm Hoa lưỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dưới của ống vành [5] Cánh đài hợp ở gốc, còn lại ở quả, cánh tràng hợp thành ống loe rộng ở đỉnh, nổi rõ các gân thùy Quả nang hai mảnh, nhiều hạt [33]

Tốc độ sinh trưởng của hoa Dã yên thảo nhanh Hoa Dã yên thảo có hình phễu, nhưng các loại Dã yên thảo lai tạo có hình dáng đa dạng và phong phú hơn nhiều Ví dụ như hoa cánh đơn, hoa cánh kép với mép có viền và gợn sóng, mép dúng hình cung nhọn ở giữa Hoa có thể có sọc, đốm hoặc viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng, tím, vàng, cam Dã yên thảo rũ hồng đậm có mùi thơm dịu dàng, khi chạm và lá và cuống hoa sẽ thấy hơi dính

Dã yên thảo là cây nhất niên, nở hoa vào mùa hè Dã yên thảo ưa sáng,

sẽ trở nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm vừa phải, có thể sống trong điều kiện hơi khô nhưng không thích ứng với điều kiện ngập úng Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, không chịu được nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng Dã yên thảo trồng được trên hầu hết các loại đất, nhưng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH từ 6.0 – 7.0 Bấm đọt để kích thích cây đâm nhánh tạo độ rũ cho cây, nếu cây ốm yếu hay sau khi cho hoa rộ thì cũng nên tỉa lá bớt để cây phục hồi lại

Dã yên thảo thường bị chết vì úng nước, vì vậy cần tưới nước đúng liều lượng, không tưới nước lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ sinh và duy trì ẩm độ thích hợp Ngoài ra, Dã yên thảo thường

bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng như sâu, sên, rệp cắn phá Một số bệnh virus cũng ảnh hưởng nhiều đến cây như làm biến dạng lá, cây chậm phát triển, hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi

liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi kết dính thành cụm [31]

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố

Hoa Dã yên thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà (Solanaceae)[7]

Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu

Mỹ, hiện nay được gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng, vườn hoa khắp nước ta Ở miền bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền nam, hoa nở vào dịp Tết Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm Hoàng Hộ (2000) cây có tên là Dã yên [7], theo Trần Hợp (2000) có tên

là cây hoa cà [8] Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài

khác của chi petunia, ví như P.axillaris BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng hoặc p.virolacea Lindl (Violet-flowered

Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím Ngày nay, các nhà vườn

từ loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp [8]

1.1.4 Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo

1.1.4.1 Các loại Dã yên thảo

Grandifloras: hoa lớn, nhiều hoa có đường kính đến 12,5 cm, gồm cả dạng hoa đơn hoặc hoa kép Một vài giống hoa đơn có cánh gợn sóng hoặc viền, thân leo, có xu hướng lan rộng ra xung quanh Do hoa lớn , nhiều và thường úp xuống nên dễ bị thối trong thời tiết nóng và ẩm, nếu muốn trồng loại này thì phải chăm sóc kĩ Những giống hoa Grandifloras phổ biến: Supercascade, Super magric, Ultra, Storm và Falcon [19]

Multifloras: hoa nhỏ, đường kính khoảng 5 - 7,5 cm, nhiều hoa, gồm

cả dạng hoa đơn và hoa kép Multiflora sống mạnh mẽ, chịu được nhiệt độ

cao lẫn sương giá, kháng được bệnh thối cánh hoa Những dạng hoa Multifloras đẹp như: Carpet, Primetime, Heavenly Lavender [19]

Floribundas: đây là dạng trung gian giữa Grandifloras, Multifloras Nhóm này trổ hoa nhiều như Multifloras và kích thước hoa trung bình Một

số dạng hoa phổ biến: Celebrity, Madness, Double Madness [19]

Millifloras: cây nhỏ, dạng bụi rậm rạp, cho nhiều hoa có đường kính từ 2,5 – 3,5 cm Chúng thích hợp để trồng trên các ụ đất hoặc trong giỏ treo Fantasy là một dạng trong nhóm này [19]

Spreading Petunias: loại này phát triển chậm nhưng có thể trải rộng ra

từ 0,9 – 1,2 cm Hoa có nhiều màu sắc, thích hợp để trồng ở bồn hoa cửa

sổ hoặc trong các giỏ treo Spreading Petunias chịu được khô hạn và rất dễ trồng Phổ biến nhất trong nhóm này là “Purple Wave” Ngoài ra trong nhóm này còn có “Wave”và “Laura Bush” [19]

có thể rủ xuống từ 40 cm

Khi gieo hạt cần phải gieo hạt trong nhà vào những khay nhỏ và mang trồng ngoài vườn khi hết sương giá Khi trồng ngoài vườn nhớ để

khoảng cách giữa các cây 30 – 45 cm Nếu không có khoảng không gian rộng thì người trồng cũng có thể gieo hạt và trồng luôn trong chậu Tuy nhiên, đối với Dã yến thảo dạng bụi người trồng chú ý nên chọn những chiếc chậu có kích thước lớn Sau đó nên ngắt ngọn để kích thích cây mọc thành bụi Khi cây có dấu hiệu già hóa, người trồng cần cắt thân khoảng 15 cm tính từ cuống hoa khi thấy các cành lan dài, hoặc mọc không đều, xô lệch vào giữa mùa hoa Dã yến thảo là cây ưa sáng Tưới nước thường xuyên và vừa phải, không nhiều quá nhưng cũng không để đất khô quá Dã yến thảo có hoa liên tục, hết đợt này đến đợt khác, dễ tìm các loại giống, dễ trồng và dễ chăm sóc [33]

Mỗi buổi sáng, nên tưới cây, nhặt lá dạ yến thảo khô, héo vì để lâu sẽ

dễ khiến cây bị úng Khi trồng cây, bạn cũng nên quan tâm một chút đến thời tiết trong ngày, nếu trời nắng to hoặc mưa to, bạn nên "di dời" cây vào trong nhà để đảm bảo cây và hoa được tốt tươi lâu hơn [33]

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Cơ sở nền tảng của nuôi cấy mô, tế bào thực vật là học thuyết về tính toàn năng của tế bào do nhà thực vật học người Đức Haberland đưa ra vào năm 1902 Kế thừa quan điểm của ông, các nhà sinh học hiện đại cho rằng tất cả các tế bào cấu tạo nên cơ thể thực vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền đủ để mã hóa hình thành một cơ thể Các nhà nghiên cứu cho rằng mỗi tế bào thực vật khi tách ra khỏi cơ thể nếu được nuôi trong điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Từ đó đến nay, rất nhiều các công trình nghiên cứu đã tạo ra được cây hoàn chỉnh từ một

tế bào riêng lẻ, một khối mô hay từ một phần của cơ quan Điều đó khẳng

định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô,

tế bào thực vật [23]

Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng rất quan trọng Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA, [23]

Sự biểu hiện tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy mô in vitro:

+ Quá trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa thành cây hoàn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính toàn năng của tế bào thực vật

+ Khả năng biểu hiện tính toàn năng của các tế bào, mô của cơ thể là khác nhau

+ Tính toàn năng của tế bào nuôi cấy in vitro biểu hiện trải qua 3 giai đoạn:

- Tế bào phản biệt hóa với sự phát sinh tế bào khả biến

- Định hướng phân hóa tế bào

- Phát sinh hình thái, phát sinh cơ quan

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus

và nhân giống in vitro Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên

cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin [23]

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro

thực chất là kết quả phân hóa và phản phân hóa tế bào

Quá trình phân hóa tế bào bao gồm 3 giai đoạn: giai đoạn phân bào, giai đoạn giãn và giai đoạn phân hóa Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các

tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể

Sự phản phân hóa tế bào trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là các tế bào đã phân hóa chức năng sẽ bị phản biệt hóa tạo thành các tế bào mô sẹo Sau đó, các tế bào mô sẹo tái sinh tạo thành chồi hay phôi soma và từ đó tái tạo thành cây hoàn chỉnh

1.2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Khử trùng mẫu và nuôi cấy khởi đầu

Giai đoạn này là giai đoạn quan trọng trong nuôi cấy in vitro, quyết

định toàn bộ quy trình nhân giống Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn nguyên liệu vô trùng có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt, để có thể chủ động nguồn mẫu trong việc nhân giống

Sau khi khử trùng, mẫu thu được phải đảm bảo các tiêu chí sau: tỉ lệ sống cao, tỉ lệ nhiễm (chết) thấp, mẫu sinh trưởng và phát triển với tốc độ nhanh Kết quả cuối cùng của giai đoạn này là tạo được mẫu sạch, điều này phụ thuộc vào khả năng chọn mẫu, nồng độ và thời gian xử lí diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [3] Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc độ nhân nhanh cao [3]

1.2.2.2 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của nhân nhanh chồi là nhằm kích thích vật liệu nuôi cấy phát sinh được chồi nhiều nhất trong thời gian ngắn nhất Từ đó tìm được môi trường thích hợp cho khả năng nhân chồi Đây là giai đoạn cực kì quan

trọng, nó quyết định tốc độ và hiệu quả của quá trình nhân giống in vitro

tế bào giãn

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tạo ra được hệ số nhân giống cao, quy trình nhân phải có hiệu quả kinh tế, chồi tạo ra có tỉ lệ sống cao, sinh trưởng và phát triển bình thường, không dị dạng, chồi khỏe, cứng cáp Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [3]

1.2.2.3 Tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro với mục

đích để tạo cây con hoàn chỉnh với tiêu chí cây khỏe mạnh, có bộ rễ cứng

cáp để có thể sinh trưởng và phát triển tốt khi đưa ra ngoài vườn ươm

Sau 3-4 tuần nuôi trên môi trường nhân nhanh chồi, các chồi được loại

bỏ bớt những đoạn già ở phần gốc chồi, rồi cấy chuyển sang môi trường tạo

rễ Trong giai đoạn này thường bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng như NAA, IAA, IAB, 2,4-D để kích thích tạo rễ cho chồi

1.2.2.4 Giai đoạn huấn luyện cây in vitro ở ngoài môi trường tự nhiên

Huấn luyện là giai đoạn tạo điều kiện cho cây con trong bình làm quen dần với môi trường tự nhiên bên ngoài, để tạo cho cây cứng cáp, khỏe mạnh, khi đưa ra cấy ngoài vườn ươm đạt tỉ lệ sống cao Đây được coi là

bước thuần hóa trước khi tách khỏi điều kiện in vitro

Ở giai đoạn này, cây con đang ở trong môi trường nhân tạo được đem

ra ngoài tự nhiên nên cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp như

ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để cây phát triển tốt nhất

1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.3.1 Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô

Trong nuôi cấy mô tế bào, môi trường nuôi cấy và môi trường xung quanh là 2 vấn đề chính quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự

tăng trưởng và phân hóa mô trong suốt quá trình nuôi cấy Cơ sở của việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Cho đến nay, rất nhiều môi trường dinh dưỡng đã lần lượt được tìm ra và chúng đều mang tên tác giả đề xuất như: White (1934), Knudson (1964), Murashige – Skoog (MS 1962), Knop (1974)… Tuy nhiên mỗi môi

trường chỉ thích hợp với vài loài cây nhất định nên trong nuôi cấy in

vitro tùy thuộc vào quá trình phát triển mà chọn môi trường dinh dưỡng

phù hợp Tùy từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy, thậm chí tùy cơ quan khác nhau trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng là khác nhau Trong môi trường nuôi cấy số lượng và các loại hóa chất phải cực kỳ chính xác với từng đối tượng cụ thể

Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đều bao gồm:

 Các chất khoáng đa lượng và vi lượng

1.2.3.2 Các loại muối khoáng

 Khoáng đa lượng

Được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, tức là trên 30 mg/l Những nguyên tố N, S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi tùy theo đối tượng

nuôi cấy Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng

- Nitơ (N): Được sử dụng ở dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR) Ammonium được

tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như axit amin Nhưng điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat

và ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây đó mà phối hợp theo tỉ lệ thích hợp [2]

- Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu kali sẽ xúc tiến mạnh quá trình trao đổi chất [2]

- Photpho (P) là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu rất cao, thường được đưa vào môi trường ở dạng ortophotphat hoặc đường photpho Photpho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nucleic Ngoài ra, khi photpho ở dạng H2PO4- và HPO42-

còn có tác dụng như một hệ thống đệm làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy [2]

- Lưu huỳnh (S) được sử dụng chủ yếu và tốt nhất là ở dạng muối SO4

2-với nồng độ thấp Các dạng khác nhau như SO32- hoặc SO2 thường kém tác dụng, thậm chí còn độc [2]

- Các ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường [2]

 Khoáng vi lượng:

Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm, nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể

thiếu được đối với sự phát triển của mô là sắt, đồng, kẽm, mangan, molybden, bo, coban, iot Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzyme, chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng

- Sắt (Fe): Thiếu sắt thì tế bào sẽ mất khả năng phân chia Thiếu Fe làm giảm lượng ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng lượng ADN

và axit amin tự do dẫn đến giảm phân bào Fe thường được tạo phức hợp với thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong

tế bào [2]

- Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các axit amin tự do

và ADN tăng lên, nhưng ARN và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào [2]

- Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin

vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm

Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh [2]

- Molypden (Mo): là ion đóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat reductase, như vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật [2]

1.2.3.3.Nguồn cacbon

Cây in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù dưới

ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhưng bị hạn chế cho việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon dưới dạng hữu cơ bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối Tùy thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô trong trường hợp đặc biệt có thể dùng các loại đường khác nhau: Sucrose, Maltose,

Galactose và Lactose Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy khác nhau nhưng thường dùng với hàm lượng từ 20-40 g/l Việc khử trùng môi trường bằng nồi hấp điện gây ra việc phân hủy đường do

sự thủy phân, nhưng không thể hiện điều bất lợi nào cho sự phát triển của thực vật Trong sản xuất đại trà cây giống, người ta thường sử dụng đường sucrose có giá rẻ và sẵn có trên thị trường [2]

1.2.3.4 Chất điều hòa sinh trưởng

Trong môi trường nuôi cấy mô – tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng Tùy theo từng mục đích nuôi cấy có thể chọn các nồng độ

và tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp Những chất điều hòa sinh trưởng thường dùng bao gồm:

 Auxin

Auxin do Went và Thimann (1937) phát hiện Auxin có tác dụng kích thích sự hình thành mô sẹo và xuất hiện rễ bất định, kích thích sự giãn của tế bào

Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt …

- Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra Hiệu quả đặc trưng của Auxin là lên sự giãn của thành tế bào

- Auxin gây ra hiện tượng ưu thế ngọn: Khi chồi ngọn hay rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên Đây là một sự

ức chế tương quan vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cắt chồi ngọn và rễ chính thì chồi bên, rẽ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh

trưởng Vì Auxin được hình thành trên ngọn với hàm lượng cao hơn và được vận chuyển xuống dưới Trên đường đi xuống dưới, nó ức chế sự sinh trưởng của chồi bên

- Auxin kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là hình thành rễ phụ

- Auxin kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt: Tế bào trứng sau khi thụ tinh đã tạo nên hợp tử và sau phát triển thành phôi Phôi hạt là nguồn tổng hợp Auxin nội sinh quan trọng, khuếch tán vào bầu và kích thích sự lớn lên của bầu thành quả Vì vậy quả chỉ được hình thành khi có sự thụ tinh Nếu không có quá trình thụ tinh thì k hình thành phôi và hoa bị rụng Việc xử lý auxin ngoại sinh cho hoa sẽ thay thế được nguồn Auxin nội sinh vốn được hình thành trong phôi và do đó không cần quá trình thụ tinh nhưng bầu vẫn lớn lên thành quả Quả không qua thụ tinh do đó không có hạt

- Auxin gây ra tính hướng động của cây Auxin kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả vì nó ức chế sự hình thành tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng Vì vậy, phun Auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sự đậu quả và phòng rụng nụ, quả non

- Các loại Auxin thường dùng trong nuôi cấy mô là:

+ Indol -3- acetic acid (IAA): auxin tự nhiên

+ Indol -3- butyric acid (IBA)

+ Naphthyl acetic acid (NAA)

phân hủy thành Các chất thuộc nhóm cytokinin thường được sử dụng

là kinetin, BAP, Zeatin Trong các chất này BAP và kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá cả không đắt

- Kinetin: là sản phẩm được phát hiện đầu tiên, có cấu trúc phân tử là 6- (2-furfuryl)- aminopurin Đây là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine

- BAP: có công thức N6 – benzyllaminopurin, là cytokinin tổng hợp nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn kinetin

- Zeatin: công thức hóa học là: 6- (4 - hydroxyl - 3- methylbut – 2 – enyl) aminopurin

BAP và kinetin cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào Ngoài ra, chúng còn tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính một

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người Nhật

(1920) khi nghiên cứu bệnh lúa von do loài nấm Gibberlla fujikuroi gây

ra Đến những năm 1930 thì mới được phân lập và tinh chế hoạt chất, được gọi là gibberellin Tới nay đã phát hiện được trên 60 loại chất khác nhau thuộc nhóm gibberellic acid Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3, có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt thân cành cây Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ các phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ

- Gibberellin kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân, sự vươn dài của lóng cây họ lúa Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của Gibberellin lên pha giãn của tế bào theo chiều dọc

- Gibberellin ảnh hưởng rất rõ rệt lên sự sinh trưởng của các đột biến lùn

- Gibberellin kích thích sự nảy mầm của hạt và của củ, nó kích thích sự tổng hợp enzyme amylase và các enzym thủy phân khác như protease, photphatase… và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như các polymer thành monomer khác tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng cho quá trình nảy mầm

- Gibberellin ức chế sự phát triển của hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực Gibberellin cũng làm tăng kích thước của quả và tạo quả không hạt trong một số trường hợp Hiệu quả này càng rõ rệt khi phối hợp tác dụng với auxin [2]

1.2.3.5 Các nhóm chất bổ sung

Cho đến nay thành phần môi trường ngày càng phong phú, đầy đủ

và phức tạp Người ta sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như:

- Nước dừa: Kết quả phân tích thành phần nước dừa của Tulecke và cộng tác viên (1961) cho thấy trong nước dừa có: Amino acid tự do, amino acid dạng liên kết, axit hữu cơ, đường, ARN và ADN

1.2.3.6 Chất độn – thạch (Agar)

Thạch là một loại polysaccharide của tảo biển Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12g thạch/lít nước, ở nhiệt độ 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và ở 400C trở về trạng thái gel

Độ thoáng của môi trường thạch có ảnh hưởng rất rõ rệt đến sinh trưởng của mô nuôi cấy Nồng độ của thạch dùng trong môi trường nuôi cấy dao động tùy thuộc vào độ tinh khiết của hóa chất và mục tiêu nuôi cấy (thường từ 6-10 g/l)

 Nước

Nước pha môi trường là loại nước hoàn toàn sạch ion Thông thường người ta sử dụng nước cất 2 lần và tốt nhất là sử dụng hệ thống cất nước thủy tinh [2]

 Độ pH của môi trường

Là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng hòa tan các chất khoáng trong môi trường, sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây Vì vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức độ ổn định ban đầu Nếu pH thấp (pH < 4,5) hoặc cao (pH > 7,0) đều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong

nuôi cấy in vitro Đối với mô sẹo của nhiều loại cây, pH ban đầu

thường là 5,5-6,0 và sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0-6,5 Đặc biệt khi

sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính axit cao như axit amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH để làm tăng hoặc dùng HCl loãng để làm giảm pH môi trường về 5,5-6,5

Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần trọng lượng môi trường nhỏ thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc [2]

1.3 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật trong và ngoài nước

1.3.1 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm

nhiễm ở cơ quan sinh dục Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có

thể tái sinh thành một cơ thể sống hoàn chỉnh Khả năng này của tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng

Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một

lá mầm nhưng không thành công Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào Năm

1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục Năm 1941, Overbeer và cs đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura Năm 1955, Miller và cs đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ Tỷ

lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi

và rễ, tạo cây hoàn chỉnh [29]

1.3.2 Tình hình nuôi cấy mô ở Việt Nam

Ở Việt Nam, ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong công tác nhân giống cây trồng nông-lâm nghiệp ngày càng rộng rãi và đã áp dụng cho nhiều loài cây trồng khác nhau

Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả

năng nhân nhanh chồi in vitro của cây Sâm cau (Curculigo orchioides

Gaertn) của Nguyễn Thị Út và cs (2010), cho kết quả: Môi trường MS

bổ sung 1,0- 4,0mg/l BA đều có khả năng tái sinh chồi in vitro cây Sâm

cau, tuy nhiên môi trường MS có bổ sung 4,0mg/l BA là tốt nhất Môi trường MS bổ sung 30g/l đường Sucrose + 8,0g/l agar + 1,0g/l than

hoạt tính + 1,0mg/l (BA + kinetin) là tối ưu cho nhân nhanh chồi in

vitro cây Sâm cau [21]

Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng

đến sự phát sinh hình thái của mô lá cây Hoắc hương nuôi cấy in vitro

của Tạ Như Thục Anh và cs (2008) cho kết quả: Nhiều thể chồi hình thành từ môi trường bổ sung 0,5 và 0,7mg/l BAP Các nồng độ bổ sung BAP khác cho đến nồng độ 1mg/l BAP chồi không hình thành Ngoài

ra, ở các công thức phối hợp NAA (0,5mg/l) và BAP tỷ lệ hình thành chồi rất thấp [1]

Nghiên cứu nhân giống cây Ba kích bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro

của Võ Châu Tuấn và cs (2010) [18]

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum thumb) của Nguyễn Xuyến Thành Thắng và cs

(2012) [12]

Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro cây Mật nhân (Eurycoma

longifolia jack.) của Võ Châu Tuấn và cs (2012) [17]